Recherche fondamentale

Manipulés deux à trois fois par semaine pendant quinze jours, habitués une semaine aux gestes d'injection, puis traités un à sept jours de suite par piqûre intrapéritonéale, sous-cutanée ou gavage : 840 souris et 840 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La corticostérone administrée par voie orale leur fait prendre du poids et déclenche anxiété et stress, et le porteur indique que les injections répétées peuvent provoquer infections, inflammations et irritations au point de piqûre, les gavages des fausses routes et des irritations de l'œsophage. Aucune mesure n'est faite sur l'animal vivant : les 1 680 rongeurs sont anesthésiés à l'isoflurane puis décapités, et c'est sur des tranches de leur cerveau que l'activité électrique est enregistrée. Le porteur écrit avoir besoin de réseaux neuronaux "natifs et connectés", ce que seule la mise à mort permet d'obtenir.

Objectifs

L’objectif de ce projet sera d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules destinées à réduire les effets du stress chronique. Pour cela, nous utiliserons un modèle chez le rongeur dans lequel un état de stress prolongé sera reproduit en administrant une hormone du stress, la corticostérone. Grâce à ce modèle et à nos mesures d’activité électrique du tissus nerveux nous pourrons mieux comprendre si les molécules testées peuvent corriger les effets du stress chronique, et d’identifier les traitements potentiels les plus prometteurs pour des études ultérieures.

Bénéfices attendus

Notre projet permet de caractériser, évaluer et comprendre les effets de futurs candidats médicaments dans ce modèle. Nos techniques, mises en œuvre dans ce projet, pour l’évaluation de leurs effets sur le tissu nerveux vivants constitue une bonne approche car elle permet : - Dans un modèle de la pathologie chronique une analyse fine de l’effet de la molécule ; - de limiter le nombre d’animaux à tester par l’utilisation de tissus (mesures multipoints sur le même tissu séparé en petits échantillons, ex vivo); Ce projet permet ainsi d’affiner la sélection et l’orientation du développement des composés testés avant de lancer les premières étapes précliniques.

Procédures

Les animaux sont manipulés 2 à 3 fois par semaine les 15 premiers jours puis habitué aux futures manipulations d’injection pendant une semaine et enfin à chaque injection les jours suivants. Ils sont traités entre une fois par jour pendant un jour ou 7 jours maximum soit 1 à 7 injections. Ces traitements peuvent être soit une injection intrapéritonéale, soit une injection sous cutanée ou soit un gavage oral. Chacun dure moins d’une minute. Et enfin une anesthésie à l’isoflurane durant 5 min maximum.

Impact sur les animaux

La projet peut générer des effets indésirables. : *-Du stress peut être induit par la manipulation régulière d’un animal ; *-la prise de poids importante, l’anxiété et le stress sont déclenchés par la prise orale de corticostérone ; *-des infections, inflammations, irritations peuvent apparaitre lors des administrations répétées au site d’injections. *-de fausses routes et irritations de l’œsophage peuvent apparaitre lors des gavages répétés.

Devenir

Ce projet nécessitant une analyse fine de l'efficacité des molécules à tester sur tranche de cerveau, nous devons mettre à mort tous les animaux de ce modèle.

Remplacement

Nos évaluations nécessitent de pouvoir réaliser des observations sur des réseaux neuronaux natifs et connectés, « donc les plus physiologiques possibles ». Il n’est pas envisageable de réaliser sur l’Homme les tests que nous proposons. Nous devrons donc utiliser des animaux vivants pour cela. En effet, nos tests, permettent d’évaluer des molécules avec des effets potentiellement inconnus, en les administrant à un organisme vivant. De plus, nous utilisons des tissus fraichement prélevés, car il n’est pas possible, in silico, de reproduire la complexité de ces connexions anormales ou perturbées observées lors d’un état de stress chroniques.

Réduction

Un test statistique a été utilisé pour calculer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour ce projet. Ce nombre est de 84 animaux maximums pour la réalisation de ce protocole lors d’une étude. Notre capacité à utiliser un même animal pour plusieurs mesures et plusieurs conditions d’exposition diminue le besoin en nombre d’animaux et nous permet de faire, une analyse précise à l’échelle du tissu tout en s’affranchissant des problèmes de passage dans le système nerveux et des problèmes de disponibilité dans l’organisme, mais aussi d’analyser rapidement l’impact sur le fonctionnement électrique du tissus nerveux d’un composé dans ce modèle de stress chronique.

Raffinement

Tous les animaux bénéficient de trois groupes d’enrichissement tournants adaptés pour contrecarrer l’anxiété des animaux. Les animaux utilisés seront habitués, dès le départ, aux contentions à réaliser pour limiter le plus possible les stress futurs liés à ces gestes techniques. Une attention particulière sera portée aux animaux pour repérer chaque signe de dispute/bagarre et isoler au plus tôt les agresseurs. Une vigilance spéciale autour des animaux injectés de façon répétée est posée, pour que lors de ces injections répétées, les sites d’injection soient modifiés dans la zone cible en surveillant tout problème éventuel d’inflammation, au lieu d’injection. Les points limites sont aussi adaptés aux effets possibles dus à cette induction de stress. Lors de la mise à mort par décapitation rapide, les animaux adultes sont au préalable anesthésiés grâce à une induction à l’isoflurane par du personnel qualifié et formé.

Choix des espèces

Le développement de ce modèle inductible de stress et la grande quantité d’informations scientifiques disponibles sur le fonctionnement du système nerveux des souris et rats, ajoutée à la maîtrise de leur élevage, de leur génétique et au développement de techniques d’enregistrement de l’activité cérébrale sur explants vivants font de ces espèces un modèle de choix pour la préparation de tranches de tissu nerveux et l’évaluation de l’efficacité de futur médicament. Pour ces raisons, nous n’utilisons que ces rongeurs. Les animaux seront utilisés entre 6 et 16 semaines post natal afin de permettre une comparaison avec des résultats précédemment publiés.

Jusqu'à trois heures d'acquisition par séance sous sédation continue, et trois séances par souris à 3, 6 et 12 mois : 260 souris et 60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit d'abord une chirurgie de la tête d'une à deux heures pour marquer, lire puis inactiver les cellules qui relient les neurones aux vaisseaux sanguins, geste dont le porteur indique qu'il peut provoquer des douleurs et une perte de poids les jours suivants. L'objet est de calibrer des marqueurs d'IRM fonctionnelle capables de suivre l'évolution des maladies des petits vaisseaux cérébraux, que l'imagerie anatomique ne renseigne pas sur la gravité. Le porteur retient des rongeurs de 8 semaines à 18 mois pour couvrir tous les stades, du jeune adulte à l'animal vieillissant, et les cerveaux sont prélevés après la mise à mort pour examen au microscope.

Objectifs

Les maladies des petits vaisseaux cérébraux (MPVC), qui affectent les vaisseaux intracrâniens de moins de 500 microns de diamètre, sont responsables de 20 à 30 % des accidents vasculaires cérébraux ischémiques (mauvaise irrigation du cerveau) et de 90 % des hémorragies intracérébrales. Elles peuvent entraîner un déclin cognitif allant de légères altérations des fonctions exécutives jusqu'à une démence sévère. À un stade avancé, elles favorisent également des difficultés de marche et d'équilibre, des troubles de l'humeur et des changements de comportement. Comme d'autres maladies neurodégénératives, les MPVC n'ont actuellement pas de traitements pharmacologiques. Le diagnostic de ces maladies repose sur l'identification de lésions caractéristiques par imagerie par résonance magnétique (IRM) anatomique. Bien que l'IRM soit utile pour le diagnostic, elle ne permet pas de définir la gravité de la pathologie, étant donné que le nombre et l'étendue des lésions varient dans le temps de manière quasi indépendante de la gravité. Elle ne permet donc pas de suivre l’évolution de la maladie. Notre premier objectif est de voir si une modalité d’IRM cette fois-ci dynamique, l’IRM fonctionnelle cérébrale (IRMf), pourrait permettre de collecter des données renseignant finement sur l’évolution de la maladie, en mesurant presque en temps réel les changements locaux de flux sanguin. Chez les souris, en alternative à l'IRM fonctionnelle, nous utiliserons l'écho-encéphalographie fonctionnelle, qui a démontré une meilleure sensibilité et une résolution temporelle supérieure, tout en fournissant des signaux similaires à ceux de l'IRMf. Pour y parvenir, nous aurons recours à plusieurs modèles animaux des MPVC qui ont été développés au cours des dernières décennies. Ces modèles génétiques ou pharmacologiques, nous permettront de comprendre l’origine des altérations vasculaires et notamment de faire la différence entre des altérations des vaisseaux eux-mêmes et des altérations de l’environnement cellulaire de ces vaisseaux.

Bénéfices attendus

Nos recherches visent à identifier et calibrer de nouveaux outils diagnostiques basés sur l'IRMf pour évaluer la présence et la gravité des MPVC. Actuellement, le diagnostic de ces maladies ne s'effectue qu'à partir des symptômes ou par analyses génétiques. Ces approches ne répondent pas aux besoins des patients, car elles ne fournissent pas d'éléments sur la gravité de la maladie et n'informent que sur les stades les plus avancés de celle-ci. Des outils diagnostiques capables de détecter les phases précoces et de produire des données quantitatives sur la gravité ouvriront la voie aux tests de différents traitements pharmacologiques déjà validés sur des modèles de souris. A plus long terme, l’obtention de marqueurs fins de la maladie et de son évolution devrait permettre de développer des premiers traitements efficaces pour ces maladies.

Procédures

Les animaux recevront un antidouleur et une anesthésie générale avant de subir une quelconque intervention. Certaines souris avec des mutations transgéniques activables via l'administration de substances spécifiques, recevront le traitement par applications transdermiques de la durée de quelques minutes, le temps pour faire absorber la solution sur la peau, pendant 5 jours consécutifs. Tous les animaux seront soumis à une chirurgie d’environ une heure (et pas plus de 2 heures) réalisée au niveau de la tête– pour : I) marquer les cellules qui participent aux interactions entre les neurones et les vaisseaux sanguins, II) pour "lire" les signaux provenant des cellules marquées, III) pour « inactiver » ces cellules avec des substances spécifiques, déjà largement utilisées dans des expériences précédentes sur des rongeurs. La lecture et l'inactivation des cellules d'intérêt seront effectuées pendant les séances d’IRM ou par l'écho-encéphalographie, mais ces imageries ne provoquent aucune douleur ni gêne aux animaux, d’autant plus qu’ils seront sédatés. Avant les sessions d'imagerie un cathéter sera posé sur le dos de animaux pour leur administrer en continue une molécule qui induit une sédation. Une fois le cathéter positionné, les animaux seront ensuite positionnés dans un berceau compatible avec l’IRM ou avec les ultrasons fonctionnels pour 3h maximum d’acquisition. Il n’y aura pas plus de 3 séances d’acquisition par souris, à 3, 6 et 12 mois. Une seule séance pour les rats.

Impact sur les animaux

La chirurgie pour préparer les animaux aux expériences d'IRM pourra entraîner des douleurs et/ou une perte de poids dans les jours suivants l’expérimentation. L’anesthésie mise en place lors du protocole d’acquisition IRM pourra fragiliser les animaux en induisant une modification de leur comportement et/ou une perte de poids. Pendant les applications sur la peau des substances d’intérêts, les souris peuvent réagir brièvement à la sensation de froid de l'éthanol, mais aucune douleur durable ni lésion tissulaire n'a été observée par des études précédents. Les animaux seront gardés isolés pendant quelques minutes dans une cage, au chaud, après chaque session d'IRM pour qu'ils se réveillent. Dans ce cas, un mouchoir en papier sera ajouté à la cage pour servir de nid et une partie de la litière de la cage d'origine sera ajoutée pour rendre l'environnement moins étranger à l'animal.

Devenir

La suite du projet prévoit des analyses approfondies des différents tissus du cerveau. Les animaux seront donc mis à mort en fin de procédure pour prélever leurs cerveaux et pour les étudier par microscopie.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’étudier la dynamique vasculaire grâce à l’IRM fonctionnelle et de mettre en place de nouvelles méthodes diagnostiques de la MPVC chez l’humain. Il n’existe pour l’instant pas de modèles in vitro suffisamment robustes et complexes pour reproduire la dynamique vasculaire cérébrale. Seul un organisme vivant suffisamment proche de l’humain possède les mêmes caractéristiques d’organisation et de complexité. Cette caractéristique du cerveau n’est présente que dans le cerveau vivant au repos. C’est pour cette raison qu’il n’est pas possible de remplacer les animaux par une autre alternative non animale.

Réduction

Nous effectuerons des recherches constantes dans la littérature scientifique pour vérifier que des études similaires à la nôtre soient publiées entre-temps. Dans ce cas, nous suspendrons les investigations qui pourraient dupliquer inutilement des résultats déjà publiés, sauf s'il y a des besoins évidents de vérification des résultats ou des doutes fondés sur la qualité des résultats publiés. En outre, tous les groupes expérimentaux ont été soigneusement calculés a priori, sur la base d'études antérieures similaires, dans le but d'utiliser le nombre minimum d'animaux, tout en permettant une analyse statistique rigoureuse des résultats.

Raffinement

Tous les animaux seront surveillés tout au long de la procédure. Pendant les interventions chirurgicales les animaux sont anesthésiés et reçoivent un analgésique ainsi que des injections d’anesthésique locales. Pour le suivi post chirurgie des modèles pharmacologiques, nous utiliserons une grille de score dans laquelle des points limites sont déterminés. Les IRM seront réalisées par une personne qualifiée et spécialiste de la pratique de cet examen. L’IRM n’est ni invasive, ni douloureuse et se déroulera sous anesthésie générale. Un monitoring de la respiration et température est prévu tout au long de la séance IRM. Si un animal présente un signe de douleur persistant il sera retiré du protocole et euthanasié. Les animaux seront hébergés en groupe. Un enrichissement avec des balles de papiers pour réaliser un nid et une maisonnette en plastique seront prévus pour chaque cage. De par notre expérience passée sur des protocoles similaires, la probabilité qu’un animal présente des signes importants de stress ou de souffrance (à cause d’une blessure par exemple) sera très faible. Néanmoins, un système d’observation rigoureux des animaux sera mis en place afin de repérer rapidement d’éventuels signes de stress ou de souffrance. Des points limites adaptés ont été définis, permettant d’identifier ces rares cas. Dans une telle situation, une évaluation précise de l’état général de l’animal sera réalisée, et les interventions nécessaires seront mises en œuvre, conformément aux recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

Notre projet repose sur l'utilisation des modèles suffisamment proches de l’humain d’un point de vue organisation générale (des organes, des tissus, des types cellulaires et des fonctions). Les rongeurs constituent un modèle adapté pour les expériences proposées, où l'unité neuro-vasculaire complètement fonctionnelle est requise. Nous utiliserons également des modèles de souris issus de lignées génétiquement modifiées disponibles, ayant une reproduction bien maitrisée. Les souris et les rats sont très couramment utilisés en recherche sur les MPVC, et de nombreux modèles expérimentaux existent déjà. Les MPVC sont des maladies qui se déclenchent à l’âge adulte. Cependant, l’intérêt de cette étude est de pouvoir mettre en place des biomarqueurs détectables à tous les stades de la maladie (d’un stade précoce à un stade âgé). Les animaux utilisés seront donc des animaux adultes âgés de 8 semaines à 18 mois afin d’avoir un panel élargit allant de jeunes adultes à rongeurs âgés.

Les 88 souris subissent une biopsie de queue pour génotypage, unique procédure décrite, dont le porteur indique qu'elle peut provoquer une légère douleur. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures classées à un niveau de souffrance modéré. Elles portent des mutations identifiées chez des patients atteints de déficits immunitaires, et doivent permettre de décrire l'effet de ces mutations sur le développement du système immunohématologique. Rien n'est dit de ce que ces mutations font subir aux souris elles-mêmes, ni de ce qui justifie le classement en souffrance modérée quand seule une biopsie de queue est mentionnée, le porteur se limitant à affirmer que l'étude ne peut être reproduite hors d'un "organisme vivant entier".

Objectifs

Certaines maladies génétiques associées causent des défauts de réparation de l’ADN qui provoquent des déficits immunitaires. Dans ce cadre, nous avons récemment identifié chez des patients des mutations dans 2 gènes impliqués dans la stabilité du génome. L'objectif du projet est de déterminer précisément l'impact de ces mutations dans des modèles de souris. En particulier en nous focalisant sur le développement du système immunohématologique qui est particulièrement affecté dans ces pathologies. Par ailleurs nous génèreront des fibroblastes embryonnaires de souris afin d'en étudier le phénotype en nous focalisant sur la stabilité du génome.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'apporter de nombreuses informations originales et fondamentales sur les conséquences fonctionnelles de ces mutations et plus largement sur le rôle des facteurs analysés dans la stabilité du génome. Les résultats obtenus devraient permettre d'ouvrir des pistes à des approches thérapeutiques chez les patients porteurs de mutations dans ces gènes.

Procédures

Les animaux seront soumis à des biopsies pour génotypage.

Impact sur les animaux

La réalisation des biopsies de queues nécessaires au génotypage des animaux peut provoquer une légère douleur.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront mis à mort.

Remplacement

L'étude de l'effet des mutations sur le développement du système immunitaire ne peut pas être reproduite dans des systèmes autres que des organismes vivants entiers.

Réduction

Des tests statistiques seront réalisés afin de minimiser le nombre d'animaux produits et analysés.

Raffinement

Des points limites stricts spécifiques au projet on été élaborés. Les animaux seront observés de façon hebdomadaire par le personnel formé et compétent de l’animalerie EOPS selon l'obligation réglementaire en vigueur. Les animaux sont au nombre maximum de 5 par cage. Les cages disposent par ailleurs de matériel d'enrichissement (bouts de coton, tunnels colorés, morceaux de bois). Le maintien des animaux dans une zone exempte de pathogène devrait les préserver d'infections opportunistes.

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle de choix pour mener des études sur le développement du système immunohématopoiëtique, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement de ce système entre les rongeurs et l’humain. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce pour la réalisation de ce projet tels que des anticorps pour les immuno-marquages. Enfin, la souris est un modèle animal dans lequel les techniques de mutagénèse permettent facilement l'introduction des mutations d'intérêt. Lot 1 et 2. Pour les croisements des souris ayant atteint la maturité sexuelle seront utilisées (à partir de 6 semaines) Lot 3. Le phénotype sera analysé dans des animaux adultes (8-10 semaines ), stade dans lequel le système immunitaire est mature.

Tués à l'issue du projet pour prélever leurs organes, sauf s'ils en sont retirés sur avis vétérinaire, 4 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun porte un collier de capture posé sous tranquillisation, une puce de température et une chambre implantée sous la peau, apprend à rester en chaise de contention pendant au moins trois semaines, puis traverse six à neuf études de 72 heures ponctuées de huit prélèvements sanguins le premier jour. L'objet est de mesurer combien de temps des vecteurs censés faire franchir la barrière hémato-encéphalique à un médicament survivent dans le sang, avant d'en retenir un pour y coupler un oligonucléotide. Le porteur décrit cette étape comme "incontournable" dans le développement préclinique, et indique qu'elle vise à proposer la technologie à l'industrie pharmaceutique.

Objectifs

Ces dix dernières années, notre société et ses partenaires académiques ont réussi à identifier et à développer des petites entités, dénommées vecteurs, pour faire pénétrer dans le cerveau des médicaments dont l’accès est proscrit par la présence d’une barrière biologique appelée Barrière Hémato-Encéphalique (BHE). Cette barrière est constituée par une paroi extrêmement étanche des vaisseaux sanguins du cerveau. Cette barrière laisse passer uniquement les composés du sang nécessaires au fonctionnement cérébral et le protège des agressions extérieures mais, ce faisant, en empêche l’accès à certains médicaments. Il existe un système de transport naturel de molécules au niveau des vaisseaux sanguins et nos vecteurs sont capables de s’y attacher pour être amenés vers le cerveau. Couplés à des médicaments ces vecteurs leurrent se système de transport comme un cheval de Troie. Cette thématique de recherche a donc un potentiel révolutionnaire pour le traitement des pathologies du cerveau comme Parkinson et Alzheimer. Nous venons d’optimiser une série de nouveaux vecteurs et dans ce projet nous souhaitons dans un premier temps étudier leur durée de vie dans le sang pour sélectionner celui qui aura le potentiel à amener le plus efficacement un médicament dans le cerveau. Le succès de ces travaux et les dernières études chez le primate non-humain ont démontré l’innocuité de nos composés et tout le potentiel de notre technologie sur le développement de nouveaux traitements. C’est dans ce contexte que nous souhaitons relever de nouveaux défis et optimiser notre technologie pour améliorer ou prolonger l’effet de cette stratégie chez le macaque. Nous comptons tout d’abord étudier la durée de vie dans le sang de 6 à 9 candidats vecteurs seul (sans impact pour les animaux) pour sélectionner le meilleur puis le coupler à une molécule thérapeutique pour évaluer son efficacité pharmacologique. Ce projet est une étape essentielle vers le développement d’un futur médicament et c’est pour cela qu’il s’effectue chez le primate non-humain.

Bénéfices attendus

Grâce à ces études nous pourrons envisager de meilleurs effets thérapeutiques dans le traitement de nombreuses pathologies du cerveau (neurodégénératives notamment) et d’optimiser ces traitements pour des maladies rares ou pour la médecine personnalisée. La molécule thérapeutique utilisée ici appartient à la classe des acides nucléiques ou oligonucléotides thérapeutiques. Dans notre cas c’est une molécule qui va permettre l’inhibition de la synthèse d’une protéine par les cellules du cerveau responsable dans notre cas du syndrome Lesch-Nyhan mais cette technologie peut-être couplé à n’importe quel oligonucléotide permettant de corriger à la baisse ou à la hausse n’importe quel type de protéines et donc de pathologies.

Procédures

Les 4 animaux seront dotés d'un collier de capture sous tranquillisation chimique. Durée pose inférieure à 1 minute. Ils seront ensuite habitués à être manipulés en chaise (au minimum 3 semaines). S'en suivra l’implantation d'une puce pour mesurer leur température corporelle et de port-à-cath (chambre d'administration et de prélèvement sanguin sous la peau) sous anesthésie générale (1h d’anesthésie générale par individu). Une série de 6-9 études débutera ensuite en vigile pour évaluer la durée de vie dans le sang des différents vecteurs (durée de chaque étude 72h) suivie d’une pause de 15 jours post administration. Au cours de ces études un vecteur sera administré (1 min) et des prélèvements sanguins auront lieu le 1er (8 prélèvements de 5 min chacun), le 2eme (1 prélèvement de 5 min) et le quatrième jour (1 prélèvement de 5 min) suivit d’une période de “rinçage” (élimination naturelle) par l’organisme pendant 10 jours. Enfin un entretien des chambres sera réalisé dans la 2eme semaine post administration (20 min par dispositifs). Après cette série d’étude, nous sélectionnerons le meilleur vecteur pour y coupler la molécule thérapeutique. Ce composé sera alors administré (1 min) aux animaux et le même nombre de prélèvements sanguins et d’entretien des dispositifs implantables seront effectués (actes de mêmes durées qu’explicité ci-dessus). Mais ici après les 2 semaines post-administration, les animaux seront mis à mort sous anesthésie générale (induction anesthésie 15 min et administration euthanasiant : 5 min pour confirmer l’arrêt cardiaque) pour procéder à la récupération des tissus et ainsi évaluer l'efficacité thérapeutique.

Impact sur les animaux

Acclimatation et entraînement à la contention : source de stress générée par le changement d’environnement qui sera réduit au fur et à mesure par l’habituation aux expérimentateurs et par l’apport de récompenses. La pose de colliers, d’une puce de monitoring de la température et l’implantation des ports à cath se fera sous anesthésie générale. Un stress sera notable à l’induction de l’anesthésie, de même que lors du réveil en phase post-opératoire et accompagné d’antalgiques pour réduire la souffrance. L’entretien des port-à-cath : les interventions se feront en vigiles, sans douleur ni stress notables. Le seul geste invasif sera la piqûre de l’aiguille à travers la peau qui sera accompagnée par une analgésie de la peau si nécessaire. La procédure de nettoyage de la peau peut engendrer irritation. Malgré les procédures d’entretien, le dispositif peut se boucher. A cette occasion une et une seule réimplantation par dispositif sera envisagée Suivi de la durée de vie dans le sang : les prélèvements et administration sont réalisés avec une seule insertion de l’aiguille dans les dispositifs par jour. Aucun effet délétère n’est attendu à l’issue des administrations, de même qu’aucune toxicité d’origine pharmacologique (données de toxicité antérieures). L’administration des composés peut engendrer une légère augmentation de température et une modification très transitoire d’un type cellulaire sanguin, les réticulocytes. Selon nos données antérieures chez cette espèce cela reste sans impact sur les animaux. Etude terminale d’efficacité : Ici pas de nouvelles sources de stress, ni d’effets indésirables supplémentaire étant donné que la molécule thérapeutique supplémentaire a déjà été testée avec succès chez cette espèce lors d’une précédente étude.

Devenir

Si le projet arrive à son terme, les 4 animaux seront mis à mort pour prélèvement des organes/tissus d’intérêt. Si les animaux sont sortis du projet sur avis vétérinaire (en relation avec les points limites), ils seront soit Réutilisés ou Replacés par la structure d'accueil (si l'avis vétérinaire y est favorable), soit Adoptés (en cas d'avis vétérinaire contredisant une Réutilisation/Replacement).

Remplacement

L’évaluation de l’efficacité et de la sécurité des produits de santé destinés à l’humain doit être réalisée chez une espèce « rongeur » et une espèce « non rongeur » avant de faire une demande d’investigation chez l’humain en clinique. La capacité de nos vecteurs conjugués à amener un médicament dans le cerveau a déjà été démontrée sur différents modèles cellulaires in vitro puis confirmée in vivo chez le rongeur ainsi que chez le rongeur humanisé pour le récepteur ciblé. Afin de pouvoir proposer à l'industrie pharmaceutique cette technologie, nous devons maintenant établir la preuve de son efficacité et innocuité chez une large espèce non rongeur proche de l’humain, le macaque. Ce projet s’inscrit donc dans une étape incontournable de développement préclinique.

Réduction

La conception de ce projet a non seulement visé à réduire au maximum le nombre d’animaux inclus (4) tout en optimisant le nombre d’études et de prélèvements pour réduire au maximum le stress occasionné, mais aussi pour limiter les interventions à des manipulations transitoires, peu invasives. L’expérience acquise chez la souris permet de réduire le nombre de primate dans chaque groupe à n=3 pour les études de durée de vie dans le sang (nombre défini en amont par nos modélisateurs), puis à n=4 (3+1) pour l’étude d’efficacité en point final. Sur cette dernière étude, nous resterons sur un groupe extrêmement restreint de 4 animaux (n=2 : composé testé et n=2 : groupe contrôle). D’après nos données internes sur cette espèce c’est le plus petit n permettant d’obtenir des résultats interprétables. Fort de cette expérience et de la reproductibilité de nos résultats nous avons donc décidé de passer à un n=2 par groupe.

Raffinement

- Hébergement : Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales pendant toute la durée du projet. Pendant toute cette période, les animaux seront logés dans des enclos avec d’autres congénères. Une grande volière ensoleillée munie de perchoirs sera également en accès libre hors périodes de manipulation. - Alimentation : un régime alimentaire spécifique adapté pour primates sera délivré sans restriction. – Enfin, au cours de toutes les étapes du projet, des récompenses ainsi que des enrichissements (jouets, dispositifs de recherche de nourriture et enrichissements audio-visuels) seront délivrés de façon quotidienne aux animaux. - Enfin, une attention toute particulière portera sur l’anesthésie et l’analgésie avec des méthodes extrêmement conservatives en tout point similaires à l’homme et en relation avec le respect strict des points limites énoncés.

Choix des espèces

Ce projet s’inscrit dans une démarche de fin de développement chez le modèle animal avant une transposition à l'humain, un modèle de large espèce est donc requis. Le modèle Primate Non-Humain est préconisé par rapport à d’autres modèles, comme le chien/cochon. En effet les paramètres d'appariement de nos vecteurs au récepteur présent au niveau des vaisseaux sanguins cérébraux est optimal chez cette espèce. Cette "affinité" est de plus similaire à celle de l'humain pour une meilleure transposabilité (ce qui n'est pas le cas pour d'autres comme le ouistiti). Les animaux utilisés dans cette étude seront tous de jeunes adultes, >2 ans et d’environ 6-7kg. L’utilisation de jeunes adultes s’explique par le compromis entre le poids de l’animal, la quantité de molécule à administrer, ainsi que par le volume total sanguin permettant de réaliser les prélèvements sanguins sans impact pour l'animal.

112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune maintenue à la main pour l'application du produit jusqu'à quarante fois de suite dans le protocole chronique, douze fois dans le protocole aigu. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré. Les oreilles sont rasées sous anesthésie au premier jour, puis une substance y est appliquée pour déclencher une dermatite atopique, ce qui provoque des démangeaisons et un comportement de grattage, avant un prélèvement sanguin terminal et la mise à mort. Le porteur espère que l'oncostatine M deviendra une cible pour de futures biothérapies, en reconnaissant que son implication directe dans la maladie n'a jamais été démontrée dans un organisme vivant.

Objectifs

La dermatite atopique est une maladie inflammatoire chronique de la peau fréquente en Europe, touchant aussi bien les enfants que les adultes. Elle se caractérise par une inflammation persistante de la peau et une altération de sa fonction de barrière naturelle qui nous protège de la pénétration des micro-organismes pathogènes. Cette maladie pose un problème de santé publique car il n’existe pas vraiment de solution pour la guérir. Les personnes atteintes par cette maladie produisent une molécule inflammatoire appelée oncostatine M dont on soupçonne le rôle délétère sur le système immunitaire et son implication dans le développement de cette maladie. Ce projet a donc pour objectif d’étudier le rôle de l’oncostatine M dans le développement et le maintien de l’inflammation de la peau. Bien que l’oncostatine M soit présente dans les lésions de dermatite atopique chez l’être humain, son implication directe dans cette maladie n’a jamais été démontrée dans un organisme vivant. Pour cela, le projet utilisera un modèle de dermatite atopique chez la souris afin de comparer l’évolution de la maladie chez des animaux produisant l’oncostatine M et chez des animaux génétiquement modifiés qui ne produisent pas cette molécule.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude nous permettront de faire progresser les connaissances sur le rôle de l’oncostatine M dans le développement de la dermatite atopique. A plus long terme, s’il s’avère que l’oncostatine M joue un rôle important dans le développement et/ou le caractère chronique de la maladie, celle-ci pourrait constituer une nouvelle cible pour le développement de biothérapies visant à bloquer les effets de cette molécule proinflammatoire, telles que le développement d'anticorps bloquants ciblant l'oncostatine M. Dans un contexte où le nombre de biothérapies pour le traitement de la dermatite atopique est actuellement limité et où certains patients peuvent être non-répondeurs ou développer des résistances à ces traitements, il est nécessaire de pouvoir identifier de nouvelles cibles pour développer ces nouveaux outils thérapeutiques.

Procédures

Pour tous les animaux inclus dans cette étude, une anesthésie sera pratiquée, une seule fois, le premier jour afin de pouvoir immobiliser l’animal pendant le temps de rasage des oreilles (pendant 10 secondes) à l’aide d’une tondeuse puis d’appliquer localement le traitement sur la peau pour induire la dermatite atopique (pendant 10 secondes) et mesurer l’épaisseur de la peau de manière non-invasive (10 secondes par oreille). Les jours suivants, les traitements et mesures seront effectuées sur animal vigile pour éviter les anesthésies répétées. Tous les animaux inclus dans cette étude seront donc brièvement maintenus par l’expérimentateur afin de permettre l’application locale du traitement sur la peau pour induire la dermatite atopique et mesurer l’épaisseur de la peau de manière non-invasive pendant une durée maximale de 20 secondes. Cette contention manuelle de courte durée peut entraîner un stress léger et transitoire. Elle sera répétée 12 fois pour les animaux qui sont inclus dans le protocole d’induction aigue, à court terme, et répétée 40 fois pour les autres animaux qui sont inclus dans le protocole d’induction chronique, à long terme. En fin de protocole, une analgésie et une anesthésie profonde seront réalisées pour effectuer un prélèvement sanguin terminal d’une durée de 30 secondes au maximum et la mise à mort des animaux en vue de collecter les échantillons biologiques.

Impact sur les animaux

Au début du protocole, l'induction d'une anesthésie et le réveil après anesthésie provoquent un stress léger et transitoire des animaux. L’injection pour induire l’analgésie et l'anesthésie à la fin du protocole crée une douleur légère et transitoire. Les protocoles d'induction d'une dermatite atopique aigue et chronique provoquent un prurit susceptible d'occasionner un comportement de grattage des animaux.

Devenir

Tous les animaux inclus dans le projet seront mis à mort de manière à collecter les différents échantillons biologiques (sang, peau de l'oreille) pour effectuer des analyses moléculaires et des analyses de tissus par microscopie.

Remplacement

Des études précédentes ont été réalisées in vitro pour décrire les propriétés de l'oncostatine M dans différents modèles de culture de cellules cutanées d’origine humaine et murine, développés sous la forme de peaux reconstruites. Cependant, il est nécessaire d’effectuer des expériences in vivo chez l’animal afin d’étudier la contribution de cette molécule à l’inflammation cutanée dans un système complexe où de nombreuses cellules immunitaires activées infiltrent la peau et où de nombreux médiateurs de l’inflammation y sont sécrétés. Il n’existe pas encore de modèle in silico pour mimer ces interactions complexes.

Réduction

A partir des données de la littérature scientifique, nous avons pu calculer un effectif de souris minimum nécessaire pour assurer une validation statistique de l’étude, à l’aide d'une formule mathématique appropriée. Une stratégie par étapes sera également appliquée permettant de réduire potentiellement de moitié le nombre d'animaux utilisés. De plus, au sein de l'animalerie, des accouplements de souris seront effectués à la demande, et non en continu, de manière à limiter le nombre d'animaux produits.

Raffinement

Afin de satisfaire les besoins comportementaux des souris, celles-ci seront maintenues en groupes de 3 à 4 individus par cage ventilée. Leur milieu sera enrichi de structures adaptées répondant à leur besoin naturel de ronger (buchettes de peuplier) et leur permettant de se cacher (nid). Afin de limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse des animaux, ceux-ci seront anesthésiés, avec contrôle de la température par tapis chauffant, lors de certaines phases d’expérimentation. Des points limites gradés, précis et adaptés sont listés dans une grille et feront l’objet d'une surveillance quotidienne des animaux. Une prise en charge par un traitement antalgique sera mise en oeuvre précocement en cas de besoin.

Choix des espèces

Le protocole que nous utilisons chez la souris est reconnu pour reproduire de nombreuses caractéristiques cliniques de la pathologie humaine (rougeur, épaississement cutané, desquamation, prurit), histologiques (épaississement de l’épiderme, présence anormale de cellules immunes dans le derme) et ses mécanismes moléculaires et cellulaires. Par ailleurs, le système immuno-inflammatoire de la souris est décrit et étudié depuis des décennies et autorise des comparaisons avec le système immuno-inflammatoire humain. Les modèles murins, bien que pouvant présenter certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier la réponse immuno-inflammatoire de la peau et évitent d’avoir recours à des espèces animales plus proches de l'Homme. Les animaux seront inclus dans le projet à partir de l’âge de 8 semaines, lorsque leur système immuno-inflammatoire est bien développé.