Recherche fondamentale

300 souris vont être utilisées, chacune opérée une fois sous anesthésie pour une ouverture de la boîte crânienne et une injection dans le cerveau, l'intervention durant environ quatre-vingt-dix minutes. Trois semaines plus tard, elles sont tuées et leur cerveau prélevé, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur relève les risques d'hypothermie, d'arrêt cardio-respiratoire sous anesthésie, de douleur postopératoire et de perte de poids rapide, et attend de cette recherche fondamentale sur un noyau du thalamus des données qu'il présente comme utiles à la compréhension de troubles psychiatriques. Cette version du projet demande 50 souris de plus que la précédente, alors qu'il affirme utiliser mâles et femelles pour éviter d'en tuer inutilement.

Objectifs

Le thalamus, porte d'entrée du cortex, est constitué d’un ensemble de structures subdivisées sur des critères anatomiques en deux catégories : les noyaux de premier ordre et les noyaux d’ordre supérieur. Les noyaux thalamiques de premier ordre ont fait l’objet de nombreuses études. Les relations entre les neurones de ces noyaux et les autres structures cérébrales ont été bien décrites et leurs rôles dans le traitement des informations, en particulier sensorielles, sont en partie établis. En revanche, l’organisation anatomique et les fonctions des noyaux d’ordre supérieur sont très mal connues. Les neurones de ces noyaux reçoivent des informations excitatrices et inhibitrices issues de nombreuses régions cérébrales mais la manière dont ces différentes entrées sont distribuées au niveau de la cellule thalamique unique et comment elles interagissent sont à ce jour inconnues. Centré sur un noyau d’ordre supérieur lié au système somatosensoriel, le noyau postérieur médian, notre projet vise à comprendre comment ces diverses informations sont intégrées par le neurone thalamique pour aboutir à un traitement complexe sensorimotreur. MODIFICATION Afin de répondre aux objectifs scientifiques sans modifier les actes mis en œuvre, ce projet nécessite une demande de modification en cours de réalisation, impliquant une augmentation du nombre d’animaux (50 animaux supplémentaires). MODIFICATION

Bénéfices attendus

Le thalamus est une structure sous-corticale par laquelle transitent la plupart des circuits neuronaux de notre cerveau ; elle établit de multiples connexions avec les régions corticales, sous-corticales et cérébelleuses. En tant que nœud de ce vaste système, le thalamus joue un rôle central dans le traitement des données sensorielles et constitue une plaque tournante essentielle pour le traitement cognitif, tel que mise en œuvre dans la mémoire de travail, l'attention ou pendant le sommeil. Des anomalies dans le système de connectivité thalamique ont été décrites chez les patients atteints de schizophrénie, de troubles bipolaires, de troubles dépressifs majeurs et de troubles du spectre autistique. De récentes données de neuro-imagerie proposent que des altérations de la circuiterie thalamique pourraient contribuer aux symptômes et aux déficits présents chez des patients psychiatriques. L’étude de la circuiterie thalamique aurait donc une grande utilité translationnelle et transdiagnostique mais les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à ces altérations sont peu connus. En étudiant de manière précise comment s’organise d’un point de vue fonctionnel la circuiterie thalamique, ce projet de recherche fondamentale apportera des données cellulaires et moléculaires indispensables pour répondre à ce type de question.

Procédures

Toutes les souris du projet recevront sous analgésie et anesthésie générale des injections intracérébrales afin de faire exprimer des protéines fluorescentes dans des régions spécifiques du cerveau par des techniques de biologie moléculaire. Chaque souris est opérée une fois et l'ensemble de la procédure chirurgicale, de l'induction au réveil de la souris, dure environ 90 minutes. Trois semaines après injection les protéines fluorescentes sont exprimées dans les neurones. Les souris sont alors euthanasiées sous anesthésie générale sans réveil et le cerveau est prélevé soit dans le but d'effectuer des études anatomiques, soit pour étudier les propriétés fonctionnelles des régions cérébrales d'intérêt, comme par exemple d'analyser le fonctionnement des réseaux de neurones.

Impact sur les animaux

Dans de ce projet, nous pratiquerons sur les animaux des chirurgies sous analgésie et anesthésie générale pendant lesquelles une ouverture de la boîte crânienne est réalisée afin de procéder à des injections dans une région cérébrale donnée. Les éventuels nuisances et effets indésirables à court et à long terme liés à cette chirurgie sont : i) une hypothermie, ii) un arrêt cardio-respiratoire liée à l’anesthésie, III) une douleur post-opératoire se traduisant par une apparence, une position et des comportements anormaux et iv) une perte de poids rapide.

Devenir

Toutes les souris sont euthanasiées environ 3 semaines après les injections intracérébrales. Les cerveaux sont ensuite prélevés soit dans le but d'effectuer des études anatomiques, soit pour étudier les propriétés fonctionnelles des régions cérébrales d'intérêt.

Remplacement

La complexité inhérente du cerveau impose l'utilisation de modèles animaux. Ainsi, l’étude du fonctionnement des réseaux synaptiques ne peut être abordée que par des enregistrements effectués dans un cerveau intact ou sur des préparations ex-vivo qui préservent une grande partie de la circuiterie neuronale comme les préparations de tranches de cerveau. Par ailleurs, la variété des techniques de modifications génétiques chez la souris, qui permettent de visualiser ou de cibler spécifiquement des mécanismes cellulaires ou des protéines, fait de cette espèce le modèle animal privilégié. Nous considérons donc le recours à la souris comme guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire pour les différentes procédures afin d’obtenir des résultats fiables a été dimensionné en s’appuyant sur nos études antérieures. L’analyse en continue des résultats nous permettra de limiter le nombre de souris dès que les valeurs moyennes estimées par rapport à notre échantillon seront dans l’intervalle de confiance satisfaisant. 300 souris seront nécessaires. Les animaux mâles et femelles seront utilisés. Cela permet de maximiser l’utilisation des animaux et de ne pas euthanasier inutilement des souris générées dans l’animalerie. Cette démarche s’inscrit donc dans l’esprit de la règle des 3R.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans l’animalerie sous la supervision des soigneurs et du vétérinaire-référent. L’hébergement des animaux est réalisé conformément à la directive européenne 2010-63-EU en terme d’espace et d’environnement. Les souris sont soumises à un cycle de lumière-obscurité dans un environnement à température et hygrométrie contrôlées avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. L’anxiété des animaux est réduite par un maintien en groupe social. Les cages complètes sont changées chaque semaine. Pour l’enrichissement, un nid végétal est placé dans la cage. Après les interventions chirurgicales, le réveil des souris est étroitement surveillé. Afin de faciliter l’hydratation des croquettes humidifiées sont disposées au fond de la cage. Des analgésiques sont administrés pour gérer la douleur post-opératoire. Lorsque le réveil est complet, la souris retourne dans sa cage avec ses congénères. Une surveillance accrue journalière est réalisée pendant 5 jours suivant l’opération afin d’observer les signes potentiels d’un mal-être. Les critères absolus suivants seront observés : i) Apparence et position anormale: poil ébouriffé, perte excessive de poils, dos courbé, yeux enfoncés, couché sur le coté et hypothermie, ii) Comportements anormaux : agressivité soudaine, abattement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit et déshydratation, iii) une perte de poids rapide. Les animaux seront pesés tous les jours pendant 5 jours après le protocole de chirurgie puis 1 fois par semaine, et iv) difficulté respiratoire. Puis une surveillance quotidienne est assurée soit par l’expérimentateur soit par les zootechniciens qui préviennent le responsable du projet en cas d’anomalie. Celui-ci prend alors une décision sur le devenir de cet animal en coordination avec le vétérinaire-référent.

Choix des espèces

Le projet utilise la souris car il s’agit du modèle mammifère de référence pour les approches expérimentales nécessitant des modifications génétiques. La puissance des outils génétiques permettra de connaitre la nature des neurones, par exemple excitatrice ou inhibitrice, et d'étudier comment l'activation de ces neurones contrôle le fonctionnement des réseaux synaptiques. Les injections intracérébrales sont effectuées chez des souris âgées d'environ 6 à 8 semaines afin que le système somatosensoriel soit parfaitement mature. Les expériences anatomiques ou les enregistrements électrophysiologiques sont réalisés 3 à 4 semaines après l'injection de virus pour permettre l’expression des protéines, soit chez des souris âgées de 9 à 12 semaines.

Jusqu'à soixante minutes d'immobilisation par test de sensibilité tactile, chaque semaine : 192 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Ils reçoivent des injections répétées de bortézomib, un anticancéreux qui provoque une neuropathie douloureuse, pour vérifier si un oméga-3 en limite les effets. Le porteur indique que l'induction de cette neuropathie constitue en elle-même une nuisance modérée qu'il juge "indispensable", et suit l'allodynie tactile et thermique, une douleur déclenchée par un stimulus normalement indolore. Le rat est retenu parce que l'équipe a déjà travaillé sur ce modèle et dispose des doses et des durées de traitement.

Objectifs

L’objectif principal de ce projet est d’étudier l'effet d'un oméga-3 sur le mécanisme toxique des neuropathies induites par un anticancéreux utilisé en clinique et d'améliorer la compréhension de l’implication d’une altération de la membrane cellulaire (impliquant aussi bien une modification de la composition en lipides qu’en protéines) dans ce mécanisme.

Bénéfices attendus

Ce projet propose d’étudier de nouvelles cibles thérapeutiques pour prendre en charge ces neuropathies pour lesquelles à ce jour la prise en charge reste très limitée en clinique. Le mécanisme sous-jacent reste encore mal élucidé et l’implication d’un remodelage membranaire potentiellement responsable des neuropathies doit être élucidé.

Procédures

Ce projet reposera sur un modèle de neuropathie chimio-induite (CIPN) chez le rat. Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaires afin d’établir l’apparition de la neuropathie et jusqu’à une semaine après la fin des injections : - évaluation de la sensibilité tactile : durée du test pour un animal de 60 minutes (max). Le test en lui-même est beaucoup plus court, mais cette durée correspond à la durée maximale de mobilisation d’un animal – évaluation de la sensibilité thermique : durée du test pour un animal 5 minutes (max). La mesure de la conduction se fera sur animal sous anesthésie permettant la pose des capteurs au niveau du nerf sciatique (3-5 min max) avant euthanasie.

Impact sur les animaux

L’induction de la CIPN chez l’animal sera une nuisance modérée à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. L’induction du modèle se faisant progressivement sur une semaine, nous pouvons redouter des symptômes notables associés à une altération de son bien-être sur les quelques jours qui suivent cette induction. Les administrations répétées d’anticancéreux peuvent notamment être responsables d’une diminution du gain de poids des animaux (suivi quotidien du poids permettant un ajustement des doses ainsi que du bien-être de nos animaux). A noter que ce type d’étude ayant recours à des tests comportementaux pour suivre la CIPN nécessitent un bon état général des animaux. Un phénotypage des animaux au cours de l’induction de la neuropathie reposera sur l’évaluation des troubles du toucher et de la perception de la température au travers de tests comportementaux rapides et indolores. La mesure de la conduction nerveuse pourra être réalisée sur animal sous anesthésie gazeuse (capteurs cutanés) avant sa mise à mort.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue des expérimentations, après une sédation profonde et rapide. Car l’objectif sera de prélever des échantillons tissulaires du système nerveux central et périphérique afin d’étudier des anomalies retrouvées au niveau des membranes cellulaires aussi bien au niveau de la composition lipidique que protéiques (expression et localisation) pouvant expliquer l’apparition des neuropathies.

Remplacement

Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Néanmoins, des travaux in vitro sont réalisées en parallèle sur une lignée cellulaire. Bien que ces travaux aident à compléter les connaissances sur le mécanisme lié à cette pathologie (notamment au travers de l’étude du stress oxydant), ils ne permettent pas encore d'appréhender la complexité de la physiopathologie de la neuropathie induite par les anticancéreux. Enfin, s'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer et évaluer ces troubles neurotoxiques générés par les anticancéreux au travers de tests comportementaux.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet sera réduit au maximum. Généralement nous travaillons avec des groupes de n=12 animaux. Mais le plus souvent, nous devons fractionner les études en nombre d'animaux plus petits (pour des raisons de faisabilité des tests comportementaux) et avec une approche par bloc de traitement. Cette méthodologie peut permettre de réduire les effectifs d'animaux si par exemple avec n=6 ou 8, les résultats attendus sont significatifs.

Raffinement

Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont eux aussi bien maîtrisés par le personnel technique de notre unité de recherche. Les troubles nociceptifs seront explorés chez l’animal au moyen de tests comportementaux mesurant les seuils d’allodynie tactile ou thermique (stimulus non douloureux perçu comme douloureux), plutôt que des seuils d’hyperalgésie (stimulus douloureux). L’allodynie est un symptôme plus proche de la clinique humaine, et offre une démarche de raffinement et éthique vis-à-vis de l’animal de laboratoire. Le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations d’anticancéreux et permettra de contrôler la tolérance des animaux au traitement anticancéreux. Une grille de score basée sur le comportement de l’animal a été créée pour évaluer son niveau de souffrance et repérer une dégradation trop importante de son état, pouvant conduire à sa mise à mort anticipée.

Choix des espèces

Le rat est habituellement utilisé pour ces travaux portant sur les neuropathies chimio-induites (CIPN). D’autres travails antérieurs de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures ainsi que du modèle de neuropathie chimio-induite (choix des doses et du temps de traitement). Enfin, le rat possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux permettant de confirmer l’induction de la neuropathie. Les animaux auront 5 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 6 semaines au début des expérimentations. L’âge de 6 semaines est communément choisi pour ce type de projet.

Une première chirurgie d'environ quatre-vingt-dix minutes sous anesthésie générale sert à injecter un vecteur viral dans le cerveau, et laisse vingt-quatre à quarante-huit heures de douleur post-opératoire modérée. Vient ensuite une seconde chirurgie de une à six heures, sans réveil, pour enregistrer l'activité des neurones et stimuler ceux qui libèrent de la dopamine. 120 souris vont être utilisées de cette façon, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées au terme de la seconde opération pour des analyses histologiques. Le porteur rattache le projet à une meilleure compréhension, à plus long terme, de la maladie de Parkinson, de l'addiction et du trouble du déficit de l'attention, quand l'objet immédiat reste de décrire un mécanisme de plasticité chez la souris anesthésiée.

Objectifs

Dans ce projet nous explorerons par quels mécanismes la dopamine permet la plasticité neuronale responsable de la mémorisation chez la souris. Pour cela, nous provoquerons la modification des connexions entre neurones de l’hippocampe en stimulant les neurones à dopamine. Après la mise à mort des souris, nous prélèverons des organes pour étudier les modifications moléculaires et cellulaires déclenchées par de cette plasticité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes neurobiologiques de la mémoire chez les mammifères en général et chez l’homme en particulier. Il permettra d’identifier les mécanismes qui font qu’on se souvient de certaines choses et pas d’autres, et à plus long terme de mieux comprendre les troubles cognitifs associés à des dysfonctionements de la transmission dopaminergique, comme par exemple dans la maladie de Parkinson, dans l’addiction ou les désordre neurodéveloppementaux comme le Trouble du Déficit de l'Attention avec ou sans Hyperactivité (TDAH).

Procédures

Les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie générale, une première permettant l’injection d’un vecteur viral durera environ 90 minutes et une seconde pour les enregistrements électrophysiologiques et la stimulation des neurones à dopamine durera de 1 à 6 heures.

Impact sur les animaux

Les animaux seront exposés à deux anesthesies générales, une première d'une durée inferieure à 90 minutes et une seconde sans réveil (durée comprise entre 1h et 6h). La première chirurgie est susceptible d’induire une douleur post-opératoire modérée durant 24 à 48 heures. Les pesées nécessaires au suivi post-opératoire peuvent entraîner un stress léger de quelques dizaines de secondes.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure en vue d’analyses histologiques.

Remplacement

Le projet a pour objectif d’évaluer comment la dopamine déclenche la plasticité dans l’hippocampe. Ceci nécessite l’intégrité de l’ensemble du cerveau (l’hippocampe et le système à dopamine) et l’utilisation de souris transgéniques qui permettent de stimuler spécifiquement les neurones à dopamine avec une résolution de l’ordre de la milliseconde. Il n’est pas possible, à l'heure actuelle, d’étudier cela par d’autres moyens que l’expérimentation animale in vivo (ni modélisation ni culture cellulaire) car les données biologiques sur ce sujet sont trop rares et parcellaires.

Réduction

Cette étude étant exploratoire, le nombre d’animaux par groupe (n= 12) a été déterminé sur la base de d’études antérieures utilisant les mêmes techniques de mesure des modifications neurobiologiques induites par des plasticités synaptiques s’approchant de celle étudiée ici. Les tissus prélevés seront réutilisés pour mesurer plusieurs types de modifications moléculaires et cellulaires.

Raffinement

Pendant les jours qui suivent la première chirurgie, une fiche de suivi est remplie quotidiennement pendant tout le temps nécessaire à la récupération totale de l'animal. Si une altération de l’état de l’animal est observée suite à la chirurgie une grille de scoring sera utilisée pour déterminer la conduite à tenir. Les animaux seront anesthésiés et analgésiés avant le début de la première chirurgie. Des analgésiques seront également administrés en post opératoire le lendemain. Pendant les semaines qui suivront la chirurgie, les animaux seront inspectés tous les jours. Les animaux seront anesthésiés pendant toute la durée de la seconde chirurgie et tout au long des enregistrements électrophysiologiques, jusqu’à la mise à mort des animaux.

Choix des espèces

Dans cette étude, nous utilisons la souris en raison de sa pertinence comme modèle en neurosciences et de la disponibilité d’outils adaptés pour manipuler précisement les circuits neuronaux. Les animaux seront des jeunes adultes afin d’éviter les effets liés au développement ou au vieillissement.

120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue après un prélèvement de sang dans le cœur sous anesthésie. Elles reçoivent un régime gras pendant quinze semaines pour installer un surpoids, passent quatre analyses de composition corporelle, des mises à jeun de cinq à sept heures, des tests de perception gustative et de préférence alimentaire, et jusqu'à trente essais d'apprentissage de trois minutes. Le porteur reconnaît que le surpoids peut gêner leurs déplacements et que les bagarres imposeront d'isoler certains individus. Il affirme avoir minimisé les effectifs pour garantir la solidité statistique, sans donner un seul chiffre à l'appui, et annonce l'arrêt des expériences dès que l'effectif sera suffisant.

Objectifs

Le récepteur nucléaire d’aryl hydrocarbone (AhR) est impliqué dans la toxicité des substances comme des polluants, dans les maladies du foie et des reins, et sur le fonctionnement du système immunitaire. Des études ont également mis en évidence l'influence de l'AhR sur la perméabilité intestinale. Cependant, aucune étude n'a encore analysé son rôle dans la détection orale des lipides Or, une perturbation de ce système de détection lipidique peut avoir des conséquences néfastes sur le métabolisme et le comportement. Les individus en condition d’obésité présentent un dérèglement de ce système. Cette étude vise ainsi à décrypter le rôle de l'AhR dans la détection orale des lipides, notamment dans un contexte d’obésité. En menant cette recherche, nous espérons contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans l'obésité et ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les perspectives par rapport aux résultats obtenus devraient : - Etablir les rôles « physiologiques » de l’AhR au niveau de la sphère orale - Déterminer si les effets obésogènes des molécules environnementales et ligands de AhR, pourraient avoir pour origine des interactions sur la détection orale des lipides.

Procédures

Les souris seront toutes soumises à 4 tests d’analyse de leur composition corporelle de 2 min, un test d’analyse de leur prise alimentaire et hydrique sur 24h, puis à des tests comportementaux : 1) analyse de leur mobilité et anxiété (30 min), perception gustative (4 tests de 30 min avec mise à jeun entre 5h et 7h) et préférence alimentaire (16h maximum) ou 2) analyse de leur motivation (4 tests de 10 min, dont 2 tests avec mise à jeun entre 5h et 7h) et de leur apprentissage (entre 25 et 30 tests de 3 min, dont 7 maximum avec mise à jeun de 6h). Un prélèvement sanguin sera réalisé, de moins d’une minute, sous anesthésie, juste avant l’euthanasie des animaux. Un hébergement individuel durant les périodes de mise à jeun aura lieu si les animaux se battent.

Impact sur les animaux

La majorité des analyses sont des études du comportement alimentaire des animaux. Les effets indésirables attendus sont un stress dû aux mises à jeun et la possibilité de bagarres qui nécessitera l’isolement des animaux pour la réalisation de ces tests qui seront minimisés aux durées d’expérimentation. Les autres nuisances possibles sont associées à l’utilisation d’un régime gras qui entrainera possiblement un surpoids chez les animaux. La durée du régime (15 semaines) qui sera appliquée permet de mettre en place une obésité mais sans aller jusqu’au développement d’une insulino-résistance ni d’un diabète. Les animaux en régime hyperlipidique peuvent également avoir des difficultés à se mouvoir en raison du surpoids. Les animaux pourront également être stressés à cause des manipulations, un minimum de personnel, auquel les souris auront été habituées, réaliseront les protocoles.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés sous anesthésie afin de réaliser des prélèvements sanguins et tissulaires.

Remplacement

Le remplacement est impossible car il s’agit d’étudier des processus physiologiques mettant en jeu plusieurs organes (intestin, tissu adipeux et foie). Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour une approche intégrée. Ce projet est couplé à des expériences réalisées in vitro dans l’objectif à terme de développer des études sur la détection des lipides dans ces modèles cellulaires sans nécessité d’avoir recours à des animaux.

Réduction

Les effectifs ont été minimisés tout en garantissant une pertinence biologique et une solidité statistique afin d’obtenir des résultats fiables. De plus, les analyses seront réalisées rapidement, dans le but d’arrêter les expérimentations dès que l’effectif sera suffisant pour obtenir des résultats fiables et diminuer ainsi le nombre d’animaux utilisé à son minimum.

Raffinement

Hormis les périodes de tests de comportement les animaux seront hébergés par fratries, dans des cages transparentes, pour garantir le maintien des interactions sociales. Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales avec un enrichissement de leur milieu adapté. Ils bénéficieront d’un suivi quotidien de leur état général. Le prélèvement sanguin intracardiaque sans thoracotomie sera réalisé sous anesthésie générale, par des personnes expérimentées. S’agissant d’un projet nécessitant l’utilisation d’animaux vivants, l’utilisation de techniques non invasives et indolores ainsi que de tests comportementaux est privilégiée afin d’acquérir les paramètres physiologiques nécessaires au projet tout en respectant les questions d’éthiques en expérimentation animale et la règle des 3Rs. Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet. Cependant, si les animaux atteignent les points limites du projet, ils seront sortis de l’étude puis euthanasiés.

Choix des espèces

Beaucoup d’études sur la thématique associée au projet ont été réalisées chez la souris. La confrontation de nos résultats avec la littérature s’avèrera donc plus pertinente. En effet, la souris est un modèle couramment utilisé dans les études sur l’obésité et les organes associés. D’autre part, dans le cas présent, le modèle transgénique utilisé permet d’éviter le passage sous un autre fond génétique et la génération d’animaux que cela engendre. Les animaux seront à l’âge adulte car tous les systèmes biologiques étudiés doivent être matures, hors phase de puberté et avant la phase de dégénérescences physiologiques liées à l’âge.

Huit injections d'alcool en huit ou quatorze jours, matin et soir ou par cycles de deux jours, sont administrées à des rats de deux mois. 180 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués ensuite pour l'enregistrement électrique de leurs neurones. L'objet déclaré est de comprendre les troubles de la mémoire chez les adolescents qui pratiquent l'alcoolisation ponctuelle importante, et le rôle de la fréquence des épisodes. Aucun test de mémoire ne figure au protocole, et le porteur ne précise ni la dose d'alcool injectée ni l'intensité de l'intoxication obtenue, retenant comme seules atteintes une douleur transitoire et une somnolence d'une heure.

Objectifs

Notre souhaitons comprendre les mécanismes cellulaires perturbés par la prise d’alcool sous forme d'intoxication répétées et responsables des troubles de la mémoire chez les adolescents pratiquant l'alcoolisation ponctuelle importante. Cette pratique est un facteur de vulnérabilité à déclencher une dépendance à l’alcool à l’âge adulte et la fréquence de cette pratique a été récemment démontré comme primordiale dans l’établissement de cette vulnérabilité. Nos résultats précédents montrent que les expositions à l’alcool à 2 fréquences différentes engendrent des modifications des modalités de communication entre les neurones de l’hippocampe (zone du cerveau impliquée dans la mémoire). Toutefois, nous ne savons rien des effets cellulaires d’expositions à l’alcool importante à différentes fréquences et par exemple, si l’intensité des défaillances mnésiques se reflète dans cette fréquence de pratique. Ici, nous souhaitons connaître le rôle des voies inhibitrices et de la voie intracellulaire, qui contrôle la production de protéines, dans les altérations de la communication entre les neurones de l’hippocampe de rats soumis à des expositions à l’alcool de type alcoolisation ponctuelle importante à 2 fréquences différentes.

Bénéfices attendus

Nos résultats précédents montrent que les expositions à l’alcool à des fréquences différentes engendrent des modifications des modalités de communication entre les neurones de l’hippocampe. Ici nous souhaitons déterminer les acteurs cellulaires responsables de ces modifications. Ce projet permettra de déterminer le type de perturbations cellulaires engendrées par les expositions à l’alcool à 2 fréquences différentes et plus particulièrement le rôle des inhibitions dans ces modifications. L’étude de la voie intracellulaire, impliquée dans la production de protéines nécessaire à générer ces modalités de communication entre les neurones, indiquera si l’alcool perturbe à long terme la production protéique, ce qui pourrait expliquer pourquoi la mémoire est altérée (sans protéines, il n’y aura pas de plasticité). Enfin, le fait de comparer deux fréquences indiquera si nous avons les mêmes cibles cellulaires impliquées dans les défauts de communication entre les neurones et si donc, on devrait prendre en compte plus sérieusement, la fréquence des expositions à des épisodes d'alcoolisation intenses et rapides (i.e., binge drinking) dans la jeune population.

Procédures

Les animaux subiront 8 injections d'alcool sur une durée de 8 ou 14 jours. Deux fréquences d’injections seront étudiées : - Fréquence 1 : une injection le matin et le soir (en alternant les côtés) tous les 2 jours pour un total de 8 injections (durée du protocole : 8 jours, Fréquence 1 binge/j) - Fréquence 2 : une injection le matin pendant 2 jours de suite, suivie de 2 jours sans alcool. Ce cycle sera répété 4 fois pour un total de 8 injections (durée du protocole : 14 jours; Fréquence de 1 binge/2j). La manipulation de l'animal nécessaire à l’injection durera moins d’une minute

Impact sur les animaux

Les animaux recevront des injections d’une solution d'alcool. Les nuisances ou effets indésirables attendus sont donc liés à l’injection elle- même et à la préhension de l'animal nécessaire pour la réaliser et qui peut induire un stress chez l'animal (contention environ 0.5 à 1 min jusqu’à l’injection), ainsi qu’à une douleur transitoire due à l'injection, et un état de somnolence durant l’heure suivant l’injection puisque l'alcool est un sédatif reconnu.

Devenir

Tous mis à mort pour études électrophysiologiques

Remplacement

La mémoire est localisée dans l’hippocampe et nécessite des interactions entre neurones de cette structure. Il est donc nécessaire d’enregistrer les neurones de l’hippocampe dans un modèle expérimental conservant l’intégrité anatomique et fonctionnelle de la structure. Aujourd’hui des modèles de culture en 3D de neurones de l’hippocampe existent. Ils sont appelés organoïdes. Malheureusement leur usage dans cette étude en remplacement des animaux n’est pas envisageable car leur niveau de complexité ne permet pas de reproduire les phénomènes de plasticité synaptique (i.e., changemetns des modalités de communication entre neurones) existant in vivo.

Réduction

Le nombre nécessaire d’animaux a été déterminé en amont à l’aide d’études préalables exécutées dans le laboratoire du dépositaire et d’articles scientifiques. De plus, le nombre d’animaux a été confirmé par un calcul de puissance statistique.

Raffinement

A leur arrivée, afin de réduire toutes formes de stress et souffrance, tous les animaux seront manipulés de manière douce de la part du personnel engagé sur le projet afin de les habituer à la présence et odeur du manipulateur. Ils seront également habitués à être manuellement contendus pour diminuer le stress lié à ce geste pendant les administrations i.p. L’ensemble du personnel est qualifié afin de surveiller quotidiennement les animaux. Chaque animal aura une fiche de bien-être qui sera remplie quotidiennement, des points limites ont été définis et seront appliqués. Si un animal présente des signes de douleur ou de souffrance (perte de poids, posture, respiration ou comportement anormal, ou déshydratation), des actions correctives seront mises en place pour le soulager (réhydratation par voie orale à l’aide de pipettes, accès facilité à la nourriture en posant des croquettes sur la litière, administration d’un traitement antalgique, ou mise à mort). Les animaux sont hébergés par 3 (groupe social stable) dans des cages contenants de l'enrichissement (tubes de carton comme abri et litiére foisonnate pour le nid).

Choix des espèces

Les études seront menées chez le rat, puisque les mécanismes de plasticité synaptique (i.e., changements des modalités de communication entre neurones) chez cet animal sont bien décrits, similaires à ceux retrouvés chez l’homme, et mesurables en laboratoire. Nous travaillerons sur des adolescents (2 mois), parce que l’alcoolisation ponctuelle importante est prépondérante dans cette tranche d’âge chez l’humain.

129 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever leur cerveau. Chacun subit une ablation des bulbes olfactifs par chirurgie intracérébrale d'environ trente minutes, puis une seconde opération onze jours plus tard pour poser un dispositif d'administration continue, avant deux séances d'observation de dix minutes de son activité motrice. Cette ablation sert à reproduire chez le rat un état dépressif, afin de mesurer la vitesse d'action de molécules agissant sur un récepteur de la sérotonine. Le porteur affirme que les rats opérés ne présentent aucune altération comportementale caractéristique d'un stress, d'une souffrance ou d'un inconfort, dans un modèle dont l'intérêt repose précisément sur l'état dépressif que cette ablation installe.

Objectifs

Les molécules actuellement disponibles pour le traitement de la dépression et des troubles de l'humeur sont loin d'être optimales. En effet, seuls 1/3 des patients répondent pleinement aux médicaments, et même dans ce cas, on n'observe une amélioration thérapeutique qu'après plusieurs semaines d'administration continue, un problème qui peut s'avérer crucial dans les cas de crise suicidaire. Il a été montré que des composés capables d'agir en activant un type particulier de récepteur à la sérotonine (un neurotransmetteur présent dans le cerveau des mammifères) présentaient un potentiel d'antidépresseur rapide dans des modèles expérimentaux, se montrant efficaces après seulement 3 jours de traitement. D’autres travaux menés sur le fonctionnement des neurones du cerveau de rat ont clairement indiqué que la capacité de ces composés à agir sur les zones cérébrales qui contrôlent l'humeur sont "freinées" en raison de l'existence d’autres récepteurs qui ressemblent aux premiers cités, mais ayant une autre fonction dans le cerveau. Très récemment, nous avons développé un outil génétique qui permet d'éliminer sélectivement ces récepteurs responsables de l’effet «parasite ». Ainsi, nous allons pouvoir disséquer les mécanismes intimes par lesquels nos composés améliorent l'humeur de façon très rapide. Pour cela, nous procèderons à un test comportemental connu et validé pour modéliser chez le rongeur la vitesse d'un traitement antidépresseur. Ce test nécessite une chirurgie, appelée « OBX » dans la nomenclature.

Bénéfices attendus

Cette étude devrait permettre de comprendre comment les composés à action antidépressive rapide agissent spécifiquement sur le fonctionnement des régions du cerveau concernées. Il deviendra alors possible de proposer la conception de nouveaux traitements contre la dépression, en concevant des molécules qui agiront directement sur les mécanismes mis à jour, sans mettre en jeu le "signal parasite" mentionné ci- dessus.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux chirurgies: la première durant laquelle sera réalisée l'OBX (environ 30 min par animal), la seconde 11 jours plus tard pour permettre d’administrer nos composés en continu (3-5 min par animal). Puis, 3 et 14 jours après cette dernière, les animaux seront soumis à deux séances de test comportemental d’une durée de 10 min, où on ne fera qu’observer leur activité motrice. Cela revient donc à 4 interventions sur la durée de vie à la mort de l'animal.

Impact sur les animaux

Le test OBX est connu et validé comme un modèle de test pour traitement antidépresseur depuis plus de 30 ans. Il repose sur la nécessité d’effectuer une chirurgie au préalable, avant de passer aux expériences comportementales proprement dites. Cette chirurgie provoque des douleurs modérées. Il a été montré que les rats opérés ne présentent aucune altération comportementale caractéristique d’un stress, d’une souffrance ou d’un inconfort particulier. La surveillance des animaux sera donc celle qui est classiquement mise en œuvre après une chirurgie intracérébrale, les risques de nuisance étant de type post-opératoire : infections, douleurs inflammatoires, réouverture de plaie. Nous suivrons les rats quotidiennement durant la semaine qui suivra l’opération, ainsi que les trois premiers jours de la semaine suivante. Le jour suivant, 11ème jour, aura lieu le début des traitements en continu. Il s’agit d’une chirurgie extrêmement minime, qui ne nécessite d’anesthésier l’animal que durant quelques minutes : aucune nuisance n’a été rapportée suite à l’utilisation de cette technique.

Devenir

A l'issue des procédures 1 et 2, tous les animaux seront mis à mort. Il sera nécessaire de prélever les cerveaux pour valider les chirurgies effectuées au préalable et analyser les effets des traitements pharmacologiques.

Remplacement

Dans ce projet, nous souhaitons valider, à l'aide d'une sortie comportementale, nos hypothèses issues de travaux menés sur le fonctionnement des circuits cérébraux impliqués dans l'efficacité des antidépresseurs. Par définition, un modèle comportemental ne peut pas s'effectuer autrement que sur le système intégré que représente un animal entier, et vivant.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d'animaux permettant l'obtention de résultats statistiquement fiables et robustes. Pour cela, nous avons procédé à l'estimation du minimum requis pour chaque groupe expérimental, en nous basant sur les acquis de nos précédents travaux, et sur des calculs statistiques. Sur cette base, nous avons déterminé qu'il sera nécessaire d'utiliser un effectif compris entre 12 et 15 animaux par groupe, en fonction de la variabilité propre à l’expérimentation. Nous avons ainsi établi un grand total de 129 rats nécessaires pour réaliser l’ensemble du projet.

Raffinement

En ce qui concerne le suivi des animaux, notre priorité sera de viser à favoriser au maximum leur bien être durant la totalité de l’étude. Un minimum de 10 jours d’adaptation sera appliquée à chaque animal dès leur arrivée à l‘animalerie. Ils seront placés en cages collectives par groupe de 2 individus, une pesée et une observation quotidienne durant la période post- opératoire seront réalisées afin de s’assurer du bon état des plaies chirurgicales, des sutures et du bien-être général. Les manipulations seront effectuées ou encadrées par du personnel formé et habitué à ce genre de gestes. Pour chaque intervention chirurgicale, les animaux recevront un anti inflammatoire afin de lutter contre l’apparition de toute douleur éventuelle. En outre, nous utiliserons des anesthésiants locaux autour des zones opérées.

Choix des espèces

Toutes les expériences précédentes, ayant mené aux hypothèses qui sont à la base de ce projet, ont été réalisées chez le rat; il apparaît donc naturel d'utiliser cette même espèce pour en établir la validation comportementale. En outre, le modèle d'OBX, qui nous permet d'évaluer la cinétique d'effet d'un traitement antidépresseur potentiel, a été validé chez le rat et ne semble pas être transposable à la souris. Les rats seront utilisés au stade de jeune adulte (entre 7 et 9 semaines), correspondant à ce qui est classiquement choisi pour le test d'OBX.