Recherche fondamentale

Trois ou quatre injections et jusqu'à sept prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse par animal : 36 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour des analyses post-mortem. Ils reçoivent de fortes doses d'un vecteur viral de thérapie génique, puis une molécule qui détruit une partie des cellules immunitaires de leur foie. Le projet existe précisément parce que ces doses abîment le foie des patients et font perdre aux rats l'expression du gène transféré. Le porteur écrit pourtant que l'injection intraveineuse du vecteur "est connue pour ne provoquer aucun effet indésirable", et ne décrit aucune conséquence de la destruction des cellules hépatiques.

Objectifs

Les virus adéno-associés recombinants (AAVr) sont de petits virus modifiés utilisés comme « véhicules » pour transporter des gènes dans les cellules. Ils servent aujourd’hui dans plusieurs thérapies géniques, notamment pour traiter des maladies de l’œil, du foie, des muscles ou du système nerveux. Sept traitements basés sur ces vecteurs sont déjà disponibles pour les patients. Pour certaines maladies plus complexes, il faut injecter de grandes quantités d’AAVr. Mais à fortes doses, ces traitements peuvent provoquer des effets secondaires, en particulier au niveau du foie, qui peut être endommagé. Notre équipe a mis au point un modèle de rat pour mieux comprendre ce problème. Nous avons injecté de fortes doses d’AAVr contenant un gène fluorescent . Nous avons observé que certains rats perdaient l’expression de ce gène dans leur foie, comme cela se produit parfois chez les patients. On ne sait pas encore si cette perte vient d’une toxicité directe ou d’une réaction du système immunitaire. L’objectif de notre étude est donc d’analyser le rôle des cellules immunitaires du foie dans cette toxicité. Pour cela, nous utiliserons une molécule (le clodronate) capable d’éliminer certaines de ces cellules. En parallèle, nous testerons des versions « inoffensives » du gène fluorescent pour disposer d’un bon contrôle.

Bénéfices attendus

Le projet devrait permettre de mieux comprendre les mécanismes responsables de l’immuno hépatotoxicité observée chez les patients après utilisation de fortes doses d’AAVr dans des modèles précliniques. Cette étude pourrait contribuer à mieux comprendre et mieux anticiper l’impact potentiel de l’immunotoxicité du transfert de gènes sur l’efficacité et la sécurité du traitement dans les essais cliniques.

Procédures

24 rats subiront trois injections ainsi que 3 prélèvements sanguins. 12 rats subiront quatre injections et 7 prélèvements sanguins. Des protocoles d'anesthésie et d’analgésie seront mis en place selon la procédure. Les injections et les prélèvements sanguins se dérouleront sous anesthésie gazeuse de courte durée (environ 5 à 10min). L’état général et l’alimentation des animaux seront surveillés quotidiennement par les techniciens animaliers et le vétérinaire.

Impact sur les animaux

Pour les prélèvements sanguins et les injections, les animaux seront sous anesthésiés gazeuse. Les animaux ressentiront au réveil, une légère douleur au point du prélèvement sanguin et au point d’injection , due à la pénétration de l’aiguille. Par ailleurs, l’injection intraveineuse d’un vecteur chez le rongeur est connue pour ne provoquer aucun effet indésirable. Pour l'euthanasie, que ce soit pour la perfusion hépatique terminale ou le prélèvement sanguin terminale au niveau de la veine cave, cela n’engendrera pas de stress ou de douleur pour les animaux, puisque cet examen sera réalisé sous anesthésie générale renforcée par une analgésie ce qui limitera une éventuelle douleur liée au geste invasif.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour des études post-mortem.

Remplacement

L’enjeu majeur des protocoles de thérapie génique développés à l’aide de virus consiste à s’affranchir de la réponse immunitaire anti-vecteur observée chez l’humain. À ce jour, il n’est pas possible de reproduire in vitro un système immunitaire et encore moins de le combiner avec des cellules d’autres organes (également transduits par le vecteur de thérapie génique). Le modèle animal demeure donc incontournable. Pour ce protocole précis, nous avons choisi un modèle de rat , car c’est le seul modèle de petit animal, qui développe une réponse immunitaire contre le virus et une immunotoxicité vis-à-vis du virus similaire à celle observée chez l’humain.

Réduction

Chez l’homme, l’apparition d’une réponse immune dirigée contre le vecteur de thérapie génique ainsi que son intensité varient d’un individu à l’autre. Cette variabilité a également été observée dans une étude précédente réalisée au laboratoire où environ 60% des rats injectés développent une réponse immunitaire. Le nombre d’animaux par groupe 6 est donc basé sur nos expériences précédentes lors desquelles nous avons pu obtenir des résultats cohérents et reproductibles dans des groupes de cette taille, pour les analyses qui seront réalisées ici (biodistribution du vecteur, analyses biochimiques et analyses histologiques). Cela semble être un nombre minimal qui permette d’assurer la robustesse des résultats sans qu’il soit excessif en termes d’animaux à inclure. Afin d’obtenir des résultats statistiquement interprétables, le nombre d’animaux par groupe devra être porté à au moins 6.

Raffinement

Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. Le bien-être animal passera également par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur (animaux hébergés à plusieurs par cage, dans la limite réglementaire ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum) avec un enrichissement du milieu (mise à disposition d’éléments d'enrichissement comme des carrés de coton, des tunnels en carton, des sizzle dry (papier) et des morceaux de bois) 2) un suivi régulier des animaux (observations quotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autre alternative). 4) Une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates. 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).

Choix des espèces

Dans la majorité des études de thérapie génique ou d'immunologie, une espèce mammifère est requise pour avoir une pertinence clinique. Récemment, nous avons développé un modèle de rat dans lequel nous observons une réponse cellulaire et de l’hépatotoxicité après injection de fortes doses de vecteur. Ce modèle semble reproduire les effets secondaires observés chez l’homme dans les essais cliniques après injection à forte dose. L'utilisation du rat est donc justifiée par la preuve de concept de modélisation de la réponse immune et de l’hépatotoxicité. De plus, l’utilisation du modèle rat permet de constituer des groupes suffisamment larges pour effectuer des analyses statistiques. Les rats seront injectés entre 7 et 8 semaines, à l’âge adulte afin d’avoir un système immunitaire mature.

Valider un geste chirurgical, pas produire des connaissances : 10 rongeurs diurnes vont subir une opération d'une heure et demie sous anesthésie générale, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des électrodes sont implantées après incision du scalp, puis chaque animal reste seul en cage pendant une semaine. Le porteur indique que la plaie peut s'enflammer au point que l'animal se gratte et arrache ses points de suture, et qu'une infection reste possible. Les dix animaux sont tués pour autopsie, afin de vérifier ce que la chirurgie a fait à leurs tissus, et le RNT ne nomme pas leur espèce.

Objectifs

Ce projet s'inscrit dans un projet de recherche plus large visant à étudier les effets de la lumière ambiante sur le cycle veille/sommeil au cours des 24 h. Les expériences seront menées en parallèle chez un modèle animal nocturne et chez un modèle animal diurne. Le projet de recherche scientifique se propose de tester l’hypothèse selon laquelle l'exposition à la lumière optimise le cycle veille/sommeil chez les espèces diurnes et nocturnes, par deux processus temporellement cohérents qui sont 1) les effets dépendants des horloges circadiennes et 2) les effets directs de la lumière sur les états de vigilances. Pour tester cette hypothèse il sera nécessaire d'enregistrer le cycle veille/sommeil sur les animaux au moyen d'électrodes d'enregistrement. L'objectif du présent projet est l'acquisition et la validation de la compétence nécessaire à la mise en oeuvre de ces enregistrements sur l'espèce diurne. Cette étape vient en amont de la mise en oeuvre de l'étude scientifique.

Bénéfices attendus

L’identification des effets directs de la lumière sur le cycle veille/sommeil pourrait permettre de participer à la prévention des troubles du sommeil et de leurs conséquences comme les troubles de l'humeur, les troubles métaboliques comme le diabète ou l’obésité, par des approches de photothérapie ciblée et par des recommandations sur des horaires d’exposition à la lumière qui seraient à éviter. Le transfert et la validation de l'approche sur l'espèce diurne permettra à la partie du projet scientifique relative à l'étude du sommeil de démarrer dans des conditions qui garantissent le bien-être des animaux, la qualité des données enregistrées et donc leur exploitation statistique.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d'une durée de 1h30 réalisée sous anesthésie générale et analgésie. Les animaux seront placés en cage individuelle à l'issu de la chirurgie pendant une semaine.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut induit une douleur modérée, de l'inflammation au niveau de la plaie cutanée (incision du scalp) ce qui peut conduire l'animal à se gratter et à arracher les points de suture. Dans de très rares cas, une infection pourrait survenir. La contention nécessaire à la mise en place de l'anesthésie pourrait induire un stress léger transitoire. A l'issu de la chirurgie, les animaux seront placés en cage individuelle enrichie pendant une semaine pendant laquelle le suivi de l'état de santé des animaux sera réalisé. Cette situation pourrait induire un stress léger chez les animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour autopsie afin de vérifier macroscopiquement les conséquences tissulaires de la procédure chirurgicale.

Remplacement

La régulation du cycle veille/sommeil et la mesure des effets de la lumière sur ce cycle implique plusieurs stuctures nerveuses et horloges cérébrales qui fonctionnent en réseau interconnectés et l'intégrité de la rétine qui leur relaie l'information lumineuse. Ainsi est-il impossible de réaliser ces études sur des organes isolés ou des cultures cellulaires in vitro ou de modéliser in silico la réponse de ce circuit multi-structures.

Réduction

Il n'y aura pas d'analyse statistique des résultats car il s'agit d'acquisition de compétences. Le nombre d'animaux a été défini sur la base de la complexité de la chirurgie, des connaissances du modèle animal et de sa physiologie et du risque anesthésique du fait que ces animaux qui sont diurnes seront opérés de jour moment où ils sont normalement actifs et au pic de leur métabolisme contrairement au rat et à la souris. Dèss que l'approche chirurgicale aura été validée comme reproductible la procédure sera stoppée.

Raffinement

La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie adaptée à l'espèce. Tout au long de la chirurgie, les animaux seront maintenus sur tapis chauffant thermostaté (température de 38°C) muni d'une sonde rectale pour éviter de placer l'animal en hypothermie. Les yeux seront recouvert de gel oculaire hydratant pour éviter le déssèchement de la cornée. La chirurgie sera réalisée en conditions aseptiques. Après la chirurgie, les animaux seront réhydratés par injection d'une solution saline isotonique et stérile puis placés sous lampe chauffante jusqu'à leur complet réveil et sous surveillance. La douleur sera prise en charge avant, pendant et après la chirurgie par la mise en place d'un traitement analgésique post-opératoire par prise de médicaments dans l'eau de boisson. La prise hydrique quotidienne sera alors mesurée. Dès le lendemain de la chirurgie, l'état de santé des animaux sera évalué quotidiennement à l'aide d'une grille de score pemettant d'objectiver des points limites pertinents suffisamment précoces pour interrompre dès que nécessaire la procédure et ainsi limiter la souffrance animale. A l'issu de la chirurgie, les animaux seront hébergés pendant une semaine dans seuls des cages enrichies avec plus du matériel de nidification pour aider à la thermorégulation et un bâton à ronger. Nous validerons que l'ajoût d'un tunnel en verre dans la cage est compatible avec la pose d'électrodes et d'un connecteur à la surface du crâne, afin de garantir l'intégrité du dispositif implanté qui permettra de collecter les données scientifiques et donc d'obtenir un résultat exploitable (principe de réduction).

Choix des espèces

Il s'agit d'un projet de formation visant à transférer une compétence chirurgicale à un modèle de rongeur diurne afin de permettre l'enregistrement du sommeil sur cette espéce. Le sommeil sera étudié sur de jeunes adultes lorsque les structures nerveuses impliquées sont mâtures.

Dix jours d'hébergement à 4 °C, ou deux mois à 30 °C, jusqu'à sept injections et cinq prélèvements sanguins : 226 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines ont 24 mois, un âge auquel le porteur prévoit des décès liés à la vieillesse et gonfle ses groupes en conséquence. La méthode mise au point est présentée comme une imagerie "non invasive" du tissu adipeux brun, et le porteur affirme que visualiser ce tissu dans un "organisme entier" rend le recours à l'animal "indispensable". Toutes les souris sont tuées à l'issue pour récupérer leur sang et leurs organes.

Objectifs

Avec l'augmentation de l'espérance de vie, améliorer ou préserver la santé et la qualité de vie des personnes afin qu'elles puissent être autonomes le plus longtemps possible représente un enjeu majeur de santé publique. L'objectif actuel est de promouvoir le vieillissement en bonne santé en déterminant des paramètres biologiques permettant de mesurer et de prédire son évolution. Le métabolisme énergétique est un régulateur clé de la longévité et de l’allongement de la vie en bonne santé. Les tissus adipeux jouent un rôle très important dans le maintien de l’homéostasie énergétique de l’organisme et leur dysfonctionnement pourrait contribuer à l’altération des fonctions de l’organisme au cours de l’âge. Alors que les tissus adipeux blancs sont spécialisés dans le stockage et la libération de l’énergie, les tissus adipeux bruns (et beiges) dissipent l’énergie sous forme de chaleur. Il est clairement admis que la quantité et l'activité du tissu adipeux brun déclinent avec l'âge. Il est aussi aujourd'hui bien démontré que les tissus adipeux bruns sont associés de manière positive à la santé cardiométabolique chez l'homme. Il est donc important de pouvoir visualiser de manière non invasive le tissu adipeux brun pour définir des trajectoires de santé à l'échelle des individus. Plusieurs méthodes d'imagerie du tissu adipeux brun existent à l'heure actuelle. Elles sont pour la plupart basée sur la détection de sondes marquées et des techniques d'imagerie adaptées. Cependant, les sondes utilisées sont souvent des métabolites comme par exemple le glucose. L'intensité du marquage peut fluctuer en fonction de l'activité du tissu (et de l'état de santé métabolique de l'individu comme en cas d'insulinoresistance) et peut générer des faux positifs par l'activité métabolique d'autres tissus. Dans ce projet, nous proposons une nouvelle méthode d'imagerie pour détecter de manière non invasive des protéines membranaires exprimées par le tissu adipeux brun, in vivo chez la souris. Ceci reposera sur l'injection d'anticorps bioconjugués et de sondes marquées avec des fluorochromes pour une détection du tissu adipeux brun par imagerie en fluorescence in vivo.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre au point une nouvelle méthode de visualisation du tissu adipeux brun in vivo de manière non invasive. Etant donné que ce tissu décline avec l'âge et dans des contextes de désordres métaboliques, mesurer sa quantité chez un individu pourrait permettre de définir des trajectoires de santé. La méthode utilisée dans ce projet pourrait aussi être élargie à d'autres tissus et d'autres pathologies. En effet, la basigine est surexprimée par de nombreux types de cellules cancéreuses et la méthode proposée dans ce projet pourrait tout à fait être utilisée pour évaluer le développement de certains types de tumeur. Enfin, la méthode développée dans ce projet pourrait être adaptée pour détecter d'autres cibles protéiques, élargissant ainsi l'intêret et les bénéfices liés à ce projet.

Procédures

Les animaux subiront des prélèvements : soit 1 prélèvement sanguin (juste avant la mise à mort) soit 5 prélèvements sanguins (soit sur 2 jours (5 min, 3 heures, 6 heures, 24 heures et 48 heures) soit sur 7 jours (1, 2, 3, 4 et 7 jours)). Les animaux subiront des injections : soit 1 injection, soit 2 injections (1 injection et 1 injection au minimum 24 heures après) soit 3 injections (1 injection, 1 injection au minimum 24 heures après, et 1 injection 1 heure après), soit 7 injections (1 injection quotidienne pendant 5 jours consecutifs, 1 injection 7 jours après et 1 injection 1 heure après). Certains animaux seront soumis à des modifications dans leurs conditions d’hébergement (température d’hébergement de 4°C pendant 10 jours ou de 30°C pendant 2 mois).

Impact sur les animaux

Certaines nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : - le stress des animaux au moment de leur réception, - des problèmes liés à l’anesthésie, - le stress lié à l’isolement et à l’individualisation des animaux en cas d’agressivité, - le stress lié aux températures d’hébergement - le stress lié à la contention nécessaire pour les injections, - les stress liés à l’injection des molécules - et le stress lié aux prélèvements sanguins. Les souris invalidées génétiquement ne présentent pas de phénotype dommageable dans les conditions d’hébergement utilisées dans cette étude.

Devenir

Au terme de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer le sang et les organes d'intéret pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Notre objectif est de visualiser le tissu adipeux brun dans un organisme entier, de manière non invasive. Le recours à l'animal est donc indispensable. Cependant, des tests préalables pour valider l'anticorps et sa reconnaissance par les tétrazines auront été réalisés in vitro.

Réduction

Au regard de la bibliographie concernant des études similaires et de tests statistiques, des groupes de 6 souris par condition seront formés afin de mettre en évidence des différences statistiques. Dans les expériences effectuées sur des animaux de 24 mois, un nombre initial de 10 animaux sera prévu pour pallier aux décès potentiels liés à l’âge. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit au minimum pour obtenir dans chaque groupe étudié un nombre d’individus suffisant pour réaliser les tests statistiques et avoir des données fiables. Mettre moins d’animaux dans chaque groupe serait prendre le risque de devoir refaire ces expériences pour pouvoir obtenir des différences significatives entre les différents groupes. Nous proposons une stratégie de suivi longitudinal de marquage sur les mêmes animaux qui permettrait d’éviter l'euthanasie des animaux à différents temps donnés et ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Les tissus et organes prélevés suite à l'euthanasie seront utilisés pour un grand nombre d’expériences différentes. Nous avons en effet mis au point des conditions de préparation des tissus qui nous permettrons, à partir du même échantillon, de faire plusieurs analyses en parallèle. Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet. Par ailleurs, chaque étude est discutée avec l’ensemble de l’équipe de recherche afin de garantir la pertinence de chaque expérience et de partager les prélèvements le cas échéant.

Raffinement

Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les animaux seront placés en zone d’acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils seront pris en charge par le personnel compétent de la zootechnie qui vérifie leur état et place de l’enrichissement dans les cages pour diminuer le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux mâles issus de différents cartons de transport ne seront jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d’hébergement. Le caractère grégaire des souris sera respecté puisqu’elles ne seront jamais seules en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause d’agressivité et de bagarres). Les souris seront surveillées quotidiennement par le personnel de la zootechnie pour repérer des problèmes éventuels ainsi que surveillées une à plusieurs fois par semaine par une personne impliquée dans le projet. De plus, toutes les procédures engendrant de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale et un analgésique sera utilisé en parallèle pour minimiser toute douleur. Une grille de score comprenant différents points limites a été établie et dès lors que le score atteindra la valeur seuil, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Nous avons décidé de travailler sur la souris puisque cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques et du vieillissement et dans lequel la biologie du tissu adipeux brun a été particulièrement bien étudiée. Par ailleurs, la cinétique du vieillissement est bien décrite chez la souris, et cette espèce permet de réduire le temps d'expérimentation car elle a une espérance de vie plus courte (2 à 3 ans) que celle du rat (2 à 3.5 ans) ou encore du cobaye (4 à 8 ans). En plus de souris sauvages (contrôles), nous utiliserons une souche de souris génétiquement modifiée. Nous utiliserons des souris sauvages âgées de 2 mois (certaines auront 4 mois en fin de protocole). Les souris âgées de 2 mois, sont matures sexuellement, et présentent un tissu adipeux brun bien développé. L'hébergement à 30°C sera réalisé chez des souris âgées de 2 mois pendant 2 mois (temps efficace pour inactiver le tissu adipeux brun comme montré par les travaux précédents de l'équipe). L'exposition au froid sera réalisée chez des souris âgées de 3 mois et 20 jours, pendant 10 jours. Des travaux précédents de l'équipe ont montré qu'à 24 mois, les animaux présentent des défauts métaboliques importants dans le tissu adipeux brun, c'est la raison pour laquelle nous avons choisi cet âge pour les souris "âgées". Les souris génétiquement modifiées et leurs contrôles seront utilisées à l'âge de 4 mois, ce qui nous permettra de comparer les résultats avec les souris hebergées aux différentes températures.