Recherche fondamentale

Comprendre pourquoi des neurones apparus pendant la gestation disparaissent une fois les petits sevrés, c'est l'objet de ce projet, qui utilise 285 souris dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des femelles reçoivent des injections avant l'accouplement puis pendant la gestation, certaines sont opérées sous anesthésie générale, d'autres gavées chaque jour pendant cinq jours après la mise bas, au risque d'une irritation de l'œsophage. Une partie des mères est séparée de ses petits dès la naissance et isolée sept jours, ce que le porteur reconnaît comme un stress non négligeable. Toutes sont tuées, après une injection dans le cœur sous anesthésie, pour prélever leur cerveau, et les points limites annoncés comme adaptés à chaque procédure ne sont pas détaillés.

Objectifs

Chez les vertébrés, de nouveaux neurones peuvent être produits dans le cerveau adulte et s'intégrer dans des circuits complexes préexistants. L’ajout de jeunes neurones constitue un levier important de plasticité cérébrale, renforçant la capacité d’adaptation du cerveau adulte à diverses expériences de vie. Durant la gestation chez la souris, on observe ainsi l’apparition de neurones particuliers, qui sont importants pour la reconnaissance des petits par leur mère. De façon surprenante, ces neurones nouvellement créés durant la gestation sont transitoires : ils sont fonctionnels durant la première semaine de lactation, puis disparaissent progressivement des circuits neuronaux de la mère au fur et à mesure que les petits acquièrent leur indépendance alimentaire. La raison pour laquelle ces neurones sont transitoires et les mécanismes régulant leur disparition sont encore totalement inconnus. Le projet proposé ici vise à étudier le processus par lequel les neurones liés à la gestation sont éliminés du bulbe olfactif de la mère. Nous allons pour cela utiliser différents groupes de souris (avec ou sans petits, suite à un protocole d’adoption, après exposition à différentes odeurs dans la cage) pour étudier cette plasticité cérébrale.

Bénéfices attendus

Le bénéfice principal de ce projet est de comprendre comment le sens de l’olfaction s’adapte pour une bonne reconnaissance de l’odeur des petits pendant la période de lactation. Cette plasticité semble être préparée en amont de la naissance, lors de la gestation, avec la génération, puis la disparition, de neurones spécifiques. À plus long terme, ces recherches auront un impact sur notre compréhension de la plasticité cérébrale et la modulation transitoire du sens de l’olfaction décrits chez la femme enceinte, mais dont les impacts fonctionnels sur l’attachement mère-enfant ainsi que sur la qualité de lactation sont encore très peu compris. Enfin, une meilleure compréhension des mécanismes de plasticité du cerveau adulte chez les mammifères pourrait mener à de nouvelles pistes thérapeuthiques dans différentes situations pathologiques où le fonctionnement du cerveau est altéré, notamment les fonctions olfactives et de mémoire (accidents vasculaires cérébraux ou maladies neurodégénératives).

Procédures

Injection de produits chez des souris adultes vigiles avant mise en accouplement (1 injection par jour pendant 3 jours, 20 secondes par injection), ainsi que pendant la gestation (2 injections par souris, espacées de 3 jours, 20 secondes par injection). Certaines de ces souris seront séparées de leurs petits tout de suite après la naissance et isolées pendant 7 jours. D'autres recevront un produit par gavage dans les jours qui suivent la mise bas : 1 administration quotidienne pendant 5 jours sur souris vigiles, 20 secondes par administration. D'autres souris gestantes subiront une chirurgie sous anesthésie générale (1 opération par souris, durée : 30-45 minutes par souris). Chez ces mêmes souris : injection d’un produit dans les jours qui suivent la mise bas : 1 administration quotidienne pendant 5 jours, 20 secondes par administration. La majorité des souris de ce projet subira 3 tests de comportement chacune, espacés de 24h : deux tests de 5 minutes chacun et un test de 35 minutes (souris vigiles). Ces tests, qui visent à évaluer la capacité de la mère à reconnaître ses petits, seront réalisés soit 4-6 jours après la mise-bas, soit 17-19 jours après la mise-bas. Juste avant la mise à mort de toutes les souris du projet : injection d’un produit dans le cœur, par chirurgie sous anesthésie générale (1 injection par souris, durée 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les injections de produits induisent une douleur temporaire au point d’injection. Le retrait des petits aux mères allaitantes peut induire un stress non négligeable pour les femelles. Plusieurs nuisances peuvent potentiellement être induites par le gavage : stress, inconfort pendant le gavage, irritation de l’œsophage. Les nuisances de la chirurgie sont liées aux effets secondaires de l’anesthésie, et la douleur post-opératoire.

Devenir

Il est nécessaire de mettre à mort toutes les souris utilisées dans ce projet, afin de pouvoir prélever leur cerveau et étudier le devenir des nouveaux neurones générés pendant la gestation.

Remplacement

Il est actuellement impossible de reproduire in vitro le milieu hormonal accompagnant l’expérience physiologique de la gestation et de la maternité ainsi que le comportement maternel. De plus, l’objectif de cette étude étant de comprendre les mécanismes de plasticité cérébrale liées à la gestation et au comportement maternel, elle ne peut pas être réalisée autrement que sur des animaux vivants, car on ne dispose pas actuellement de modèle in vitro reproduisant la complexité du fonctionnement du cerveau.

Réduction

Le nombre d'animaux a été déterminé en fonction de notre connaissance des lignées de souris utilisées (plus ou moins maternelles et portées plus ou moins nombreuses selon les lignées), ainsi que de la variabilité observée précédemment pour l’étude des neurones générés pendant la gestation et pour les données comportementales. Les mêmes souris seront utilisées de façon longitudinale pour différentes observations comportementales afin de minimiser les cohortes produites. Le nombre total de souris prévu inclut des souris supplémentaires afin de pallier, si besoin, à l’exclusion potentielle d’animaux après la chirurgie (difficulté de récupération). Des analyses statistiques adaptées aux différents types de données (étude des neurones ou étude du comportement maternel) sont prévues.

Raffinement

Les souris seront pesées une fois par semaine pendant toute la durée des expériences. Des points limites spécifiques adaptés aux différentes procédures ont été établis. En cas d'approche d'un point limite par l'un des animaux, la surveillance sera réalisée quotidiennement. Les injections réalisées sur une même souris seront réalisées sur différents sites d'injection. Les mères gestantes seront hébergées par paires pour limiter le stress d’isolement. Pour les tests de comportement, les souris seront habituées à la pièce de test au moins 30 min par jour pendant deux jours avant le premier test, afin de réduire le stress induit par le changement d’environnement. Dans le cas d’administration de produit par gavage, les souris seront observées avec attention dans les minutes qui suivent, pour détecter toute anomalie. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale, avec prise en charge antalgique avant, pendant et après l’opération. Une fois la chirurgie terminée, la souris sera surveillée et isolée jusqu’à son réveil puis remis en cage avec sa congénère.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle expérimental qui reproduit bien le remodelage significatif du cerveau récemment décrit chez la femme lors des périodes de grossesse et de maternité. De plus, l’utilisation de souris génétiquement modifiées nous permet d’étudier in vivo et de façon très fine des mécanismes précis. Chez les vertébrés, ce type d’approche n’est actuellement envisageable que chez la souris. L’intérêt de l’étude est d’analyser le cerveau ainsi que le comportement maternel de femelles allaitantes. Toutes les souris de l’étude seront donc utilisées au stade adulte.

5 576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune reçoit des injections quotidiennes pendant trois à cinq jours et subit une à deux chirurgies cérébrales pouvant durer deux heures et demie, avec un risque déclaré de douleurs aiguës, d'apathie, de perte de poids jusqu'à 10 % et d'infection du site d'implantation. Les tests mesurent la locomotion, l'apprentissage et les interactions sociales, jusqu'à trois fois par jour pendant trois jours. Les débouchés thérapeutiques évoqués pour l'autisme ou le syndrome de Williams sont renvoyés au long terme, et le porteur affirme qu'aucun modèle informatique ou cellulaire ne peut remplacer l'observation d'animaux vivants pour ces comportements.

Objectifs

Les astrocytes sont des cellules du cerveau qui jouent un rôle important en aidant les neurones à communiquer efficacement. Cette communication est essentielle pour les pensées, les émotions et les comportements. Ce projet vise à mieux comprendre comment ces cellules influencent les interactions sociales lors de défaut de sociabilité (hyper- et hypo-sociabilité).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le role des astrocytes dans lors de dérégulation du comportement social. A long terme ce projet permettrait de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour des pathologies associées à des défauts de sociabilité comme le trouble du spectre autistique ou le syndrome de William en manipulant l'activité ou la structure des astrocytes.

Procédures

Les animaux vigiles recevront des injections durant environ 5 minutes, une fois par jours 3 à 5 jours consécutifs par souris. Des chirurgies durant de 30 minutes à 2H30 selon l'objectif expérimental seront également réalisées dans ce projet (1 à 2 chirurgies par animal). Pendant ces interventions, les animaux seront anesthésiés (anesthésie générale) et ne seront donc pas vigiles. Enfin les animaux verront leur comportement évalué dans 4 types de tests qui durent entre 10 et 20 minutes et sont répétés de 1 à maximum 3x dans une même journée et cela sur 3 jours au plus. Ces tests visent à mesurer leur locomotion, la performance liée à l'apprentissage et les interactions sociales. Ces évaluations comportementales sont réalisées par des animaux vigiles (non anesthésiés).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables liés aux chirurgies (interventions modérées) sont perte de poids allant jusqu'à 10%, une apathie transitoire, des douleurs aigues et des récations inflammatoires légères au site d'injection et d'implantation pendant 24/48h. Il est également possible que des effets liés aux anesthésies soient observées comme une dépression respiratoires et une hypothermie ainsi que des effets liés aux complications post-opératoires comme une infection ou un saignement. Les effets indésirables liés aux tests comportementaux (intervention légère) inclus une augmentation de l'anxiété due à la manipulation des animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir prélever leur cerveau pour des études en histologie ou biochimie.

Remplacement

Le but de ce projet est de mieux comprendre comment le cerveau permet les interactions sociales et pourquoi celles-ci peuvent être altérées dans certains troubles. Les comportements sociaux font intervenir plusieurs zones du cerveau qui fonctionnent ensemble, ainsi que des substances naturelles produites par l’organisme et impliquées dans le lien social. Pour étudier ces mécanismes, il est indispensable d’observer des animaux vivants. En effet, les interactions sociales sont des comportements complexes qui ne peuvent pas être reproduits par ordinateur ni étudiés uniquement sur des cellules en laboratoire. Ces approches ne permettent pas de prendre en compte l’ensemble du cerveau, ni les échanges entre différentes régions, ni l’influence des hormones. Nous souhaitons en particulier comprendre comment une hormone connue pour son rôle dans les liens sociaux agit sur certaines cellules du cerveau pendant les interactions entre individus. Ces mécanismes ne peuvent pas être étudiés dans des modèles plus simples. L’utilisation de souris est donc nécessaire pour répondre à ces questions. Lorsque cela sera possible, nous utiliserons des méthodes complémentaires en laboratoire afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Toutefois, ces méthodes ne peuvent pas remplacer l’étude du comportement social chez l’animal vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été réduit au minimum possible selon nos expériences passées pour nous permettre d’obtenir des résultats statistiquement fiables et tiennent compte des différentes problématiques expérimentales qui peuvent être rencontrées. Pour des expériences de séquençage, la faible quantité de matériel pouvant être récoltée nous oblige à utiliser plusieurs animaux par échantillons mais des expériences précédentes nous ont permis de réduire le nombre d’animaux à regrouper au maximum pour obtenir de résultats analysables.

Raffinement

Les chirurgies sont faites sous anesthésie et avec une analgésie appropriée. En post opératoire les animaux seront placés sous surveillance jusqu’au réveil puis, replacés dans leur cage d’origine (avec leur congénères) et restent sous une surveillance renforcée jusqu'à récupération totale. Nous utiliserons une grille d'évaluation du bien être animal pour suivre quotidiennement les animaux définissant ainsi sur des critères de changements dans l'aspect physique ou comportemental, despoints limites adaptés. Si des blessures sont constatées ou si leur bien être est compromis nous utiliserons des antalgiques en premier lieu et si aucune amélioration n'est constatée le jour suivant les animaux seront mis à mort. Avant les expériences, nous procéderons à une habituation des souris à l'expérimentateur ou au matériel sur 3 à 5 jours consécutifs pendant des séances de 10 minutes minimum.

Choix des espèces

La souris est l’espèce de référence en neurosciences et bénéficie d’un écosystème expérimental exceptionnel : nombreuses lignées transgéniques déjà disponibles, outils viraux et capteurs génétiquement encodés validés. Ce cadre permet d’interroger directement, in vivo, les interactions neurones–astrocytes au cours de comportements sociaux complexes, dans des circuits pertinents tels que le cortex préfrontal et le noyau accumbens, et dans le contexte de la modulation ocytocinergique propre aux mammifères. Les expériences seront réalisées chez des souris adultes, stade où les circuits sociaux sont matures et où les influences liées au développement précoce ou au vieillissement sont limitées. Les deux sexes seront pris en compte. Les injections seront effectuées entre 1 et 6 mois, et les évaluations comportementales débuteront au moins 3 semaines après les injections ou l’implantation optique, afin de permettre la récupération et l’expression stable des outils.

936 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour que leur cerveau soit observé au microscope. Chacune subit une chirurgie cérébrale de quarante minutes, six à huit injections sur animal vigile et jusqu'à treize séances d'observation de trente minutes, autour d'une exposition à la cocaïne. L'objectif est de tester si la kétamine efface la mémoire associative qui déclenche la rechute, les femelles n'étant incluses que si les effets se confirment chez les mâles. Le RNT indique lui-même que des essais cliniques de cette molécule contre la dépendance à la cocaïne sont déjà en cours chez l'être humain.

Objectifs

La toxicomanie est un problème de santé, social et économique majeur qui coûte des milliards d'euros à notre société. En France, on constate une augmentation de la consommation de cocaïne (plus d'un million de consommateurs en France, soit 2,7 poucents en 2023 contre 1,6pourcents en 2017 et 0,6pourcents en 2005) et près de 10 pourcents de la population générale a consommé de la cocaïne au moins une fois (chiffre enregistré en 2023, www.ofdt.fr). L'une des principales caractéristiques des troubles liés à l'usage de substances est l'association persistante entre la drogue et le contexte, et le fait que l'exposition à des signaux associés déclenche la consommation et entraîne une rechute. Cela concorde également avec les nombreuses preuves démontrant que la toxicomanie recourt à des mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent les souvenirs associatifs à long terme, avec notamment la formation de nouvelles connexions neuronales. À ce jour, il n'existe aucun médicament approuvé spécifiquement pour le traitement de la dépendance à la cocaïne. Cependant, des essais cliniques utilisant une molécule pour traiter la dépendance à la cocaïne sont en cours. Lette molécule est actuellement un traitement efficace contre la dépression. Les études pré-cliniques montrent que cette molécule réorganise la connectivité neuronale, qui est justement un mécanisme cellulaire clé dans la formation de l’association entre cocaïne et contexte. Les associations apprises tout au long de la vie entre la cocaïne et certains stimuli ne conduisent pas seulement à la consommation, mais aussi à la rechute, donc ce projet vise à évaluer le potentiel thérapeutique de la molécule pour disrupter la mémoire pathologique induite par la cocaïne, et étudier les effets de la kétamine sur la réorganistion des connexions neuronales.

Bénéfices attendus

Ce projet testera les effets d’une molécule sur la caractère renforcant de la cocaïne et sur la rechute dans la consommation. Le bénéfice possible est de révéler une stratégie médicamenteuse contre l’addiciton à la cocaïne, pour laquelle aucun traitement n’existe à ce jour.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule opération chirurgicale (durée 40minutes) sous anesthésie générale en condition d'analgésie pendant et après l'opération. Les animaux vigiles seront soumis à des injections (de 6 à 8), et seront placés dans une enceinte pour observer leur comportement spontané pendant 30 minutes (de 4 à 13 fois).

Impact sur les animaux

Les injections engendrent une douleur de très courte durée au niveau de l’abdomen. Lors des actes chirurgicaux, l’anesthésie peut engendrer une baisse de température corporelle et une déshydratation. Dans de très rares cas, l’anesthésie peut provoquer un arrêt cardio-respiratoire. En post opératoire de la chirurgie, les nuisances possibles sont une douleur, et une infection au niveau de la suture de la peau du crâne. La manipulation des animaux par l’expérimentateur, ainsi que l’exposition à un nouvel environnement (cage de test de comportement) peut engendrer un stress.

Devenir

La totalité des animaux seront euthanasiés afin d'étudier le cerveau. Il est nécessaire de prélever le cerveau car seule une observation par microscopie permettra de connaître les événements cellulaires associés aux effets thérapeutiques attendus.

Remplacement

Les études in vitro et sur invertébrés ne permettent d’étudier les comportements de type addictif car la neuropathologie de ces troubles psychiatriques est complexe, évolutive et multicellulaire. La stratégies à visée thérapeutique développée dans ce projet ne peut se faire qu’avec des animaux. L’utilisation de lignées cellulaires ne permet pas d’appréhender ces études, ni de développer des stratégies à visée thérapeutique pour obtenir des preuves de concepts en vue d’une application translationnelle. Cependant, avant chaque procédure décrite dans ce projet, des résultats obtenus sur des cultures de cellules ont permis d’obtenir des résultats préliminaires solides afin de limiter les études in vivo chez la souris.

Réduction

Le projet impliquera un nombre maximum de 936 animaux. Les résultats publiés par de nombreux laboratoires dont le nôtre nous ont permis de déterminer précisément le nombre d’animaux par groupe expérimental permettant de générer des données statistiquement solides. Il est bien établi que 18 animaux par groupe sont nécessaires, ce nombre est établi pour minimiser le nombre d'animaux tout en assurant de générer des résultats fiables, autant pour l'analyse comportementale que pour l'analyse de la connectivité neuronale. Notre équipe réalise ce test comportemental et l'analyse des connexions depuis des années avec de nombreuses publications. De plus, nous réaliserons les expériences avec plusieurs lots de 6 souris par groupe expérimental, de sorte que dans le cas où 2 lots (12animaux) suffiraient (ce n'est pas systématique, mais il arrive que 12 souris suffisent pour obtenir un résultat fiable), nous ne réaliserons pas cette expérience avec le 3ème lot, donc pour chaque expérience le nombre de souris pourrait être 12 au lieu de 18. Selon les résultats, la généralisation de l'effet thérapeutique sera testée chez des animaux femelles, mais ces expériences ne seront réalisées que si les effets thérapeutiques chez les mâles sont robustes.

Raffinement

Les animaux font l’objet d’un contrôle au moins quotidiennement par une personne compétente qui surveille posture, pelage, mobilité. Des points limites ont été définis qui permettent de s'assurer du suivi du bien-être animal. Afin de réduire la douleur, les animaux sont sous analgésie avant, pendant et après la phase opératoire qui est réalisée sous anesthésie générale. La température de l'animal est régulée lors de l'induction de l'anesthésie, de l'injection et du réveil de l'animal au moyen d'un tapis chauffant. Durant la chirurgie, une difficulté respiratoire est un point limite. Suite à la chirurgie, les animaux sont pesés quotidiennement pendant 3 jours. En cas de perte de poids, l’animal est pesé aussi les jours suivants, et de la nourriture est placée au fond de la cage, ainsi que de l'hydrogel. En cas d'infection au niveau de la suture de la peau une médication appropriée est appliquée. Les souris récupèrent au minimum 1 semaine avant les tests comportementaux. Les animaux sont habitués progressivement afin de réduire stress pouvant être induit par la manipulation, la contention et l’injection. L’utilisation d’une aiguille de taille minimale contribue à diminuer l’impact des injections. Les souris recevront l’injection d’un sédatif avant l'euthanasie pratiquée par une personne formée et réalisée dans le cadre réglementaire.

Choix des espèces

La souris est reconnue comme modèle animal idéal pour l'expérimentation et la translation vers les thérapies. Les régions cérébrales, les types de neurones et les circuits neuronaux ainsi que les mécanismes cellulaires de l'addiction sont largement conservés entre le rongeur et l'être humain. Les animaux seront au stade adulte, car notre projet vise à développer des approches thérapeutiques destinées aux patients adultes souffrant d'addiction.

La finalité déclarée est méthodologique, mettre au point et standardiser les tests auditifs eux-mêmes et harmoniser les pratiques entre expérimentateurs. 525 souris vont y être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue, aucune réutilisation n'étant prévue. Elles subissent des mesures auditives sous anesthésie générale jusqu'à six fois chacune, une chirurgie d'une heure pour implanter des électrodes sur le crâne, et pour certaines une exposition unique de deux heures à 100 décibels destinée à provoquer un traumatisme sonore. Le porteur annonce que l'harmonisation des protocoles "contribuera à limiter le stress ressenti par les animaux", dans le même document qui décrit le confinement, une hypothermie de un à deux degrés à l'induction de l'anesthésie et une désorientation de plusieurs heures au réveil.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’optimiser et/ou de mettre au point des tests de mesures auditives et vestibulaires sur les rongeurs. Pour certains tests, nous partons de zéro, tandis que d'autres sont déjà utilisés dans le cadre d'autres projets de l'établissement. Ces tests sont essentiels pour mieux comprendre les troubles auditifs et vestibulaires, qui peuvent aussi affecter les humains. Nous souhaitons : 1. Identifier les facteurs influençant les résultats des tests 2. Etablir des protocoles consensus et normaliser les pratiques pour les tests de phénotypage auditif et vestibulaire de base sur les rongeurs et pour l’application de traumatismes sonores Cette approche nous permettra d’améliorer l’accompagnement des expérimentateurs dans leurs travaux en permettant la transmission des bonnes pratiques associées aux tests auditifs, favorisant la transversalité entre recherche préclinique et clinique. Ces travaux contribueront à améliorer la compréhension et l’évaluation des atteintes sensorielles, ouvrant la voie à de futures stratégies de prévention et d’intervention.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des bénéfices directs pour la qualité et la fiabilité des recherches menées sur les troubles auditifs et vestibulaires. L’identification et la stabilisation des paramètres critiques qui influencent les tests permettront de réduire la variabilité des résultats, souvent liée à des différences dans les conditions expérimentales ou dans l’utilisation du matériel. En proposant des protocoles mieux maîtrisés, le projet contribuera à limiter le stress ressenti par les animaux, ce qui se traduit non seulement par une amélioration de leur bien-être, mais aussi par une meilleure qualité des données recueillies. Parallèlement, l’harmonisation des pratiques offrira un cadre plus clair pour la formation et l’accompagnement des expérimentateurs renforçant leur formation, leur autonomie et leur efficacité dans la conduite des expériences. Ce travail favorisera la mise en place de modèles expérimentaux plus robustes et plus représentatifs, capables de mieux prédire les phénomènes sensoriels étudiés. Cela constitue un enjeu majeur pour progresser dans la compréhension des troubles auditifs et vestibulaires, qui représentent une problématique importante de santé publique. En parallèle, l’amélioration de la reproductibilité et de la comparabilité des résultats obtenus entre différents laboratoires contribuera à réduire le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des données significatives. Le projet illustre la volonté de maximiser la valeur scientifique de chaque expérimentation tout en minimisant le recours et l’impact sur les animaux. Au-delà de l’amélioration immédiate des pratiques, le projet contribue à inscrire la recherche dans une dynamique durable et responsable, répondant aux attentes de la société en matière d’éthique et de transparence. En résumé, ce projet représente une opportunité importante pour : - Renforcer la qualité et la fiabilité des recherches actuelles, - Améliorer le bien-être des animaux utilisés, - Offrir une meilleure formation aux expérimentateurs, - et préparer des avancées scientifiques qui bénéficieront à terme à la santé humaine. Il constitue ainsi un levier pour faire progresser à la fois les pratiques expérimentales et les perspectives cliniques dans le domaine de l’audition et de l’équilibre.

Procédures

Tests auditifs standards réalisés sous anesthésie générale, d'une durée de 30 à 45 minutes, pouvant être répétés jusqu'à six fois par animal. Evaluation des réflexes acoustiques : un test réalisé une à deux fois par animal pendant 30 minutes sous sédation légère, un autre sur deux à trois sessions consécutives de 45 minutes sur animal éveillé, répétable sur plusieurs semaines. Induction d'un traumatisme sonore par exposition unique de deux heures à 100 décibels sur animal éveillé, suivie de contrôles auditifs post-exposition sous anesthésie générale. Intervention chirurgicale d'une heure sous anesthésie générale pour l'implantation d'électrodes sur le crâne, suivie d'enregistrements physiologiques de 30 minutes réalisés une à deux fois par animal sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Ce projet ne concerne que des procédures de classe légère et modérée. Bien que les techniques de mesure auditive soient qualifiées de non invasives, plusieurs effets indésirables ponctuels et réversibles peuvent survenir. La manipulation et la contention physique nécessaires au positionnement dans les cabines de test induisent un stress aigu caractérisé, une accélération du rythme cardiaque. Une anesthésie injectable est requise pour certains enregistrements, il peut survenir une dépression cardiorespiratoire transitoire, une hypothermie rapide (1 à 2 °C en quelques minutes) lors de l’induction, ainsi qu’une période de désorientation post-réveil pouvant aller jusqu’à quelques heures. Le confinement dans des espaces réduits par rapport à l’hébergement standard, combiné au transport entre animalerie et salle d’expérimentation (vibrations) génère un stress multisensoriel. Enfin, dans les rares cas où se déclareraient les critères d’arrêt prédéfinis: une perte de poids atteignant ou dépassant 10 % du poids initial traduisant une détresse métabolique et déshydratation, des altérations faciales (score de grimace modifié) révélant une souffrance douloureuse non contrôlée, un pelage hirsute témoignant d’une défaillance de régulation de la température corporelle ou nutritionnelle, et un retrait comportemental caractéristique d’une anxiété ou d’une détresse physiologique majeure.

Devenir

À l’issue de chaque procédure, les animaux seront systématiquement euthanasiés. Aucune réutilisation ne sera envisagée, afin de garantir à la fois leur bien-être et l’absence de biais expérimental liés aux procédures déjà subies.

Remplacement

Plusieurs approches alternatives existent dans le domaine de l’audition, notamment les cultures cellulaires, les organoïdes, les modèles tissulaires ex vivo et les outils de modélisation informatique. Ces approches ne permettent pas de reproduire l’organisation multi-échelle et la dynamique fonctionnelle du système auditif. Les modèles cellulaires, tissulaires et organoïdes auditifs, ne permettent pas encore de simuler la complexité anatomique et physiologique du système auditif complet, ni de prendre en compte les réponses comportementales ou l’intégration corticale des sons. Quant aux modèles informatiques ou mathématiques, ils reposent sur des simplifications nécessaires qui ne capturent pas la totalité des processus physiopathologiques ni les réponses de l’organisme dans son ensemble. Ainsi, bien que ces alternatives contribuent à améliorer nos connaissances, elles ne suffisent pas à répondre aux objectifs visant à étudier le fonctionnement global du système auditif, l’évolution des atteintes auditives et l’évaluation de stratégies thérapeutiques dans un contexte physiologique réaliste. Dans ce cadre, l’utilisation d’animaux vivants demeure indispensable. Elle permet de travailler dans un environnement anatomique et biologique complet, de prendre en compte la variabilité interindividuelle et d’évaluer à la fois les réponses physiologiques et comportementales aux stimulations sonores ou aux traitements. La souris est particulièrement adaptée à ces recherches : son système auditif est proche de celui de l’homme, tant au niveau de l’organisation cellulaire et moléculaire que des mécanismes de transduction et de plasticité neuronale. De plus, la disponibilité de nombreuses lignées génétiquement modifiées permet d’explorer le rôle de gènes impliqués dans les surdités humaines, tandis que la rapidité de son cycle de vie et la standardisation des protocoles garantissent la reproductibilité et la robustesse des résultats.

Réduction

La stratégie expérimentale retenue pour ce projet a été conçue de manière à limiter au maximum l’utilisation d’animaux, tout en assurant la robustesse scientifique et la fiabilité des résultats. Le nombre d’animaux prévu a été déterminé à partir d’une analyse de puissance statistique. Nous utilisons la méthode adaptée aux données appariées. Cette approche permet d’estimer un effectif compris entre 10 et 15 animaux par groupe selon les procédures, garantissant un dimensionnement précis et évitant aussi bien la sous-utilisation que la surutilisation d’animaux. Tout au long du projet, l’inclusion des deux sexes est prévue afin d’éviter de multiplier les expérimentations futures et d’assurer la représentativité des résultats. L’ensemble des protocoles est conçu pour minimiser le stress et la souffrance des animaux, conformément au principe de raffinement, ce qui contribue également à obtenir des données de meilleure qualité.

Raffinement

Ce projet ne concerne que des procédures dont la mise en œuvre ne devrait se traduire ni par une dégradation de l’état de santé de l’animal ni par des douleurs importantes. Si nous observions un comportement anormal en termes de santé (perte de poids, du pelage, etc.) dès l’initiation de l’intégration dans un groupe expérimental, l’animal serait immédiatement pris en charge. Selon la situation, des soins appropriés seront apportés (ajout du gel nutritif, maintien au chaud, soins locaux). Si nécessaire, une mise à mort sera effectuée afin d’éviter toute souffrance. L’emploi d’analgésiques et d’anesthésie sera systématique tout comme l’application d’un gel ophtalmique lors des chirurgies de souris adultes. Les animaux anesthésiés seront gardés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet puis remis dans une cage propre et pourvue d’une coupelle de gel nutritif hydratant. Les animaux opérés seront auscultés et pesés tous les jours par l’expérimentateur pendant une semaine détecter et traiter les éventuels signes d’inconfort sur la base d’observations cliniques établies.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies pour ce projet en raison de leurs caractéristiques biologiques et comportementales qui permettent d’étudier de manière fiable les fonctions auditives et les réponses aux stimulations sonores. Leur petite taille, leur cycle de vie relativement court et la grande connaissance scientifique accumulée sur cette espèce facilitent la planification des suivis longitudinaux et le développement de méthodes reproductibles. Les souris utilisées dans ce projet auront entre 4 semaines et 5 mois. Elles seront assez âgées pour que l’audition soit pleinement développée, mais suffisamment jeunes pour que les fonctions auditives restent intactes et que les tests soient réalisables. Cela permet d’obtenir des résultats précis sur l’impact du bruit sur l’audition.

Jusqu'à quarante séances comportementales par animal, cinq par semaine pendant huit semaines, dont une qui dure quatre heures. 540 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour vérifier la position des implants et analyser leur cerveau. Avant cela, les souriceaux sont brièvement séparés de leur mère pour une biopsie de l'oreille destinée au génotypage, puis chaque animal subit une chirurgie cérébrale d'une heure sous anesthésie profonde, le projet portant sur les effets aversifs des opiacés et la rechute. Le porteur justifie le choix de l'espèce par une lignée transgénique disponible seulement chez la souris et affirme qu'aucun autre animal ne permet une manipulation aussi précise de la zone cérébrale visée.

Objectifs

Le noyau tegmental rostromédian (RMTg) est une région du cerveau qui agit comme un frein naturel sur les neurones impliqués dans le circuit de la récompense. Ce circuit joue un rôle clé dans la manière dont nous ressentons le plaisir et la motivation, ainsi que dans la dépendance aux substances comme les opiacés. Jusqu’à récemment, il était difficile d’étudier cette région spécifiquement car il manquait d’outils précis. La découverte d’un marqueur génétique particulier, a permis de développer une lignée spéciale de souris qui permet une manipulation ciblée du noyau tegmental rostromédian. Notre projet cherche à mieux comprendre comment le noyau tegmental rostromédian régule l’équilibre entre sensations agréables et désagréables, influence les comportements addictifs, et agit sur la dopamine, une substance chimique clé du cerveau. Nous utiliserons pour cela des techniques innovantes permettant d’activer ou d’inhiber sélectivement les neurones du noyau tegmental rostromédian et d’observer les effets sur le comportement des souris. Ces recherches ouvriront de nouvelles pistes pour traiter les addictions en visant directement cette région du cerveau.

Bénéfices attendus

À l'issue de ce projet, nous espérons mieux comprendre le rôle du noyau tegmental rostromédian (RMTg) dans les comportements de type addictif et identifier un candidat clinique capable de réduire de manière significative les comportements addictifs sans compromettre les effets analgésiques de la morphine. Enfin de compte, ce programme de recherche débouchera sur une meilleure connaissance du noyau tegmental rostromédian (RMTg) et des potentiels cibles thérapeutique pour le traitement des troubles de l'usage des opiacés et d'autres troubles liés à l'utilisation de drogues d'abus.

Procédures

Une biopsie de l’oreille sur animal vigile pour permettre le génotypage des animaux transgéniques (1/2 minute). Une chirurgie unique sur animaux anesthésiés profondément (1 heure). D'un à 40 tests comportementaux de 6 minutes à une heure (avec un minimum de 24 heures entre chaque test)réparti comme suit : 5 sessions comportementales par semaine seront réalisées pendant 8 semaines (2 jours de repos par semaine), les sessions seront limitées à 60 minutes, sauf pour une session qui sera limité à 4 heures, après un délais de 4 semaines après la chirurgie.

Impact sur les animaux

Un stress induit par la séparation brève souriceaux/ mère, et une douleur légère due à la biopsie (durée 1heure). -Chirurgie : Après la chirurgie, Il existe aussi un risque d’inflammation de la plaie, d’infection et de douleur post-opératoire (durée 48 heures). -Tests : les tests comportementaux choisis ne posent aucun risque corporel pour l’animal. Les animaux peuvent également présenter des états de stress en lien avec les expérimentations (durée 24 heures).

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de verifier l'emplacement des implants quand cela est nécéssaire et pour faire des analyses moléculaire sur les cerveaux.

Remplacement

Ce projet étudie une zone du cerveau appelée le noyau tegmental rostromédian, ou RMTg, qui joue un rôle important dans les comportements liés à la dépendance aux substances. Pour mieux comprendre ses fonctions, nous utilisons des souris comme modèle, car leur cerveau reproduit la complexité du cerveau humain, notamment les nombreuses interactions entre différentes régions cérébrales. Les modèles en laboratoire faits uniquement de cellules ne permettent pas d’étudier les comportements ni les interactions complexes entre les régions du cerveau. L’addiction agit justement sur ces réseaux neuronaux complexes, ce qui rend indispensable l’étude d’animaux vivants entiers pour mieux comprendre ses mécanismes. C’est pourquoi notre projet se concentre sur des organismes vivants afin de mieux cerner ces effets.

Réduction

Dans ce projet, nous utilisons le nombre minimum de souris nécessaire pour obtenir des résultats fiables, en tenant compte des différences naturelles entre les individus. Chaque groupe expérimental sera composé de 15 souris mâles et 15 femelles afin de pouvoir comparer les deux sexes. Même si cela double le nombre d’animaux, il est important d’étudier ces différences car la dépendance aux opiacés touche les hommes et les femmes de façon différente, et nous voulons mieux comprendre pourquoi. Cette approche permet aussi de valoriser pleinement tous les animaux issus de la reproduction. Les résultats seront analysés avec des méthodes statistiques reconnues pour bien interpréter les effets observés.

Raffinement

Raffiner" : Nous avons choisi d’utiliser des protocoles expérimentaux qui minimisent au maximum l’inconfort des animaux tout en permettant néanmoins d’étudier les propriétés aversives des opiacés. Les conditions d’hébergement sont optimisées en fonction des comportements naturels des rongeurs. Enfin, lors de la réalisation de procédures chirurgicales, les animaux seront sous anesthésie générale profonde avec analgésie per et postopératoire (anesthésique local autour du site de chirurgie et traitement par un anti- inflammatoire non stéroïdien), et maintien de la température corporelle.De plus, des points limites seront déterminés avant et après les procédures chirurgicales afin d’apporter un suivi individuel à chaque animal permettant de limiter ou arrêter la souffrance de l’animal. . Du gel ophtalmique sera mis sur les yeux pendant la chirurgie, de plus les souris seront maintenues à la température corporelle par un tapis chauffant pendant toute la chirurgie et la phase de réveil. Avant de commencer les expérimentations les animaux seront habitués à l’opérateur, à la manipulation et aux dispositifs expérimentaux, pour réduire leur stress.

Choix des espèces

Nous utilisons la souris car c’est aujourd’hui l’animal de laboratoire le plus courant pour étudier de nombreuses maladies grâce à la connaissance de son génome. La souris permet aussi de créer des lignées génétiquement modifiées, ce qui signifie que l’on peut changer un gène précis ou cibler certains neurones spécifiques. Pour notre étude, nous utilisons une souche spéciale, qui est uniquement disponible chez la souris. Ces souris, âgées de 8 semaines, nous permettent de manipuler uniquement les neurones d’une zone précise du cerveau, le RMTg, qui joue un rôle important dans la dépendance. Aucun autre animal ne permet d’utiliser cette technique aussi précise pour étudier les comportements liés à l’addiction. Nous choisissons des souris adultes de 8 semaines car les comportements complexes que nous voulons étudier nécessitent un cerveau mature. Pour ce projet, des animaux adultes, âgés de 8 semaines au début de l’expérience, seront utilisés puisque l’étude repose sur l’exploration de comportements complexes qui nécessitent des systèmes neurobiologiques matures.

Vingt-six semaines de régime gras et enrichi en cholestérol, puis cinq injections quotidiennes pour déclencher un diabète, avant d'être tuées sous anesthésie sans réveil pour le prélèvement de leur aorte ou d'un rein : c'est le parcours des souris donneuses de greffon. Les receveuses sont opérées de quarante-cinq à soixante minutes pour recevoir ce greffon, subissent une néphrectomie, jusqu'à soixante injections d'inhibiteurs et des prélèvements sanguins hebdomadaires à la lancette dans la joue, puis vivent seules en cage pour qu'elles ne rongent pas leurs sutures. 5 742 souris vont être utilisées au total dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, le porteur retenant surtout des mâles, "plus faciles à opérer du fait de leur grande taille", et comptant 10 % de mortalité périopératoire. Toutes sont tuées, les donneuses pour livrer leur organe, les receveuses pour l'analyse du greffon, du sang et des cellules immunitaires.

Objectifs

La transplantation d’organes est le traitement de référence en cas de défaillance chronique terminale d’un organe vital (rein, cœur, poumon, foie). Malgré le recours aux traitements immunosuppresseurs, la dysfonction chronique du greffon, se manifestant à partir d’un an après transplantation, demeure un problème médical majeur, limitant la longévité du greffon ainsi que la qualité et l’espérance de vie des patients transplantés. La vasculopathie de transplantation (VT) est une lésion fréquemment observée après la greffe, qui se traduit par une sténose des vaisseaux sanguins du greffon, entraînant un défaut d'approvisionnement en sang. Les signatures histologiques de la VT se retrouvent particulièrement dans le coeur et le rein greffés : dans 10-50 % des cas plus d’un an après la greffe rénale et avec une prévalence de 40 % 8 ans après transplantation cardiaque. La sévérité de la VT est notamment associée aux facteurs de risque cardiovasculaires classiques, dont le diabète. Ainsi plusieurs larges études récentes réalisées entre 1995 et 2019 et regroupant les données de plus de 200 000 patients, démontrent que les greffons rénaux provenant de donneurs diabétiques présentent une survie diminuée par rapport aux donneurs non diabétiques. Sachant qu’en 2045, 46 % de la population, donc des donneurs potentiels, sera diabétique, il est primordial de comprendre les mécanismes sous-jacents à la dysfonction des organes greffés issus de donneurs diabétiques. Ceci permettra d’augmenter le taux d’acceptation de ce type de greffons, ce qui élargira le pool de greffons disponibles et permettra de mieux prendre en charge les patients greffés avec des organes de diabétiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'identifier des nouvelles cibles thérapeutiques pertinentes et efficaces pour prévenir le développement de la vasculopathie de transplantation, notamment lorsque les patients reçoivent un organe issu de donneur diabétique. Ceci permettra de rendre l’utilisation d’organes donneurs diabétiques plus sûre, et donc à la fois de diminuer le temps passé sur liste d’attente pour un greffon, et d’augmenter la qualité et la durée de vie des patients transplantés avec des greffons diabétiques.

Procédures

Tout ou partie des animaux enrolés dans les procédures seront soumis: 1/un régime enrichis en gras et cholestérol pendant 26 semaines 2/une chirurgie sans réveil : prélèvement du greffon aortique (30 min) 3/ une chirurgie avec réveil : implantation du greffon aortique (45 min) 4/ une chirurgie sans réveil : prélèvement du greffon rénal (45 min) 5/ une chirurgie avec réveil : implantation du greffon rénal (60 min) 6/des injections tous les jours pour induire un diabète (5 jours, 5 injections, durée: 30 sec) 7/ des injections tous les jours pour induire un diabète (2 jours, 2 injections, durée: 30 sec) 8/ des injections d'inhibiteurs de cibles thérapeutiques (15 jours, 15 injections, durée : 30 sec ou 1 mois, 30 injections, durée : 30 sec ou 2 mois, 60 injections, durée : 30 sec) 9/ des prélèvements sanguins sur le donneur de greffon (7 fois en 26 semaines, ou 6 fois en 6 semaines, durée : 5 sec) 10/ des prélèvements sanguins sur l'animal greffé (6 fois en 2 mois, durée : 30 sec) 10/un prélèvement sanguin le jour de la mise à mort sur animal anesthésié (durée: 1 min).

Impact sur les animaux

L’implantation du greffon aortique ou rénal (durées de la chirurgie : respectivement 45 et 60 min) ou la néphrectomie (15 min) sont des procédures de gravité modérée qui doivent être exécutées avec une technicité sans faille et dans le temps imparti afin d’éviter des complications, dont le décès périopératoire ou la douleur et le mal-être postopératoires. Les chirurgies peuvent entraîner une hypothermie (max. 12h) et une douleur post-opératoire (en général moins de 24h et max. 5 jours). Une perte de poids légère peut survenir après la chirurgie. La chirurgie peut causer un stress (max. 3 jours), et les points de suture sont un danger potentiel en cas de contact avec les pairs. Le prélèvement sanguin à la veine mandibulaire à l’aide d’une lancette de 5mm effectué de manière hebdomadaire pour les souris transplantées rénales entraîne une douleur légère et de courte durée.

Devenir

Les animaux donneurs de greffon sont mis à mort pour le prélèvement de leur greffon aortique ou rénal, utilisé pour être implanté aux animaux receveurs. Les animaux receveurs de greffon sont mis à mort pour analyse de la vasculopathie de transplantation sous l'impact du diabète du receveur, en combinaison ou non avec différents traitements ou modifications génétiques. Seront analysés les greffons ainsi que le sang et les cellules immunitaires des souris receveuses de greffon.

Remplacement

Notre équipe développe des modèles 2D et 3D de vaisseaux sanguins afin d’analyser et de modéliser les structures des artères, afin d’éviter d’avoir recours à des animaux quand cela est possible. Cependant, la vasculopathie de transplantation est un contexte pathologique complexe faisant intervenir plusieurs types cellulaires de la paroi vasculaire, le microenvironnement rénal, ainsi que des facteurs circulants, en particulier les cellules immunitaires. De ce fait, les mécanismes étudiés ne sont pas toujours modélisables in vitro, le recours aux modèles animaux est donc nécessaire et indispensable. De plus, dans notre contexte d’étude, une transplantation d’organes in vivo est la seule approche expérimentale permettant de mimer la transplantation d’organes chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au maximum, en respectant les exigences des publications, sans nuire aux objectifs du projet et en garantissant des analyses statistiques de qualité . Par ailleurs, les expérimentations ont été optimisées de manière à regrouper les analyses sur un même animal chaque fois que cela est possible. Des groupes de 11 animaux sont requis pour obtenir une distribution normale, compenser la variabilité entre individus et tenir compte de la mortalité périopératoire (10%). La plupart des manipulations seront réalisées sur des souris mâles, plus faciles à opérer du fait de leur grande taille, et seuls les résultats les plus porteurs (espoir d’une nouvelle thérapie etc) seront validés sur des groupes de souris femelles. La transplantation rénale, plus lourde que la transplantation aortique, ne sera utilisée que pour la preuve de concept des résultats obtenus avec les transplantations aortiques. Le choix du groupe contrôle a été réfléchi afin de pouvoir le comparer à plusieurs groupes expérimentaux. Enfin, les tissus non prélevés chez l’animal pourront être récupérés par d’autres membres de l’équipe ou de l’institut pour optimiser la nécessité d’une mise à mort d’un animal.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages ventilées conformes aux normes de la directive 2010/63/EU, avec un enrichissement approprié (igloo, bâtonnets de bois, coton, sizzle nest) et un statut sanitaire sans pathogène fixe, contrôlé tous les trimestres. Les souris receveuses ayant reçu une greffe d’organe sont hébergées de manière individuelle afin d’éviter les accidents potentiels (grignotage des points de suture, compétition pour la nourriture). Des méthodes alternatives à la préhension par la queue sont mises en place. Les protocoles d’anesthésie utilisés lors des chirurgies sont éprouvés par notre équipe et ont été réfléchis en concertation étroite avec le vétérinaire. Ils garantissent la narcose, la myorelaxation et l’analgésie de manière stable. En particulier, un anti-douleur fort (opioïde de palier 3), agit au niveau de la moelle épinière et du cerveau, ce qui permet d’interférer à plusieurs niveaux du trajet de la nociception. Le cocktail anesthésique est antagonisé chez la souris receveuse à la fin de la chirurgie afin d’éviter le développement de l’hypothermie ou autres effets indésirables dus à une anesthésie trop longue (dépression respiratoire, cardiaque). A ce moment-là, une administration d'anti-douleur avec un temps d'action long prend le relais. Le personnel de zootechnie suit les animaux au quotidien et utilise une grille de scoring validé par la structure chargée du bien-être des animaux. Si un animal présente des signes cliniques comme la perte de poids, la prostration ou des blessures, l’état général pourra être évalué par la structure chargée du bien-être des animaux et le vétérinaire désigné pour décider des soins à mettre en place pour réduire le stress, la douleur, l’incofort de l’animal. Si l’état est jugé négatif, l’animal sera sorti de l’étude et mis à mort. Les procédures de mise à mort sont réalisées sous anesthésie et analgésie afin de diminuer au maximum la douleur des animaux. Des molécules analgésiques sont administrées en post-opératoire suite à la chirurgie et sont étendues jusqu’à 5 jours, jusqu’à rétablissement complet de l’animal. Des suppléments nutritionnels sont donnés aux animaux post-chirurgie pour faciliter l’accès à la nourriture et éviter une perte de poids. Si l’hyperglycémie des souris donneuses induit une diurèse plus fréquente, les litières seront changées plus fréquemment pour que les animaux aient un environnement propice au bien-être.

Choix des espèces

La souris est le seul modèle expérimental pour lequel il existe des animaux génétiquement modifiés pour lesdifférentes cibles thérapeutiques étudiées dans ce projet. Du fait de sa petite taille et de son cycle de reproduction rapide, la production de générations successives facilite la mise en œuvre des protocoles expérimentaux. La souris possède également des paramètres physiologiques similaires à ceux de l'Homme, ce qui en fait un modèle privilégié pour l'étude des pathologies chroniques, en particulier consécutives à la transplantation d’organes. Les animaux enrôlés dans les procédures seront âgés de 7 à 35 semaines. Il est nécessaire d’utiliser des animaux adultes avec un système vasculaire mature, donc des animaux de plus de 7 semaines. Dans la plupart des cas, les animaux utilisés auront entre 7 et 12 semaines, donc des jeunes adultes, ce qui permet de ne pas tenir compte du vieillissement. Lorsque les animaux donneurs de greffons seront soumis au protocole d’induction du diabète impliquant une mise sous régime spécial, ils seront utilisés à 33-35 semaines car leur régime alimentaire de type western diet dure 26 semaines.

Les souris qui perdent 15 % de leur poids, cessent de s'alimenter plus de vingt-quatre heures ou deviennent apathiques sont retirées de l'étude et tuées par dislocation cervicale. 106 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs tissus. Certaines subissent une inoculation de bactéries directement dans une dent, refermée ensuite, sous anesthésie générale, d'autres un badigeonnage de la bouche cinq fois par semaine pendant cinq semaines, et une partie une chirurgie de réduction de l'estomac de trente à quarante-cinq minutes, avec un régime riche en graisses et des ponctions répétées à la veine de la queue. Les retombées annoncées, des tests salivaires et une médecine personnalisée pour les personnes obèses ou diabétiques, sont renvoyées au long terme, alors que la chirurgie de l'estomac et l'infection dentaire sont, elles, immédiates.

Objectifs

L’objectif principal de ce projet est d’étudier le rôle du microbiote oral dans l’aggravation des maladies cardiométaboliques et d’évaluer son influence sur la réponse au traitement chirurgical de l’obésité. Des données récentes suggèrent que la translocation bactérienne depuis la cavité buccale pourrait influencer la physiopathologie de pathologies telles que l’obésité, l’hypertension artérielle et le diabète de type 2. Ce projet propose une approche intégrée combinant modèle murin d’obésité, dysbiose orale induite et chirurgie bariatrique pour explorer ces interactions. Les objectifs spécifiques sont : • Analyser la composition et la dynamique du microbiote oral dans un contexte d’obésité induite par un régime riche en graisses. • Évaluer l’impact d’une dysbiose orale sur l’inflammation systémique et la régulation glucidique, en lien avec les paramètres métaboliques majeurs. • Étudier l’influence du microbiote oral sur l’efficacité métabolique de la chirurgie bariatrique, notamment sur la perte de poids et l’amélioration de la tolérance au glucose.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des avancées significatives dans la compréhension du rôle du microbiote oral dans les maladies cardiométaboliques, en explorant ses interactions avec l’inflammation systémique, la régulation glycémique et la réponse métabolique à la chirurgie bariatrique. À court terme, il fournira des données inédites sur l’impact d’une dysbiose orale sur la prise de poids, la tolérance au glucose et l’inflammation dans un contexte d’obésité induite par régime riche en graisses. L’intégration de la chirurgie bariatrique dans le protocole permettra d’évaluer l’influence du microbiote oral sur la variabilité interindividuelle des résultats post-opératoires. Grâce aux approches métagénomiques et métabolomiques, ce projet vise à identifier : • des signatures microbiennes spécifiques corrélées à l’aggravation des troubles métaboliques, • des biomarqueurs prédictifs de la réponse à la chirurgie. Ces connaissances permettront d’évaluer la pertinence du microbiote oral comme biomarqueur des complications métaboliques et ouvriront la voie à des stratégies de modulation ciblée (probiotiques, traitements antimicrobiens, hygiène bucco-dentaire optimisée). À long terme, ces données pourraient contribuer au développement d’outils diagnostiques non invasifs (tests salivaires) et à une médecine personnalisée, améliorant la prise en charge des patients obèses ou diabétiques

Procédures

Pendant l’étude, les souris subiront : • Colonisation buccale : -Option 1 – Badigeonnage buccal : application locale sur les joues et dents, 5 fois/semaine pendant 5 semaines (durée : 1 à 2 minutes par animal). -Option 2 – Inoculation intra-dentaire : acte unique sous anesthésie générale avec fermeture de la dent (durée : 10 à 15 minutes par animal). • Prélèvements sanguins : réalisés une fois par semaine (durée : 1 à 2 minutes par animal). • Prélèvements de salive : réalisés une fois par semaine (durée : 1 minute). • Mesures du poids : deux à trois fois par semaine (durée : moins d’1 minute par animal). • Tests de glycémie : plusieurs fois pendant l’étude, notamment avant et après certains tests (durée : 1 à 2 minutes par mesure). • Chirurgie gastrique (pour certains groupes) : réalisée sous anesthésie complète (durée : 30 à 45 minutes par animal).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues concernent principalement les interventions expérimentales et leur suivi : • Manipulations répétées (prise de poids, prélèvements sanguins) : induisent un stress modéré et une contention brève (quelques minutes), pouvant générer une anxiété transitoire (quelques minutes). • Administration orale (inoculation microbiote) : inconfort léger lors des instillations de l’inoculum bactérien, sans effets prolongés (quelques minutes) car acclimatation au geste au préalable et sans anesthésie générale. • Tests de tolérance au glucose (IPGTT) : ponctions répétées à la veine caudale, risque mineur d’hématome ou douleur locale, résolutifs en quelques heures. • Chirurgie bariatrique : Inconfort, voir douleur légère en phase postopératoire immédiate (24–72 h). Risques associés : perte de poids excessive, ralentissement de la reprise alimentaire, déshydratation. • Prélèvements terminaux : réalisés sous anesthésie profonde, sans douleur pour l’animal. • Régime gras prolongé : peut induire une diminution de mobilité et une surcharge pondérale, sans souffrance directe. Tous les animaux feront l’objet d’un suivi clinique renforcé et de points limites prédéfinis, afin d’interrompre ou adapter les procédures en cas de signes de détresse (perte de poids ≥15 %, apathie, altération de la prise alimentaire). En cas d’atteinte des points limites l’animal sera mis à mort par dislocation cervicale.

Devenir

Les analyses prévues (tissus et organes) ne peuvent être réalisées que sur des animaux euthanasiés, afin de répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Remplacement

Actuellement, aucune méthode in vitro ou in silico ne permet de reproduire de manière fiable la complexité des interactions entre microbiote oral, système immunitaire et métabolisme de l’hôte dans un contexte d’obésité et de chirurgie bariatrique. Les raisons principales sont : • Absence de modèles alternatifs intégratifs : les cultures cellulaires ou organoïdes ne permettent pas de simuler la circulation systémique, la translocation bactérienne et la réponse immuno-inflammatoire à l’échelle de l’organisme. • Complexité des interactions microbiote-hôte : la composition et la dynamique du microbiote dépendent de facteurs multiples (alimentation, état inflammatoire, chirurgie) qui ne peuvent être reproduits que dans un organisme vivant. • Objectifs du projet : évaluer l’impact d’une dysbiose orale sur la régulation glycémique, l’inflammation et la réponse métabolique à une chirurgie bariatrique nécessite une approche intégrée impliquant plusieurs organes et systèmes physiologiques. En conséquence, le recours à un modèle animal est indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. Les données obtenues serviront toutefois à alimenter des modèles prédictifs in silico, qui pourraient, à terme, réduire l’utilisation d’animaux dans ce domaine.

Réduction

Le nombre d’animaux a été défini à partir : • d’un calcul de puissance statistique fondé sur les données de variabilité issues de notre étude pilote (et complétées par notre expérience en nutrition expérimentale. Ce calcul indique qu’au moins 10 animaux par groupe sont nécessaires pour détecter une différence significative sur les paramètres métaboliques (glycémie, inflammation systémique). • d’une marge de 10 % pour anticiper les pertes (points limites, complications postopératoires). Ainsi, nous retiendrons 12 animaux par groupe, pour un total de 105 animaux répartis en 4 groupes expérimentaux, ce qui assure la robustesse des résultats tout en respectant la règle des 3R. Mesures mises en œuvre pour réduire l’utilisation des animaux : • Suivi longitudinal des mêmes individus pour réaliser plusieurs mesures (poids, glycémie, prélèvements biologiques), réduisant le besoin de groupes supplémentaires. • Analyses multi-omiques sur les mêmes échantillons (métagénomique, métabolomique, marqueurs inflammatoires) pour maximiser l’information par individu. • Utilisation des données existantes et comparaisons avec des cohortes antérieures (approches de modélisation in silico en cours de développement), afin de limiter le recours à des expérimentations répétées. Ces pratiques garantissent que le nombre d’animaux est limité au strict nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques, tout en assurant une puissance statistique suffisante pour des résultats interprétables.

Raffinement

Afin de limiter la douleur, le stress et les complications, plusieurs mesures spécifiques seront mises en place en plus des obligations réglementaires : Gestion de la douleur et anesthésie • Utilisation systématique d’une anesthésie générale à l’isoflurane pour toute procédure invasive (inoculation orale sous sédation légère, chirurgie bariatrique). • Mise en place d’une analgésie multimodale pendant 3 jours après la chirurgie. • Surveillance renforcée des signes de douleur (score clinique) avec adaptation du traitement si nécessaire. Soins postopératoires et surveillance accrue • Suivi clinique biquotidien pendant les 72 heures postopératoires, puis quotidien jusqu’à cicatrisation complète. • Maintien sur tapis chauffant en phase de réveil et mise à disposition de gel oculaire pour prévenir les lésions cornéennes. • Mise à disposition d’une alimentation enrichie (gel diet) et eau gélifiée pour favoriser la reprise alimentaire. • Réhydratation sous- cutanée (deux fois par jour) si signes de déshydratation ou perte de poids postopératoire. Surveillance du poids et critères d’arrêt • Pesée au minimum 2 à 3 fois par semaine pendant toute la durée du protocole (au lieu d’une fois toutes les deux semaines). • Points limites précoces : retrait de l’étude si perte de poids ≥15 % par rapport au poids initial, altération de la mobilité, anorexie >24 h. Autres mesures de raffinement • Hébergement en groupes homogènes (même sexe) pour éviter les conflits. • Utilisation d’isolateurs ventilés (IVC) pour réduire le risque infectieux, notamment chez les souris transgénique à déficit immun. • Manipulations réalisées en poste de sécurité microbiologique (PSM) pour limiter le stress et garantir l’asepsie. • Aucun transport inter-établissement. Outils d’évaluation • Application d’une grille d’évaluation clinique incluant score de douleur, état du pelage, posture, activité et hydratation, pour ajuster les soins et déclencher les points limites. Ces mesures permettent de réduire la douleur et le stress, d’assurer une récupération rapide après chirurgie et de maintenir un haut niveau de bien-être tout au long du protocole expérimental.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce la plus pertinente pour ce projet car : •Microbiote comparable à celui de l’Homme : le microbiote intestinal et buccal de la souris présente une composition et une diversité proches de celles observées chez l’Homme, permettant des études translationnelles fiables. •Contrôle des variables expérimentales : la souris offre des conditions expérimentales homogènes (statut génétique, alimentation, environnement), indispensables pour analyser l’impact spécifique du microbiote oral sur les paramètres métaboliques et la réponse à la chirurgie bariatrique. •Adaptation aux approches multi-omiques : la taille de l’animal permet la réalisation de prélèvements biologiques et tissulaires multiples (sang, salive, organes), nécessaires pour les analyses métagénomiques, métabolomiques et immunologiques prévues. L’étude sur ces espèces permettra de comparer un contexte immunocompétent et un contexte d’immunité adaptative altérée, garantissant la robustesse des conclusions sur le rôle des réponses immunitaires dans les interactions microbiote/métabolisme.