Recherche fondamentale

4 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées pour analyse du cœur et des organes, une partie gardée pour entretenir l'élevage. Elles subissent une biopsie de la queue ou de l'oreille, des injections, et pour certaines des échocardiographies sous anesthésie de quinze minutes. Le porteur indique que certains animaux portent un phénotype dommageable provoquant une atteinte cardiaque et une mort spontanée, et prévoit 60 souris par groupe au lieu de 40 pour absorber cette mortalité. Il qualifie le modèle animal d'"incontournable" et de "préalable indispensable" pour valider des traitements de la myocardite, tout en précisant que les produits testés sont des références du commerce dont l'efficacité a déjà été confirmée sur cellules.

Objectifs

Notre projet a pour but de comprendre le rôle de l'inflammation dans la myocardite, pathologie cardiaque aigüe et sévère. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris présentant spontanément une myocardite. Nous étudierons la fonction cardiaque ainsi que la présence de cellules immunitaire dans le coeur afin d’identifier les acteurs clés responsables de l’aggravation de la maladie. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes de cette myocardite, et d’identifier de potentielles pistes thérapeutiques pour cette pathologie qui présente chez l’homme une évolution rapide et souvent grave, avec un taux de mortalité pouvant atteindre 30 à 50%.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de développer une stratégie thérapeutique innovante visant à limiter les dommages tissulaires résultant de l'action des cellules immunitaires au cours d'une myocardite. Le développement d'un traitement de la phase aiguë de la myocardite présente de nombreux avantages potentiels, permettant d’améliorer la qualité de vie des patients, réduire les coûts de santé et diminuer la morbidité.

Procédures

Les animaux vont subir la une biopsie de queue ou d'oreille. Une partie des animaux va subir une injection d'une durée maximale de 30 seconde. Une partie des animaux va subir une ou plusieurs échocardiographie non-invasive et indolore qui sera réalisée sous anesthésie générale pour une durée maximale de 15 minutes.

Impact sur les animaux

Effets indésirables liés à l’expérimentation : inconfort lié à la préhension et contention des animaux, stress lié à l'anesthésie. Potentielle douleur légère et de courte durée lors de l'injection et lors de la biopsie de queue ou d'oreille. Certains animaux présentent un phénotype dommageable associé à une atteinte cardiaque provoquant une mort spontannée.

Devenir

Les animaux issus de l'élevage seront utilisés pour contribuer au maintien de l'élevage ou pour constituer les groupes expérimentaux s'ils sont d'un génotype d'intérêt, ils seront mis à mort sinon. Les animaux constituant les groupes expérimentaux seront mis à mort pour réaliser des analyses histologiques ou d'inflammation dans le coeur et les organes.

Remplacement

L'étude expérimentale sur des animaux est une étape incontournable pour comprendre les mécanismes intervenant dans le développement de la myocardite. En effet, ces phénomènes complexes impliquent plusieurs organes et de nombreux types cellulaires, ce que les modèles in vitro ne peuvent reproduire. Nous cherchons à comprendre dans ce modèle animal, les diverses interactions cellulaires et tissulaires qui se produisent lors d'une myocardite. Ces modèles précliniques de souris sont également un préalable indispensable pour valider les stratégies thérapeutiques avant leur application chez les patients atteints d'une myocardite. Les produits utilisés sont des références disponibles dans le commerce et dont l'efficacité a déjà été confirmée in vitro sur des cellules.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de ce projet a été calculé au plus juste. En utilisant des calculs de puissance pour déterminer la taille minimale suffisante des groupes expérimentaux, nous obtenons une taille d’échantillon de 17 souris par groupe. En tenant compte des aléas inhérents au modèle animal, et en distinguant mâles et femelles, nous estimons une taille de groupe à 40 animaux sans phénotype dommageable et 60 pour les animaux présentant le phénotype dommageable, afin d’inclure la mortalité associée au modèle. Les résultats seront analysés à l'aide des tests statistiques adaptés. Pour réduire le nombre d’animaux, nous analyserons plusieurs paramètres sur le même animal.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cages enrichies dans l’animalerie où les conditions d'hébergement et d'élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris. Lors des procédures expérimentales, la souffrance animale sera réduite au maximum par l'utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptées et l’établissement de points limites stricts et adaptés aux procédures. Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière par le personnel technique qualifié de l’animalerie ainsi que les expérimentateurs pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être. Les grilles de score de suivi des points limites seront remplies sous contrôle de la personne responsable de la mise en oeuvre du projet.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour l'étude des maladies cardiovasculaires. De plus, c’est le seul modèle dans lequel ont été générées les lignées mutantes que nous souhaitons étudier. Nous utiliserons des souris âgées de 3 semaines environ au moment de l'identification Cet âge correspond à l'âge à partir duquel il faut sevrer les animaux. Nous utiliserons ensuite les animaux adultes, âgés de 9 à 32 semaines pour les expérimentations. A ces âges, le système cardio-vasculaire est arrivé à maturité mais n'est pas encore senescent.

Quatre loups vont être capturés au piège à patte ou par fléchette anesthésique, chacun immobilisé environ 45 minutes, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Pendant ce laps de temps, l'animal est pesé, mesuré, prélevé de sang et d'ADN, perforé aux deux oreilles pour y fixer une étiquette et équipé d'un collier GPS. Le porteur énumère les risques de la capture, du stress aux blessures superficielles jusqu'aux luxations, fractures des os longs et myopathie de capture, et rappelle que l'anesthésie peut provoquer un arrêt cardio-respiratoire. Les quatre loups sont relâchés immédiatement après la manipulation puis suivis douze à vingt-quatre mois, le temps de la batterie du collier.

Objectifs

Un certain nombre d’études ont été menées à travers le monde sur le loup et son rôle sur les populations proies et les écosystèmes. En effet, en tant que prédateur, le loup a un impact potentiellement important sur les populations de proies, en particulier les ongulés sauvages, en termes de densité et de comportement en modifiant la distribution, la sélection des habitats, le régime alimentaire et la démographie des grands herbivores sauvages, avec des effets sur les écosystèmes associés. Ces effets sont toutefois très peu documentés dans des environnements dominés par les activités humaines, tel qu’on peut en trouver en France et en Europe. Or, en tant que super-prédateur, l’humain et ses activités impactent l’ensemble des interactions entre les espèces et leur environnement. Alors que le loup recolonise rapidement le territoire européen et français, il devient nécessaire de mieux évaluer son comportement dans des écosystèmes dominés par les activités humaines et les effets de son expansion sur ceux-ci, en particulier sur des territoires à protection forte. Ce projet vise à combler ces lacunes en étudiant le comportement et l’utilisation de l’espace d’une meute de loups vis-à-vis des activités humaines et de ses interactions avec les autres espèces sauvages, et ainsi nous éclairer sur le rôle que joue le loup dans un écosystème anthropisé de montagne. Du fait des nombreux suivis qu’elle réalise sur la faune sauvage, la flore et les habitats naturels depuis de nombreuses années, et de son rôle majeur dans la conservation de la biodiversité, une Réserve naturelle nationale abritant depuis peu une meute de loup, représente un site d’étude idéal pour étudier ces questionnements. Les objectifs d’une telle étude sont : Étudier le comportement d’une meute de loup sur leur territoire en fonction de la saisonnalité et des activités humaines; Définir le régime alimentaire des loups dans un contexte d’abondance forte de cervidés sauvages et une dominance de l’élevage bovin ; Évaluer les impacts sur la densité, la distribution et le comportement des ongulés sauvages, notamment du Cerf élaphe, et les effets indirects à plus ou moins long terme sur les écosystèmes forestiers utilisés par ces derniers. L'intérêt global est l'acquisition de données comportementales sur le loup en tant que nouvel acteur dans un écosystème à protection forte afin de pouvoir assurer sa conservation ainsi qu'une coexistence optimale de cette espèce avec les différentes activités humaines.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de concrétiser des études et suivis de loups dans un territoire multi-usages et multi-acteurs, typique des paysages montagnards confrontés au retour de ce grand prédateur ces dernières décennies en France et en Europe. Via l’acquisition de données par GPS sur cette espèce très discrète, sur un site d’étude protégé et très suivi (faune, flore et habitats) par ailleurs sur le long terme, ce projet permettra d’acquérir de nouvelles connaissances sur le comportement des loups, le fonctionnement d’une meute dans un contexte local à usages multiples et leurs rôles dans les socio-écosystèmes de montagne. Des connaissances importantes seront également acquises sur les impacts directs et indirects des loups sur la faune sauvage à l’instar des ongulés sauvages, mais aussi sur d’autres espèces à enjeu telles le Grand tétras, la Gélinotte des bois et le Lynx, ainsi que sur les écosystèmes associés (notamment forestiers). Bénéficiant de paysages contrastés, le projet permettra également d’acquérir des connaissances sur les potentiels points de contacts entre loups et humains et sur les déplacements de loup dans un paysage dynamique en termes de dérangements anthropiques en fonction des secteurs et de la saisonnalité. À plus long terme, le projet permettra de mettre en évidence les effets indirects du loup sur les écosystèmes forestiers et le rôle bénéfique qu’il pourrait jouer via la réduction des impacts des herbivores sur les forêts exploitées. Les connaissances acquises serviront à une conciliation des usages entre les activités d’exploitation forestières et de chasse tout en assurant le maintien de la biodiversité sur les milieux forestiers. Enfin, le suivi des loups et l’étude de leurs interactions avec les activités humaines et la faune sauvage, nous permettra d’avoir une meilleure compréhension de l’espèce et de son rôle dans les écosystèmes. En local, afin de maintenir l’intégrité des loups équipés et le bon fonctionnement de la meute suivie, la Réserve naturelle coordonnant ce projet a proposé en parallèle, pour les zones en dehors de son territoire (le tir létal dans la Réserve naturelle étant interdit), des alternatives aux tirs létaux de défense (ex. surveillance troupeau par agent de la réserve ou bénévole, aide berger, tir d’effarouchement, etc), ce qui assurerait la protection des individus concernés.

Procédures

Les loups seront capturés avec des pièges à patte ou par téléanesthésie (flèche anesthésique projetée par un fusil alimenté au CO2). Ils seront manipulés sous anesthésie générale. Sur une bâche de manipulation, ils seront équipés d’un collier GPS puis un ensemble de mesures corporelles (poids, mensuration), une prise de sang (analyses sanguines) et un frotti buccal (prélèvement ADN) seront effectués avant que l’animal soit relâché. Un marquage auriculaire sera également réalisé par perforation sur chaque oreille à l’aide d’une pince et d’une étiquette en plastique spécifique et adaptée. L’ensemble des manipulations est réalisé en 45 minutes environ (de l’anesthésie générale au relâcher). Après leur relâcher, les déplacements des animaux seront suivis pendant 12 à 24 mois (durée de batterie du collier). Une fois le suivi terminé le collier sera décroché automatiquement ou à distance.

Impact sur les animaux

La capture peut occasionner du stress, des troubles locomoteurs légers en réponse à un stress musculaire, des changements hiérarchiques au sein de la meute, des blessures superficielles en cas de traction sur le piège ou de morsure du câble, des blessures sévères (rares : boiterie du membre entravé, luxation des articulations, fractures des os longs), une myopathie de capture, un risque de mortalité (très faible: aucun cas de mortalité n’a été rapporté avec ce protocole par les partenaires internationaux du projet). Les effets indésirables potentiels de l'anesthésie sont : hypoventilation, hypotension, anomalies du rythme cardiaque, perturbations de la température corporelle, troubles neurologiques, nausées, vomissements, déficit de la circulation sanguine, ulcères de la cornée de l’œil, arrêt cardio-respiratoire dans de très rares cas. Des protocoles seront mis en place tout au long de l’anesthésie pour prévenir ou contrecarrer ces effets.

Devenir

Tous les animaux sont relâchés dans le milieu naturel immédiatement après leur manipulation.

Remplacement

Il n’y a pas d’alternative satisfaisante aujourd’hui au suivi des grands prédateurs en milieu naturel, constat établi récemment par le conseil scientifique du Plan National d’Actions loup et activités d’élevage. En effet, les études écologiques et comportementales impliquant le suivi de ces espèces sont essentielles pour comprendre leurs interactions avec les activités humaines, la faune sauvage ainsi que les effets en cascade sur la végétation forestière notamment. Cet état des connaissances est d'autant plus important dans un contexte montagnard qui est sensible au retour du loup de par sa fragilité intrinsèque, mais aussi par la présence de multiples activités humaines, dont le pastoralisme. Cependant, les données apportées par ce type de suivi permettront d’ouvrir la voie à la modélisation informatique de l’utilisation de l’espace par les loups et de leurs interférences avec la faune sauvage et les activités humaines, ce qui pourrait autoriser à l’avenir un remplacement des suivis en nature pour répondre à certaines questions scientifiques et/ou de gestion (par exemple caractérisation des facteurs orientant la prédation sur des animaux domestiques).

Réduction

Pour obtenir des données généralisables à d’autres contextes, en prenant en compte les différences intrinsèques liés à l’individu, son rôle social au sein de la meute, les variations de cultures de meute, etc, il faut compiler des données sur un certain nombre d’animaux. Dans un premier temps, nous avons pour ambition de commencer par la capture de 4 loups, qui permettront de construire la capacité et les connaissances de terrain sur les captures, et commenceront à produire des données exploitables (dès la première capture). Capturer plusieurs individus d’une même meute est envisagé afin d’obtenir des informations sur la dispersion d’individus isolés d’une part, et pour assurer une redondance en cas de tir/collision avec un véhicule ou autre mortalité d’un individu suivi d’autre part. Ce suivi de plusieurs loups par collier GPS en milieu de moyenne montagne bénéficiera à de nombreux partenaires scientifiques en France et en Europe. En effet, les données sur l’écologie spatiale du loup seront mises à disposition dans le cadre d’un réseau scientifique européen sur les mouvements des mammifères et, plus globalement, dans une dynamique mondiale de partage de ce type de données. Les données collectées lors de notre projet, uniques en France, seront combinées à celles d'autres projets européens (dans des contextes socio-écologiques différents) impliquant des captures de loups et s'intéressant à des questions similaires. Une collaboration nationale et internationale est déjà établie dans ce sens avec les équipes partenaires travaillant sur ce sujet en France et en Europe.

Raffinement

1/ Piégeage : *Choix des sites et moments de capture priorisant la sécurité des animaux (pas de capture en été et dans conditions météo non favorables) *Ajout de ressorts et d'articulations (pivots) à la longe afin de garantir un bon niveau d'absorption pour limiter les risques de blessures *Ajout de bourrelets en tissus sur le lacet coulant pour assurer la circulation sanguine dans la patte *Alerte de déclenchement pour une intervention rapide (

Choix des espèces

Dans des territoires sauvages, il a été montré que le loup peut substantiellement modifier la densité, la distribution et le comportement des grands herbivores sauvages (ses proies privilégiées) avec des conséquences en cascade sur les écosystèmes associés. Le comportement du loup, ses interactions avec les autres espèces et son impact sur les écosystèmes sont toutefois peu documentés dans des environnements dominés par les activités humaines, qui peuvent impacter l’ensemble des interactions entre les espèces. Ainsi, les connaissances sur l'écologie du loup demeurent encore insuffisantes pour appréhender et prédire ses effets sur un territoire. Ce projet vise donc à combler ces lacunes et à nous éclairer sur le rôle que joue le loup dans un écosystème anthropisé de montagne. Pour répondre à cette problématique le recours au suivi de loups équipés de collier GPS est l’option la plus pertinente (cf. rapport du Plan National d’Actions loup et activités d’élevage). Les équipements seront déployés uniquement sur des individus subadultes et adultes d’au moins 23 kilogrammes, qui sont jugés comme suffisamment développés pour pouvoir supporter un équipement par collier GPS, d’après les retours d’expérience des projets européens portant sur le loup. Les périodes ciblées de capture permettront d’éviter de capturer des femelles dans le dernier tiers de gestation ou des jeunes.

Choisis parce que le rat se concentre mieux sur une tâche que la souris et se montre "très gourmand", 30 rats sont équipés d'électrodes implantées dans quatre régions du cerveau. Le niveau de souffrance déclaré est modéré. La chirurgie avec ouverture du crâne dure quatre heures, suivie de deux périodes de dix jours de restriction alimentaire et d'isolement, pendant lesquelles l'activité cérébrale est enregistrée en continu. Le porteur écrit que la prise en charge de la douleur est optimisée "pour que les animaux ne ressentent aucune douleur", et prévoit de tuer les 30 rats à la fin pour ouvrir leur cerveau et vérifier où les électrodes avaient été posées.

Objectifs

Ce projet vise à élucider les mécanismes neuronaux qui sous-tendent la mémoire de travail et sa sensibilité aux interférences, en s’appuyant sur des enregistrements électrophysiologiques multi-sites chez le rat. Il permettra de répondre aux questions suivantes : (1) Comment différentes régions cérébrales (hippocampe, cortex préfrontal, pariétal et rétrosplénial) coopèrent-elles pour a) maintenir à court terme des informations en mémoire, puis b) effacer celles-ci afin qu’elles n’interfèrent pas avec le stockage et rappel ultérieur de nouvelles informations ? (2) Quelles sont les signatures oscillatoires et les mécanismes synaptiques associés à ce stockage des informations en mémoire et à leur oubli ? (3) Ces signatures diffèrent-elles selon que la tâche impose un haut ou faible niveau d’interférence ?

Bénéfices attendus

Le projet proposé vise à caractériser les dynamiques synaptiques et neuronales impliquées dans la mémoire de travail et les processus d’oubli adaptatif chez le rat. En combinant des tâches comportementales bien contrôlées à des enregistrements électrophysiologiques multi-sites, ce travail permettra de documenter avec une résolution inégalée les interactions entre hippocampe, cortex pariétal, rétrosplénial et préfrontal dans la gestion flexible des traces mnésiques. À court terme, le projet apportera des données fondamentales sur les signatures oscillatoires et synaptiques liées à la gestion des interférences en mémoire de travail. Il permettra également de valider l’usage des sondes d'enregistrements multi-sites pour l’étude de fonctions cognitives complexes en contexte comportemental, renforçant la faisabilité technique de futures recherches multi-régions chez le rongeur. À long terme, ces résultats pourraient contribuer à l’élaboration de nouveaux modèles intégrés de la mémoire de travail, en rupture avec les approches cloisonnées classiques. Une meilleure compréhension de l’équilibre entre persistance et effacement des souvenirs pourrait éclairer certains déficits cognitifs observés dans des pathologies comme le vieillissement cérébral, le TDAH ou les troubles liés à un excès de rigidité cognitive (ex. autisme, troubles obsessionnels). Bien que ce projet ne soit pas directement translationnel, ses retombées théoriques pourraient guider des recherches ultérieures visant à identifier des biomarqueurs électrophysiologiques exploitables en clinique ou à développer de nouvelles stratégies de remédiation cognitive. D’un point de vue méthodologique, il contribuera aussi à renforcer les normes de raffinement en neurophysiologie in vivo, notamment via la réduction du stress expérimental grâce à une instrumentation légère, continue, et intégrée au comportement libre de l’animal.

Procédures

les animaux subissent une chirurgie invasive avec craniotomie (4 heures). Puis, ils subissent deux périodes de restriction alimentaire couplées à un isolement de leurs congénères (2 fois 10 jours) et seront enregistrés en continu pendant ces deux périodes.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus dans ce projet sont liés aux procédures chirurgicales et aux protocoles comportementaux. En effet, les animaux peuvent souffrir de douleurs post-opératoires, qui sont minorées par les antalgiques. Les tests comportementaux peuvent provoquer un stress du fait de l’hébergement individuel.

Devenir

tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure afin de pouvoir prélever leur cerveau et confirmer les sites d’implantation des électrodes.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour ce projet. En effet, ce projet combine étude du comportement chez le rat pendant des tâches d’apprentissage faisant intervenir des formes de mémoires distinctes et enregistrements simultanés de plusieurs aires cérébrales. Il est à ce jour impossible de mimer des apprentissages aussi complexes impliquant le traitement d’interférences en mémoire de travail dans aucun modèle vivant complexe tels que les organoïdes qui de plus ne sont pas encore assez aboutis pour reproduire les connexions entre les différentes aires corticales.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit grâce à l’utilisation de tests statistiques appropriés qui permettent de prendre en compte à la fois les mesures répétées sur le même animal et les mesures effectuées entre les animaux. Ces tests puissants permettent d'inclure des animaux même en cas de données manquantes et de réduire le nombre d'animaux grâce aux mesures répétées. De plus, chaque animal sera enregistré en situation contrôle (avant apprentissage) et de test (après apprentissage) afin de pairer les résultats ce qui les rend plus puissants.

Raffinement

Le haut niveau de complexité des chirurgies effectuées sur ces animaux permet de générer un grand nombre de données par animal et de maintenir une haute qualité d’enregistrement pendant plusieurs jours consécutifs. Dans ce projet, les enregistrements électrophysiologiques seront combinés à des tâches comportementales complexes qui ont été largement validées dans notre équipe ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux. Dans la grande majorité des études, les animaux implantés sont isolés pour protéger les implants. Or, l’isolement représente un stress majeur pour les rats. Nos étapes d’habituation et d’isolement ont donc été raffinées afin de limiter le stress des animaux, et ceci nous permet de maintenir les animaux au minimum par deux. Dans cette étude, les rats seront ainsi équipés d’un chapeau de protection en plastique solide afin de protéger les implants et de permettre de maintenir les animaux en groupe lorsqu’ils ne sont pas cablés. Enfin, la prise en charge de la douleur pendant la chirurgie et en post-chirurgie est optimisée pour que les animaux ne ressentent aucune douleur et une habituation lente et progressive est effectuée afin de réduire au maximum le stress de l’animal. Une grille de score est utilisée pendant les 5 jours post-opératoires afin d’avoir une mesure objective de la récupération de l’animal. Des points limites clairs et objectifs ont été définis afin de limiter au maximum toute souffrance.

Choix des espèces

Ce projet requiert l’utilisation de rats du fait du haut niveau de dextérité et de complexité cognitive attendus. Il n’existe pas de méthode alternative pour étudier un phénomène physiologique aussi complexe que la synchronisation des oscillations cérébrales et activités neuronales sur les réponses synaptiques. Les rats possèdent des rythmes cérébraux oscillatoires très similaires à ceux de l’homme. D’autre part, le rat possède les capacités cognitives et les facultés de se concentrer sur une tâche qui ne sont pas aussi développées chez la souris par exemple. Ils sont aussi très gourmands, ce qui permet d’effectuer l’étude sans une restriction alimentaire très poussée une fois qu’ils sont habitués à récupérer leurs récompenses alimentaires (en fin d’habituation, les rats sont souvent motivés à rechercher les récompenses alimentaires en étant seulement à -10 voire -5% de leur poids initial). Les animaux seront des jeunes adultes suivant ce protocole : arrivée à 8 semaines, chirurgie et post-chirurgie de 0 à 12 semaines, enregistrements et comportement des semaines 12 à 17. Ce projet vise à étudier le comportement et l’activité cérébrale associée chez des animaux adultes non âgés.

94 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit d'abord une chirurgie crânienne de 80 minutes, puis 31 séances d'auto-administration d'héroïne, onze de deux heures et vingt d'une à six heures selon le groupe, couplées à des injections de substances directement dans le cerveau par un dispositif implanté. Le porteur signale une possible stagnation du poids liée au cumul de la chirurgie, des injections ciblées et des séances prolongées. Le bénéfice qu'il avance, faire de cette protéine une "cible thérapeutique prometteuse" contre la rechute chez les personnes dépendantes aux opioïdes, reste une perspective, quand la dépendance à l'héroïne provoquée chez ces 94 rats est le point de départ du protocole.

Objectifs

Dans une étude en cours de publication, nous avons observé que certains rats, qui développent un comportement de consommation compulsive d’héroïne, présentent une baisse du niveau d’expression d’une certaine protéine dans une région précise du cerveau. En revanche, les rats qui ne deviennent pas dépendants ne montrent pas cette diminution. Pour mieux comprendre le rôle de cette protéine dans l'apparition du comportement addictif, nous prévoyons de bloquer sa production spécifiquement dans cette zone du cerveau. Cela nous permettra de voir si cette protéine joue un rôle clé dans la consommation excessive d’héroïne.

Bénéfices attendus

Cette caractérisation permettra de faire de cette protéine une cible thérapeutique prometteuse pour diminuer le risque de rechute chez les patients dépendants aux opioïdes.

Procédures

Chaque animal participe à un parcours expérimental structuré en différentes étapes :chirurgie (80 min) puis, après récupération, séances de comportement (11 séances de 2 h suivies de 20 séances d’1 h ou de 6 h selon le groupe) couplées à l’injection intracérébrale de substances via un dispositif implanté (3 injections ou 6 injection selon les groupes).

Impact sur les animaux

• Après chirurgie : douleur légère à modérée et gêne transitoire, prévenues et traitées par une prise en charge antalgique et des soins adaptés. • Pendant les séances de comportement : fatigue transitoire possible chez certains animaux très actifs ; surveillance du poids et de l’état général tout au long du projet. • Effets cumulés : la combinaison d’une chirurgie, d’injections ciblées et de séances prolongées peut entraîner une stagnation temporaire du poids chez quelques animaux. Des points limites sont définis et déclenchent, si besoin, une sortie anticipée de l’animal du protocole.

Devenir

A l'issue des 2 procédures, les animaux sont mis à mort pour prélèvement des cerveaux.

Remplacement

Ce projet ayant pour but d’étudier le rôle fonctionnel d’une protéine sur le comportement d’auto-administration de drogue, aucune méthode alternative n'existe. Il s'agit en effet d'étudier le comportement spontané et volontaire des animaux après apprentissage, ce qui ne peut être réalisé sur des modèles alternatifs (approches in silico, in vitro ou ex vivo).

Réduction

La taille des groupes est fondée sur des données antérieures afin d’obtenir une puissance statistique suffisante tout en limitant le nombre d’animaux. Les comparaisons prévues utilisent des méthodes statistiques appropriées ; les analyses intermédiaires permettront, si nécessaire, d’ajuster les effectifs pour éviter toute inclusion non indispensable.

Raffinement

•Anesthésie/analgésie adaptées à chaque étape ; soins oculaires, maintien de la température •Chirurgie stérile réalisée par du personnel formé ; surveillance rapprochée pendant l’anesthésie et au réveil. •Hébergement enrichi, habituation à la manipulation, et points limites prédéfinis (poids, aspect, comportement) déclenchant une prise en charge ou une sortie anticipée. •Utilisation de dispositifs implantés pour limiter les manipulations répétées et garantir des injections ciblées courtes.

Choix des espèces

L’investigation d’une pathologie telle que l’addiction nécessite d’étudier une espèce animale phylogénétiquement voisine de l’être humain pour pouvoir reproduire la maladie. Le rat est un modèle de référence dans le domaine des addictions. Il possède une organisation anatomique et structurelle du cerveau comparable à celle de l’Homme. De plus, il est idéal pour les études comportementales. Le rat est capable d’apprendre des tâches complexes et peut réaliser des comportements élaborés. Les animaux testés seront de jeunes adultes. Ils arriveront au laboratoire à l’âge de 6 semaines environ et ne seront pas testés avant leur 7ème semaine, ce qui correspond à une phase où ils sont sexuellement mâtures. Il est important que nous réalisions ces expériences chez l’animal adulte pour pouvoir éviter le facteur confondant de l’âge sur les facteurs comportementaux mesurés. En effet, l’âge peut influencer de manière significative l’état émotionnel et le comportement de l’animal, un animal vieux pourra ainsi présenter un déclin cognitif ou une diminution de l’exploration par exemple. De même un rat adolescent pourra présenter un comportement différent de l’adulte (exploration plus importante, une prise de risque et une recherche de la nouveauté plus importantes).

Tuées à la fin de chaque procédure parce qu'elles ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées, 1 112 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont injectées dans la rate par chirurgie, puis viennent jusqu'à dix injections, dix prises de sang et neuf séances d'imagerie sous anesthésie par animal, pour tester un vaccin contre le cancer du foie lié au virus de l'hépatite B. Le porteur écrit que la croissance de la tumeur hépatique "est tolérée par les souris" tout en indiquant qu'elle peut affecter leur capacité à s'alimenter. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'évaluer l'immunogénicité des vecteurs et que la complexité des réponses vaccinales dans un "organisme entier" impose l'animal.

Objectifs

Les cancers sont caractérisés par la prolifération incontrôlée de cellules qui subissent une transformation maligne. Le système immunitaire a un rôle majeur dans le contrôle de cette prolifération et plus particulièrement certaines cellules immunitaires capables de tuer des cellules tumorales de façon spécifique. L’utilisation d’une vaccination thérapeutique basée sur de nouveaux candidats vaccins pourrait être particulièrement efficace pour activer ces cellules immunitaires et contrôler la prolifération tumorale. Dans un premier temps, le but est d'établir des lignées tumorales exprimant des antigènes du virus de l'hépatite B au niveau du foie des souris. En cas de succès, l’objectif sera d'évaluer l’efficacité des candidats vaccins seuls, ou en combinaison avec des molécules anticancéreuses, à éliminer ces tumeurs. Cela permettra d’établir la preuve de concept de cette immunothérapie contre le cancer du foie et d’étudier les mécanismes du contrôle immunitaire mis en place dans l’organisme par une vaccination thérapeutique basée sur ces nouveaux candidats vaccins. Ultimement, les vaccins candidats ayant une activité antitumorale notable seront développés en vue d’un essai clinique

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme de ce projet sont la validation de la preuve du concept préclinique d'utilisation d’une vaccination thérapeutique basée sur des candidats vaccins, avec ou sans combinaison avec d’autres molécules anticancéreuses, dans l’immunothérapie du cancer du foie lié à l'infection par le virus de l'hépatite B. L’avantage à long terme du projet actuel sera l'utilisation de ces vaccins d’immuno-oncothérapie dans le contexte d’une co-administration en clinique dans le but d’obtenir un effet additif ou synergique de la réponse immunitaire contre des tumeurs hépatiques.

Procédures

Pour un groupe d’animaux : - Marquage à l’oreille sur animaux vigiles (quelques secondes): 1x - Chirurgie sous anesthésie gazeuse (environ 1/2h): 1x - Injection d’analgésiques (20-30 secondes/souris) toutes les 8-12h jusqu’à disparition des symptômes de douleurs - Injections sur animaux anesthésiés (quelques secondes): 7x - Prélèvements de sang sur animaux vigiles (quelques secondes): 7x - Suivi en imagerie sous anesthésie gazeuse (3-5min/souris): 6x Pour un autre groupe d’animaux : - Marquage à l’oreille sur animaux vigiles (quelques secondes): 1x - Chirurgie sous anesthésie gazeuse (environ 1/2h): 1x - Injection d’analgésiques (20-30 secondes/souris) toutes les 8-12h jusqu’à disparition des symptômes de douleurs - Injections sur animaux anesthésiés (quelques secondes): 10x - Prélèvements de sang sur animaux vigiles (quelques secondes): 10x - Injections sur animaux vigiles (quelques secondes): 1 ou 2x - Suivi en imagerie sous anesthésie gazeuse (3-5min/souris): 9x Pour un autre groupe d’animaux : - Marquage à l’oreille sur animaux vigiles (quelques secondes): 1x - Chirurgie sous anesthésie gazeuse (environ 1/2h): 1x - Injection d’analgésiques (20-30 secondes/souris) toutes les 8-12h jusqu’à disparition des symptômes de douleurs - Injections sur animaux anesthésiés (quelques secondes): 10x - Prélèvements de sang sur animaux vigiles (quelques secondes): 10x - Injections sur animaux vigiles (quelques secondes): 4x - Injection sur animaux vigiles (quelques secondes): 1x - Suivi en imagerie sous anesthésie gazeuse (3-5min/souris): 9x

Impact sur les animaux

L'injection dans la rate des cellules tumorales nécessite une chirurgie et des complications post-opératoires comme des infections peuvent survenir pendant toute la période de suivi. La croissance de la tumeur au niveau hépatique est tolérée par les souris mais peut, dans certains cas, s’associer à une perte d'activité et affecter leur capacité à s'alimenter. Les animaux sont susceptibles de ressentir une légère douleur au moment des injections de vaccins, d'anticorps ou des prises de sang. Cette douleur sera de courte durée et sans impact significatif sur leur bien-être ou leur état général. Douleur au point de piqure et stress lors des prélèvements de sang sur animaux vigils.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Les souris présentant des tumeurs seront euthanasiées pour des raisons éthiques (pour éviter les souffrances). Les souris sans tumeur ne peuvent être réutilisées car leur système immunitaire a été modifié par la vaccination.

Remplacement

L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité vaccinale antitumorale d’un vaccin thérapeutique, injecté seul ou en co-injection avec des molécules anticancéreuses, destiné ultimement à la thérapie de certains cancers du foie. Actuellement, aucun système cellulaire in vitro ne peut être utilisé pour remplacer la recherche vaccinale, car aucun modèle in vitro ne permet d’évaluer l’immunogénicité des vecteurs d’immunisation. Ce type d’étude implique nécessairement une phase d’expérimentation animale du fait de la complexité des réponses vaccinales et antitumorales au niveau d’un organisme entier. Les mécanismes en jeu sont multifactoriels et ne sont pas encore caractérisés de manière exhaustive. Cette étape constitue une preuve de concept requise par les agences réglementaires de santé en vue d’une application chez l’humain, en complément des études réalisées in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour chaque expérience est déterminé en prenant en compte que le développement d’une tumeur et son interaction avec le système immunitaire comporte une large variabilité entre les individus, comme chez l’homme. En choisissant des animaux d’âge proche, il est possible de réduire au maximum cette variabilité. Toujours pour réduire le plus possible le nombre de souris utilisées tout en s’assurant qu’un nombre suffisant sera inclus de façon à rendre les résultats concluants, le nombre d’animaux et de répétitions par expérience ont été définis en fonction de la nature de l’expérience et validés suite à l’exposé et à la discussion du projet avec un biostatisticien. Sur ses conseils, les groupes seront constitués de 10 animaux du fait de la capacité d’implantation et de la variabilité de la croissance tumorale de manière à obtenir des différences statistiquement significatives entre les groupes. Ce nombre pourra être réduit si la variabilité observée lors de la première procédure est moins élevée que celle actuellement estimée. Des études précédentes ont permis d’optimiser notre protocole de vaccination et de définir la cinétique de vaccination permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les vaccins utilisés dans cette étude ont été préalablement validés par des études d’immunogénicité chez la souris afin de s’assurer qu’ils permettent la mise en place de réponses spécifiques contre les tumeurs chez la souris. Avant chaque procédure, le résultat des procédures précédentes sera pris en considération. Si les tumeurs ne s'implantent pas ou si un candidat vaccin n'a pas d’effet significatif sur la croissance de la tumeur, les procédures suivantes ne seront pas réalisées.

Raffinement

L'injection dans la rate des cellules tumorales sera effectuée sous anesthésie gazeuse avec une prise en charge de la douleur avant, pendant et après l'injection. L’implantation de tumeurs hépatiques peut induire une gêne modérée qui sera spécifiquement monitorée 2 à 3 fois par semaine au cours des expériences. Selon notre expérience antérieure, l’injection des vecteurs lentiviraux vaccinaux n’induit aucun signe clinique chez les souris. Les animaux seront observés 2 à 3 fois par semaine pour détecter tout signe d’inconfort ou de souffrance. Si un point limite est atteint, la souffrance des animaux sera abrégée par leur mise à mort. Si les signes cliniques de souffrance sont légers, mais néanmoins présents, comme des poils hérissés, inactivité, plusieurs mesures seront prises. Cela inclut l’ajout de gel hydrique, la réhydratation sous cutanée, le chauffage des cages ou bien l’amélioration de l’enrichissement qui consistera à ajouter la litière à base de cellulose pour éviter l’irritation par les copeaux de bois.

Choix des espèces

Le système immunitaire de la souris est proche du système immunitaire humain. Il existe un modèle de tumeur hépatique qui peut être utilisé chez la souris pour tester notre candidat vaccin. Nos études précédentes montrent que les vecteurs vaccinaux évalués sont immunogènes chez la souris. De plus, de nombreux outils sont disponibles pour étudier les réponses immunitaires chez cette espèce. Les expériences envisagées requièrent des animaux avec un système immunitaire fonctionnel. Elles seront donc menées sur les souris adultes âgées de 6 semaines au minimum.