Recherche fondamentale

Injectées à l'âge de 15 jours avec du N-nitrosodiéthylamine pour déclencher un cancer du foie, puis pour une partie d'entre elles soumises à des injections de tétrachlorure de carbone deux fois par semaine pendant douze semaines, 72 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les tumeurs se développent sur neuf à dix mois, avec une augmentation du volume du foie, une baisse d'activité et une perte de poids possibles, avant quatre semaines d'injections quotidiennes d'un inhibiteur de cyclophilines, puis la mise à mort et le prélèvement du sang et du foie. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucune méthode ne peut se substituer à cette étude et qualifie d'"essentielle" l'utilisation de lignées de souris. Les retombées annoncées, de nouvelles pistes thérapeutiques contre le cancer du foie, restent au conditionnel et à terme, quand les neuf à dix mois de développement tumoral sont, eux, au programme.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement potentiel contre le cancer du foie le plus fréquent. Pour cela, nous utiliserons deux modèles de souris permettant de reproduire différentes situations observées chez les patients. Dans le premier modèle, le cancer du foie se développe progressivement après l’administration d’une substance qui provoque l’apparition de tumeurs au fil du temps. Les animaux développent des lésions au niveau du foie après plusieurs mois. Dans le second modèle, le cancer se développe dans un foie déjà fragilisé par des lésions chroniques (appelées fibrose), une situation fréquente chez les patients atteints de cancer du foie. Ce modèle permet donc de se rapprocher davantage des conditions réelles observées chez l’Homme. Dans les deux cas, le traitement étudié sera administré pendant les dernières semaines de l’expérience afin d’évaluer sa capacité à ralentir la croissance des tumeurs déjà formées, plutôt que d’empêcher leur apparition.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer si ce nouveau traitement peut ralentir la progression du cancer du foie dans deux situations différentes : un foie sain et un foie déjà endommagé. Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement du cancer du foie, notamment le rôle de certaines protéines appelées cyclophilines. À terme, ces travaux pourraient contribuer à l’identification de nouvelles pistes thérapeutiques et servir de base à de futurs développements visant à améliorer la prise en charge des patients atteints de cancer du foie.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection intrapéritonéale unique de N-nitrosodiéthylamine (DEN) à l’âge de 15 jours afin d’induire la carcinogenèse hépatique. Dans le modèle combiné, les animaux recevront également des injections intrapéritonéales répétées de tétrachlorure de carbone (CCl4) deux fois par semaine pendant 12 semaines à partir de l’âge de 8 semaines, afin d’induire une fibrose hépatique. Le traitement par inhibiteur de cyclophilines sera administré par injection intrapéritonéale quotidiennement pendant 4 semaines au cours de la phase tardive des protocoles expérimentaux. Chaque injection intrapéritonéale a une durée approximative de quelques secondes par animal. Les administrations répétées peuvent entraîner une contrainte légère et transitoire liée à la manipulation. Un prélèvement sanguin sera réalisé au moment de la mise à mort afin de permettre les analyses biologiques nécessaires à l’évaluation des effets du traitement.

Impact sur les animaux

L’administration de N-nitrosodiéthylamine (DEN) entraîne le développement progressif de tumeurs hépatiques. À un stade avancé (environ 9 à 10 mois après administration), les animaux peuvent présenter une augmentation du volume du foie (hépatomégalie) liée à la présence de tumeurs. Dans le modèle combiné, l’administration répétée de tétrachlorure de carbone (CCl4) induit une fibrose hépatique, pouvant s’accompagner d’une altération de l’état général des animaux (fatigue, perte de poids modérée). De manière générale, le développement tumoral et la fibrose hépatique peuvent entraîner une dégradation progressive de l’état de santé, incluant une diminution de l’activité et une perte de poids. L’administration de l’inhibiteur des cyclophilines n’est pas associée, à ce jour, à des effets indésirables connus aux doses utilisées.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de faire un prélèvement de sang et du foie pour étudier les effets de l'inhibiteur de cyclophilines.

Remplacement

L'utilisation de modèles animaux est essentielle pour étudier les effets d'un inhibiteur de cyclophilines sur le développement tumoral. Nous avons recours à des animaux car il n’y a pas de méthodes alternatives. En effet, il n’existe aucun moyen de remplacer une telle étude dans laquelle la réponse physiopathologique est complexe et met en jeu plusieurs types cellulaires (hépatocytes, cellules inflammatoires, fibroblastes, …).

Réduction

Le nombre de souris nécessaire a été déterminé comme celui permettant de démontrer une différence statistiquement significative de 30 % de l'aire tumorale. Les résultats seront analysés grâce à un test statistique non paramétrique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en présence de papier kraft et de carrés de coton pour faire leur nid, ainsi que des maisonnettes et des dômes en cellulose. Par ailleurs, un suivi des souris sera réalisé en observant leur comportement et les indices pouvant suggérer une douleur. Des points limites ont été définis. Si un animal atteint l'un de ces points limites, il sera mis à mort de manière anticipée afin de prévenir toute souffrance. Une anesthésie sera réalisé au moment de la mise à mort des animaux.

Choix des espèces

La souris est une espèce largement utilisée dans les modèles expérimentaux de cancer du foie. Les modèles murins d’induction du cancer du foie par le DEN, seul ou en combinaison avec le CCl4, sont bien caractérisés et largement décrits dans la littérature scientifique. Ces modèles permettent de reproduire des étapes clés du développement du cancer du foie observé chez l’Homme, notamment la progression tumorale ainsi que l’association fréquente avec des atteintes chroniques du foie telles que la fibrose. La souris présente par ailleurs des caractéristiques physiologiques compatibles avec l’étude des mécanismes impliqués dans la carcinogenèse hépatique et la réponse aux traitements pharmacologiques. L’utilisation de ce modèle permet également de disposer d’outils expérimentaux validés (marqueurs biologiques, analyses histologiques, données de référence), facilitant l’interprétation des résultats et leur comparaison avec les données existantes. Les animaux seront utilisés à des stades précoces de développement ainsi qu’à l’âge adulte, en fonction des différentes phases du protocole expérimental. Dans le modèle de carcinogenèse induit par le DEN seul, une injection unique de DEN sera réalisée chez des souris mâles âgées de 15 jours. Ce stade de développement est choisi car il correspond à une période de forte prolifération hépatocytaire, ce qui favorise l’intégration d’altérations génotoxiques dans les cellules du foie et permet l’initiation du processus tumoral conduisant au développement progressif du cancer du foie 9-10 mois après l’administration. Dans le modèle combiné associant le DEN et le CCl4, le DEN sera également administré à l’âge de 15 jours selon les mêmes modalités. À partir de l’âge de 8 semaines, les animaux recevront des injections répétées de CCl4 afin d’induire une fibrose hépatique progressive, reproduisant un contexte pathologique chronique proche des situations cliniques humaines associant fibrose et carcinogenèse. Dans les deux modèles, le traitement par inhibiteur des cyclophilines sera administré au cours de la phase tardive de la carcinogenèse (injection 5 fois/semaine pendant les 4 sernières semaines des protocoles), lorsque les tumeurs sont présentes et établies, afin d’évaluer son effet sur la progression tumorale plutôt que sur l’initiation.

2 880 souris vont être utilisées, chacune recevant une greffe de tumeur des voies biliaires puis jusqu'à quatre séances de traitement sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Aux injections et aux quinze minutes d'anesthésie gazeuse s'ajoutent des prélèvements de sang pratiqués sur animal vigile, auxquels le porteur attache un stress et une douleur légère. Le principe consiste à chauffer la tumeur en excitant par laser ou par champ magnétique des nanoparticules injectées sur place, le volume tumoral étant suivi par échographie. Le bénéfice avancé, un traitement local qui réduirait les doses de chimiothérapie et pourrait s'étendre à d'autres cancers digestifs, reste au conditionnel, quand les 2 880 mises à mort, elles, sont programmées.

Objectifs

Les cancers des voies biliaires, en particulier le cholangiocarcinome (CCA), sont difficiles à traiter. Le développement de nanoparticules permet d’envisager des traitements anticancéreux mieux ciblés, plus efficaces et avec de moindres effets secondaires par rapport aux traitements systémiques conventionnels. Le projet a pour objectif d'évaluer l'efficacité d'une thérapie anticancéreuse localisée par nanoparticules en association ou non avec une thérapie par voie générale et une exposition à un rayonnement Laser ou un champ magnétique. L’évolution du volume tumorale sera suivie par échographie. L’imagerie permettra aussi de suivre la diffusion et l’élimination des nanoparticules utilisées. L’objectif final est d’identifier les nanomatériaux les plus efficaces avec les meilleures diffusions et sans effet indésirable à long terme.

Bénéfices attendus

Les cholangiocarcinomes (CCA) sont de très mauvais pronostiques et très agressifs. Les traitements sont limités, seule la résection chirurgicale est efficace mais seuls 20 à 30 % des patients sont éligibles, les autres recevront une chimiothérapie palliative. La recherche de traitements dit innovants dans un but de traiter localement la tumeur est nécessaire pour proposer de nouvelles options thérapeutiques pouvant être proposées seules ou en combinaison avec des thérapies systémiques déjà en place. Dans son ensemble, ce projet a pour objectif de tester dans des modèles expérimentaux murins, le traitement par nanohyperthermie dans des tumeurs de CCA. Les bénéfices attendus sont de démontrer un effet antitumoral de la nanohyperthermie dans des modèles bien décrits de CCA représentatifs de la maladie humaine. Si l’effet anti-antitumoral s’avérait efficace, ce projet pourrait permettre de développer un nouvel outil thérapeutique anti-cancéreux locorégional applicable en santé humaine, permettant de réduire à la fois les doses de chimiothérapies et les effets secondaires de ceux-ci dans le cas d'un traitement combinatoire. Au-delà du CCA, la nanohyperthermie pourrait être également utilisée pour traiter d’autres cancers digestifs (péritoine, tubes digestifs, foie, pancréas).

Procédures

- Injections durée 10-20 secondes/animal - Traitement sur souris anesthésiées 10 minutes/souris, répété 4 fois max. - Anesthésie gazeuse durée 15 min/souris - Prélèvements sanguins sur animal vigile, durée 5 min/souris.

Impact sur les animaux

-injections cutanées : stress et douleur légère de courte durée -anesthésie et chirurgie d'implantation de tumeurs : stress et douleurs modérée -Injections intratumorale et systémiques : stress et douleurs légères de courte durée - Prélèvement sanguin vigile : stress et douleur légères e de courte durée - Anesthésie Gazeuse : un stress légéer de courte durée.

Devenir

Les animaux impliqués dans ce projet seront mis à mort afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures.

Remplacement

Il n'est actuellement pas possible de simuler le développement d'un cancer avec tous ses aspects dans un modèle in vitro. Neanmoins, nous développons également des modèles cellulaires in vitro en 3 dimensions afin de sélectionner les molécules, ce qui permetra de réduire le nombre d'animaux utilisés puisque l'effficacité de certaines molécules pourra être testée en amont. Cependant ces expériences menées sur ces modèles cellulaires ne sont pas suffisants et ne permettent pas de remplacer les animaux, notamment pour évaluer la réponse avec un système immunitaire ou pour évaluer les effets indésirables.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Compte tenu des données existantes et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, enrichissement). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum, le milieu est enrichi. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie). Un analgésique sera utilisé en pré-opréatoire et en post-opératoire pour limiter la douleur et garantir un bien-être optimal des animaux. Un protecteur oculaire en gel sera aussi utilisé lors de l'anesthésie pour éviter tout assèchement des yeux. Pour le transport des animaux, celui-ci est effectué dans le respect du bien-être animal (mise à disposition d'eau sous forme de gel et de nourriture) et est réalisé par un transporteur agréé.

Choix des espèces

La souris est le modèle de référence des expériences et études en cancérologie car elle permet de représenter le comportement d'une tumeur se développant chez le patient (réponse immune, diffusion des traitements dans l'organisme). La possibilité de disposer d'animaux de fond génétique défini permet limiter les variabilités biologiques et de mieux identifier les effets des thérapies. Les animaux seront utilisés à l'âge de 5 à 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. Les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale après injection des cellules cancéreuses, une souris juvénile ou trop agées induirait un biais dans l'expérimentation.

Une partie des souris de ce projet appartient à une lignée dont la rétine dégénère d'elle-même, les autres reçoivent sur animal vigile une injection qui déclenche chimiquement cette dégénérescence. 192 souris sont utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour éprouver chez elles le rôle d'une molécule inflammatoire, l'IL-1b, dans la réparation de la rétine. Elles subissent une injection dans l'œil sous anesthésie puis des injections répétées un à trois jours de suite sur animal vigile, le porteur annonçant une altération de la vision et une inflammation locale de l'œil. Toutes sont tuées pour que leurs rétines soient prélevées, les deux yeux de chaque souris étant utilisés, ce que le porteur compte comme une mesure de réduction.

Objectifs

La rétine, qui est une partie de l’œil essentielle à la vision, a une capacité très limitée à se réparer lorsqu’elle est endommagée, notamment dans les maladies dégénératives. Certaines cellules de la rétine, appelées cellules de Müller, possèdent toutefois un potentiel de réparation, qui peut être stimulé dans certaines conditions. Nous avons montré que des cellules impliquées dans l’inflammation (les microglies) jouent un rôle important dans l’activation de ce processus. Une molécule produite lors de l’inflammation, appelée IL-1b, semble particulièrement efficace pour stimuler cette activation dans des expériences réalisées in vitro. L’objectif de ce projet est de vérifier ce rôle dans un modèle chez la souris, en reproduisant une atteinte de la rétine et en étudiant l’effet de cette molécule sur les mécanismes de réparation. À terme, ce projet permettra de mieux comprendre les interactions entre inflammation et réparation dans la rétine.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra de mieux comprendre le rôle d’une molécule impliquée dans l’inflammation dans les mécanismes de réparation de la rétine. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer à identifier de nouvelles approches pour favoriser la réparation de la rétine dans les maladies dégénératives, qui représentent un enjeu important de santé publique en raison de la perte de vision qu’elles entraînent.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : • Injection (48 souris) pour déclencher chimiquement la dégénérescence de la rétine : réalisée sur animal vigile, durée inférieure à 30 secondes. • Injection (96 souris) pour l’anesthésie : réalisée sur animal vigile, durée inférieure à 30 secondes. • Injection (96 souris) : réalisée sous anesthésie générale, permettant l’administration dans l’œil de la molécule testée et d’un marqueur de prolifération, durée inférieure à 30 secondes • Injections répétées (96 souris) : réalisées sur animal vigile pour marquer les cellules en prolifération, réalisées une fois par jour pendant 1 à 3 jours, durée inférieure à 30 secondes. Les animaux sont ensuite mis à mort afin de prélever les rétines pour analyses.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus incluent : • un inconfort transitoire lié aux injections • une altération de la vision liée au modèle expérimental • une inflammation locale au niveau de l’œil après injection intraoculaire Ces effets font l’objet d’une surveillance quotidienne afin d’adapter rapidement la prise en charge si nécessaire.

Devenir

Les animaux doivent être mis à mort à l’issue des procédures expérimentales afin de permettre le prélèvement des rétines et l’analyse des cellules étudiées (microglies et cellules de Müller). Ces analyses nécessitent des tissus prélevés et ne peuvent pas être réalisées sur des animaux maintenus en vie. Il n’est donc pas possible de réutiliser ou de replacer les animaux.

Remplacement

La nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie par le fait que la rétine est un tissu complexe composé de nombreux types de cellules dont les interactions sont cruciales et l’objet même de notre étude. Les modèles alternatifs existants ne permettent pas d’étudier ce type d’interactions cellulaires dans un contexte physiologique.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé à partir d’une estimation statistique permettant d’obtenir des résultats robustes avec un effectif minimal. Nous utiliserons systématiquement les deux yeux de l’animal ce qui permet de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe selon la réglementation en vigueur. Des mesures sont mises en place pour limiter la douleur et le stress des animaux tout au long du protocole, incluant un suivi quotidien, un hébergement enrichi et la limitation des manipulations. Les procédures susceptibles de générer une gêne sont réalisées sous anesthésie adaptée, et des soins de confort (notamment oculaires) sont mis en place. Des critères d’arrêt précoces permettent de retirer rapidement tout animal présentant des signes de souffrance et d'administrer un traitement pour soulager ces souffrances.

Choix des espèces

La souris est un modèle couramment utilisé pour l’étude des maladies de la rétine. Elle présente une organisation rétinienne comparable à celle de l’humain et permet l’utilisation d’outils génétiques adaptés à l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires. Les animaux sont utilisés à des stades de développement adaptés à l’étude des mécanismes de dégénérescence et de régénération rétiniennes. Dans le modèle génétique, ce stade correspond à l’apparition de la dégénérescence rétinienne. Dans le modèle de dégénérescence induite chimiquement, il correspond à une maturité suffisante de la rétine pour permettre le déclenchement de la dégénérescence.

Douze semaines de régime riche en graisses pour les rendre obèses, douze prélèvements sanguins à la queue sur animal éveillé, sept séances de contention pour mesurer la composition corporelle, deux jeûnes de quatre heures suivis chacun de deux heures de mesures de glycémie. 240 souris sont utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue par prélèvement sanguin sous anesthésie profonde sans réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur qualifie chacune de ces atteintes de transitoire, gêne, inconfort, fatigue légère, et juge le rapport entre bénéfices et risques "favorable". Il écrit pourtant que les souris ne sont pas réutilisées car les interventions "ne permettent pas leur maintien dans des conditions compatibles avec leur bien-être".

Objectifs

Le diabète de type 2 et l’obésité sont des maladies fréquentes caractérisées par une mauvaise utilisation du glucose par l’organisme, appelée insulino-résistance. Cette situation est en partie liée à une accumulation anormale de lipides dans certains organes comme le muscle et le foie. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment certaines modifications du métabolisme des lipides peuvent influencer la sensibilité à l’insuline et la régulation de la glycémie. Pour cela, le projet vise à étudier l’impact d’une intervention ciblée sur le métabolisme lipidique dans un modèle expérimental d’obésité. L’objectif est de déterminer si cette approche permet d’améliorer la réponse à l’insuline et de limiter les perturbations métaboliques associées à un excès de graisses alimentaires. À terme, ces travaux pourraient contribuer à identifier de nouvelles pistes pour prévenir ou améliorer les troubles métaboliques liés à l’obésité.

Bénéfices attendus

Au regard des connaissances actuelles, l’insulino-résistance constitue un enjeu majeur de santé publique, impliqué dans le développement du diabète de type 2 et de ses complications. À l’échelle mondiale, le diabète touche plus de 500 millions de personnes, et sa prévalence est en constante augmentation. Le coût socio-économique du diabète et de ses complications est considérable, représentant plusieurs centaines de milliards d’euros par an à l’échelle mondiale, en raison des dépenses de santé directes et des pertes de productivité. Ce projet vise à mieux comprendre comment des modifications du métabolisme lipidique contribuent à l’altération de la sensibilité à l’insuline et de la régulation de la glycémie dans un contexte d’obésité. Les résultats attendus permettront d’améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans l’insulino-résistance, et pourraient contribuer à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Les contraintes imposées aux animaux sont classées comme modérées et seront encadrées par des mesures de raffinement visant à limiter la douleur, le stress et l’inconfort. Elles apparaissent proportionnées aux objectifs scientifiques poursuivis. Ainsi, les bénéfices attendus en termes de production de connaissances et d’identification de nouvelles pistes pour la prévention ou le traitement des troubles métaboliques justifient le recours à ce modèle animal. Le rapport bénéfices/risques est donc considéré comme favorable.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Administration d’une préparation biologique expérimentale destinée à modifier l’expression d’une protéine impliquée dans le métabolisme lipidique. Cette administration sera réalisée une seule fois, sous anesthésie générale, par voie systémique. La durée de l’administration sera de quelques secondes. Mise en place d’un régime alimentaire spécifique pendant 12 semaines. Une partie des animaux recevra un régime standard, tandis que l’autre recevra un régime riche en graisses afin d’induire une obésité et des altérations métaboliques. Ces régimes seront donnés à volonté, avec un accès libre à l’eau. Mesure de la composition corporelle par une méthode non invasive. Les animaux seront placés brièvement dans un dispositif de contention adapté, sans anesthésie. Cette mesure sera réalisée une fois toutes les deux semaines pendant les 12 semaines de régime, ainsi qu’en fin d’étude, soit au maximum 7 fois par animal. Chaque mesure durera moins de 2 minutes. Prélèvements sanguins de faible volume pour le suivi métabolique. Ces prélèvements seront réalisés sur animaux éveillés, au niveau de la queue, une fois par semaine pendant les 12 semaines de régime, soit 12 fois par animal. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Test de tolérance au glucose. Ce test sera réalisé une seule fois par animal, sur animal éveillé, après 12 semaines de régime. Il sera précédé d’une mise à jeun de 4 heures avec accès libre à l’eau. Il comprendra une administration orale de glucose et des mesures répétées de la glycémie pendant environ 2 heures. Test de sensibilité à l’insuline. Ce test sera réalisé une seule fois par animal, sur animal éveillé, à distance du test de tolérance au glucose. Il sera également précédé d’une mise à jeun de 4 heures avec accès libre à l’eau. Il comprendra une administration d’insuline et des mesures répétées de la glycémie pendant environ 2 heures. Prélèvement sanguin de fin d’étude. En fin de procédure, un prélèvement sanguin sera réalisé une seule fois, sous anesthésie générale profonde, sans réveil de l’animal, afin d’analyser certains paramètres biologiques circulants. Euthanasie. À la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir une sensation de faim transitoire lors des périodes de mise à jeun nécessaires aux tests métaboliques. Le régime riche en graisses entraînera une prise de poids progressive et des modifications du métabolisme pouvant altérer l’état physiologique des animaux. Les injections pourront provoquer une gêne ou un inconfort transitoire lié à la manipulation et à l’acte d’injection. Une irritation locale ou une infection au site d’injection est possible mais rare. Les anesthésies pourront entraîner un stress physiologique transitoire, notamment lors de l’induction et du réveil. Les prélèvements sanguins répétés de faible volume pourront provoquer une douleur légère et transitoire, un stress lié à la manipulation, un hématome, un saignement local ou, plus rarement, une infection au site de prélèvement. Une fatigue transitoire ou une déshydratation légère pourra également survenir en lien avec les mises à jeun et les prélèvements répétés. Les manipulations et la contention nécessaires aux différentes procédures, notamment lors de la mesure de la composition corporelle, pourront induire un stress transitoire.

Devenir

À l’issue de la procédure expérimentale, les animaux seront euthanasiés. L’euthanasie est nécessaire afin de permettre la réalisation de prélèvements de sang et de tissus, indispensables à l’analyse des paramètres biologiques étudiés. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées chez un animal maintenu en vie et sont essentielles pour comprendre les mécanismes impliqués dans les altérations métaboliques étudiées. Les animaux ne sont pas réutilisés après la procédure, car les interventions réalisées ne permettent pas leur maintien dans des conditions compatibles avec leur bien-être ni leur inclusion dans d’autres protocoles expérimentaux. Ainsi, le recours à l’euthanasie est scientifiquement justifié par la nécessité d’obtenir des données fiables et complètes, tout en garantissant le respect du bien-être animal.

Remplacement

Ce projet vise à mieux comprendre comment certains déséquilibres du métabolisme des graisses peuvent perturber l’utilisation du glucose par l’organisme, un phénomène appelé insulino-résistance, impliqué dans le diabète de type 2. Des études préalables réalisées sur des cellules ont permis d’identifier certains mécanismes impliqués. Cependant, ces modèles ne permettent pas de reproduire le fonctionnement global de l’organisme, ni les interactions entre les différents organes, ni la régulation hormonale. Or, les paramètres étudiés dans ce projet, comme la capacité à réguler la glycémie ou à répondre à l’insuline, dépendent du fonctionnement coordonné de plusieurs organes et ne peuvent être évalués que chez un organisme entier. Ainsi, il n’existe pas de méthode alternative permettant de répondre à ces questions, ce qui justifie le recours à un modèle animal.

Réduction

Un total de 240 animaux sera utilisé dans ce projet. Ce nombre a été déterminé afin d’utiliser le minimum d’animaux nécessaire pour répondre à la question scientifique. La taille des groupes a été établie à l’aide d’un calcul permettant d’estimer le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Des tests statistiques seront ensuite utilisés afin d’interpréter correctement les résultats obtenus. Les animaux seront répartis en différents groupes expérimentaux incluant les mâles et les femelles, et l’étude sera réalisée sur plusieurs séries indépendantes afin de renforcer la fiabilité des résultats. Plusieurs mesures permettront de limiter le nombre total d’animaux utilisés : les mêmes animaux seront suivis au cours du temps, plusieurs tests non terminaux seront réalisés sur les mêmes individus, et les prélèvements biologiques permettront plusieurs analyses. Lorsque cela sera possible, les échantillons seront conservés pour des analyses complémentaires. L’ensemble de ces dispositions permet de limiter le nombre d’animaux au minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques du projet.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation. Les animaux proviendront d’un fournisseur extérieur agréé et bénéficieront, à leur arrivée à l’animalerie, d’une période d’acclimatation réglementaire minimale de 7 jours avant toute procédure expérimentale. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères, l’hébergement individuel étant limité au maximum, en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Le milieu sera enrichi avec au minimum deux enrichissements adaptés, et les animaux seront vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Raffinements spécifiques au projet : une habituation préalable des animaux aux manipulations sera mise en place afin de réduire le stress lors des procédures expérimentales ; la durée de mise à jeun sera limitée au strict minimum, soit 4 heures, avec accès libre à l’eau, afin de réduire l’inconfort ; les manipulations, administrations de substances et prélèvements seront réalisés par du personnel expérimenté, avec une durée de contention limitée ; les animaux bénéficieront de périodes de récupération sans manipulation entre les différents tests ; lors des anesthésies, un gel ophtalmique sera appliqué pour prévenir le dessèchement oculaire ; les animaux seront maintenus sur un tapis chauffant pendant les procédures sous anesthésie afin de préserver leur température corporelle ; une alimentation facilitée, avec des croquettes déposées au sol, sera mise en place après intervention si nécessaire pour favoriser la reprise alimentaire ; une surveillance clinique quotidienne permettra de détecter précocement tout signe d’altération de l’état général ; des critères d’arrêt humanitaires précoces seront définis afin d’éviter toute souffrance prolongée. Ainsi, la douleur et le stress seront limités par des soins adaptés, une surveillance attentive et des points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi car il permet d’étudier, dans un organisme entier, les perturbations de la régulation du glucose observées dans l’obésité et l’insulino-résistance. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, lorsque leur métabolisme est stabilisé, afin d’éviter les variations liées à la croissance ou au vieillissement. Les expériences seront réalisées chez des souris mâles et femelles, car les réponses métaboliques peuvent différer selon le sexe ; cela permet d’obtenir des résultats plus robustes et plus représentatifs.

Toutes tuées à l'issue pour "récupération et valorisation des tissus", 2 181 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer de l'ovaire humain chimiorésistant, sont transportées entre deux établissements, puis reçoivent des radioligands couplés à un isotope avant 45 minutes d'imagerie TEP sous anesthésie et des prélèvements de sang à la veine saphène. Le porteur attend de cette irradiation ciblée qu'elle abîme l'ADN des cellules tumorales, signale que l'accumulation des radiotraceurs dans certains organes peut provoquer une irradiation localisée des tissus sains, et annonce une observation quotidienne du comportement, rupture du lien social et prostration, sans décrire de test comportemental. Sur le remplacement, il écrit qu'aucune puce microfluidique ni aucun organoïde ne restitue la distribution d'un composé dans un "organisme entier", et conclut à la "nécessité" de recourir à la souris.

Objectifs

Dans le domaine de la médecine nucléaire, la thérapie par radioligand (TRL) représente une avancée majeure pour le traitement des cancers. Cette approche théranostique repose sur l’utilisation d’agents biologiques, tels que des peptides ou des anticorps, ciblant spécifiquement des protéines exprimées à la surface des cellules tumorales, couplés soit à un radioisotope d’imagerie pour le diagnostic, soit à un radioisotope thérapeutique. Cependant, aucun agent théranostique n’existe encore pour des cancers agressifs tels que le cancer de l’ovaire séreux de haut grade dont le sombre pronostic est généralement associé à des résistances à la chimiothérapie. Ce projet multisite se déroulera sur deux établissemnents utilisateurs et vise à évaluer l’efficacité de nouveaux radioligands, développés pour cibler de façon spécifique différentes protéines membranaires surexprimées à la surface des cellules tumorales ovariennes. À ce jour, quatre cibles dont les ligands naturels sont déjà bien caractérisés ont été identifiées. Le premier objectif de ce projet consistera à évaluer la biodistribution de différentes molécules dirigées contre ces quatre cibles d’intérêt, après couplage à un radioisotope d’imagerie, afin de vérifier leur spécificité. Le second objectif sera d’étudier l’efficacité thérapeutique de ces molécules en les couplant avec un radioisotope thérapeutique émettant des rayonnements ionisants afin de créer des dommages à l’ADN des cellules tumorales ciblées et de provoquer leur mort. Des souris porteuses de tumeur sous-cutanées ovariennes humaines (chimiorésistantes) seront ainsi utilisées soit pour réaliser des imageries par Tomographie à Emission de Positron (TEP) après injection d’un radioligand couplé à un radioisotope d’imagerie ; soit pour étudier le suivi de la croissance tumorale après injection d’un radioligand couplé à un radioisotope thérapeutique. Cette étude a pour but d’évaluer la spécificité et l’efficacité thérapeutique de radioligands ciblant des protéines surexprimées dans les cancers de l’ovaire. Cela permettra de sélectionner les candidats les plus prometteurs qui pourraient avoir un intérêt dans le traitement de ces cancers.

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront de déterminer la faisabilité d’une approche théranostique, chez les patientes atteintes de cancer de l’ovaire, en fournissant de précieuses informations sur la distribution des radioligands au sein de l’organisme, son excrétion et stabilité dans le sang, connaissances indispensables pour le choix des radioligands possédant la meilleure efficacité thérapeutique, tout en minimisant les effets sur les tissus sains. Ainsi, cela permettrait d’envisager de nouvelles méthodes de prise en charge des patientes atteintes de cancer de l’ovaire grâce à la théranostique, dans l’espoir d’augmenter leurs perspectives de survie et d’améliorer leur qualité de vie pendant et après le traitement, par la diminution des effets secondaires. De plus, les 4 récepteurs d'intérets étant également surexprimés dans d’autres types de cancers, cela pourrait étendre les bénéfices de ces composés innovants à d’autres patients.

Procédures

Injection de cellules tumorale (5minutes sous anesthésie gazeuse). Transfert entre les deux sites : moins de 3 km (environ 10 minutes). Injection de radiotraceurs (2 minutes) sous anesthésie gazeuse suivi d'imagerie TEP sous anesthésie gazeuse : environ 45 minutes. Prélèvements sanguin (veine saphène) sous contention : 1 minute.

Impact sur les animaux

Une inspection détaillée et quotidienne dans les périodes critiques, i.e. après implantation et après traitement, de chaque animal est effectuée afin d’observer le comportement et les symptômes cliniques de l’animal : rupture du lien social, prostration, grimace scale. De plus, de l’aliment gélifié leur sera proposé. Les animaux ressentiront de l’inconfort, voire de la douleur, en raison de la nécessité de procéder à des injections de cellules tumorales ou de radiotraceurs : - Stress de la préhension des souris pour les implantations des tumeurs : environs 2 min - Inconfort associé au développement tumoral : légère gène au niveau moteur : environ 2 semaines - Au moment du transfert des animaux : environ 3 jours - Injections des radiotraceurs sous anesthésie : pas de stress en dehors de la préhension pour sédation - Imagerie TEP : pas de stress ni douleur prévue, car non invasif et réalisé sous anesthésie Les signes de toxicité possibles sont principalement liés à l’accumulation des radiotraceurs dans certains organes qui peut entrainer une irradiation localisée. Ces toxicités seront évaluées via les études de bio distribution (et comptage gamma après prélèvements d’organes). Nous serons tout de même attentifs aux pertes d’appétit, de diarrhée et de perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupération et valorisation des tissus.

Remplacement

Bien que de nombreux modèles in vitro, de plus en plus poussés, existent et qu’il s’agisse d’un champ de la biologie en essor, il n’est à l’heure actuelle pas possible de remplacer un organisme vivant par une puce microfluidique ou un organoïde. En effet, dans le cadre de l’étude présentée ici, il est nécessaire d’évaluer des paramètres tels que la distribution au sein d’un organisme entier ainsi que l’excrétion des radioligands. Tout ceci nécessite des systèmes circulatoires et excrétoires, dont toute la complexité ne saurait encore être retranscrite artificiellement. C’est pourquoi il est nécessaire d’avoir recours à un modèle murin. Les étapes de recherche de récepteurs cibles ont été menées in silico. Par ailleurs, les étapes de validation des cibles ainsi qu’une première sélection des ligands présentant les meilleures caractéristiques (liaison spécifique au récepteur cible et capacité d’internalisation) ont été réalisées in vitro, sur des lignées cellulaires de cancer ovarien. Cela permet ainsi de réduire l’utilisation d’animaux et leur utilisation n’arrive qu’à la fin d’un processus réfléchi et optimisé, de sorte à en minimiser l’usage.

Réduction

Les différents tests in vitro permettent de sélectionner uniquement les composés ayant montré les meilleures caractéristiques pharmacologiques avant l’utilisation d’animaux. La quantité d’animaux utilisée a été réduite au minimum nécessaire, en limitant la quantité de ligands testés grâce à une analyse « en entonnoir ». Ainsi, le nombre d’animaux annoncé est un nombre maximum est pourra être réduit si un des radioligands testés répond à tous les paramètres étudiés. De plus, le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés.

Raffinement

Concernant l'hébergement, les cages sont insérées dans un portoir ventilé, permettant le maintien d’un statut sanitaire exempt d’organismes opportunistes et pathogènes et d’éviter l’apparition d’infections. Pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et leurs yeux lubrifiés afin d’éviter toute sècheresse ou irritation oculaire. Les conditions d’anesthésie sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Afin de diminuer l'effort en convalescence, de l'aliment gélifié est placé dans les cages après chaque anesthésie (il aura été présenté en amont aux souris pour les habituer et passer l’étape de néophobie alimentaire). En fin de protocole, les souris seront placées dans une salle isolée du reste des souris pour la mise à mort et les manipulations post-euthanasies seront également réalisées dans une autre pièce. Les animaux seront transportés entre les deux établissements (3 km) suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état clinique des souris utilisées sera assurée. Les greffes sont réalisées sous anesthésie gazeuse afin de réduire à son strict minimum le stress et la souffrance de l’animal. Les antalgiques ou anti-inflammatoires non stéroïdiens sont prévus et pourront être utilisés si nécessaire. Les tumeurs seront mesurées 2 fois par semaine afin de suivre leur progression et/ou l'apparition de zones de nécrose. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués.

Choix des espèces

La souris demeure un modèle de choix pour les études précliniques en oncologie : les souches sont parfaitement décrites et la parenté biologique des souris avec l’Homme permet d’obtenir des informations extrapolables à la pratique clinique humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, soit entre deux et six mois. Les expériences sur adultes permettent de garantir une bonne reproductibilité et donc une réduction du nombre d’animaux à utiliser.

Une injection de cellules tumorales directement dans le poumon ouvre le protocole, suivie de trente jours d'immunothérapie tous les quatre jours et de séances d'imagerie sous anesthésie. 84 souris mâles de 50 semaines sont utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de sang et de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois fois au cours du protocole, elles passent un test d'agrippement où le manipulateur les tire par la queue, une course sur tapis roulant poussée jusqu'à l'épuisement et un test d'équilibre au rotarod, pour mesurer si une supplémentation en acides gras et en bêta-hydroxybutyrate combinée à de l'activité physique volontaire renforce l'effet de l'immunothérapie. Le porteur annonce que la tumeur peut provoquer des difficultés respiratoires, de la léthargie et de l'agressivité, et qu'au-delà de trois points limites notables ou d'un point sévère "il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum", sans dire laquelle.

Objectifs

L’immunothérapie est une stratégie thérapeutique en plein essor, notamment dans le cancer du poumon, car elle n’induit pas de toxicité secondaire comme les traitements par radiochimiothérapie. Son efficacité reste cependant à améliorer car tous les patients ne répondent pas aux traitements d’où la nécessité de travailler sur des traitements adjuvants. Nous souhaitons combiner 2 approches pour améliorer cette efficacité : - nutritionnelle : supplémentation en acides gras polyinsaturés et en béta-hydroxybutyrate - activité physique : mise en place d’enrichissement dédié à l’augmentation de l’activité physique volontaire.

Bénéfices attendus

Nous attendons à ce que nos traitements améliorent l’efficacité de l’immunothérapie. Pour voir cela, nous suivrons l’évolution du volume tumoral. Des traitements adjuvants tels qu’une supplémentation nutritionnelle ou la mise en place d’une activité physique adaptée est envisageable au cours du traitement par immunothérapie chez les patients. Il y a donc une réelle possiblité de transfert des résultats obtenus dans ce projet en clinique.

Procédures

Les supplémentations nutritionelles se feront ad libitum, par remplacement de l’eau de boisson par le béta-hydroxybutyrate et avec des croquettes pour les acides gras en débitant une semaine vant la tumorigenèse puis pendat les 30 jours du suivi tumoral. L’implantation des tumeurs sera effectuée par injection intra-pulmonaire. Le suivie du volume tumoral par imagerie de biolomuminescence durera 30jours. L’administration de l’immunothérapie sera effectuée tous les 4 jours pendant les 30 jours de tumorigenèse par injection intra-péritonéale d’anicorps anti PD-1. La tumorigenèse sera suivie par imagerie avec calcul du volume tumoral sous anesthésie à l’isoflurane. La mesure de la synthèse protéique sera effectuée après injection sous cutané d’un traceur (isotope stable). Le test d'agrippement sera réalisé à l'aide d'un dynamomètre munie d'une grille où la souris s'accroche, le manipulateur tire alors la souris par la queue. La mesure de la vitesse maximale de course sera effectuée sur un tapis roulant, le test s'arrête quand la souris est épuisée, elle reste alors sur une grille en bout de tapis. Le test dure en moyenne une quizaine de minutes. Une habituation au tapis de course aura lieu en amont du test. Le test d'équilibre au rotarod se déroule sur un cylindre en rotation, les souris seront habituées à cette procédure en amont. Le test dure en moyenne 2-3 minutes. Le passage en echoMRI implique une légère contention des animaux dans un tube placé dans l'appareil. La mesure dure 1 minute environ. Les mesures de performances physiques ainsi que l'echoMRI auront lieu juste avant l'implanttaion (J0) puis à J15 et J30 post-implantation.

Impact sur les animaux

La tumorigenèse peut s'accompager de difficultés respiratoires, d'une perte de poids, de comportements anormaux, tels que l'isolement social, la léthargie, l'agressivité́ accrue ou une altération de la locomotion. Les souris seront surveillées quotidiennement pour suivre leur comportement général.

Devenir

tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole pour prélèvements de sang et de tissus

Remplacement

L’utilisation d’animaux, dans ce projet est absolument nécessaire et ne peut être remplacer par l’utilisation de systèmes de culture cellulaire à 2 voire 3 dimensions. En effet, ces systèmes ne permettent pas d’aborder les relations inter-organes et de mesurer simultanément la digestibilité des acides gras polyinsaturés w3 et du béta-hydroxy-butyrate, l’évolution de la fonctionnalité musculaire, de la performance et de la mobilité, le métabolisme protéique musculaire et le statut inflammatoire circulant et enfin l’évolution du volume tumoral.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans en compromettre les objectifs. Il a été déterminé par un calcul d’échantillonnage. Le nombre de souris nécessaires à l’étude est calculé pour une différence attendue de 25% pour le volume tumoral entre les souris supplémentées en acides gras ou en béta-hydroxybutyrate + activité physique et les souris nourries avec un régime standard. Des études antérieures ont montré que la variabilité du paramètre choisi est de 14%. L’effectif est calculé pour un risque de 1ère espèce alpha de 5% et un risque de 2ème espèce béta de 5%. Ainsi, le nombre de souris nécessaires par groupe est de 8. Toutefois, afin d’anticiper une mortalité éventuelle liée à la tumorigénèse, nous avons choisi de débuter l’étude avec des groupes de 12 souris. Le nombre total de souris nécessaires à la réalisation de ce projet est donc de 84. Pour comparer les résultats des différents paramètres mesurés, nous utiliserons une ANOVA (analyse de la variance) à 2 voies (effet régime, effet activité physique, interaction) suivie d’un test de comparaisons multiples, le test de Tukey si les conditions d’utilisation de l’ANOVA sont remplies (normalité des résidus et égalité des variances). Dans le cas contraire, le test non paramétrique de Kruskal-Wallis suivi d’un test de comparaisons multiples non paramétriques, le test de Dwass-Steel, seront réalisés.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Les souris seront hébergées par 6. Tous les animaux auront un accès illimité à leur régime et à l’eau de boisson. Quotidiennement, l’animalier observera le comportement général de chaque souris, son apparence et contrôlera la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur le cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Une grille d'évaluation définissant des points limites sera mise en place. Elle permettra d'identifier des points limites notables et des points limites graves. Si un animal présente 3 points limites notables ou 1 point sévère, il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum.

Choix des espèces

Pour réaliser notre projet d’étude, nous avons choisi la souris C57BL/6 car nous allons leur injecter des cellules tumorales issues de souris C57BL/6. Le modèle de tumorigenèse est donc syngénique et orthotopique. De plus, ces souris sont très actives en environnement enrichi ce qui est crucial pour tester l’effet de l’activité physique volontaire. Nous avons utilisé cette espèce par le passé et validé toutes les procédures détaillées dans ce dossier avec ces souris. Chez l’homme, le cancer du poumon non à petites cellules est diagnotiqué à l’âge moyen de 65 ans. Nous utiliserons par conséquent des souris mâles adultes de 50 semaines.