Recherche fondamentale

320 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune soumise à sept semaines de régime alimentaire spécifique puis à quatre semaines de traitement dans l'eau de boisson pour détruire la myéline de son cerveau. S'y ajoutent une biopsie de la queue, une anesthésie générale de 45 minutes à 1 h 30, des injections intracérébrales et une chirurgie d'une heure et demie ouvrant une fenêtre d'imagerie. Le porteur affirme que la souris est "le seul modèle" permettant de suivre en temps réel l'effet de la perte de myéline sur des types précis de neurones. Une partie des animaux est tuée sans avoir servi, faute de porter le génotype recherché, les autres le sont pour que leur cerveau soit prélevé.

Objectifs

La myéline est une gaine protectrice qui entoure certaines cellules du cerveau et permet une bonne transmission des messages nerveux. Lorsqu’elle est abîmée, comme dans la sclérose en plaques, cela perturbe non seulement la transmission de l'information, mais aussi la communication entre les cellules du cerveau. Notre projet cherche à mieux comprendre ce lien encore peu exploré entre la myéline et le bon fonctionnement du cerveau. Nous nous intéressons particulièrement à un type de cellule clé dans le traitement de l'information, souvent touché dans ce type de maladie. Ces cellules sont aussi entourées d’une matrice de soutien qui se dégrade quand la myéline est atteinte. Nous pensons que cette double atteinte, à la fois la perte de la gaine protectrice et la dégradation de cette matrice, pourrait fortement perturber le fonctionnement du cerveau. Nous allons donc observer comment les cellules réagissent à la perte, puis à la réparation de la myéline, et comment leur environnement évolue. Ces recherches pourraient ouvrir la voie à de nouveaux traitements, visant à protéger à la fois la myéline et les connexions essentielles entre les cellules du cerveau.

Bénéfices attendus

Ce projet démontrera comment la perte de la myéline altère la communication des neurones et comment la matrice qui les entourent peut les protéger. Ces découvertes éclaireront le fonctionnement des connexions entre neurones dans des individus sains et malades. Elles pourraient mener à de nouvelles thérapies combinant protection de la myéline et de la communication entre neurones, particulièrement pertinentes pour la sclérose en plaques. En révélant ces mécanismes clés, cette recherche ouvre la voie à des traitements innovants préservant les fonctions cérébrales.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1) Réalisation de biopsies à la queue (une fois, durant quelques secondes); 2) un traitement alimentaire spécifique de 7 semaines; 3) un traitement spécifique dans l’eau de boisson de 4 semaines; 4) injections sous-cutanées pour les analgésiques; 5) anesthésie générale (durée : 45 minutes à 1h30); 6) injections intracérébrales (durée : 45 minutes); 7) chirurgie pour l’imagerie cérébrale (durée : 1h30); 8) séance d'habituation et d'imagerie (durée : 45 min à 1h); 8) prélèvement des cerveaux pour des analyses.

Impact sur les animaux

La biopsie peut provoquer un stress léger et l’anesthésie générale peut provoquer également un stress léger. Concernant la chirurgie, les nuisances comprennent douleur modérée post opératoire. Concernant les injections sous-cutanées, une douleur légère peut survenir. En ce qui concerne l’imagerie du cerveau, les nuisances peuvent inclure un stress léger de la manipulation.

Devenir

Certains animaux sont mis à mort car ils sont sans génotype d’intérêt pour le projet. Tous les autres animaux seront utilisés pour des expériences et seront mis à mort afin de pouvoir collecter leur cerveau.

Remplacement

Notre compréhension des mécanismes impliqués dans les maladies telles que la sclérose en plaques sera toujours insuffisante si ces mécanismes ne sont pas induits et analysés dans leur milieu naturel complexe. En étudiant les différentes composantes de façon isolée, de nombreux effets émergents de l'activité neuronale et des interactions cellulaires seront obligatoirement négligées. L’utilisation de l’animal est donc primordiale pour obtenir des résultats qui puissent avoir un véritable impact dans le développement de nouvelles thérapies chez l’homme. Les souris sont le seul modèle permettant d'étudier l'effet des altérations de la myéline sur des types spécifiques de neurones par imagerie cellulaire en temps réel.

Réduction

La stratégie que nous avons utilisée pour maintenir la lignée de souris est calculée de manière à minimiser au maximum le nombre de souris. Le nombre de cages pour les élevages a été réduit afin d'obtenir la production minimale nécessaire pour nos expériences. Afin de réduire au strict minimum nécessaire le nombre d’animaux, nous utiliserons une analyse de puissance statistique pour déterminer le nombre d’animaux nécessaires afin d’obtenir un résultat scientifiquement fiable. De plus, les données seront analysées avec des tests statistiques adaptés et si la significativité est atteinte avec un nombre d’animaux plus faible que prévu, les expériences seront arrêtées.

Raffinement

Lors des actes chirurgicaux, les animaux sont anesthésiés et reçoivent des analgésiques en pré- et post-opératoires par voie locale et sous-cutanée. Après l’opération, un apport de fluide est effectué pour réhydrater l’animal, puis celui-ci est placé dans une enceinte chauffée jusqu’à son réveil complet. De la nourriture est placée dans la cage d’hébergement afin de faciliter la récupération; la surveillance des animaux est renforcée afin d’éviter toute souffrance; les animaux sont observés régulièrement et une grille précise d’évaluation des points limites est utilisée. Tout signe de douleur est soulagé avec des analgésiques.

Choix des espèces

Les expériences seront réalisées chez des souris génétiquement modifiées. La souris a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux. Les souris présentent un système nerveux suffisamment développé pour permettre une extrapolation des résultats à l’espèce humaine. Une autre raison pour utiliser la souris est la possibilité de manipuler de types précis de cellules chez des animaux transgéniques. Pour le génotypage et les biopsies, les souriceaux ont entre 5 et 10 jours. L'expérimentation est menée sur des animaux adultes entre 2 à 5 mois ce qui nous permet de faire nos protocoles et traitements.

Greffées sous la peau du flanc droit avec des cellules cancéreuses de pancréas, les souris reçoivent une chimiothérapie puis, pour 1280 d'entre elles, une immunothérapie injectée trois fois par semaine pendant trois semaines. 1920 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées, soit lorsqu'un point limite est atteint, soit pour le prélèvement de la tumeur. Le porteur indique que la tumeur peut gêner leurs mouvements et provoquer perte de poids, posture douloureuse, léthargie et arrêt du toilettage. Il affirme qu'aucun effet des traitements sur l'état général n'est attendu et annonce que l'apparition d'éventuels points limites sera recherchée, sans dire lesquels.

Objectifs

Le cancer du pancréas est l'un des cancers les plus courants et les plus mortels. Il est souvent traité par chimiothérapie, mais cette approche n’entraîne pas toujours une guérison complète, surtout dans les formes avancées. On sait que le système immunitaire joue un rôle clé dans l'efficacité de la chimiothérapie, c’est pourquoi on essaie parfois de combiner celle-ci avec de l’immunothérapie (anti-PD-1) pour améliorer les résultats. Cependant, cette combinaison ne fonctionne pas pour le cancer du pancréas, ce qui montre qu’il y a des résistances qu’il faut comprendre. Une molécule, l'IL-1β, est impliquée dans les réponses inflammatoires et peut influencer la façon dont les traitements contre le cancer fonctionnent. Son rôle dans la réponse aux traitements est complexe et n’est pas totalement compris. Le projet a pour but d'étudier l'impact de l’IL-1β sur l’efficacité des traitements combinés chimiothérapie et immunothérapie contre le cancer du pancréas chez la souris. En examinant les cellules immunitaires présentes dans les tumeurs, l’objectif est de voir comment la présence ou l'absence d’IL-1β affecte les résultats des traitements et de mieux comprendre les raisons pour lesquelles certains traitements ne fonctionnent pas.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est d’évaluer le rôle de la voie IL-1β/IL-1R1, sur l’efficacité anti-tumorale des chimio-immunothérapies, utilisées en clinique dans différents modèles de cancers murins. Ce projet permettra également de déterminer les cellules cibles et les cellules produisant cette cytokine. En invalidant l’expression de l’IL-1β soit dans les cellules cancéreuses, soit dans les cellules de l’hôte, nous déterminerons son origine. En invalidant l’expression de IL-1R1 soit dans les cellules cancéreuses, soit dans les cellules de l’hôte, nous déterminerons quelle est la cible cellulaire de l’IL-1β. Dans ce projet, nous évaluerons l’efficacité des traitements sur la croissance tumorale. Etant donné que certaines cellules du système immunitaire peuvent contribuer à l’élimination des cancers, nous étudierons leur présence et leur état d’activation au niveau des tumeurs, chez les souris traitées ou non par chimio-immunothérapie. L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre les mécanismes immunologiques associés aux tumeurs et de rechercher des moyens de potentialiser la chimio-immunothérapie, jusqu’alors peu efficaces dans le traitement du cancer.

Procédures

- Injection des cellules cancéreuses murines : - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse - Une seule injection par animal - Durée : 5 minutes - Nombre de souris : 1920. - Traitements par chimiothérapie ou PBS : - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 1920 - Traitements par immunothérapie : - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection trois fois par semaine pendant 3 semaines par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 1280

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales en sous-cutané génère une masse tumorale au niveau du flanc droit pouvant gêner la liberté de mouvement de l’animal. Une altération de l’état général est possible, du fait de la pathologie cancéreuse induite (perte de poids, posture douloureuse, léthargie, absence de toilettage ). Aucun effet des traitements utilisés sur l’état général de la souris n’est attendu.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Les souris utilisées pour les expériences de croissances tumorales seront mises à mort lorsqu’un point limite sera atteint. Les souris utilisées pour les expériences d’analyse du système immunitaire seront mises à mort afin de prélever la tumeur.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

Les groupes seront constitués de 10 animaux (suivis de croissance) ou de 5 animaux (immunomonitoring) afin de considérer les variabilités inter-individuelles. Les expériences ne seront réalisées que deux fois ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude tout en en conservant la puissance statistique nécessaire. Le test statistique utilisé sera celui de Kruskal-Wallis en raison de la présence de nombreux groupes. Les 2 modèles utilisés dans ce projet sont nécessaires. En effet, des mutations intrinsèques des cellules cancéreuses utilisées, le microenvironnement tumoral sont différents et peuvent affecter la réponse aux traitements. Les expériences de croissances tumorales seront réalisées en premier. Si aucune différence entre les différents groupes n’est observée pour un ou plusieurs modèles, les expériences d’immunomonitoring ne seront pas réalisées sur ces mêmes modèles. Si certains groupes de traitements (par exemple FOLFIRIONOX ou Gem/N-PTX) n’ont aucun effet démontré dans la partie I, ces groupes ne seront pas utilisés dans la partie II.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (en groupes, dans un environnement enrichi avec mise à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids). Les animaux seront habitués aux techniques de préhension de contention et de pesées. Une anesthésie générale gazeuse (isoflurane 3% + oxygène 1.5L/min) sera réalisée avant chaque greffe et pour les traitements intra-tumoraux. Durant toute l’expérience, suivi du poids et évaluation de la NEC (Note d’Etat Corporel) au minimum trois fois par semaine. L’apparition d’éventuels points limites sera recherchée. Le volume tumoral sera déterminé trois fois par semaine, afin d’appréhender au plus tôt d’éventuels signes de souffrance.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Diverses souches de souris immunocompétentes sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. De plus, l’existence des souris C57BL/6 génétiquement modifiées pour ne plus exprimer l’IL-1R1 ou l’IL-1β renforce le choix de cette espèce. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.

Rasées sur le dos, puis enduites chaque jour pendant cinq jours d'une crème qui provoque rougeurs, épaississement de la peau et desquamation, 100 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de la peau et des organes. Vingt d'entre elles sont gavées trois jours de suite, quarante reçoivent des injections quotidiennes d'un anticorps ciblant la molécule CD146 ou d'un placebo. Le projet cherche à savoir si cette molécule intervient dans le psoriasis et si la bloquer soulage la maladie, ainsi que l'athérosclérose qui l'accompagne souvent. Le porteur cite des études cliniques déjà menées sur des patients psoriasiques, les juge descriptives, et affirme qu'il n'existe "aucune alternative à l'animal" pour étudier cette maladie.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de la molécule d'adhésion cellulaire CD146 également appelée MCAM (Melanoma Cell Adhesion Molecule) dans la physiopathologie du psoriasis et à évaluer cette molécule comme cible thérapeutique dans le psoriasis et une comorbidité associée au psoriasis, l'athérosclérose.

Bénéfices attendus

Plusieurs études cliniques portant sur des patients psoriasiques ont été menées antérieurement pour évaluer les niveaux d’expression de la molécule d'adhésion cellulaire CD146/MCAM sur des biopsies de peau, quantifier les concentrations de sa forme soluble dans le sang ou pour étudier les différentes sous-populations leucocytaires exprimant ce marqueur cellulaire dans le sang. Cependant, ces études restent descriptives et ne permettent pas d’évaluer le rôle du CD146 global, du CD146 endothélial ou du CD146 exprimé par certaines cellules du système immunitaire sécrétrices de la cytokine proinflammatoire interleukine 17 dans la pathogenèse du psoriasis. Contrairement à notre projet qui compare des souris mutées ou non pour CD146, ces études ne permettent pas d’étudier les voies de signalisation régulées par CD146. De plus, ces études cliniques n’ont pas évalué l’effet de thérapies ciblant CD146. Ainsi, ce projet permettra d'identifier des mécanismes moléculaires régulés par CD146 dans la pathogenèse du psoriasis. Il permettra aussi d'évaluer dans un modèle murin le bénéfice thérapeutique d'anticorps monoclonaux ciblant CD146 pour traiter le psoriasis et une comorbidité associée au psoriasis, l'athérosclérose.

Procédures

Tous les animaux du projet seront rasés une fois sur le dos (2 minutes par souris). Ils recevront un traitement sous la forme d'une application quotidienne de crème sur le dos pendant 5 jours (30 secondes par application). 20 souris seront gavées avec une solution diluée dans de l'huile de maïs une fois par jour pendant 3 jours (30 secondes par gavage). 40 souris recevront des injections quotidiennes d'un traitement ciblant CD146 ou un placebo pendant 5 jours (30 secondes par injection). Un prélèvement sanguin sera effectué sur toutes les souris (30 secondes par prélèvement).

Impact sur les animaux

20 souris seront gavées une fois par jour pendant 3 jours avec une solution à base d'huile de maïs. Bien que le gavage ne soit pas douloureux, cela pourrait tout de même causer une gêne à l'animal ou un stress du fait de sa répétition et de la contention. Les souris seront rasées sur le dos, ce qui pourrait générer un stress. L'application d'un traitement à base de crème sur la peau des souris pour induire le psoriasis devrait entraîner une inflammation associée à à l'apparition de rougeurs, un épaississement de la peau et une desquamation en plaques. Ce traitement peut entraîner une déshydratation et une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure pour pouvoir évaluer les conséquences physiopathologiques par de l'histologie, l’étude de l'expression protéique et génétique des marqueurs de dommages tissulaires et inflammation à partir des organes et des tissus d'intérêt.

Remplacement

Nous étudions l'implication de la molécule d'adhésion cellulaire CD146, également appelée MCAM (Melanoma Cell Adhesion Molecule) dans la pathogenèse du psoriasis. Cette pathologie autoimmune implique différents types cellulaires (kératinocytes, fibroblastes, cellules endothéliales, cellules du système immunitaire), avec de nombreuses interactions biochimiques et cellulaires. Malheureusement, il est impossible de reproduire un système aussi complexe dans un modèle in vitro, le recours à l'animal est donc nécessaire. A ce jour, dans la littérature, il n’existe aucune alternative à l’animal pour étudier cette maladie.

Réduction

Afin de réduire le nombre de souris nécessaires pour générer les effectifs de chaque groupe utilisé dans les procédures expérimentales, nous utiliserons des souris issues d'accouplements homozygotes et nous utiliserons aussi bien des mâles que des femelles, le psoriasis touchant chez l'humain autant les hommes que les femmes. En l'absence de toute étude antérieure sur le rôle de la molécule d'adhésion cellulaire CD146 dans le psoriasis chez la souris, nous évaluerons son implication dans cette pathologie en comparant des groupes de 10 souris entre eux, effectif minimal déterminé par une approche statistique pour mettre en évidence de potentielles différences significatives.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 10 jours sera observée après l’arrivée des animaux issus des établissements d'élevage. Les souris seront observées avant d’initier le protocole et les animaux présentant des symptômes type infection seront écartés des protocoles. Le protocole sera arrêté si l’animal présente des difficultés à respirer (visualisées par une augmentation des rythmes cardiaque et respiratoire répercutée au niveau des flancs de l’animal), si l’animal est prostré ou en retrait, si ses poils sont hérissés. Les animaux seront pesés une fois par jour et observés deux fois par jour pour prévenir tout risque de déshydratation liée à leur traitement. Les animaux seront hébergés en groupe avec un enrichissement. Les animaux disposeront de nestlets, nids à base de fibres courtes de coton, utilisés comme enrichissement de l ’environnement et matériaux de nidification, ainsi que de tunnels afin de réduire l'ennui et de diminuer le stress en stimulant l'activité et en procurant un sentiment de sécurité à l'animal.

Choix des espèces

Le modèle de souris présente de nombreux avantages pour notre protocole expérimental. Outre sa petite taille et son coût avantageux, la souris permet de générer un grand nombre de descendants très rapidement. Par ailleurs, sa manipulabilité génétique permet d'analyser l'effet de mutations du gène cible sur la pathogenèse du psoriasis. La souris permet également d'évaluer l'effet d'un traitement thérapeutique ciblant une protéine d'adhésion cellulaire potentiellement impliquée dans le psoriasis et une comorbidité associée, l'athérosclérose. Les souris utilisées seront âgées entre 8 et 16 semaines. Un âge compris entre 8 et 16 semaines est couramment utilisé dans la littérature pour ce modèle induit de psoriasis car l'épaississement de l'épiderme, l'érythème et la desquamation sont clairement visibles à cet âge là. De plus, cette tranche d'âge a permis de mettre en évidence dans plusieurs études les effets thérapeutiques chez la souris de différents traitements utilisés pour soigner le psoriasis chez l'homme.

Une grille de score décide du sort de chaque souris : au score 2, elle est mise à mort. 148 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements de moelle et de tissus. Elles reçoivent du carboplatine, faible dose une fois par semaine six fois ou dose forte toutes les trois semaines, puis six prises de sang à la queue sous anesthésie gazeuse, une mesure du temps de saignement de trente minutes et une chirurgie de l'aorte abdominale. Le porteur qualifie de légères les souffrances liées à la chute des plaquettes, qu'il juge non impactante pour des souris en élevage, et classe la procédure en modérée du seul fait des contentions répétées.

Objectifs

Le cancer reste un défi majeur en France, avec environ 370 000 personnes traitées par chimiothérapie chaque année. Bien qu'efficace, cette approche peut entraîner des thrombopénies (diminution du nombre de plaquettes) induites par chimiothérapie (CIT), une complication sérieuse pouvant retarder les traitements et affecter les chances de guérison. Le carboplatine, utilisé contre les tumeurs solides, est particulièrement connu pour sa toxicité sur la moelle osseuse, provoquant une baisse importante des plaquettes sanguines. L'enjeu principal est de déterminer le schéma thérapeutique optimal pour gérer cette toxicité médullaire. La production de plaquettes est assurée par les mégacaryocytes de la moelle osseuse. Cependant, on ignore encore l'impact précis du carboplatine sur les mégacaryocytes, en particulier dans les cas où la chimiothérapie entraîne de graves perturbations de la moelle osseuse. L'objectif de cette étude est d'analyser de manière qualitative et quantitative l'état fonctionnel des mégacaryocytes de la moelle après traitement au carboplatine. Pour cela, nous utiliserons un modèle préclinique murin mimant la CIT. Cette approche nous permettra de suivre en temps réel la dynamique de libération des plaquettes, tout en surveillant la numération plaquettaire pour corréler la gravité de l'hématotoxicité avec les thrombopénies dose-dépendantes. Nous comparerons également différents schémas d'administration : trois cycles de faibles doses hebdomadaires versus deux cycles de fortes doses toutes les trois semaines. Cette démarche nous aidera à adapter nos modèles précliniques aux réalités cliniques, tenant compte du fait que la fréquence et la gravité de la toxicité peuvent varier selon l'intensité du traitement antérieur. Enfin, le plasma sera prélevé à la fin de chaque cycle pour rechercher des biomarqueurs prédictifs qui pourraient servir à identifier les individus à risque de développer une thrombopénie sévère.

Bénéfices attendus

Les retombées de ce projet sont cognitives et cliniques. Cette étude permettra de mieux comprendre l’impact d’une chimiothérapie sur la moelle osseuse et donc sur la production de plaquettes. Une thrombopénie est un réel frein au traitement des cancers puisque la seule prise en charge actuelle est de décaler le traitement de chimiothérapie, nuisant ainsi à l'efficacité du traitement anti cancéreux.

Procédures

- injection en cinétique d'une molécule de chimiothérapie sur animaux vigiles, soit une dose faible 1 fois par semaine 6x ou une dose plus forte 1 fois toutes les 3 semaines 2x - prélèvement de sang à la queue sous anesthésie gaz 5minutes : 6 x - temps de saignement à la queue sous anesthésie gaz 1x 30 minutes - anesthésie profonde par injection 1x 20 minutes - chirurgie pour un prélèvement à l'aorte abdominale sous anesthésie profonde 1x 20minutes

Impact sur les animaux

- En ce qui concerne les traitements de perte de plaquettes induite par la chimiothérapie (CIT), les souffrances infligées aux animaux sont légères, la thrombopénie induite est certes notable mais non impactante pour des souris en élevage, nous anticipons malgré tous des risques de saignements potentiels en cas de bagarre par un enrichissement supplémentaire et un suivi rigoureux. - Nous prenons en compte le stress généré par les manipulations et contentions répétées et classons la procédure en modérée. - Risque de douleurs et infections sur les zones d'injections ainsi que la section de la queue pour la numération sanguine.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure. Nous prélevons systématiquement des tissus post mortem en vue d'analyses d'imagerie de pointe pour compléter l'étude, et ce afin de limiter le nombre d'animaux utilisés.

Remplacement

Les expériences nécessitent un animal adulte vivant, car elles posent la question du fonctionnement du système hématopoïétique in vivo dans sa totalité, en faisant appel à une multitude de cellules qui interagissent dans toute la complexité du vivant et en particulier la circulation sanguine. En particulier, l’intravasation met en œuvre simultanément des interactions entre les mégacaryocytes (MKs), les vaisseaux et la circulation sanguine. Ces évènements sont intégrés et demandent à être étudiés sur l’animal. Il s’agit d’étudier la capacité des mégacaryocytes à franchir une barrière vasculaire dans des conditions où le microenvironnement natif est fortement perturbé par une chimiothérapie. Des expériences préliminaires réalisées in vitro, sur des MKs cultivés dans des inserts, indiquent que ces cellules ne franchissent pas naturellement une membrane poreuse (même en présence de chimiokines).

Réduction

Pour le dosage plasmatique des marqueurs de prédiction de la thrombopénie peut être réalisé sur le sang d’une seule souris pour chaque point de cinétique, c’est-à-dire 26 points donc 26 souris (répété 3x = 7 selon nos calculs statistiques). Il est prévu une seule cinétique témoin avec le véhicule NaCl de 26 souris qu’il n’est pas nécessaire de reproduire statistiquement. Par ailleurs nous prélevons le maximum de tissus sur les animaux post mortem (imagerie) afin de limiter leur nombre.

Raffinement

Les expériences seront raffinées afin de limiter l’angoisse, l’inconfort, le stress et la douleur associés aux procédures expérimentales. Les moyens de raffinement des expérimentations sont les suivants : - Pendant l’hébergement, les animaux sont élevés en groupe dans un environnement calme et non stressant et privilégié avec un minimum de manipulation. Le milieu est enrichi avec de la frisure de papier, des carrés de cellulose et des bâtonnets de coton afin de permettre aux souris de confectionner leur nid et structurer leur environnement. Des croquettes sont déposées sur le fond de la cage pour favoriser le comportement de fouissage. Les prélèvements de sang à la queue seront réalisés sous anesthésie gazeuse, nous appliquerons un tampon hémostatique pour arrêter le saignement avant de replacer l'animal dans sa cage. A la fin de l’expérimentation, les animaux sont sacrifiés avant leur réveil. Une fiche de suivi avec les points limites définis sera mise en place afin de pouvoir contrôler l’état des animaux tout au long du protocole expérimental. Quand un score de 2 est observé, la souris est mise à mort. Quand un score de 1 est observé, une attention particulière est apportée à l’animal et une décision est prise : augmentation de l’enrichissement, soins. Concrètement, lors de la surveillance quotidienne des animaux, nous observerons attentivement l’aspect des souris pour s’assurer de l’absence de signes extérieurs d’infection tels que des lésions cutanées ou des écoulements nasaux ou oculaires. Une attention particulière sera apportée au niveau des sites d’injection des substances pour s’assurer qu’il n’y a pas d’infections. Pour limiter au maximum l'agressivité, les animaux restent entre individus issus de la même cage d'origine avec un enrichissement accru.

Choix des espèces

La souris est largement utilisée pour étudier et modéliser la biologie et la physiologie humaine. De nombreux outils ont été développés pour suivre chez cet animal la production des plaquettes sanguines à partir de leur précurseurs les mégacaryocytes (ex : anticorps, souris génétiquement modifiées, suivi en imagerie intra vitale). La connaissance de la souris et notre expertise d’imagerie adaptées à cette problématique conduisent à choisir cet animal pour l’étude. Par ailleurs la souris est un mammifère qui, par expérience, supporte bien les traitements de CIT (limités à quelques jours et à des doses d’injections faibles basées sur la clinique), et présente une thrombopénie proche de celle des patients humains dans les conditions de chimiothérapies. C'est également un animal indiqué pour le suivi des traitements pharmacologiques en général. Les expériences ne demandent pas de stade de développement particulier, nous utiliserons des souris adultes entre 8-18 semaines.

Tapis roulant une semaine, test de préhension sur grille la suivante, et cela de la quatrième à la quarante-troisième semaine : 324 souris porteuses d'une forme lente de la maladie de Charcot vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent le lysat de plaquettes par ponction intrathécale, l'équivalent d'une ponction lombaire chez l'humain, et subissent six prélèvements sanguins étalés sur 300 jours. La mise à mort sert à prélever les tissus nerveux et à supprimer les animaux dont la pathologie a atteint son maximum. Le porteur décrit un modèle sans amyotrophie, sans perte de poids et sans signes de douleur, dont l'atteinte motrice ne se révèle que lorsqu'un effort est demandé.

Objectifs

La maladie de Charcot est une maladie neurodégénérative incurable, mortelle, causée par la perte des neurones moteurs localisés dans le cerveau et la moelle épinière et qui sont responsables de la contraction des muscles striés. La maladie de Charcot touche environ 7000 patients en France. La maladie débute généralement entre 50 et 70 ans par une faiblesse musculaire, évoluant rapidement vers une paralysie généralisée des membres et une insuffisance respiratoire qui conduit au décès dans les 3 ans suivant l'apparition des symptômes. L’administration de lysats de plaquettes sanguines dans le cerveau de souris modèles de la maladie a déjà démontré ses effets thérapeutiques. Ce présent projet translationnel s’inscrit dans un projet global d’essai clinique ou une voie alternative efficace à l’administration directe dans le cerveau est explorée. La voie intrathécale est une approche peu invasive, simple et rapide qui permet aux médicaments administrés d'atteindre rapidement la moelle épinière. Notre objectif est donc d’évaluer l’effet thérapeutique de l’administration intrathécale de lysat de plaquettes dans des animaux qui présentent des signes de la maladie. Ce modèle est différent de celui qui a permis d’établir la preuve de concept, il permet de mimer l’hétérogénéité clinique de la maladie de Charcot. Le modèle que nous utilisons est un modèle léger de la maladie. La règle des 3R est appliquée à ce projet dans son ensemble. Le but est d’offrir une alternative thérapeutique peu invasive, plus accessible cliniquement, qui pourra s’intégrer ultérieurement dans une démarche clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet s’insère dans un programme de recherche hospitalo-universitaire qui doit aboutir à un essai clinique chez les patients atteints de la maladie de Charcot. Les expériences de notre partenaire ont démontré le pouvoir thérapeutique du lysat des plaquettes sanguines dans un modèle sévère de la maladie de Charcot. La preuve de concept s’est faite par une injection dans le cerveau qui est invasive. Notre objectif est d’évaluer une voie d’administration alternative peu invasive, simple et rapide dans un modèle moins sévère de la maladie de Charcot. Nos partenaires évaluent en parallèle cette même méthode alternative dans un modèle sévère de la maladie. Notre projet permettra de consolider cette approche thérapeutique avant de réaliser les premiers essais cliniques. L’utilisation d’un modèle différent de celui utilisé par nos collaborateurs permet de mimer l’hétérogénéité clinique de la maladie et représente donc un autre point fort de cette étude. Le bénéfice de notre approche est clairement identifiable de par la robustesse et la reproductibilité de nos résultats et l’application directe vers la clinique. La valorisation de ce projet se traduira par des publications dans des journaux internationaux à comité de lecture et un/des dépôts de brevet et la participation à la réalisation d’un essai clinique.

Procédures

Le projet implique de délivrer du lysat plaquettaire par voie intrathécale et de réaliser des prélèvements sanguins. Ces procédures réalisées sur animaux vigiles sont rapides (2 min maximum) et n’occasionnent que le stress de la contention et celui d’une piqûre. Afin de suivre l’évolution des capacités motrices des souris atteintes de la maladie de Charcot, les animaux seront suivis par des tests comportementaux simples, non invasifs, ne nécessitant pas de déprivation de nourriture et ne durent pas plus de 5 min. Trois tests comportementaux moteurs seront ici utilisés pour définir les capacités motrices. Le test du tapis roulant évalue l’endurance à l’effort. Ce test n’excède pas 20 min. Lorsque ce test est réalisé aucun autre test n’est réalisé dans la semaine afin de permettre une bonne récupération. Nous avons besoin de réaliser des études d’histologie du système nerveux. A cette fin, une préparation des tissus est nécessaire avant de procéder à la biopsie. Nous procédons donc à une perfusion ou ponction intra-cardiaque sur des animaux anesthésiés ayant reçu une dose léthale d’anesthésique/analgésique chimique. Cette procédure prend moins de 5 min par animal.

Impact sur les animaux

La maladie de Charcot est une maladie paralysante incurable dont l’issue est inexorablement fatale. Le modèle murin que nous utilisons a été déjà phénotypé dans de nombreuses publications, ce qui nous assure une optimisation de la règle des 3Rs. Le modèle de souris que nous utilisons perd très lentement ses capacités à effectuer des taches motrices et certains individus peuvent tardivement présenter une posture anormale (dandinement) qui est stable, et ne gêne pas l’accès à la nourriture et eau, pour suivre un déclin normal lié à l’âge et à la prise de poids. Ce modèle présente une atteinte motrice qui est principalement révélée lors d’une demande d’effort. Ce modèle ne présente pas une espérance de vie plus courte et la pathologie n’est pas associée à une amyotrophie et une perte de poids. Les souris, comme c’est le cas chez les patients, ne présentent pas de signes de douleurs. Notre objectif est d’améliorer les symptômes moteurs par une approche d’administration intra-thécale qui est une piqure de courte durée. Cette administration est standardisée, simple, rapide et sure pour l’animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour répondre à deux nécessités du projet : 1) prélever des tissus afin d’étudier les paramètres histologiques en liens avec des caractéristiques cliniques et un effet thérapeutique. 2) L’autre nécessité, qui est liée à la pathologie elle-même, est d’euthanasier des animaux à phénotype dommageable une fois la manifestation de la pathologie est maximale.

Remplacement

L’utilisation de souris mimant la pathologie humaine est le seul système qui permet de valider l’effet thérapeutique d’une biothérapie qui bloque différents processus cellulaires et moléculaires impliqués dans la maladie de Charcot. Les résultats précédents ont démontré le pouvoir thérapeutique du lysat des plaquettes sanguines dans un modèle souris de la maladie de Charcot quand celui-ci est administré directement dans le cerveau. Une étude à plus grande échelle prévoit une administration continue chez des patients atteints de la maladie de Charcot à un stade précoce. Notre mission est de proposer une voie d’administration alternative qui est peu invasive et rapide. L’administration intrathécale, qui correspond chez l’humain à réaliser un geste de ponction lombaire, de biomolécules répond à ces critères et offre un moyen de délivrer facilement les molécules thérapeutiques dans le système nerveux. Le modèle vivant demeure donc nécessaire pour évaluer une nouvelle voie d’administration et pour développer tout transfert thérapeutique vers la clinique.

Réduction

Le nombre de souris est déterminé en suivant scrupuleusement les recommandations internationales et les études qui définissent les tailles optimales des cohortes de souris modèles de la maladie. Nous suivons donc un traitement statistique qui permet de réduire le nombre d’animaux et de limiter les faux positifs. Nous nous référons aux études réalisées sur les effets de taille de groupe sur la puissance et la fiabilité des tests statistiques. Chaque cohorte est composée de 16 souris pour le comportement et 8 souris pour les études histologiques. Nous utilisons également des cohortes mixtes mâle et femelle, réduisant ainsi le nombre d’animaux euthanasiés au sevrage.

Raffinement

Une connaissance extensive du modèle de la maladie de Charcot permet de connaître et donc d’anticiper les différents jalons de la maladie et donc d’optimiser l’expérimentation. La lignée de souris utilisée ne présente une forme légère de la maladie de Charcot qui se caractérise principalement par un défaut à effectuer un effort moteur. Ces souris ne présentent pas d’amyotrophie, pas de perte de poids et n’ont pas une durée de vie limitée. Une surveillance régulière est mise en place et assurée par les expérimentateurs et nous travaillons étroitement avec la structure du bien-être animal. Les conditions d’élevage qui incluent des copeaux dans les litières, un igloo et du coton vierge pour faire un nid végétal contribue à améliorer le bien-être des animaux en créant un microenvironnement propice au repos. Une surveillance visuelle quotidienne est effectuée par les zootechniciens. L’administration intrathécale est une approche rapide, peu invasive et peu douloureuse, et qui est conforme aux recommandations de la littérature. Afin de réduire le nombre de gestes le jour de l’injection, nous rasons la zone d’injection la veille. Avant l’injection intrathécale, nous injectons un anesthésique. Afin de s’assurer d’une injection efficace de la solution thérapeutique et d’ainsi optimiser le nombre d’animaux par cohorte, nous utilisons lors de l’injection deux marqueurs visuels de la bonne réalisation du geste : un mouvement reflexe de la queue et la présence temporaire de quelques minutes de membres postérieurs flaccides induit par la présence d’un anesthésique. De plus, les animaux sont suivis régulièrement après chaque administration. Toute anomalie indépendante de la pathologie comme des signes d’angoisse, de détresse, de douleur ou d’infection est signalée afin d’apporter une réponse rapide et adaptée.

Choix des espèces

Les lignées transgéniques modèles de la maladie de Charcot récapitulent l’hétérogénéité clinique de la pathologie et renforce la validité des résultats: début précoce/tardif, progression lente/rapide, traits cliniques, électrophysiologiques et histopathologiques spécifiques de la maladie. L’exploration des propriétés phénotypiques et génétiques des neutrophiles au cours de la maladie ainsi que le protocole d’immunothérapie que nous proposons requiert une expérimentation sur les modèles murins de la maladie. Notre étude a en effet pour objectif d’amener au plus proche de la clinique une stratégie d’immunothérapie. La complexité des interactions entre le système immunitaire et le système nerveux requiert un modèle à la physiologie complexe qui se rapproche de celle de l’homme. Le modèle de la maladie de Charcot que nous utilisons présente un phénotype léger de la maladie avec une progression lente. Pour l’étude comportementale, les animaux vont alterner d’une semaine à l’autre un test moteur. Les tests débuteront la 4ème semaine (30 j) avec le tapis roulant, la semaine suivante les animaux effectuerons le test de préhension d’une grille. Ce jusqu’à la 43ème semaine (300 jours). Les prélèvements sanguins sont effectués à 6 temps qui comprennent le stade avant l’administration (60 j), au début de l’administration (90j) et durant la progression des déficits moteurs (120, 190, 240 jours) et la fin de l’étude (300 jours). Cette fréquence assure le suivi longitudinal des paramètres sanguins étudiés. Pour l’étude des tissus, certains seront prélevés à des stades correspondant au début de l’administration (90 j), à la phase précoce et au pic de la progression (120 et 240 j) et au stade terminal de l’étude (300 j).

Une perte de poids supérieure à 20 %, ou une douleur qui résiste aux analgésiques, fait sortir la souris de l'étude et la fait tuer. 600 souris vont être utilisées dans ce second établissement, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement d'organes. Elles passent douze semaines sous une alimentation à 60 % de lipides, reçoivent une mini-pompe implantée par chirurgie, deux injections dans la trachée et deux dans une veine chaque semaine pendant un mois, une échographie cardiaque hebdomadaire et un test de tolérance au glucose de deux heures. Les animaux font le trajet à pied entre les deux établissements, dans des sacs opaques, et les retombées annoncées pour des personnes de 70 à 80 ans sont renvoyées au long terme.

Objectifs

Avec l’âge, le cœur perd progressivement sa capacité à se remplir correctement, ce qui peut conduire à une forme fréquente d’insuffisance cardiaque chez les personnes âgées. Ce projet vise à mieux comprendre comment le vieillissement contribue à cette maladie. En particulier, nous nous intéressons à des cellules dites « sénescentes » qui s’accumulent dans le cœur avec l’âge et impactent la fonction cardiaque. Le projet testera également de nouvelles approches pour éliminer ou neutraliser ces cellules nuisibles, dans le but d’améliorer la santé cardiaque. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de mieux prévenir ou traiter cette forme d’insuffisance cardiaque, pour laquelle il n’existe à ce jour pas de traitement efficace. À long terme, ces travaux pourraient contribuer à améliorer la qualité de vie et l’espérance de vie des personnes âgées souffrant de maladies cardiovasculaires.

Procédures

Les souris suivront plusieurs types d’interventions : alimentation modifiée riche en graisse (60% kcal) pendant 12 semaines ; une chirurgie pour implanter une mini-pompe sur animal anesthésié (intervention de 10min) ; des injections intra-trachéales 2x par semaine d’une durée de quelques secondes à 1 min chacune (temps d’intubation et injection, sur animal anesthésié) et intra-veineuse 2x par semaine (quelques secondes par injection, sur animal vigile), pendant 4 semaines; des examens du coeur par échographie 1x par semaine, environ 10 min, sur animal anesthésié; des exercices physiques adaptés (quelques minutes par séance) ; un test de tolérance à l’insuline et au glucose en fin de protocole (intervention de 2h).

Impact sur les animaux

Certains régimes peuvent entraîner une prise de poids, une fatigue ou une réduction de mobilité. Des traitements peuvent provoquer une tension élevée ou une inflammation. Les signes de douleur ou d’inconfort seront surveillés, et des mesures seront prises pour soulager les animaux ou les retirer de l’étude si nécessaire.

Devenir

L’étude implique des analyses tissulaires nécessitant le prélèvement d’organes. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées sans mise à mort.

Remplacement

Avant d’utiliser des animaux, des expériences sur cellules ont été menées et ont permis d’identifier des cibles thérapeutiques pour lutter contre l’insuffisance cardiaque chez les personnes âgées. Mais pour comprendre les effets du vieillissement sur un organisme entier, les animaux sont indispensables. Ils permettent d’évaluer le fonctionnement du cœur dans un contexte proche de la réalité humaine.

Réduction

Dans un souci de réduction, nous nous limiterons aux seules expériences indispensables et chaque animal sera utilisé pour mesurer un maximum de paramètres. Le nombre d’animaux minimum a été déterminé par approche statistique sans compromettre les résultats scientifiques attendus.

Raffinement

Dans un souci de raffinement, nous mettrons en place plusieurs mesures visant à assurer le bien-être des animaux et à réduire au maximum la douleur et la souffrance associées aux procédures expérimentales : - litière absorbante, renouvelée régulièrement, permettant les comportements naturels (fouille, creusage, nidification). De plus, les animaux obèses seront suivis plus régulièrement (remplissage des biberons, changement de litière plus fréquent si nécessaire). - interaction sociale préservée : les souris seront hébergées en groupes de 5 individus pour éviter l’isolement. - accès libre à l’eau et à la nourriture. Toutes les interventions potentiellement douloureuses seront réalisées sous anesthésie appropriée : - Anesthésie : l’induction et l’entretien seront adaptés en fonction du protocole expérimental. Les souris anesthésiées sont maintenues sur tapis chauffant et du gel oculaire sera appliqué pour prévenir la déshydratation. - Analgésie préventive et post-opératoire : administration de médicaments analgésiques, avec un suivi attentif des animaux pour ajuster les doses si nécessaire. - Les animaux seront surveillés quotidiennement afin de détecter précocement tout signe de souffrance, de détresse ou d’inconfort : poil ébouriffé, posture anormale, signes de déshydratation, détection de signes de douleur (respiration anormale, mouvements réduits, vocalisations inhabituelles), analyse du comportement : isolement, diminution des interactions sociales, réduction de l’activité locomotrice, diminution de la prise alimentaire. - Des points limites stricts ont été définis pour mettre fin à l’expérimentation en cas de souffrance excessive. Un animal sera immédiatement retiré de l’étude et euthanasié si une perte de poids > 20 % est observée ou une douleur persistante ou non contrôlable est détectée malgré l’administration d’analgésiques. Ces mesures permettront de limiter au maximum la souffrance animale tout en assurant la qualité et la fiabilité des résultats obtenus dans cette étude. Le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs sera effectué à pied, pour une durée inférieure à 10 minutes, à l’écart du public, dans des cages de transport sécurisées, placées dans des sacs spécifiquement conçus pour garantir l’obscurité et l’isolement des stimuli extérieurs. Cette procédure vise à réduire au maximum le stress des animaux pendant le déplacement.

Choix des espèces

Les souris sont utilisées car elles développent avec l’âge des signes d’insuffisance cardiaque similaires à ceux des humains, comme un cœur plus rigide ou des troubles de la relaxation cardiaque. Les jeunes souris représentent des adultes jeunes, tandis que les plus âgées correspondent à des personnes de 70 à 80 ans.

Un trou est percé dans l'os du crâne ou dans la mandibule de chaque rat, sous anesthésie profonde, pour y implanter un biomatériau. 600 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec des douleurs postopératoires de vingt-quatre heures au crâne, de trois jours à la mâchoire, des hématomes, des œdèmes mandibulaires et un risque de fracture. Le porteur présente le percement des deux côtés du crâne d'un même animal comme une économie d'animaux, et précise que la lésion mandibulaire ne sera faite que d'un côté pour ne pas empêcher les rats de s'alimenter. Tous sont tués à l'issue pour que les os implantés soient examinés au microscope.

Objectifs

Les os du crâne et du visage sont particulièrement exposés aux pertes osseuses d’origine traumatique, tumorale, infectieuse ou congénitale. Leur réparation nécessite le développement de matériaux capables de soutenir mécaniquement la zone tout en favorisant la repousse osseuse. Avant toute application clinique, ces matériaux doivent être testés dans des modèles animaux adaptés. Le modèle le plus couramment utilisé est la réalisation d’une petite lésion dans l’os du crâne du rat. Cet os n’est pas soumis à des forces mécaniques importantes (il ne supporte pas de charge). Ce modèle est simple et reproductible ; il permet d’implanter deux matériaux chez le même animal (un de chaque côté du crâne), ce qui permet de vérifier la reproductibilité de la réparation de l’os au sein du même animal. Il est donc idéal pour sélectionner et comparer plusieurs matériaux selon leur capacité à favoriser la formation osseuse. Cependant, ce modèle ne reproduit pas les conditions réelles pour les os soumis à des forces mécaniques importantes, comme la mâchoire inférieure. C’est pourquoi un second modèle est utilisé en complément consistant en une petite lésion réalisée sur un seul côté de la mâchoire inférieure. Ce modèle simule un environnement mécanique plus réaliste, d’un seul côté pour ne pas gêner l’alimentation des rats. L’utilisation séquentielle et complémentaire de ces deux modèles permet de combiner leurs avantages : •Le modèle crânien, sans contrainte mécanique, sert à sélectionner les matériaux les plus prometteurs dans un contexte simple et reproductible. •Le modèle de la mâchoire inférieure, soumis à la mastication, permet ensuite de valider l’intégration osseuse de ces matériaux dans des conditions proches de la réalité clinique. L’objectif final est de développer et valider des matériaux capables de restaurer efficacement les pertes osseuses importantes de la tête et du visage, afin de préparer leur utilisation future chez les patients.

Bénéfices attendus

Ce projet est un projet de recherche fondamentale pré-clinique pour la réparation des os du crâne et de la face. Alors que la prévalence des grandes pertes osseuses causées par des traumatismes diminue dans les pays de l'UE, les cas de cancer maxillo-faciaux attribués au papillomavirus humain augmentent, en particulier chez les jeunes adultes. Les techniques actuelles de reconstruction osseuse altèrent considérablement la qualité de vie des patients. Pouvoir proposer des matériaux qui s’intègre à l’os quel que soit les contraintes mécaniques qu’il subit, sans casser permettrait d’apporter de nouvelles solutions aux patients, y compris sur des os difficiles à reconstruire comme ceux de la mâchoire inférieure.

Procédures

Réalisation d'une petite lésion osseuse dans le crâne ou dans la mandibule, l'animal étant profondément endormi, (10min, n=12 rats / groupe / temps d'analyse), Prélèvement sanguin (1min, n= 6 rats/groupe/temps d'analyse), Imagerie scanner sous anesthésie gazeuse (10min, tous les rats non mis à mort). Injection de produit de contraste d'imagerie, l'animal étant endormi profondément (1min par injection/œil et 10 min entre les deux injections, n= 6 rats /groupe/temps d'analyse). Injection d'un produit de marquage vasculaire l'animal étant profondément endormi (1min, n= 6 rats /groupe/temps d'analyse).

Impact sur les animaux

Douleurs post-opératoires modérées au niveau du crâne pendant 24h, hématomes. Douleurs post opératoires modérées au niveau de la machoire pendant 3 jours, hématomes et œdèmes mandibulaires. Faible risque de fracture mandibulaire. Pour les rats subissant des injections, ils peuvent avoir des douleurs légères au point de prélèvement.

Devenir

Tous les animaux implantés seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de permettre des analyses histologiques.

Remplacement

La régénération osseuse présente une biologie complexe impliquant la participation et l’interaction de différents types cellulaires. Les matériaux utilisés seront tous validés préalablement in silico par des tests de simultations informatiques et des tests mécaniques; puis par des tests in vitro pour vérifier leur biocompatibilité cellulaire. Néanmoins, les processus complexes impliqués dans la régération osseuse ne peuvent être mimés en utilisant uniquement des cultures in vitro ou des modèles informatiques. La réalisation de défaut osseux dans le crane et la mandibule chez le rat permettra de sélectionner les matériaux adéquats pour favoriser leur intégration osseuse, y compris dans des situations de contraintes mécaniques importantes.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe et par temps d'analyse est justifié en fonction de nos objectifs de mise au point. Sur le plan statistique, la réparation osseuse et la vascularisation seront quantifiés et les différents groupes comparés grâce à l'application de différents tests statistiques adaptés. Une veille bibliographique sera systématiquement effectuée pour éviter toute expérience redondante.

Raffinement

La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales notamment l'utilisation d’anesthésie générale, l’utilisation d’une anesthésie locale, et d’analgésique adaptée durant les procédures avec une médication systématique en per et également post-opératoire 72h, et l’établissement de points limites adéquats. Concernant le modèle mandibulaire, une nourriture en gelée sera donnée 15 jours suivant la chirurgie pour prévenir au mieux tout risque de douleur et de fracture, le retour à la nourriture en croquette sera validée par l'imagerie à J15. Une surveillance biquotidienne des animaux sera effectuée les 5 premiers jours puis quotidienne (6 jours sur 7). Les conditions d’élevage sont présentes pour le bien-être animal de façon à réduire le stress et l’anxiété dans un environnent enrichi au sein de groupes sociaux de 2 individus, avant et après les procédures.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de laboratoire appropriée et classiquement utilisée pour l’étude du tissu osseux. A partir de 8 semaines et jusqu'à 5 mois, les rats ont terminés leur croissance et sont considérés comme de jeunes adultes.

Cent cinq jours de régime gras, quarante-huit heures enfermées seules dans une cage de mesure sans le moindre enrichissement, une pression artérielle relevée chaque semaine sur animal conscient : 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un inhibiteur métabolique ajouté à leur eau de boisson, associé au régime, leur fait prendre du poids, rigidifie leurs vaisseaux et abîme leur cœur, ce que le projet cherche justement à observer. Le porteur reconnaît que les injections répétées exposent à une péritonite, l'anesthésie à une détresse respiratoire, et l'isolement à un stress social. Les souris sont décrites comme viables, fertiles, immunocompétentes et sans pathologie spontanée, l'atteinte étant entièrement fabriquée, et toutes sont tuées pour le prélèvement de leurs organes.

Objectifs

Certaines maladies métaboliques chroniques peuvent fragiliser les vaisseaux sanguins et le cœur. Elles surviennent souvent après une alimentation déséquilibrée, trop riche en graisses, et en raison de troubles de la régulation vasculaire. Ces désordres augmentent le risque de maladies cardiovasculaires, qui se manifestent notamment par une prise de poids excessive, une élévation de la pression artérielle, une baisse de la tolérance à l’effort et, à long terme, par une plus grande vulnérabilité à l’insuffisance cardiaque. Ces complications représentent aujourd’hui un problème majeur de santé publique, car leur fréquence augmente dans la population et elles sont associées à une forte morbidité et mortalité. L’origine exacte de ces atteintes reste encore mal comprise. Les interactions entre alimentation, métabolisme, système vasculaire et cœur sont complexes et ne peuvent pas être étudiées uniquement avec des approches cellulaires. Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes qui conduisent à ces complications cardiovasculaires. Pour cela, un modèle expérimental chez la souris sera utilisé afin de reproduire les effets d’un régime alimentaire déséquilibré associé à une altération de la régulation vasculaire. L’objectif est de déterminer si certains processus biologiques naturels peuvent limiter ou prévenir la prise de poids excessive, la rigidité des vaisseaux et les altérations cardiaques observées. À terme, ces recherches permettront d’identifier de nouvelles pistes pour protéger le cœur et les vaisseaux dans des contextes métaboliques défavorables. Elles pourraient contribuer à améliorer la prévention et la prise en charge des maladies cardiovasculaires en agissant sur leurs causes profondes.

Bénéfices attendus

Les maladies du cœur et des vaisseaux sanguins sont parmi les plus fréquentes dans la population. Elles sont souvent favorisées par une alimentation trop riche en graisses ou par un déséquilibre du métabolisme. Ces situations entraînent progressivement une perte de souplesse des vaisseaux et une baisse de la performance du cœur. Ce projet cherche à comprendre comment ces déséquilibres se développent et à trouver des moyens de les prévenir. Des études réalisées chez la souris permettront d’observer les effets d’une alimentation déséquilibrée sur l’organisme et d’identifier des mécanismes naturels capables de protéger le cœur et les vaisseaux. Les bénéfices attendus sont les suivants : – améliorer les connaissances sur les liens entre alimentation, métabolisme et santé cardiovasculaire ; – identifier des processus biologiques qui aident le cœur à résister aux effets d’une mauvaise alimentation ; – ouvrir la voie à de nouvelles stratégies de prévention des maladies du cœur ; – à long terme, réduire le nombre de personnes atteintes d’hypertension, d’insuffisance cardiaque ou de rigidité artérielle. Ces recherches devraient ainsi contribuer à améliorer la qualité de vie et à diminuer la charge médicale associée aux maladies cardiovasculaires.

Procédures

Certaines souris recevront, pendant cinq jours consécutifs, une injection quotidienne réalisée sur animal vigile, chaque administration durant seulement quelques secondes. À partir du début du protocole, les animaux seront répartis entre deux types d’alimentation, maintenus pendant toute la durée du protocole distribués ad libitum pendant toute la durée du protocole (105 jours). À intervalles réguliers, des prélèvements sanguins seront recueillis chez chaque animal, chaque manipulation ne durant que quelques secondes. Les animaux disposeront d’un temps de récupération complet d’au moins quatre semaines entre deux prélèvements. La pression artérielle sera mesurée chaque semaine (environ 10 minutes) sur animaux vigiles, après une courte phase d’habitation. Les fonctions cardiaques et vasculaires seront évaluées à trois reprises (jours 35, 70 et 105) grâce à des examens d’imagerie réalisés sous anesthésie légère, d’une durée d’environ 30 minutes chacun. Entre les jours 90 et 92, les animaux seront hébergés individuellement pendant une durée maximale de 48 heures afin de mesurer en continu leur activité, leur dépense énergétique et leur consommation alimentaire et hydrique.

Impact sur les animaux

L’administration prolongée d’un régime alimentaire riche en graisses, associée à l’exposition à un inhibiteur métabolique dans l’eau de boisson, peut induire une prise de poids excessive, une diminution de la tolérance à l’effort et une altération de la mobilité. Ces modifications s’accompagnent d’un risque de déséquilibre alimentaire pouvant entraîner une diminution de l’appétit ou une perte de poids excessive. Elles peuvent également induire des perturbations cardiovasculaires progressives, responsables de fatigue accrue et d’une moindre activité locomotrice. Les injections nécessaires à l’induction génétique sont susceptibles de provoquer une douleur transitoire au point d’administration ainsi qu’un risque rare d’irritation locale ou d’inflammation et, en cas d’injections répétées, un risque rare de péritonite. L’anesthésie brève requise pour les examens échocardiographiques peut entraîner une perturbation de la thermorégulation, une récupération plus lente, et exceptionnellement une détresse respiratoire. Ces épisodes sont transitoires mais génèrent un stress physiologique et une sensation d’inconfort. Le placement temporaire en hébergement individuel, limité à 48 h, s’accompagne d’une réduction des possibilités d’enrichissement et peut induire un stress social ou environnemental. De même, les prélèvements sanguins effectués sur animaux vigiles peuvent provoquer une douleur brève, un risque de petit hématome et un stress lié à la contention.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

Notre équipe privilégie chaque fois que possible le recours à des méthodes alternatives pour limiter l’utilisation d’animaux. Dans les phases préparatoires, nous utilisons des modèles in vitro (cultures cellulaires) ainsi que des approches in silico (modélisation informatique et analyses prédictives). Ces méthodes permettent de formuler des hypothèses et de tester certaines pistes de recherche sans recourir directement à l’animal. Cependant, l’avancée de ce projet nécessite l’utilisation de modèles animaux. En effet, il s’agit d’évaluer les conséquences de déséquilibres métaboliques prolongés sur le cœur et les vaisseaux. Ces phénomènes reposent sur des interactions complexes entre plusieurs systèmes de l’organisme (métabolique, vasculaire, cardiaque, nerveux, immunitaire) qu’aucun modèle in vitro ou in silico ne peut reproduire dans leur globalité. À ce jour, aucune méthode alternative ne permet de simuler de manière fidèle l’impact chronique d’une alimentation déséquilibrée et ses effets sur l’ensemble du corps. Seul un organisme vivant permet d’intégrer et de mesurer ces réponses, dans des conditions proches de la situation pathologique humaine. L’expérimentation animale est donc indispensable à ce stade du projet, car elle seule permet de valider les observations, de comprendre les mécanismes en jeu et d’évaluer le potentiel de nouvelles approches préventives ou thérapeutiques.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 720 souris. Pour limiter le nombre d’animaux, plusieurs mesures sont mises en place. Les suivis sont réalisés de manière longitudinale, ce qui signifie que les mêmes animaux sont observés à différents moments de l’étude. Cette approche permet d’obtenir plusieurs informations successives chez un même individu et donc de réduire le nombre total d’animaux nécessaires. De plus, chaque animal fournit plusieurs organes et tissus qui sont analysés selon différentes approches. L’exploitation multiple des échantillons maximise ainsi les informations recueillies pour un même animal. Ces échantillons pourront également être partagés avec nos collaborateurs, ce qui contribue à limiter encore davantage le recours à de nouveaux animaux dans le cadre d’autres projets. Le nombre d’animaux a été défini sur la base d’une analyse statistique préalable, afin de garantir que les effectifs soient suffisants pour obtenir des résultats fiables tout en évitant l’utilisation d’animaux en excès. L’équilibre entre mâles et femelles sera respecté afin de rendre les conclusions plus transposables. L’ensemble de ces mesures vise à optimiser l’utilisation des animaux, à réduire leur nombre au strict nécessaire et à maintenir la robustesse scientifique des résultats obtenus.

Raffinement

Les conditions d’hébergement respecteront la réglementation en vigueur, à l’exception de périodes très courtes encadrées par une autorisation spécifique, lors des séjours temporaires dans des cages de mesure où aucun matériel d’enrichissement ne peut être ajouté. L’environnement habituel sera enrichi avec du matériel permettant la construction de nids et des abris, favorisant les comportements naturels et limitant le stress. Les animaux seront observés régulièrement afin de détecter précocement tout signe de mal-être, tel qu’une activité réduite, un pelage terne, un isolement ou une posture inhabituelle. Des critères précis sont définis pour interrompre la participation à l’étude si l’état d’un animal se détériore, notamment en cas de perte de poids importante, de baisse durable de l’appétit ou de signes de faiblesse. Les zones d’injection seront suivies pour repérer toute irritation. L’utilisation d’aiguilles fines et l’alternance des côtés permettront de réduire les effets locaux. Pour les examens nécessitant une anesthésie, une durée courte sera privilégiée afin de limiter l’impact sur l’animal. La respiration et la température corporelle seront surveillées, et les animaux resteront sur une surface chauffée jusqu’à leur réveil complet. En cas de baisse d’appétit, une alimentation adaptée sera proposée. Lors des séjours temporaires dans les cages de mesure, la durée sera limitée à deux jours, avec une attention particulière portée au comportement et à l’état général des animaux. Le personnel participant à ces procédures est formé et suit une formation continue. Les ajustements nécessaires pourront être décidés avec le vétérinaire ou le responsable du bien-être animal pour améliorer les conditions sans compromettre la validité scientifique du projet.

Choix des espèces

Les souris utilisées dans ce projet sont viables, fertiles, immunocompétentes et ne présentent pas spontanément de pathologie. Le phénotype étudié est induit par l’association d’un régime alimentaire déséquilibré et d’un traitement perturbant la fonction vasculaire. Les animaux développent alors une prise de poids, une rigidité des vaisseaux, des anomalies cardiaques et une diminution de la tolérance métabolique, reproduisant certaines caractéristiques des maladies cardiovasculaires liées à une mauvaise alimentation et à une altération de la fonction endothéliale. Le choix de la souris repose sur sa pertinence scientifique et méthodologique. Ce modèle est bien établi, largement utilisé pour l’élevage, les manipulations et le suivi clinique. L’existence de lignées génétiquement modifiées ciblées permet d’explorer la contribution spécifique de certains tissus à la physiopathologie étudiée. Le modèle murin présente ainsi une transposabilité pertinente pour comprendre les interactions entre métabolisme, cœur et vaisseaux. Les animaux seront utilisés à partir de 8 à 10 semaines, âge correspondant à la maturité physiologique et métabolique, notamment cardiaque. Ce stade permet d’évaluer de façon fiable l’impact d’un régime alimentaire gras associé à une dysfonction vasculaire, tout en évitant les biais liés à la croissance ou au développement.

Comprendre comment les cellules sénescentes rigidifient le cœur vieillissant, et tester des moyens de les détruire, conduit à utiliser 600 souris dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant douze semaines une alimentation composée à 60 % de lipides, portent une mini-pompe implantée sous anesthésie, subissent quatre injections par semaine pendant un mois dont deux dans la trachée, une échographie cardiaque hebdomadaire, des séances d'exercice et un test de tolérance au glucose de deux heures. Une souris qui perd plus de 20 % de son poids, ou dont la douleur résiste aux analgésiques, est retirée de l'étude et tuée. Le même protocole se déroule dans un second établissement sur 600 autres souris, l'ensemble étant tué à l'issue pour le prélèvement d'organes.

Objectifs

Avec l’âge, le cœur perd progressivement sa capacité à se remplir correctement, ce qui peut conduire à une forme fréquente d’insuffisance cardiaque chez les personnes âgées. Ce projet vise à mieux comprendre comment le vieillissement contribue à cette maladie. En particulier, nous nous intéressons à des cellules dites « sénescentes » qui s’accumulent dans le cœur avec l’âge et impactent la fonction cardiaque. Le projet testera également de nouvelles approches pour éliminer ou neutraliser ces cellules nuisibles, dans le but d’améliorer la santé cardiaque. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de mieux prévenir ou traiter cette forme d’insuffisance cardiaque, pour laquelle il n’existe à ce jour pas de traitement efficace. À long terme, ces travaux pourraient contribuer à améliorer la qualité de vie et l’espérance de vie des personnes âgées souffrant de maladies cardiovasculaires.

Procédures

Les souris suivront plusieurs types d’interventions : alimentation modifiée riche en graisse (60% kcal) pendant 12 semaines ; une chirurgie pour implanter une mini-pompe sur animal anesthésié (intervention de 10min) ; des injections intra-trachéales 2x par semaine d’une durée de quelques secondes à 1 min chacune (temps d’intubation et injection, sur animal anesthésié) et intra-veineuse 2x par semaine (quelques secondes par injection, sur animal vigile), pendant 4 semaines; des examens du coeur par échographie 1x par semaine, environ 10 min, sur animal anesthésié; des exercices physiques adaptés (quelques minutes par séance) ; un test de tolérance à l’insuline et au glucose en fin de protocole (intervention de 2h).

Impact sur les animaux

Certains régimes peuvent entraîner une prise de poids, une fatigue ou une réduction de mobilité. Des traitements peuvent provoquer une tension élevée ou une inflammation. Les signes de douleur ou d’inconfort seront surveillés, et des mesures seront prises pour soulager les animaux ou les retirer de l’étude si nécessaire.

Devenir

L’étude implique des analyses tissulaires nécessitant le prélèvement d’organes. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées sans mise à mort.

Remplacement

Avant d’utiliser des animaux, des expériences sur cellules ont été menées et ont permis d’identifier des cibles thérapeutiques pour lutter contre l’insuffisance cardiaque chez les personnes âgées. Mais pour comprendre les effets du vieillissement sur un organisme entier, les animaux sont indispensables. Ils permettent d’évaluer le fonctionnement du cœur dans un contexte proche de la réalité humaine.

Réduction

Dans un souci de réduction, nous nous limiterons aux seules expériences indispensables et chaque animal sera utilisé pour mesurer un maximum de paramètres. Le nombre d’animaux minimum a été déterminé par approche statistique sans compromettre les résultats scientifiques attendus.

Raffinement

Dans un souci de raffinement, nous mettrons en place plusieurs mesures visant à assurer le bien-être des animaux et à réduire au maximum la douleur et la souffrance associées aux procédures expérimentales : - litière absorbante, renouvelée régulièrement, permettant les comportements naturels (fouille, creusage, nidification). De plus, les animaux obèses seront suivis plus régulièrement (remplissage des biberons, changement de litière plus fréquent si nécessaire). - interaction sociale préservée : les souris seront hébergées en groupes de 5 individus pour éviter l’isolement. - accès libre à l’eau et à la nourriture. Toutes les interventions potentiellement douloureuses seront réalisées sous anesthésie appropriée : - Anesthésie : l’induction et l’entretien seront adaptés en fonction du protocole expérimental. Les souris anesthésiées sont maintenues sur tapis chauffant et du gel oculaire sera appliqué pour prévenir la déshydratation. - Analgésie préventive et post-opératoire : administration de médicaments analgésiques, avec un suivi attentif des animaux pour ajuster les doses si nécessaire. - Les animaux seront surveillés quotidiennement afin de détecter précocement tout signe de souffrance, de détresse ou d’inconfort : poil ébouriffé, posture anormale, signes de déshydratation, détection de signes de douleur (respiration anormale, mouvements réduits, vocalisations inhabituelles), analyse du comportement : isolement, diminution des interactions sociales, réduction de l’activité locomotrice, diminution de la prise alimentaire. - Des points limites stricts ont été définis pour mettre fin à l’expérimentation en cas de souffrance excessive. Un animal sera immédiatement retiré de l’étude et euthanasié si une perte de poids > 20 % est observée ou une douleur persistante ou non contrôlable est détectée malgré l’administration d’analgésiques. Ces mesures permettront de limiter au maximum la souffrance animale tout en assurant la qualité et la fiabilité des résultats obtenus dans cette étude. Le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs sera effectué à pied, pour une durée inférieure à 10 minutes, à l’écart du public, dans des cages de transport sécurisées, placées dans des sacs spécifiquement conçus pour garantir l’obscurité et l’isolement des stimuli extérieurs. Cette procédure vise à réduire au maximum le stress des animaux pendant le déplacement.

Choix des espèces

Les souris sont utilisées car elles développent avec l’âge des signes d’insuffisance cardiaque similaires à ceux des humains, comme un cœur plus rigide ou des troubles de la relaxation cardiaque. Les jeunes souris représentent des adultes jeunes, tandis que les plus âgées correspondent à des personnes de 70 à 80 ans.