Recherche fondamentale

Toutes biopsiées à l'oreille au poinçon ou aux ciseaux, et 320 d'entre elles gavées une fois par semaine jusqu'à seize fois, 1 536 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent des modifications génétiques qui leur font développer des tumeurs pulmonaires entre trois et quatre mois, et sont tuées au plus tard à cinq mois pour prélever des tissus, ou parce que le porteur les juge "inutilisables" pour le projet. L'objet est de savoir si les cellules sénescentes freinent ou favorisent le cancer du poumon. Le porteur reconnaît que ces tumeurs sont indétectables à l'œil comme à la palpation et annonce un simple suivi hebdomadaire, sans dire comment il repérera la souffrance des souris chez lesquelles elles progressent.

Objectifs

Malgré les efforts considérables déployés pour lutter contre le cancer et trouver des traitements efficaces, cette maladie demeure l’une des principales causes de mortalité en France et dans le monde. Un des principaux défis des différentes approches anticancéreuses est leur incapacité à éliminer toutes les cellules tumorales. En effet, une petite proportion de ces cellules parvient à survivre aux traitements puis redonne naissance à des tumeurs. La nature de ces cellules cancéreuses résistantes reste largement méconnue et sujette à débat, néanmoins, il pourrait s'agir de cellules sénescentes (CS). La sénescence est un processus qui se déclenche lorsqu’une cellule est soumise à un stress susceptible de la rendre cancéreuse, entrainant un blocage définitif de sa capacité à se multiplier, et donc a créer des tumeurs. Néanmoins, certaines études suggèrent que les CS sont non seulement sont très résistantes aux traitements anticancéreux, mais pourraient contourner leur blocage et redevenir capable de se multiplier. Pire encore : ces traitements pourraient paradoxalement induire la sénescence par le stress qu’ils engendrent, et donc permettre a des cellules précancéreuses de survivre. Nous supposons donc que la sénescence n’est pas nécessairement une barrière définitive et qu’elle pourrait être contournée, permettant ainsi à des cellules potentiellement tumorales de survivre aux traitements et de compléter ultérieurement leur transformation en cellules cancéreuses, expliquant ainsi le retour du cancer chez les patients traités. Le but de ce projet est de comprendre comment les cellules pulmonaires sénescentes influencent le développement du cancer en utilisant un modèle murin développant des tumeurs pulmonaires associé à des systèmes génétiques et pharmacologiques permettant de marquer et d'éliminer les cellules sénescentes.

Bénéfices attendus

En déterminant la contribution des cellules sénescentes dans le développement tumoral, nous espérons pouvoir déterminer si elles inhibent ou au contraire promeuvent celui-ci. Dans ce dernier cas, nous aurons découvert une nouvelle cible pharmacologique dans la lutte contre le cancer pulmonaire.

Procédures

Biopsie : La totalité des 1536 souris seront biospiées, par prélèvement d'un petit bout de tissu par punch ou avec des ciseaux (3 mm). Fait une seule fois dans la vie de l'animal pour une durée inférieur a 1 minute. Gavage : 320 souris seront gavées une fois par semaine à partir de l’âge d’un mois et jusqu’à leur mise à mort a l'age de 2 mois (4 gavages), 3 mois ( 8 gavages), 4 mois (12 gavages) et 5 mois (16 gavages). 80 souris seront traitées pour chaque âge. La procédure de gavage prend moins de 15 secondes par souris.

Impact sur les animaux

Le modèle murin utilisé dans ce projet développe des tumeurs pulmonaires entre 3 et 4 mois au point d'impacter leurs bien-être à partir de 6 et de causer la mort a près de 7 mois. Néanmoins, ces souris seront mises à mort à 5 mois maximum, soit avant que des problèmes sanitaires n'apparaissent. Il est néanmoins possible que certaines d'entre elles développent des difficultés respiratoire mineures. De même, il existe une faible probabilité de voir apparaître des prolapsus rectal et des papillomes sur le corps de la souris. Les souris seront également maintenues en contention puis biospiées : elles devraient donc subir un stress et une douleur légère pour un court laps de temps. En ce qui concerne le gavage, les souris ne devraient alors ressentir qu'un léger et fugitif inconfort, peu de stress et aucune douleur.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de chaque procédure pour les raisons suivantes : soit les souris seront susceptibles de développer des tumeurs pulmonaires et doivent dont être mises à mort avant que cela ne se produise ; soit les souris seront mises à mort pour prélèvement de tissus aux temps impartie ; soit les souris seront inutilisables pour ce projet (mauvaise combinaison de gènes ou souris trop âgée).

Remplacement

L'étude de la senescence est un processus intégré impliquant une communication intra- et inter-cellulaire et tissulaire. Il est ainsi impossible de mimer in vitro ou in silico le développement tumoral au sein des poumons et son interaction avec des cellules sénescentes. Pour ce projet, le recours à l’animal reste donc indispensable.

Réduction

Nous n’avons pas trouvé de système in vitro permettant de faire des analyses préliminaires susceptibles de diminuer le nombre de souris à utiliser. Des efforts seront faits pour limiter le nombre de souris nécessaires par groupe, par exemple en utilisant les règles statistiques adéquates et des logiciel dédiés. En se basant sur la littérature déjà existante et en prenant en compte les exigences de réduction, nous constituerons des groupes expérimentaux composés de 20 animaux. Pour cette étude, nous aurons besoin de souris sur 4 à 5 ans. Les effectifs ont été choisis en prenant en compte 2 paramètres : -(1)Le nombre minimum de souris permettant d’obtenir des résultats significatifs. –(2)Le taux de mortalité/échec associé au travail sur animaux et a la part d’incertitude, notre modèle murin cancéreux développant un phénotype dommageable.

Raffinement

Le raffinement sera assuré par: 1) Un enrichissement permettant l’expression des besoins comportementaux et physiologiques de l’espèce (morceau de bois, abris dans la cage...). 2) Un suivi sanitaire hebdomadaire par les membres de l’équipe (expérimentateurs + personnels techniques). Ce suivi permettra d’indiquer si la souris a atteint des points limite préalablement définis et imposera la prise de mesures adéquats. La fréquence de ces examens sera intensifiée en fonction des symptômes relevés sur un animal jusqu'à la disparition du problème ou la mise à mort de l'animal. Le suivi permettra notamment d'identifier un développement tumoral non pulmonaire visible qui peut rarement se produire dans notre modèle murin. En ce qui concerne les tumeurs pulmonaires, il sera impossible de les détecter visuellement ou par palpation. Cependant, elles se traduisent par un affaiblissement de l'animal associé à un essoufflement marqué de la souris. De plus, le développement de cancers pulmonaires entre 3 et 4 mois n'aura qu'un impact mineur sur le bien-être des souris car nous les mettrons à mort à 5 mois maximum (le bien-être étant impacté à partir de 6 mois et la mort survenant à 7 mois)». Pour le gavage, nous utiliserons une sonde à bout rond et de longueur appropriée afin de limiter les risques d'irritation voire de blessures. Plusieurs mesures correctives seront faites suivant les problèmes sanitaires rencontrés : désinfection en cas de plaie, nourriture gélifiée+mesure du poids si la souris parait amaigrie, antalgique en cas de signe de souffrance de la souris, et enfin consultation du vétérinaire en cas de doute sur la conduite à tenir.

Choix des espèces

Il s'agit d'une étude exploratoire et innovante basée sur les modèles murins transgéniques qui ont déjà été utilisés dans le cadre d'études portant sur la sénescence. À notre connaissance, il n'existe pas d'autres organismes modèles transgéniques comparables et utilisables pour étudier la sénescence, tant au niveau de leur disponibilité, de la vitesse de leur vieillissement et de leur capacité a générer rapidement les animaux expérimentaux nécessaires. Nous aurons besoin d'animaux adultes à l'âge adulte, tant pour générer les animaux expérimentaux que pour mener nos expériences. En effet, nous suivrons le développement tumoral, lequel n'apparaît que chez les souris adultes. Pour des raisons scientifiques (d'étude de la croissance tumorale) et éthiques ,toutes les souris expérimentales seront mises à mort entre 2 et 5 mois.

1 450 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 80 recevront trois injections dans le ventre par semaine pendant six à huit mois. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever des organes. 970 subissent un prélèvement de peau à l'oreille et 570 une injection sous la peau, le porteur attendant douleur, perte de poids et mobilité réduite à mesure que les cancers cutanés se développent. Les retombées annoncées, de nouveaux marqueurs et de nouvelles cibles thérapeutiques, sont renvoyées au conditionnel, l'objectif immédiat restant de comprendre le rôle d'une protéine dans la pigmentation de la peau.

Objectifs

Des données de plus en plus nombreuses indiquent que des protéines impliquées dans la croissance des cellules ont un rôle clé dans le fonctionnement de la cellule. Dans ce contexte, le but de notre projet est d’étudier les rôles d’une protéine dans le fonctionnement des cellules de la peau qui sont responsables de la pigmentation. Ces cellules sont également responsables du développement de certains cancers, et un second objectif de notre projet sera d’étudier le rôle de cette protéine dans le développement de ces cancers de la peau. Pour atteindre notre objectif, nous utiliserons différents modèles de souris génétiquement modifiées nous permettant d'inactiver notre protéine d’intérêt spécifiquement dans les mélanocytes et d'évaluer les conséquences sur la croissance de ces cellules et sur leur capacité à pigmenter.

Bénéfices attendus

A court terme, notre projet vise à comprendre le rôle d'une protéine dans le fonctionnement des cellules de la peau et le développement des cancers de la peau. Nos travaux permettraient ainsi de comprendre comment se forment ces cancers et identifier de nouveaux marqueurs prédictifs voir même de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter ces cancers. De plus, il existe de nombreuses pathologies cutanées associées à des défauts de pigmentation de la peau, et à long terme nos travaux pourraient également avoir des retombées sur la compréhension de ces maladies dermatologiques.

Procédures

Sur les 1450 souris du projet : - 970 auront un prélèvement de peau à l’oreille (1 minute) - 80 recevront uniquement 3 injections dans le ventre (2 minutes par injection) – 80 recevront 3 injections dans le ventre par semaine et pendant 2 semaines (2 minutes par injection) - 80 recevront 3 injections dans le ventre par semaine et pendant 1 mois (2 minutes par injection) - 80 recevront 3 injections dans le ventre par semaine et pendant 6 à 8 mois (2 minutes par injection) - 570 recevront une injection sous la peau (3 minutes par injection) dont 240 recevront en plus 3 injections dans le ventre par semaine

Impact sur les animaux

Les effets indésirables qui pourraient être observés sur les animaux de notre projet sont notamment des effets associés au prélèvement à l’oreille, aux injections dans le ventre, à la manipulation des animaux et au développement des cancers de la peau, à savoir de la douleur, une perte de poids, une mobilité réduite et du stress. Nous n’attendons pas d’effet secondaire des différents traitements proposés sur la base de travaux déjà publiés dans la littérature.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever des organes pour la réalisation d'analyses.

Remplacement

Notre étude in vivo s’appuie sur nos résultats expérimentaux obtenus à partir de lignées cellulaires en culture. En effet, nous montrons dans ces modèles que la perte de notre protéine conduit à une forte diminution des facteurs qui régulent la pigmentation. Certains de ces acteurs étant également essentiels au développement des cancers de la peau, nous émettons l’hypothèse que la perte de notre protéine aura un impact majeur sur la croissance de ces tumeurs. Etant donné que ces travaux ne nous permettent pas d’aborder les différentes questions liées à l’initiation et au développement tumoral, nous souhaitons aborder ces questions dans des modèles intégrés in vivo, et notamment les modèles murins génétiquement modifiés.

Réduction

Nous générerons plusieurs groupes expérimentaux contenant 10 animaux chacun et le nombre d'individus par groupe a été déterminé à partir de tests statistiques. Par ailleurs, nous avons intégré une étude préliminaire afin de minimiser notre nombre d'animaux.

Raffinement

Une observation quotidienne de l’état clinique des animaux sera assurée. La sévérité des signes sera déterminée selon une grille d’évaluation qui permettra la mise en place de soins éventuels (administration d’anti-douleurs) ou conduira à l’euthanasie des animaux. Enfin, les conditions d’hébergement sur des portoirs adaptés ainsi que le suivi du statut sanitaire des animaux immunodéprimés permettent de les protéger.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour nos études in vivo car c'est la seule espèce dans laquelle nos gènes d'intérêts ont déjà été modifiés, permettant ainsi de limiter le nombre d'animaux à générer pour notre étude. Nous estimons que les conclusions de ces études réalisées chez la souris pourront être étendues à d'autres mammifères, dont l'homme. Des similarités sont observées entre nos lignées de souris génétiquement modifiées et les patients atteints de cancer de la peau ce qui nous laisse penser que ce modèle animal est un excellent modèle d'étude de la pathologie humaine et qu'il permettra, à terme, d'établir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter ce cancer de la peau. Selon les expériences, certaines souris seront utilisées à 18 jours, correspondant à la première pousse du poil adulte chez la souris et d'autres à 6 semaines.

Pour valider un dispositif d'ultrasons focalisés destiné à traiter les varices humaines, 5 cochons et 10 brebis vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour prélever leurs veines saphènes. Chaque animal est traité sur ses deux veines saphènes sous anesthésie générale, jusqu'à quatre heures, puis suivi par trois à six échographies d'une demi-heure. Le porteur présente la technique comme "plus rapide et indolore" pour les patients, et signale que des brûlures cutanées ont été observées sur les sites traités lors d'essais précédents. La brebis est retenue parce qu'une norme ISO la recommande, le cochon parce que sa peau ressemble davantage à celle de l'être humain, les essais antérieurs ayant montré que celle des brebis était trop fine.

Objectifs

L'insuffisance veineuse superficielle est l'une des maladies majeures dans le monde, actuellement traitée par ablation thermique ou sclérothérapie. La technologie d'ultrasons focalisés de haute intensité utilisant une modalité thermique peut être utilisée pour obtenir l'oblitération des varices, avec certaines limitations : un temps de traitement long et douloureux. La méthode utilisant des ultrasons de haute intensité traite les varices de manière plus rapide et indolore. Jusqu'à présent, les études montrent que pour le traitement, il est nécessaire d'injecter un agent de contraste. Cette étude préclinique sur des animaux vise à démontrer la sécurité et la faisabilité de cette nouvelle approche thérapeutique.

Bénéfices attendus

Les varices sont présentes chez 25% de la population des pays industrialisés et représentent un coût sociétal de ressources médicales pour ces pays. Les techniques mini-invasives développées ces dernières années permettent de traiter avec efficacité et peu de récidives cette maladie. La technique nouvellement développée et étudiée dans ce projet pourrait permettre d'obtenir d'aussi bons résultats que les autres techniques tout en diminuant les risques associés. Elle permettrait donc de continuer à améliorer le traitement de cette maladie.

Procédures

Les animaux seront traités sous anesthésie générale, pour une durée maximale de 4 heures. Chaque animal recevra un traitement par veine, soit deux traitements au total. Un suivi échographique et post-traitement de la zone traitée sera réalisé à plusieurs points (entre 3 et 6), chaque session durant environ 30 minutes. Les porcs seront placés sous anesthésie générale, tandis que les brebis seront, si nécessaire, simplement sédatées pour cet examen.

Impact sur les animaux

La principale nuisance attendue chez les animaux est le léger stress et la douleur modérée lors de réalisation des tranquillisations des animaux. De plus, dans les essais précédents, des brûlures ont pu être observées au niveau des sites traités. Ce problème a été résolu par l'ajout d'un système déjà validé de refroidissement de la peau au niveau de la sonde. Ce risque est donc très faible, mais nous devons mentionner qu'un léger échauffement peut être observé.

Devenir

Les animaux du projet seront mises à mort à la fin de chaque étude afin de prélever leurs veines saphènes pour les analyser.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle in vitro validés ou de modèle simulé par ordinateur qui puissent imiter les points finaux de ce projet. Il est donc nécessaire de travailler sur animal vivant. Le modèle ovin est recommandé dans la norme ISO 10993, partie 6 (2016) comme un animal approprié pour évaluer la performance et les effets tissulaires locaux des traitements vasculaires. Cependant, le porc a également été retenu en raison de la similarité structurelle et fonctionnelle de sa peau avec celle de l’homme, ce qui en fait un modèle plus adapté que l’ovin pour l’évaluation de traitements vasculaires transcutanés.

Réduction

Le nombre d’animaux a été volontairement réduit grâce à une preuve de concept sur lapin et une étude de faisabilité sur brebis, permettant d’optimiser les paramètres de dispositif. Seuls 10 animaux sont nécessaires pour les deux études (validation de dose et étude réglementaire). De plus, le traitement est appliqué sur les deux veines saphènes, divisant ainsi par deux le nombre d’animaux requis. L’utilisation de 5 porcs, dont la peau est proche de celle de l’homme, permet une validation pertinente tout en limitant le nombre total d’animaux utilisés.Les données seront analysées statistiquement via une statistique, afin d’optimiser l’interprétation des résultats sans avoir recours à un plus grand nombre d’individus.

Raffinement

Afin de permettre aux animaux de s’adapter à leur environnement et de s’assurer de leur bon état de santé, une période d’acclimatation adaptée à l’espèce et au stade physiologique sera dispensée avant début de traitement. Tout au long de leur hébergement, les animaux auront des conditions d'hébergement adaptées et optimales. Les paramètres d'ambiance, l'aliment, l'abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les animaux seront hébergés collectivement en groupes harmonieux. Un programme spécifique d’habituation à la manipulation par l’homme est en place. Les ovins disposeront d'un environnement enrichi (exemples : objets à manipuler de type ballon) permettant à l'animal de jouer. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement par un personnel habilité et habitué à travailler avec des brebis. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s'il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d'un traitement thérapeutique. L’administration du traitement prescrit devra être réalisée par une personne habilitée. Un renforcement positif sera également réalisé pour obtenir leur coopération lors des opérations courantes ou de soins. Les animaux suivront également un programme de socialisation afin de réduire le stress engendré par les actes. De plus, les points limites généraux suffisamment prédictifs sont définis dans ce projet.

Choix des espèces

La brebis est recommandée dans la norme ISO 10993-6 comme un animal approprié pour évaluer la performance et les effets tissulaires locaux des traitements vasculaires. En effet, la morphologie et la taille des veines saphènes du mouton sont similaires à celles de l'homme et ce modèle a été décrit dans la littérature comme un modèle approprié pour évaluer l'occlusion veineuse. En outre, la faisabilité a été évaluée lors d'une étude précédente, au cours de laquelle les mesures des veines saphènes des animaux ont été réalisées. Le porc a été ajouté à ce projet. Cet essai permettra d’évaluer le dispositif dans des conditions plus proches de l’humain, les essais réalisés sur les brebis ayant montré que leur peau était trop fine en comparaison. Brebis : Les animaux sont adultes afin d'avoir une structure comparable à l'homme. Porc : les animaux autour de 60 kg seront utilisés, afin d'avoir un poids comparables à ceux de l'homme et des brebis adultes.

Deux injections dans le sinus situé derrière l'œil, dix prises de sang à la queue et une ponction cardiaque finale attendent chacune des 144 souris du projet, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses et résistantes à l'insuline, elles reçoivent un virus qui modifie une enzyme du foie, pour faire monter leur cholestérol et favoriser des dépôts dans les artères. Le porteur affirme que ce changement reste "sans signes visibles ni douleur pour l'animal", tout en rangeant les injections rétro-orbitales et les prises de sang bimensuelles parmi les effets indésirables attendus. La mise à mort sert à prélever le foie et le tissu adipeux.

Objectifs

Nous allons étudier l'impact d'une modification d'une enzyme du foie sur des souris obèses et résistantes à l'insuline. Pour cela, nous utiliserons une version particulière de cette enzyme et rendrons les souris plus sensibles aux déséquilibres des graisses dans le sang en modifiant une autre protéine. Nous analyserons ensuite la quantité de graisses présentes dans le sang et vérifierons si ces changements favorisent la formation de plaques dans les artères, un facteur clé des maladies cardiovasculaires.

Bénéfices attendus

Nos recherches ont montré qu’une forme particulière de la lipase hépatique, plus active que la normale, permet de faire baisser le taux de cholestérol dans le sang, chez la souris comme chez l’homme. Or, le cholestérol LDL (souvent appelé "mauvais cholestérol") est l’un des principaux facteurs de risque des maladies cardiovasculaires. En s’accumulant dans les artères, il peut former des dépôts qui les rétrécissent et gênent la circulation du sang. Ce projet cherche à savoir si cette forme modifiée de la lipase hépatique peut protéger des souris obèses, avec un taux de sucre élevé dans le sang et une sensibilité réduite à l’insuline, contre ce type de problèmes dans les artères.

Procédures

Chaque souris recevra deux injections d’un virus (durée de 5/10 secondes), subira dix prises de sang (durée 5/15 secondes) et une ponction cardiaque avant la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les souris auront un taux de cholestérol élevé et seront plus susceptibles de développer des dépôts de graisses dans les artères. Cependant, ce changement reste sans signes visibles ni douleur pour l’animal. Contrairement à l’humain, les souris ne développent pas de maladies graves comme les crises cardiaques ou les accidents vasculaires cérébraux : les plaques qui se forment dans leurs artères restent stables. Les effets indésirables possibles concernent surtout les deux injections dans le sinus rétro-orbital et les prises de sang régulières réalisées au niveau de la queue toutes les deux semaines.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure, conformément aux objectifs expérimentaux. Cette mise à mort est nécessaire pour permettre le recueil des organes et tissus d’intérêt (par exemple le foie, le tissu adipeux ou d’autres prélèvements), indispensables aux analyses biologiques et histologiques prévues dans le protocole.

Remplacement

Ce projet comprend plusieurs volets : des analyses génétiques menées sur une cohorte humaine et des études en laboratoire sur des cellules hépatiques. Les données déjà obtenus ont confirmé l’intérêt de la cible étudiée. Les maladies cardio-métaboliques résultent de mécanismes complexes impliquant plusieurs organes qui communiquent entre eux. Actuellement, ces interactions ne peuvent pas être reproduites en laboratoire avec des modèles cellulaires. C’est pourquoi l’utilisation de modèles animaux reste essentielle.

Réduction

Ce projet a été conçu dans le respect de la règle des "3R" (Remplacement, Réduction, Raffinement). Seules les expériences strictement nécessaires à la réussite du projet seront réalisées.Le nombre d’animaux utilisés a été déterminé avec rigueur, en s’appuyant à la fois sur notre expérience passée et sur un logiciel d’analyse statistique permettant d’optimiser la taille des échantillons. De plus, nous avons sélectionné les lignées de souris les plus adaptées afin de maximiser la pertinence des résultats tout en limitant le nombre d’animaux impliqués.

Raffinement

Nous avons pris en compte le bien-être animal en mettant en place une surveillance quotidienne assurée par des zootechniciens formés, afin de détecter tout signe de stress ou de souffrance. De plus, un examen clinique hebdomadaire sera réalisé par les responsables du protocole de recherche. Pour limiter la douleur et le stress des animaux, des mesures adaptées seront mises en place. Les injections dans le sinus rétro-orbital seront réalisées sous anesthésie gazeuse, avec l’application d’un collyre anesthésiant pour une analgésie locale. Une analgésie appropriée sera également administrée avant la mise à mort. Par ailleurs, une sédation légère sera utilisée lors des prises de sang au niveau de la queue pour réduire le stress des animaux . Des critères précis ont été établis pour définir des seuils au-delà desquels l’expérimentation serait arrêtée et l’animal mis à mort, garantissant ainsi une prise en charge éthique et responsable. Enfin, les souris seront hébergées dans des conditions optimales : elles disposeront de cages équipées de litières et d’enrichissements (frisottis, igloo ou tube en polycarbonate). Elles seront également restreintes en nombre dans chaque cage en fonction de leur poids, afin d’assurer leur confort. Les animaux seront maintenus en groupes pour préserver leur bien-être social.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix dans l’étude des maladies cardiaques et métaboliques. Il est utilisé de longue date pour caractériser les différentes complications associées à l’obésité et est largement reconnu pour sa pertinence dans la recherche biomédicale en raison de sa similitude génétique avec l'humain. Facile à manipuler et à reproduire, il offre une bonne reproductibilité des résultats, ce qui en fait un choix pour les études précliniques. Son utilisation permet ainsi d'obtenir des données fiables. Nous avons choisi des souris qui sont naturellement obèses et moins sensibles à l’insuline. Pour les rendre plus à risque de développer des plaques dans les artères (athérosclérose), nous modifions une protéine, ce qui augmente leur taux de cholestérol. Les animaux débuteront le protocole de recherche à 5 semaines d’âge (randomisation) car il est nécessaire de débuter avant la mise en place de l’insulino-résistance qui s’établit entre 6 et 12 semaines.

Tués à la fin des procédures pour que leur cerveau et leur sang soient analysés, 252 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une solution chimique détruisant les récepteurs de l'équilibre est injectée à travers le tympan d'une oreille, geste de 72 minutes par animal qui provoque vertiges, pertes d'équilibre, chutes, perte de poids et anxiété. Un médicament anti-vertigineux ou un placebo leur est ensuite administré chaque jour pendant trois, sept ou dix jours, avec tests comportementaux. Le porteur explique avoir quitté le modèle félin pour le rat parce que le syndrome vestibulaire y dure deux à trois semaines contre 90 jours chez l'humain, "gain temporel avantageux" pour tester des composés.

Objectifs

Ce projet porte sur le système vestibulaire, responsable de l’équilibre postural et locomoteur, ainsi que de la stabilisation du regard lors de mouvements de la tête. L’information perçue par les récepteurs vestibulaires localisés dans l’oreille interne est transmise via le nerf vestibulaire aux noyaux vestibulaires (situés dans le tronc cérébral). Un dysfonctionnement de ce système peut causer des symptômes tels que des vertiges, des déséquilibres, des chutes ou encore de l’anxiété, qui affectent la vie quotidienne des patients. La thérapie vestibulaire implique une rééducation vestibulaire et un traitement médicamenteux. Toutefois, le manque d’efficacité des médicaments utilisés ou encore la méconnaissance de leurs sites et mécanismes d’action représentent un obstacle de taille. Un médicament couramment utilisé en France dans la pathologie du vertige est la bétahistine. Certains de ses mécanismes d’action sont connus dans le modèle animal de lésion chirurgicale du nerf vestibulaire. Toutefois, ce modèle est comparable, en clinique, à une ablation curative du nerf vestibulaire, pratiquée uniquement dans le cas de schwannomes (tumeurs bénignes du nerf vestibulaire). Les effets et mécanismes d’action de ce médicament ne sont pas connus dans un modèle animal de lésion vestibulaire mimant des pathologies telles que la névrite ou la maladie de Ménière, qui sont plus couramment observées en clinique. L’objectif de ce projet est d’étudier les effets de la bétahistine sur un modèle de lésion vestibulaire induisant une inflammation telle qu’observée dans la névrite en clinique. Nous savons que la bétahistine augmente la concentration d’histamine, un neurotransmetteur qui module l’inflammation, dans le cerveau. De plus, des cellules intervenant dans l’inflammation sont importantes pour la récupération des fonctions vestibulaires. Ainsi, nous supposons que ce traitement va favoriser des mécanismes essentiels à la compensation vestibulaire via des récepteurs à l’histamine dans ce modèle. Enfin, nous supposons que la bétahistine aura un effet anxiolytique dans notre modèle car elle module un neurotransmetteur intervenant dans l’anxiété (sérotonine). Des tests comportementaux, l’utilisation de molécules chimiques bloquants des récepteurs à l’histamine (antagonistes), ainsi que des analyses sur les tissus des animaux nous permettront de réaliser ce projet.

Bénéfices attendus

Les désordres vestibulaires touchent un tiers des adultes de plus de quarante ans aux Etats-Unis. En France, les vertiges constituent un des motifs prépondérants de consultation chez le généraliste, avec plus de 15 millions par an. En Allemagne, la prévalence des troubles vestibulaires est de 6,5% selon une étude épidémiologique. Ainsi, les désordres vestibulaires représentent un enjeu de santé publique majeur et l’étude des désordres vestibulaires ainsi que des traitements pharmacologiques utilisés restent primordiaux. Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont nécessaires afin d’étudier les déficits vestibulaires et leur compensation. Le modèle de lésion utilisé dans ce projet est un modèle se rapprochant de pathologies humaines telles que la vestibulopathie périphérique aiguë (névrite) ou la maladie de Ménière. Il mime des symptômes vestibulaires retrouvés chez l’humain. A court terme, ce modèle animal et ces tests comportementaux vont permettre d’observer l’efficacité de la bétahistine (traitement étudié prescrit en clinique humaine) sur les symptômes posturo-locomoteurs induits par la pathologie et également sur l’anxiété des animaux. D’un point de vue fondamental, nous mettrons en évidence l’impact de ce traitement sur l’inflammation et sur l’anxiété des animaux dans un contexte de pathologie vestibulaire. Nous préciserons également le rôle de l’histamine dans la pathologie vestibulaire. Enfin, ce projet permettra d’élucider la compensation vestibulaire à un niveau plus global que seulement au sein des noyaux vestibulaires. Plus globalement, d’un point de vue clinique, ce projet pourrait amener à des nouveaux mécanismes quant aux fonctionnements d’un composé pharmacologique de référence prescrit en clinique. A plus long terme, les résultats obtenus permettront d’adapter la prise en charge médicamenteuse des patients afin de mieux traiter les pathologies vestibulaires.

Procédures

Pour induire des vertiges, un groupe d’animaux est soumis à une injection transtympanique d’une solution chimique détruisant les récepteurs vestibulaires de l’oreille interne alors qu’un autre groupe d’animaux reçoit une solution saline. L’injection transtympanique a lieu une fois, chez l’ensemble des animaux de l’étude. Avant la lésion, les animaux sont soumis à une injection d’analgésique 30 minutes avant d’être placés sous anesthésie gazeuse et un anesthésique local est appliqué 5 minutes avant incision. L’injection transtympanique se fait dans l’oreille moyenne des animaux en utilisant une aiguille. Les gestes décrits ci-dessus durent 72 minutes par animal. L’administration d’un marqueur de la prolifération cellulaire a lieu une seule fois, chez les animaux, au 3ème ou 7ème jour après la lésion vestibulaire. L’administration d’un médicament anti-vertigineux ou du placebo a lieu une fois par jour chez de nombreux animaux. Elle s’effectuera pendant les 10 jours qui suivent la lésion pour les animaux soumis aux tests comportementaux ou pendant les 3 ou 7 jours après la lésion pour les animaux non soumis aux tests comportementaux qui sont utilisés afin d’étudier les effets à court terme du traitement. Les tests comportementaux ont une durée de 25 min10 secondes par animal à plusieurs délais (avant la lésion, J2, J3, J7, J15 et J30). Les tests effectués pour un groupe ont une durée correspondant à une matinée. Pour mesurer l’audition des animaux, les animaux sont anesthésiés pendant 40 minutes. Cette mesure est répétée à 3 délais chez un petit nombre d’animaux : avant la lésion, 3 et 30ème jour après la lésion. L’exposition à des stimuli sonores répétés, sont calibrés en intensité et en durée, ce qui n’engendre pas de gêne auditive chez les animaux. Cependant, l’insertion des électrodes sous-cutanées peut provoquer une gêne passagère au point d’application et une anesthésie est pratiquée pour éviter cette gêne. Après cette mesure, les animaux peuvent présenter un stress au réveil de l’anesthésie.

Impact sur les animaux

Pour tous les animaux de ce projet, l’introduction d’un liquide dans l’oreille moyenne et l’incision cutanée (qui ont lieu lors de l’administration transtympanique) peuvent être source de douleur et d’inconfort. Dans les 3 procédures de ce projet, les mêmes effets indésirables sont prévus sur les animaux lésés. Les animaux soumis à une lésion transtympanique peuvent avoir un déficit d’hydratation dans les 24-48 heures après l’atteinte vestibulaire et une perte de poids est attendue chez ces animaux lésés. Le syndrome vestibulaire conduit à d’autres effets indésirables tels que des problèmes de maintien de posture et de perte d’équilibre. Également, l’anxiété est connue pour être une des composantes du syndrome vestibulaire. L’injection des antagonistes (quotidiennement durant 10 jours), l’injection d’un marqueur de la prolifération cellulaire (une fois, J3 ou J7 post-lésionnel) ainsi que l’injection d’un analgésique (une fois avant l’administration transtympanique et une fois avant la mise à mort de l’animal) peuvent être perçues comme une nuisance par l’animal. L’ensemble du groupe d’animaux testé est délocalisé hors de son environnement (correspondant à la salle d’hébergement de l’animalerie) pendant une matinée aux différents délais des tests comportementaux (délais pré-administration, J2, J3, J7, J15 et J30 post-lésionnels). Cela pourrait être perçu comme une nuisance par l’animal. L’exposition à des stimuli sonores répétés, sont calibrés en intensité et en durée, ce qui n’engendre pas de gêne auditive chez les animaux. Cependant, l’insertion des électrodes sous-cutanées peut provoquer une gêne passagère au point d’application. Après mesure de l'audition, les animaux peuvent présenter un stress au réveil de l’anesthésie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures et le sang et les tissus seront récupérés pour procéder à des analyses. Il est nécessaire de procéder à des dosages et marquages histologiques spécifiques dans le cerveau des animaux utilisés dans ce projet afin d’élucider les effets de notre médicament dans notre modèle animal. Le sang récupéré permettra de procéder à des dosages de marqueurs spécifiques du stress et de l’anxiété. Ces mises à mort sont nécessaires pour la mise en évidence des effets à court et à long terme du traitement.

Remplacement

Il existe des alternatives n’utilisant pas de modèles animaux telles que la méthode in silico ou encore in vitro. La méthode in silico utilise des modèles informatiques dans le but de prédire ce qui se passerait dans la réalité. Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle informatique mimant de manière aussi complexe la physiologie et la physiopathologie du syndrome vestibulaire. Un autre modèle serait le modèle in vitro qui consiste en l’étude d’éléments hors de leur environnement en conditions définies et contrôlées. Puisque nous avons besoin de l’individu dans son ensemble, autant au niveau cérébral qu’au niveau périphérique (informations quant à la posture et concernant l’état d’anxiété des animaux), nous ne pouvons pas substituer le modèle animal par ces modèles.

Réduction

Afin de respecter le principe de réduction, les rats correctement lésés lors de l’apprentissage de la lésion par l’expérimentateur seront inclus dans l’étude pilote. De plus, cette étude sera effectuée dans le but de permettre une mise à mort des animaux à deux délais au lieu de trois délais différents (J3 ou J7 post-lésionnel et J30 post-lésionnel). L’étude de ces deux délais est nécessaire afin d’élucider les effets à court terme du traitement et la prolifération cellulaire (J3 ou J7 post-lésionnel) mais aussi afin de comprendre les effets à long terme du traitement et la survie et différenciation cellulaire (J30 post-lésionnel). De plus, les animaux mis à mort au 30ème jour après la lésion pour les investigations cellulaires sont les animaux soumis aux tests comportementaux. Également, il a été choisi de faire un test qualitatif permettant d’observer l’expression de plusieurs protéines pro- et anti-inflammatoires, pouvant être modulées dans le syndrome vertigineux. Ce test permettra de cibler les protéines à étudier en profondeur en utilisant des tests semi-quantitatifs et ainsi de ne pas multiplier le nombre d’essai et d’animaux. Enfin, les mêmes animaux seront utilisés afin de réaliser l’ensemble des études biochimiques (correspondant aux dosages des protéines et des marqueurs du stress et de l’anxiété). Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour chaque groupe en fonction de l’expérience précédente de l’équipe et avec l’aide d’un statisticien. Enfin, la répartition des animaux dans les groupes sera randomisée et l’expérimentateur travaillera en aveugle. Dans la dernière procédure de ce projet, les groupes qui auront préalablement été faits lors de la procédure précédente ne seront pas répétés afin de limiter le nombre d’animaux.

Raffinement

Notre modèle d’étude est un modèle de vestibulopathie unilatérale périphérique aiguë, obtenu par une administration transtympanique (TT) d’un composé ototoxique. Avant cette administration TT, les animaux sont anesthésiés pour éviter tout inconfort ou angoisse. Leur température est maintenue avec une couverture chauffante thermorégulée par une sonde anale et une solution d'hydrogel est appliquée sur leurs yeux pour assurer une hydratation oculaire. Après l’administration TT (ou lésion), l’animal est observé jusqu'à récupération de l’anesthésie. Avant le réveil, l’animal est hydraté (injection sous-cutanée d’un liquide) afin de compenser les pertes liquidiennes associées à la lésion. Les biberons sont équipés d'une pipette allongée pour faciliter l’hydratation et une solution nutritionnelle complète est déposée dans la cage pour assurer une bonne alimentation durant 1 semaine. Un examen clinique journalier à la même heure sera effectué afin de surveiller l’état des animaux prévenant une souffrance de ces derniers : allure du pelage, prostration, état des oreilles et des yeux. Puisqu’une perte de poids est un effet indésirable connu suite à une lésion vestibulaire, un suivi de poids régulier sera également effectué. L’administration TT n’occasionne pas de douleur post-opératoire et ne nécessite donc pas d’administration d’analgésiques. Elle est pratiquée en clinique chez les patients sans anesthésie préalable pour détruire le vestibule chez des patients résistants aux traitements pharmacologiques et souffrants de syndromes vestibulaires invalidants. Tous les animaux sont soumis à une phase d’habituation à l’expérimentateur ainsi qu’à la salle d’expérimentation pendant une semaine limitant ainsi tout stress ou angoisse potentielle. Les co-porteurs du projet sont formés en expérimentation animale (niveau concepteur de projet) et sensibilisés au bien-être animal. MODIFICATION : en cas de besoin, une crème sera appliquée en soins post-opératoires (2×/jour, 1–2 semaines) pour améliorer le confort et limiter la variabilité liée aux complications locales. Lors des enregistrements électrophysiologiques, une anesthésie locale est réalisée aux points d’insertion des électrodes. La température est maintenue par couverture chauffante.

Choix des espèces

La compensation vestibulaire est un processus présent chez les mammifères. Précédemment, notre laboratoire étudiait le modèle félin, espèce la mieux adaptée au comportement d’équilibration. Les tests comportementaux utilisés chez le chat ont ensuite été adaptés chez le rat. Le modèle rongeur présente de nombreux avantages en termes de manipulation et il reproduit le syndrome vestibulaire rencontré chez différentes espèces, dont l’humain. De plus, la durée totale du syndrome vestibulaire est significativement réduite chez le rat (2 à 3 semaines) par rapport à l’humain (90 jours). Ce gain temporel est avantageux pour l’étude de composés anti-vertigineux et pour la compréhension des mécanismes neurobiologiques responsables du syndrome. De plus, à un niveau cellulaire, nous retrouvons les mêmes modifications post-lésionnelles que celles observées chez le chat (production de cellules, modification dans l’inflammation et dans les marqueurs de l’excitabilité neuronale). La présente étude s’intéresse aux processus de compensation post-lésionnelle adultes présents après lésion vestibulaire et à l’effet anxiolytique de la bétahistine. L’étude de ces mécanismes dans les noyaux vestibulaires sera donc réalisée sur des rats adultes (10 à 13 semaines), afin de s'assurer d’être sorti de la période développementale. Pour un rat, la maturation des neurotransmetteurs et la densité synaptique est atteinte à plus de 8 semaines. De plus, en période développementale, un marqueur de l’excitabilité neuronale (co-transporteur membranaire) est moins exprimé qu'à l'âge adulte. Puisque nous étudions cet élément comme étant une des modifications post-lésionnelles, il est nécessaire d'avoir des rats adultes d'au moins 10 semaines pour tester nos différents composés et avoir une maturation complète du système nerveux central.

Greffer dans les bronches des cellules souches humaines corrigées génétiquement conduit ici à utiliser 10 mini-porcs, tous tués à l'issue pour analyses histologiques, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie sous anesthésie pouvant durer deux heures trente, deux séances d'imagerie d'une heure trente et huit prélèvements sanguins sous anesthésie de trente minutes. Le porteur liste les risques attendus, bronchite, pneumonie, saignement, détresse respiratoire aiguë, pneumothorax, pleurésie et signes de sepsis, puis les juge "extrêmement réduits" grâce aux traitements préventifs. Le bénéfice qu'il avance, fournir les données d'un futur essai clinique sur la dyskinésie ciliaire primitive, dépend entièrement de résultats "favorables" encore à obtenir.

Objectifs

La majorité des maladies pulmonaires d’origine génétique, comme certaines formes de mucoviscidose, n’ont pas encore de traitement curatif. Les tentatives de traitement par inhalation de virus modifiés n’ayant pas donné les résultats espérés, une nouvelle approche combinant thérapie cellulaire et thérapie génique a vu le jour. Nous avons mis au point une méthode simplifiée pour créer des cellules souches à partir du sang du patient, les corriger génétiquement, puis les transformer en cellules capables de régénérer les voies respiratoires. Cette technologie ouvre la voie à des traitements innovants pour les maladies pulmonaires génétiques. Pour valider cette approche, nous l’appliquons actuellement à une maladie rare appelée dyskinésie ciliaire primitive (PCD).

Bénéfices attendus

Les bénéfices concernent le traitement de la dyskinésie ciliaire primitive (PCD). Si les résultats sont favorables, notre travail pourrait permettre à conduire un futur essai clinique, en fournissant des données qui seront nécessaires à la mise en place d'un essai clinique.

Procédures

Les animaux sont soumis à : -Procédures chirurgicales : sous anesthésie, donc la durée sera plafonnée à 2h30, afin d'assurer une récupération optimale aux animaux; - Imagerie (2 fois) : sous anesthésie, donc la durée sera plafonnée à 1h30; - Prélèvements sanguins (8 fois) : sous anesthésie rapide de 30 minutes maximum.

Impact sur les animaux

La principale nuisance attendue chez les animaux est relative à la greffe des cellules, plus précisément au conditionnement excessif (risque de dommage des bronches) ou bien insuffisant, lesquelles pourront induire la mort des cellules greffées. Une mort cellulaire excessive pourrait être la conséquence d'une dissociation unicellulaire des progéniteurs bronchiques humains dérivés des iPSC dans le contexte d'une stase intra bronchique, d'un piégeage du mucus ou, à l'inverse, d'une toux et d'expectorations après administration. Les risques principaux sont également : bronchites, pneumonie, saignement, détresse respiratoire aigue, pneumothorax, pleurésie, signes de sepsis. Ces risques à priori paraissent extrêmement réduits étant donnés les prémédications prophylactiques périprocédures (antibiothérapies, corticothérapie, anti tussifs). La simple mesure des constantes, et la réalisation d’une tomodensitométrie visant à évaluer ces risques sont ainsi prévues. Entre autres, des complications liées à la chirurgie ou à l'anesthésie ou les effets indésirables du traitement immunosuppression peut être également observées. De plus, une adaptation du protocole en termes de médicament anesthésique, de choix de traitement, etc. sera éventuellement proposée pour la deuxième série d'animaux (8 mini-pigs).

Devenir

A la fin du projet, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses histologiques

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative de remplacement, car l’objectif de cette étude est d’évaluer la toxicité ainsi que l’efficacité sur un modèle animal avant passage chez l’homme.

Réduction

Au total, 10 animaux seront utilisés (2 et 8). Un nombre d'animaux se trouve réduit au minimum nécessaire pour l'obtention de données suffisamment fiables, la toxicité et efficacité de xénogreffe de progéniteurs d'épithélium bronchique dérivés d'iPSC en "conditions réelles".

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leurs besoins éthologiques avec des enrichissements propres à l’espèce. De plus, la température de la salle d’hébergement sera augmentée après chaque anesthésie. Le suivi quotidien des animaux et les pesées hebdomadaires sont assurés par le personnel technique et animalier habilité et habitué à travailler avec des porcs. Les animaux suivront également un programme de socialisation afin de réduire le stress engendré par les actes quotidiens. En cas de troubles liés au dispositif, des traitements pourront être mis en place, similaires à ceux pratiqués en médecine humaine. Tout acte douloureux ou fortement stressant sera réalisé sous sédation ou sous anesthésie (locale ou générale selon les besoins). Si nécessaire, la douleur sera prise en charge par l'administration de traitements analgésiques adaptés : anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et/ou morphiniques. Au cours des études, les animaux feront l'objet d'un suivi clinique, afin de détecter tout signe de mal-être ou toute anomalie physique. Des examens d'imagerie (une bronchoscopie et le scanner) et sanguins viendront compléter cette évaluation.Concernant l'immunosuppression, le traitement par ciclosporine sera administré avec l’alimentation, afin de limiter le stress et de ne pas perturber les animaux. De plus, compte tenu de l’immunosuppression, des mesures de biosécurité seront renforcées : un équipement de protection individuelle propre sera utilisé pour réduire le risque infectieux. Enfin, un suivi biologique régulier (formule sanguine complète et biochimie) permettra d’adapter rapidement la posologie en fonction des effets observés, limitant ainsi les effets secondaires.

Choix des espèces

Nous utiliserons des mini-porcs qui ont une anatomie pulmonaire proche de celle de l'humain et peuvent facilement être immunosupprimés pendant plusieurs semaines grâce à la ciclosporine permettant une xénogreffe. De plus, seul un grand modèle comme le porc peut fournir une situation clinique similaire à celle rencontrée chez l'homme, notamment en ce qui concerne l'accès par fibroscopie lobaire et la grande surface à traiter. Les mini-pigs à l'âge adulte (8 à 10 mois) ont une anatomie pulmonaire proche de celle de l'humain (5 lobes, accès facile à l'endoscope humain).