Recherche fondamentale

Dès qu'une souris atteint trois points sur la grille de score clinique, elle est mise à mort. 160 souris porteuses d'une mutation mitochondriale vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvements post-mortem. Elles reçoivent deux immunosuppresseurs dans leur nourriture à partir du sevrage, avec pesée, température rectale et notation clinique au moins trois fois par semaine, et passent trois séances de dix minutes sur rotarod à quarante jours, alors que le porteur situe le début des difficultés à se mouvoir vers quatre semaines. L'objectif déclaré est de vérifier si deux molécules déjà testées sur un autre modèle murin du syndrome de Leigh agissent aussi sur celui-ci, donc de généraliser un résultat publié à un second gène.

Objectifs

Il n'existe aucun traitement disponible pour la plupart des maladies mitochondriales, maladies génétique du métabolisme entraînant un handicap grave et une mort prématurée. Le syndrome de Leigh en est une des formes plus graves. Il est causé par des mutations dans de nombreux gènes différents affectant la fonction des mitochondries, les centrales énergétiques de nos cellules. Cliniquement, cette maladie affecte généralement le cerveau et les muscles. Une étude récente a rapporté un effet positif de deux médicaments agissant sur l'inhibition du système immunitaire chez un modèle de souris développant un syndrome de Leigh suite à l'inactivation d'un gène mitochondrial particulier. Le but de notre projet est de tester ces deux molécules sur un deuxième modèle de souris du syndrome de Leigh, impliquant un autre gène, afin de déterminer si ces deux traitements peuvent être généralisable à tous les patients atteints par cette maladie.

Bénéfices attendus

Le projet vise à étudier l'implication du système immunitaire en tant que mécanisme principal à l'origine du syndrome de Leigh et la possibilté d'approches thérapeutiques le ciblant . Si les résultats sont solides et montrent des améliorations significatives, cela devrait permettre le développement de traitements cliniques pour le syndrome de Leigh et potentiellement pour d’autres maladies mitochondriales.

Procédures

Traitement pharmacologique: administration de deux molécules thérapeutiques dans la nourriture, de l'âge de 21 jours jusqu'à la mise à mort de l'animal basée sur l'observation de signes cliniques. Basé sur une publication sur un modèle similaire, le traitement pourrait s'étendre sur 6 mois. Test de coordination motrice: les souris seront placées sur une machine (rotarod) permettant de vérifier leur capacité à coordonner les mouvements de leurs pattes. Il y aura une phase d'entrainement à l'âge de 30 jours, puis une phase de mesure à 40 jours. Basé sur des publications scientifiques, les souris restent en moyenne 10 minutes sur le rotarod, par mesure. Trois mesures seront effectuées, espacées de 15 minutes de récupération.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées sur ce projet ont un phénotype dommageable qui commence par une perte de poids et un retard de croissance (vers 4 semaines), puis des difficultés progressives à se mouvoir, et enfin des difficultés respiratoires peu avant le décès (à 7-8 semaines). Les traitements pharmacologiques en question ont été déjà appliqués dans des études scientifiques publiés qui ne semblent pas attribuer effets indésirables spécifiques.

Devenir

Tous les animaux prévus sur ce projet seront mis à mort en fin de protocole expérimental en vue de prélèvements post-mortem

Remplacement

Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle en absence d’autre modèles cellulaires qui permettent d’étudier la réponse du système nerveux à des immunotraitements in vivo. De plus, les modèles physiopathologiques par définition étudient les conséquences pathologiques de la mutation sur l’ensemble de l’organisme. Les lignées cellulaires tels que les cellules de peau de patients atteints par le syndrome de Leigh ne peuvent pas reproduire les mécanismes complexes d'adaptation physiologique systémiques liés à ces dysfonctionnements des mitochondries.

Réduction

Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux à utiliser pour obtenir des résultats exploitables au niveau statistique et les effectifs ont été calculés à l'aide d'un logiciel. Ainsi nous allons utiliser les mêmes souris pour les analyses cliniques, pathologiques et moléculaires.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la structure de bien-être animal, les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). En raison du phénotype dommageable des souris, nous ajoutons de la nourriture directement dans les cages, et utilisons des biberons avec tétine longue, pour permettre aux animaux de s'alimenter plus facilement. Pour limiter l’inconfort lié aux procédures, les manipulations seront réalisées par des personnes compétentes et expérimentées. Le bien-être des animaux fera l’objet d’un contrôle quotidien par le personnel de l'établissement utilisateur et du laboratoire. De plus, dans le cadre du protocole expérimental, à partir du début du traitement à lâge de 3 semaines, le poids corporel, la température rectale, la consommation alimentaire, l’état clinique seront évalués en aveugle au moins trois fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi). Une pesée supplémentaire sera effectuée le dimanche à partir de l’âge de 6 semaines. Un score sera attribué aux signes cliniques. Dès que les souris obtiendront un score de 3 points, elles seront mises à mort (point limite).

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines, car l'organisation de ses gènes est très similaire à celle de l'homme. De plus, la disponibilité de souris génétiquement modifiées permet d'étudier finement les mécanismes sous-tendant la pathogenèse de ces maladies mitochondriales. Dans le cas présent, cela permettra de tester l'efficacité de molécules thérapeutiques sur le syndrome de Leigh à l'échelle d'un organisme par des observations concrètes sur la survie et l'évolution pondérale. Le début du traitement commencera dès le sevrage des animaux à 21 jours car les molécules testées étant dans la nourriture, il faut que les souris puissent se nourrir seules. Le traitement continuera jusqu'au moment de la décision d'euthanasier les souris, basée sur notre grille de score, car le critère principal d'efficacité du traitement pharmacologique est la survenue plus tardive des signes cliniques pathologiques.

Exposées à un son intense à 18 jours de vie, puis chaque jour pendant une semaine à partir de 23 jours, les souris convulsent immédiatement après chaque exposition, jusqu'à trois crises par jour. Opérées du crâne pendant deux à trois heures, certaines passent ensuite 31 jours en sessions d'imagerie tête fixée, une à deux heures par jour. 382 souris vont être utilisées dans ces procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour identifier les circuits cérébraux qui transforment une perception sonore en décharge épileptique. Toutes sont tuées à la fin, le porteur indiquant qu'après de telles interventions elles ne peuvent être ni réutilisées, ni placées, ni adoptées.

Objectifs

Le but du projet est d’approfondir la connaissance des mécanismes par lesquels une stimulation sensorielle peut déclencher une crise épileptique. Ce phénomène est bien connu dans les épilepsies humaines, avec notamment le principe de photosensibilité (déclenchement d’une crise après stimulation lumineuse intermittente), qui reste mal compris, notamment en ce qui concerne le site cérébral, où se réalise ce processus et où est générée la décharge épileptique. Les dynamiques d’activation lors d’une crise déclenchée par un son sont également mal élucidées. Ce projet permettra d’étudier comment une perception sensorielle conduit à la génération d’une activité neuronale pathologique. Une meilleure connaissance de ces mécanismes aidera à identifier des structures anatomiques à cibler dans le cadre de protocoles de neurostimulation, actuellement en plein essor dans la prise en charge des patients souffrant d’épilepsie. Enfin, ces résultats pourraient aider à comprendre au sens plus large d’autres mécanismes d’intégration sensorielle neurologique pathologiques, observés par exemple dans la migraine, les acouphènes, ou encore l’hyperacousie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus dans le domaine médical et clinique sont une meilleure connaissance des épilepsies dites « réflexes » (déclenchées par une stimulation sensorielle), incluant des phénomènes tels que celui de photosensibilité, bien connu dans les épilepsies humaines (déclenchement d’une crise après stimulation lumineuse intermittente). L’ensemble de ces épilepsies avec composante réflexe représente environ 5% des épilepsies (soit environ 30 à 50.000 patients en France) bien que ce chiffre soit probablement sous-estimé par défaut d’évaluation systématique. Les déterminants physiopathologiques des épilepsies réflexes sont encore mal connus, en particulier en ce qui concerne le site anatomique d’où sont générées ces crises, et les dynamiques d’activation et de propagation neuronale. Une meilleure connaissance de ces mécanismes aidera à identifier, à long terme, des structures anatomiques à cibler dans le cadre de protocoles de neurostimulation (invasive ou non invasive), actuellement en plein essor dans la prise en charge des patients souffrant d’épilepsie. Ceci impliquera au préalable une phase de translation de ces résultats aux patients, par exemple via l’imagerie fonctionnelle ou d’autres études invasive ou non-invasive. Enfin, ces résultats pourraient aider à comprendre au sens plus large d’autres mécanismes d’intégration sensorielle neurologique pathologiques, observés par exemple dans la migraine, les acouphènes, ou encore l’hyperacousie.

Procédures

Les souris seront soumises à: - une exposition sonore à l’âge de 18 jours, pour une durée maximale de 60 secondes (un jour) - une exposition sonore à l’âge de 23 jours, quotidienne pendant 7 jours, pour une durée maximale de 60 secondes. Ces expositions sonores déclenchent une crise convulsive immédiatement après l’exposition. - une procédure chirurgicale sous anesthésie et analgésie à l’âge de 1, 3 et 56 jours. La durée de la chirurgie est de 2 à 3 heures. - pour certains 10 expositions sonores déclenchant des crises convulsives. Chaque animal subira un maximum de 3 crises par jour. -pour certains animaux des sessions d’1 à 2 heures d’imagerie en contention, quotidiennes sauf le weekend sur 31 jours, après une phase d’entraînement à la contention de 7-15 jours. Les nuisances attendues sur les souris sont essentiellement liées au stress généré par les expositions sonores et les crises épileptiques, ainsi qu’aux lésions réalisées lors des gestes chirurgicaux et aux douleurs que celles-ci peuvent entraîner.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les souris sont : -L’exposition sonore à une intensité contrôlée peut entraîner une douleur légère de courte durée (durée maximale de 60 secondes) -La survenue d’une crise convulsive après l’exposition sonore ou la stimulation lumineuse peut entraîner dans les suites une douleur musculaire modérée et de courte durée (pas de souffrance pendant la crise du fait de la perte de connaissance). Les souris ne subiront pas plus de 3 crises par jour. -L’injection de certains composés à l’âge de 1 ou 3 jours se fait sous anesthésie et analgésie mais peut entraîner des douleurs post-opératoires légères et de courte durée. -La réalisation de 4 orifices crâniens à l’âge de 56 jours se fait sous anesthésie et analgésie mais peut entraîner des douleurs post-opératoires légères pendant 1 à 2 jours selon les observations faites dans des protocoles similaires. -Pour certains animaux, la réalisation une autre chirurgie craniale se fait sous anesthésie et analgésie et peut entraîner des douleurs post-opératoires modérées pendant 1 à 2 jours. -Pour certains animaux, la réalisation de sessions d’imagerie en contention, tête fixée, sur une durée maximale de deux heures par jour pendant 31 jours, peut entraîner un inconfort modéré pendant la durée de la contention. -Le maintien en place d’un dispositif crânien pour envelopper les électrodes intracrâniennes peut entraîner une gêne légère pour les souris, sur une durée totale d’1 à 2 mois.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet ces animaux auront subi des procédures invasives ne permettant pas de réutiliser les animaux au-delà des expériences décrites ci-dessus et auxquelles ils ont été initialement destinés, ni de les adopter en dehors de ce contexte expérimental.

Remplacement

Les outils modernes d’imagerie optique que nous utiliserons permettent d’enregistrer plus de 1000 neurones en parallèle, permettant de traiter un grand ensemble de données avec un minimum d’animaux. Le nombre d’animaux utilisés est aussi minimisé par la possibilité de répéter le protocole de mesure sur plusieurs jours voire plusieurs semaines avec le même animal pour maximiser la taille de l’échantillon de neurones collecté sur chaque animal. Le nombre d’animaux utilisé est donc essentiellement déterminé par la nécessité de mesurer des différences statistiques significatives pour la comparaison des groupes de souris. Certains animaux utilisés pour un type d’expériences seront réutilisés pour un autre type d’expériences. L’utilisation de tests statistiques sur échantillons appariés (lorsque nous compareront la fréquence de survenue de crise audiogène entre un animal stimulé et non stimulé, par exemple) permet de réduire le nombre de sujet nécessaire, chaque animal étant son propre témoin.

Réduction

Les outils modernes d’imagerie optique que nous utiliserons permettent d’enregistrer plus de 1000 neurones en parallèle, permettant de traiter un grand ensemble de données avec un minimum d’animaux. Le nombre d’animaux utilisés est aussi minimisé par la possibilité de répéter le protocole de mesure sur plusieurs jours voire plusieurs semaines avec le même animal pour maximiser la taille de l’échantillon de neurones collecté sur chaque animal. Le nombre d’animaux utilisé est donc essentiellement déterminé par la nécessité de mesurer des différences statistiques significatives pour la comparaison des groupes de souris. Certains animaux utilisés pour un type d’expériences seront réutilisés pour un autre type d’expériences. L’utilisation de tests statistiques sur échantillons (lorsque nous compareront la fréquence de survenue de crise audiogène entre un animal stimulé et non stimulé, par exemple) permet de réduire le nombre de sujet nécessaire, chaque animal étant son propre témoin.

Raffinement

L’utilisation de protéines excitables par stimulation lumineuse à travers la boîte crânienne permet d’éviter une procédure de chirurgicale additionnelle. Pour toutes les procédures chirurgicales, plusieurs mesures supplémentaires seront prises. Pendant la chirurgie, une réhydratation sera mise en place. Le volume de réhydratation sera ajusté en fonction de la durée de la chirurgie. Après la chirurgie, les animaux en récupération sont placés en cage de réveil sur une plaque chauffante, puis replacés dans leur cage qu’il sera possible de continuer à chauffer par des chaufferettes, et reçoivent une analgésie supplémentaire. De l’eau gélifiée sera ajoutée dans les cages suite à la chirurgie pour faciliter l’hydratation des souris. L’environnement de la cage sera enrichi. Les animaux sont suivis quotidiennement, s’il y a des signes de douleur, des doses d’antalgiques sont ajoutées, s’il y a des signes d’infection un traitement antibiotique est mis en place. La phase de récupération est de 7 jours au minimum pendant lesquelles l’animal n’est pas manipulé sauf pour le suivi post-opératoire en première semaine. Des points limites spécifiques et précoces sont définis, entrainant l’arrêt de l’expérience ou la mise à mort si les traitements associés ne permettent pas de diminuer la douleur ou l’inconfort sous 24h. Ils sont basés sur des indicateurs de poids, la persistance pendant plus de deux jours d’une réduction de la mobilité avec dos voussé, d’une piloérection marquée, d’un manque de toilettage ou toilettage excessif ; ou encore la survenue de signes de détresse. Lors d’une crise épileptique prolongée au-delà de 2 minutes, l’animal sera placé sous un masque à oxygène. Pour diminuer le stress et l’angoisse pendant l’imagerie en contention, nous avons mis en place un protocole d’habituation progressive. La souris est placée en contention le premier jour pendant 30min puis le second et le troisième jour pendant 1h. Si à la fin de l’entrainement l’animal montre des signes de stress et d’angoisse, l’animal sera ré-entrainé le jour suivant au palier inférieur et le protocole décalé en fonction. Si ces signes perdurent l’expérience sera arrêtée pour l’animal.

Choix des espèces

Ce projet implique l’utilisation d’organismes vivants dotés d’un système nerveux central permettant l’intégration des perceptions sensorielles. Ces organismes vivants doivent par ailleurs pouvoir présenter des crises épileptiques. La souris est un modèle adapté qui répond à ces deux critères. Par ailleurs, l’utilisation de souris comme modèle animal est nécessaire pour permettre l’application des outils de manipulation ciblée des circuits neuronaux qui nous permettront d’avancer dans la compréhension des mécanismes de l’épilepsie. Ces outils sont mieux établis chez cet animal que dans d’autres espèces. Par ailleurs le modèle souris possède un système auditif similaire à l’homme et est suffisant pour l’exploration de mécanismes fondamentaux. Le stade de développement est un point crucial dans la susceptibilité des souris aux crises audiogènes. La susceptibilité maximale des souris étudiées à la procédure de « priming » (procédure qui confère la susceptibilité aux crises audiogènes après une exposition à un son bref et intense au cours de leur développement) entre 13 et 25 jours post-natal, et idéalement au 18ème jour. Il existe également une fenêtre temporelle de susceptibilité au « kindling » (expansion progressive du réseau épileptique par expositions sonores répétées) se situant entre le 21ème et le 30ème jour post-natal. Ainsi, nous réaliserons le « priming » au 18ème jour et le « kindling » au 23ème au 30ème jour. Une injection intracérébrale sera réalisé chez le souriceau à P1-P3, sous anesthésie générale, pour permettre une expression homogène et diffuse. La procédure chirurgicale principale sera réalisée à la 8ème semaine post-natale, et les expériences d’activation ou d’inhibition des différentes structures, couplées à la neurophysiologie, seront réalisées 5 semaines plus tard (environ 13ème semaine post-natale).

1 415 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir une injection de virus, d'anti-œstrogènes ou d'un agent chimique cancérogène, puis passer en moyenne huit échographies hépatiques sous anesthésie avant une chirurgie abdominale terminale. Certaines reçoivent en plus une injection d'anticorps tous les trois jours pendant deux mois, ce qui peut provoquer des péritonites, ou une toxine déclenchant une hépatite. Toutes sont tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la nuisance principale déclarée étant le développement de tumeurs du foie pouvant conduire à une encéphalopathie mortelle. Le porteur annonce des pistes thérapeutiques pour un cancer au pronostic "sombre" et des cultures cellulaires qui réduiraient à terme le nombre de souris, alors que 1 415 animaux sont demandés maintenant.

Objectifs

Ce projet s’intéresse aux cancers du foie de l'adulte et de l'enfant qui reste un problème majeur de santé public. Chez l’adulte, il est la quatrième cause de morts liées au cancer dans le monde et son incidence ne cesse d’augmenter avec l’épidémie de diabète et d’obésité. Il touche plus particulièrement les hommes même si l’évolution des facteurs de risque modifie quelque peu les proportions homme/femme. Récemment, l’immunothérapie a donné des résultats intéressants mais une majorité des tumeurs ne répondent pas à ces traitements. L’objectif de ce projet est de comprendre comment une même mutation conduit au développement de deux types de tumeurs hépatiques. Notre projet consiste à caractériser ces deux types de tumeurs émergeant sur foie sain ou malades induits par des régimes riches en gras et en sucre afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques et de comprendre pourquoi ces tumeurs sont résistantes aux immunothérapies. Notre objectif est aussi de développer des modèles de culture cellulaire tridimensionnelle pour tester de nouveaux médicaments tout en limitant le nombre de souris mais aussi de confirmer nos résultats chez la femelle, du fait du changement de proportions homme/femme touchés par la maladie. MODIFICATION : L’ajout d’un geste technique sur certains animaux pour étudier l'activité traductionnelle implique une modification du projet initial sans ajout d’animaux.

Bénéfices attendus

En aidant à la compréhension des mécanismes moléculaires, métaboliques et immunitaires de développement et de réponse aux traitement des cancers du foie, ce projet permettra d'identifier de nouvelles pistes thérapeutiques administrées seules ou à coupler aux traitements d'immunothérapie émergeant ces dernières années et de proposer des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques pour ce cancer au pronostic toujours aussi sombre. Enfin, il permettra de disposer de nouveaux modèles in vitro qui pourront être utilisés pour prédire la réponse à ces nouvelles thérapies.

Procédures

1) En premier geste, les animaux pourront subir soit : a) une injection unique de virus sous anesthésie générale en 30 secondes b) une injection unique d'anti-oestrogènes sur animaux vigiles sous contention en 30 secondes c) une injection unique d'un agent chimique induisant des tumeurs du foie sur animaux vigiles sous contention en 30 secondes 2) En second geste, les animaux pourront subir: a) une échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10-25min tous les 15 jours (8 échographies en moyenne) b) une chirurgie abdominale terminale sous anesthésie générale et analgésie pendant 15min c) une injection d’anticorps ciblant le système immunitaire sur animaux vigiles sous contention tous les 3 jours en 30 secondes (pendant 2 mois maximum) d) une injection unique de toxine induisant une hépatite sur animaux vigiles sous contention en 30 secondes MODIFICATION 3) certains animaux pourront recevoir une injection d'antibiotique modifié permettant de mesurer l'activité de traduction, 4) Le dernier geste étant un prélèvement sanguin suite à une injection unique d’anesthésique sous contention sur animaux vigiles en 30 secondes.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, la nuisance principale est liée au développement de tumeurs hépatiques pouvant conduire à une encéphalopathie létale sans perte de poids. Les injections de virus adéno-associés et les échographies réalisées sous anesthésie peuvent entraîner un stress thermique et un inconfort au réveil. Les injections d'anti-oestrogènes, d'anticorps, d'antibiotique ou de toxine peuvent entraîner un stress lors de la contention et une douleur de courte durée lors de l‘introduction de l’aiguille. L'injection répétée d'anticorps peut conduire à des péritonites ou infections.

Devenir

L'ensemble des animaux de ce projet sera euthanasié pour analyse de leurs tissus hépatiques et de leurs tumeurs

Remplacement

Le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire mais aussi l’environnement métabolique et les autres organes pathologiques en cas d’obésité. L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permet donc pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité. Les lignées immortalisées perdent d'ailleurs beaucoup de leurs caractéristiques phénotypiques et métaboliques in vitro. C'est pourquoi il est crucial de travailler sur des modèles murins pertinents.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux transgéniques, une technique innovante d'édition génique nous permet d'éviter la création de lignées et de n'injecter que les animaux d'expérimentation. 585 animaux sur les 1415 nécessaires nécessaires au projet suivront ce protocole. Nous suivrons le développement des tumeurs pour 200 animaux par échographie ce qui permet un suivi longitudinal du développement tumoral. Ce suivi évite d'euthanasier les animaux à l'aveugle. Les tests statistiques utilisés seront des tests permettant l’analyse d’échantillons de petites tailles. Le nombre d’animaux a été choisi grâce à notre expertise : le suivi échographique de 20 animaux par lot est nécessaire et suffisant pour générer des résultats statistiquement fiables. Pour les études à court terme, seuls 15 animaux par lot sont nécessaires. De plus, nous souhaitons mettre au point des cultures in vitro de tumeurs murines pertinentes pour les cancers du foie qui nous permettront à terme de tester de nouvelles drogues anti-tumorales et ainsi de ne tester chez l’animal que les molécules préalablement efficaces sur ces cultures. Récemment, nous avons développé un nouveau modèle de cancer basé sur l'édition génique qui permet de générer moins d'animaux.

Raffinement

Nous suivrons le développement des tumeurs en échographies, ce qui permet un suivi longitudinal du développement tumoral. Ce suivi évite la souffrance due à un développement tumoral important (raffinement). Nous connaissons les phases possiblement délétères après invalidation génique, et les procédures se dérouleront avec une surveillance adaptée. Les injections stressantes et échographie seront réalisées sous anesthésie générale et les animaux mis sur tapis chauffant après anesthésie. Pour réduire le stress au quotidien, le milieu est enrichi par des cotons compactés, des tunnels en carton et des maisonnettes suspendues et les animaux hébergés à raison de 5 animaux par cage au maximum. Dans la fenêtre de temps où le phénotype délétère lié à l'activation de la beta-caténine peut avoir lieu, un suivi accru sera mis en place. Au cours du suivi échographique, si les points limites sont atteints, les animaux seront immédiatement euthanasiés. Au cours de ce suivi, l'euthanasie des animaux ayant atteint le point limite peut conduire à des animaux isolés dans les cages pour lesquels un suivi accru sera mis en place et le milieu enrichi (nids, tunnels, bois à ronger).

Choix des espèces

Pour ce projet l’espèce animale choisie est la souris. Ce choix est lié : 1) A notre expertise pour l’étude, l’utilisation et le développement de modèles murins. 2) A la possibilité de réaliser des manipulations génétiques de façon aisée dans cette espèce pour reproduire les mutations observées dans les cancers du foie humains. Un modèle de carcinogenèse chimique nécessite des souriceaux de 14 jours puisque c'est en injectant à cet âge que les tumeurs se développent . Pour les autres modèles, des souris adultes âgées de deux mois seront utilisées afin que le cancer se développe à partir d'une cellule mature.

352 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie de quinze à vingt minutes pour recevoir des cellules cancéreuses humaines directement dans le pancréas, puis des injections cinq fois par semaine, un gavage quotidien pendant 28 jours et un suivi tumoral hebdomadaire par échographie. Le porteur indique que le gavage peut enflammer l'œsophage et que la chimiothérapie provoque faiblesse et perte de poids importante. Il affirme avoir besoin d'un organisme complet parce que les cultures cellulaires ne reproduisent ni la structure du pancréas, ni la circulation sanguine, ni les interactions avec le système immunitaire, système immunitaire que les souris choisies n'ont justement pas.

Objectifs

Le cancer du pancréas représente un enjeu majeur de santé publique, avec environ 10 000 nouveaux cas recensés chaque année en France. À l’échelle mondiale, son incidence varie entre 1 et 10 cas pour 100 000 habitants. D’ici 2030, il est prévu que ce cancer devienne la deuxième cause de mortalité par cancer dans le monde. Le but principal de ce projet est de tester l’efficacité d’un nouveau traitement contre le cancer du pancréas. Pour cela, nous utilisons un modèle qui reproduit au mieux ce qui se passe chez l’être humain, notamment l’environnement autour de la tumeur, qui joue un rôle essentiel dans l’évolution de la maladie et dans la résistance aux traitements. Si le traitement s’avère efficace, nous chercherons ensuite à comprendre comment il agit. Nous analyserons la façon dont il modifie les échanges entre les cellules cancéreuses et leur environnement, ainsi que les mécanismes qui contrôlent la croissance des tumeurs, leur survie et leur résistance aux thérapies. Cette étude nous aidera aussi à repérer des marqueurs biologiques pouvant prédire la réponse au traitement, ce qui sera très utile pour adapter de futures stratégies thérapeutiques chez l’être humain.

Bénéfices attendus

Le cancer du pancréas est l’un des cancers les plus graves et les plus difficiles à traiter, car il résiste souvent aux thérapies utilisées aujourd’hui. C’est pourquoi il est essentiel de mettre au point de nouvelles stratégies thérapeutiques. Dans ce projet, nous testons un nouveau traitement ciblé, c’est-à-dire un médicament conçu pour bloquer des mécanismes précis utilisés par les cellules cancéreuses pour se développer et résister. Nous l’évaluons seul, mais aussi en association avec une chimiothérapie classique et/ou un médicament innovant qui bloque une voie très active dans ce type de cancer. Ce choix s’appuie sur les résultats déjà encourageants d’un essai clinique en cours chez des patients atteints de cancer du pancréas. En menant cette recherche, nous espérons mieux comprendre comment ce nouveau traitement agit sur les cellules cancéreuses et leur environnement immédiat (les cellules qui entourent et soutiennent la tumeur). Nous chercherons aussi à identifier dans quelles conditions il est le plus efficace, et comment ses effets peuvent être optimisés en association avec d’autres médicaments. À terme, ces travaux devraient permettre de concevoir des traitements plus performants et mieux adaptés, offrant de nouvelles options thérapeutiques aux personnes atteintes de ce cancer particulièrement agressif.

Procédures

Les animaux seront soumis à différents types injections 5x/semaine lors des administrations thérapeutiques ainsi qu'une procédure chirurgicale permettant d’accéder au pancréas. Chaque souris sera soumise à des injections pour l'administration d'analgésique. Chacune des injections dure moins d'1 minute. La durée de la chirurgie est estimée à 15 et 20 minutes par animal. En complément, les souris recevront un gavage oral quotidien pour l’administration de certains traitements durant 28 jours. Les souris subiront différentes manipulations chaque semaine pour des pesées, le suivi de la croissance tumorale par échographie mais également une procédure de chirurgie permettant d'injecter des cellules cancéreuse directement dans le pancréas. Ces manipulations peuvent entrainer du stress durant le temps des contentions ainsi que pour l'anesthésie (endormissement et réveil) lors de la chirurgie.

Impact sur les animaux

L'anesthésie des animaux peut entrainer une détresse légère et une courte hypothermie. La chirurgie peut entrainer une douleur modérée mais prolongée. Les piqures et contentions peuvent entrainer un stress physique et une douleur légère inférieure à 1 minute. Le développement des tumeurs peut, à un stade avancé (plus de trois semaines après l’injection), perturber le fonctionnement normal des organes et entraîner une perte de poids. La chimiothérapie peut aussi provoquer une faiblesse générale et une perte de poids importante. Le traitement ciblé est administré trois fois par semaine pendant 3 semaines, tandis que la chimiothérapie est donnée deux fois par semaines également durant 3 semaines. Un autre traitement expérimental par gavage (donné le traitement par la bouche) est donné chaque jour pendant 28 jours. Le gavage peut provoquer une inflammation de l’œsophage pour les animaux. Dans ce modèle, le cancer ne se propage pas à d’autres organes.

Devenir

L’ensemble des animaux étant soumis à la chirurgie seront mis à mort car notre projet nécessite le prélèvement d’organes pour analyse.

Remplacement

Nos recherches étudient comment les cellules du pancréas et d’autres tissus interagissent entre elles. Pour cela, nous avons besoin d’un modèle vivant complet et ne pouvons pas nous contenter de cultures cellulaires en laboratoire. Notre protéine joue un rôle important dans la communication entre cellules et dans la façon dont elles s’adaptent et se modifient. Les expériences sur cellules seules, ne permettent pas de reproduire correctement la structure du pancréas, la circulation sanguine, l’apport en nutriments et en oxygène, ni les interactions avec le système immunitaire et les tissus environnants.

Réduction

Le nombre de groupes et l’effectif de chaque groupe d’animaux ont été réduits au maximum, en se basant sur la littérature et l’utilisation de tests statistiques. Dans un premier temps, plusieurs conditions de prise tumorale seront testées, mais seules les combinaisons qui montrent une vraie prise tumorale (plus de 80 %) seront retenues pour les étapes suivantes. Les observations sur la croissance des tumeurs et la survie des animaux seront analysées avec des méthodes statistiques appropriées, avec des groupes d’environ 10 souris chacun. Les tests utilisés permettent de vérifier si les traitements ont un effet réel sur les tumeurs.

Raffinement

Avant chaque expérience, les souris sont progressivement habituées à la présence des expérimentateurs, avec quelques contacts pendant leur période d’acclimatation, afin de réduire leur stress. Tout au long de l’étude, elles sont surveillées régulièrement grâce à un suivi précis pour détecter tout signe de mal-être ou de perte de poids avec également un suivi de la croissance tumoral à l'aide d'imagerie par echographie. Les interventions chirurgicales et les injections se font sous anesthésie et avec des médicaments pour limiter la douleur. Le personnel qui manipule les animaux est formé et veille à réduire le temps de manipulation pour minimiser le stress. Des mesures de confort sont mises en place : éléments de nidification supplémentaires, tapis chauffant pendant l’anesthésie, nourriture semi-liquide en cas de perte de poids, gel protecteur pour les yeux, et enrichissement des cages après les injections. Les souris, qui ont un système immunitaire affaibli, sont hébergées dans des conditions très propres pour éviter les infections, en petits groupes dans des cages ventilées.

Choix des espèces

Le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils destinés à l'analyse des tissus. Le modèle de sourisutilisé est capable de générer des tumeurs pancréatiques dans 100 % des animaux. Il récapitule les aspects génétiques, moléculaires et micro-environnementaux liés à l’évolution de la maladie humaine. Le modèle de souris immunodéficientes (= avec un système immunitaire incomplet) est nécessaire à la réalisation de cette étude, en effet, les cellules injectées dans le pancréas étant d’origines humaines, il faut nécessairement utiliser ce type de souris afin que les cellules injectées ne soient pas rejetées par l’organisme, ce qui empêcherait la prise tumorale. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines. A ces âges, les animaux présentent des caractéristiques adultes avec un pancréas développé et fonctionnel et sont réceptifs à la prise tumorale. Les souris utilisées seront de sexe mâles et femelles.

Stressées dix minutes par jour pendant cinq jours, ou privées de sommeil six heures d'affilée, des souris sont ensuite opérées du cerveau sous anesthésie pendant une heure à une heure trente. 410 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. L'objectif déclaré est de fabriquer un modèle murin de la bascule entre dépression et manie, en manipulant à la fois l'horloge circadienne et le circuit de la récompense. Le porteur annonce des tests comportementaux répétés une à trois fois par animal pour caractériser leur état affectif, sans dire lesquels.

Objectifs

Les troubles affectifs (TAs), tels que le trouble dépressif majeur (TDM) et le trouble bipolaire (BD), se caractérisent par d'importantes perturbations de l'humeur. Les TA sont les formes les plus répandues de maladies mentales et représentent un fardeau énorme pour la société. Les principaux états affectifs sont la dépression (tristesse, perte d'intérêt pour les activités) et la manie (exaltation euphorique, hyperactivité et troubles cognitifs). Les transitions entre les états affectifs se produisent épisodiquement et peuvent être exacerbées par des altérations au niveau génétique, cellulaire et des circuits neuronaux, conduisant à des épisodes durables dans les troubles affectifs. Les mécanismes à l'origine des transitions restent mal compris. Les altérations du sommeil et des rythmes journaliers sont des caractéristiques communes des troubles affectifs. La privation de sommeil (PS) et les traitements chronobiologiques peuvent déclencher des épisodes maniaques chez les patients atteints de trouble bipolaire et/ou inverser les épisodes dépressifs, ce qui suggère que la perte de sommeil induit un changement global des états affectifs. En outre, des modifications du système impliqué dans la récompense ont été largement impliquées dans les troubles affectifs et la régulation du sommeil. La manipulation des gènes régulateurs des rythmes journaliers et du système de récompense dans les circuits cérébraux impliqués pourraient générer des états comportementaux dépressifs, maniaques ou mixtes. Il est donc important d'élucider les voies neurobiologiques qui sous-tendent les changements physiologiques dans les états affectifs pour comprendre les mécanismes impliqués dans la pathogenèse des troubles affectifs et développer de nouvelles approches thérapeutiques. Les objectifs de ce projet sont de générer et de caractériser fonctionnellement et comportementalement des modèles de souris pour les transitions d'états affectifs (manie ou dépression) en manipulant le cycle veille-sommeil, les rythmes et le système de la récompense.

Bénéfices attendus

Les troubles affectifs sont des troubles psychiatriques graves caractérisés par un phénotype comportemental complexe, une pathophysiologie peu claire et un traitement difficile. Un modèle animal adéquat servant d’outil utile pour faire progresser les connaissances fait toujours défaut. Ce projet permettra la génération et la caractérisation fonctionnelle et comportementale d'un nouveau modèle de souris pour la transition d'état dans les troubles affectifss. Ce nouveau modèle qui combinera simultanément les deux principales hypothèses de la pathologie - troubles des rythmes et du système de la récompense. Son but ultime est d'améliorer notre compréhension de la neurobiologie des troubles affectifs et de déboucher sur de potentielles nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Deux modèles de trouble affectif seront mis en place sur animal vigile: un état dépressif induit par exposition répété de l'animal à une situation stressante 10 minutes/jour pendant 5 jours) ou un état maniaque (privation de sommeil pendant 6 heures une fois).Les animaux seront ensuite soumis à une procédure chirurgicale réalisée sous anesthésie générale et analgésie adaptée (durée 1h à 1h30). Une partie de ces animaux opérés sera ensuite soumise à un traitement administré soit par injection (1 injection/animal vigile, durée quelques secondes) ou via l'eau de boisson (durée 7j). Pour finir les animaux vigiles seront soumis à des tests comportementaux visant à caractériser leur état affectif. Ces tests seront répétés de 1 à 3 fois /souris et ils durent en moyenne 5 à 10 minutes. Enfin les animaux surbiront une chirurgie terminale (durée 10 minutes) réalisée sur animal anesthésié.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet subiront un paradigme de stress ou une privation de sommeil ou un traitement pharmacologique afin d’induire soit un état tde ype dépressif, soit un état de type maniaque . Les conséquences des deux états inclueront une perturbation des rythmes biologiques des souris comme le rythme veille/sommeil, de l’anxiété, une perte d’appétence pour le plaisir, du desespoir mais également de l’hyperactivité et des troubles cognitifs. Certaines substances pharmacologiques injectées pourront également induire une production accrue d'urine ou un gain de poids . Les injections en elles-mêmes pourront générer une douleur aigue. La chirurgie réalisée sur certains animaux pourra induira une douleur modérée et occasionner , bien que très rarement, inflammation ou infection. Le placement en cage individuelle de certains animaux sur une courte durée, pour réaliser une partie de l'étude, pourra induire un stress léger.

Devenir

La mise à mort des souris de ce projet est nécessaire pour le prélévement de tissus nécssaires aux analyses moléculaire et histologiques.

Remplacement

La complexité du cerveau des mammifères est unique. Bien qu'il soit maintenant possible d'étudier de nombreux problèmes neurobiologiques sur des cellules isolées ou des cultures de tissus, l'utilisation de modèles animaux ne peut être remplacer dans ce projet puisqu'il s'agit de modéliser des troubles affectifs. Les connaissances sur ces troubles et les changements d’état qu'ils génèrent (état dépressif et maniaques) sont bien trop limités, et de fait aucun modèle in silico ou in vitro n’existe pour les modéliser dans toute leur complexité. En effet, il s’agit d’une maladie complexe, faisant probablement intervenir plusieurs types cellulaires spécifique et régions du cerveau. En outre, l’étude du comportement animal est primordiale pour comprendre les troubles affectifs.

Réduction

La taille des échantillons a été déterminée sur la base d'une vaste expérience de laboratoire et a été vérifiée par une analyse statistique de puissance. Dans des travaux antérieurs, aucune différence n’a été observée entre les mâles et les femelles ce qui permet d'optimiser l'utilisation des portées des lignées de souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet.

Raffinement

2 semaines d’acclimatation à la salle d’hébergement sont mises en place avant toutes procédures. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux dans des cages enrichies leur permettant d’exprimer les comportements naturels de l’espèce : matériel de nidification et à ronger. Un tunnel sera ajouté pemrettant de réduire le stress lors des transferts de cage au cours du change. La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale et analgésie adaptée multi-modale. La températuire corporelle des animaux est maintenue grâce à un tapis chauffant thermostaté relié à une sonde rectale. De plus, une pommade ophtalmique sera appliquée sur les yeux empêchant la déshydratation oculaire. En fin de chirurgie, l'animal sera réhydraté et réchauffé jusqu’à son réveil complet. L'accès à la nourriture sera facilitée par ajout de nourriture gélifiée et de croquettes dans la cage. Suite à la chirurgie, un traitement post-opératoire analgésique sera mis en place pendant plusieurs jours et l'état de santé des animaux sera suivi quotidiennement et objectivés grâce à une grille d'évaluation de plusieurs paramètres algiques, comportementaux et physiologiques. Lors des tests comportementaux des mesures sont mises en place pour limiter l'impact de ces tests sur le bien-être des animaux. De plus, des points limites ont été établis pour pouvoir interrompre les procédures afin de limiter la souffrance animale en mettant en place des mesures correctives adaptées.

Choix des espèces

Les cerveaux murin et humain possèdent de nombreuses similitudes, des régions et circuits analogues mais aussi une réponse au stress, permettant de modéliser des réactions et phénotype proche des troubles affectifs. L’utilisation de modèles de stress largement établis chez la souris ainsi que de tests comportementaux pour mesurer le stress/anxiété/manie est également un énorme atout, tout comme les modèles génétiques permettant une étude approfondie des mécanismes moléculaires impliqués. de plus, les souris réagissent de manière prévisible aux traitements antidépresseurs et anxioliytiquesqui sont utilisés chez l'humain. Notre étude sera effectuée chez l'adulte jeune (8-14 semaines). L’étude repose sur l'exploration des comportements et nécessite que les systèmes neurobiologiques soient totalement mâtures.