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Traitement de surdités héréditaires par des thérapies géniques innovantes chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Tuées en cours ou en fin de procédure pour prélever les tissus de leur oreille interne, 694 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie d'entre elles est génétiquement sourde. Elles subissent des mesures de l'audition, une chirurgie de quinze minutes et l'administration d'un traitement génique dans l'oreille interne, soit par la voie chirurgicale classique, soit par un dépôt assisté par laser dont le porteur annonce qu'il ne génère "aucune douleur ou traumatisme", des douleurs étant en revanche attendues durant les deux jours qui suivent la chirurgie. Le porteur appuie le choix de l'espèce sur l'affirmation que le patrimoine génétique de la souris est "identique à 99% à celui de l'espèce humaine", et opère les souriceaux à treize jours, âge auquel leur audition commence à être évaluable.
Objectifs
La surdité profonde héréditaire humaine liée à la mutation du gène de l’Otoferline est actuellement l’objet des premiers tests de thérapie génique de l’oreille interne chez l’homme. Mais, cette thérapie ne restaure que la forme principale de l’Otoferline et repose sur une chirurgie invasive et traumatisante pour l’oreille interne, réduisant le taux de réussite. Notre laboratoire a montré qu’une seconde forme de l’Otoferline est également exprimée. Nous proposons de mesurer les bénéfices qu’apporterait une double thérapie génique réparant les deux formes de l’Otoferline dans la restauration de la fonction auditive. En parallèle, nous développerons une méthode de délivrance de thérapie génique dans l’oreille interne, innovante et non traumatisante. En adaptant la technique de bioimpression assistée par laser, il est possible de faire de l’administration de thérapie génique permettant la correction de surdité d’origine génétique. Nous souhaitons valider un nouveau dispositif laser conduit à l’aide d’une fibre optique et permettant le dépôt ciblé de thérapie génique sur l’oreille interne humaine, sans chirurgie invasive. L’objectif est de valider la récupération de l’audition chez un modèle de souris génétiquement sourdes avec cette technique révolutionnaire. A l’issue de ce projet, nous disposerons des arguments pour introduire la seconde forme de l’Otoferline dans les protocoles de thérapies géniques chez l’homme et transposer la méthode de délivrance assistée par laser dans tous les futurs traitements ciblant l’oreille interne avec un laser conduit par fibre optique.
Bénéfices attendus
Les premiers traitements par thérapie génique des surdités profondes chez des patients déficients pour le gène de l’Otoferline sont prometteurs mais restent à améliorer. La caractérisation fonctionnelle d’une autre forme de cette protéine dans la fonction auditive démontrera le bénéfice médical d’une thérapie génique incluant sa restauration. Cette prise en compte dans les thérapies des patients traités devrait suivre rapidement après la publication des travaux. De plus, ce projet permettra d’améliorer le dispositif d’administration de thérapie génique ciblée vers le système auditif sans risque d’endommager des structures auditives, contrairement aux stratégies développées à ce jour. D’un point de vue technique, ce projet est une étape-clé pour optimiser la technologie de délivrance ciblée de médicaments assistée par laser. Le développement d’un prototype avec un partenaire industriel se fera durant le projet. Les études cliniques de ce système interviendraient à l’issue du projet.
Procédures
Selon la procédure, les animaux seront soumis à des mesures de l’audition, n’excédant pas 15 minutes. Cette mesure est similaire aux mesures réalisées sur l’homme éveillé. Les animaux seront soumis à une chirurgie (durée de 15 minutes) et à une administration de médicaments ciblant l’oreille, soit par une méthode classique (durée de 5 minutes), soit par délivrance assistée par laser (durée de 10 à 12 minutes au total pour installer la souris, paramétrer le laser puis administrer le médicament). L’administration de médicaments assistée par laser ne génèrent aucune douleur ou traumatisme chez l’animal, et est réalisée sous anesthésie générale car cela nécessite une immobilisation complète de l’animal. Dans leur globalité, les procédures préopératoires et opératoires n’excèdent pas 40 minutes maximum afin de limiter la durée de l’anesthésie. Toutes ces interventions seront faites sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront subir du stress avant et lors des anesthésie (entre 2 et 5 minutes). Un délai de 24h minimum sera respecté entre les anesthésies pour le limiter. Des douleurs pourront être ressenties après la chirurgie durant les 2 jours post-opératoires. Les protocoles de dépôt assisté par laser et de mesure de l’audition n'engendreront aucune douleur.
Devenir
En cours ou à la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort par une méthode garantissant l’absence de nuisances, de stress et de douleur. Sur l’ensemble des animaux du projet, les tissus de l’oreille interne seront prélevés pour des analyses quantitatives et qualitatives.
Remplacement
L’application de thérapie génique assistée par laser s’insérant dans un projet d’application clinique future, il est nécessaire de valider son efficacité (diffusion et transfert) et son innocuité (sans impact auditif) sur un modèle animal. La caractérisation de ces surdités est également nécessaire pour mieux comprendre l’effet de la thérapie génique. Seules les conditions in vivo chez l’animal permettent d’évaluer l’effet de la procédure sur l’audition. Ces mesures doivent être effectuées sur des animaux mammifères qui possèdent un système auditif suffisamment proche de l’homme, et un défaut auditif génétique similaire. Aucun environnement multifactoriel ne permet de reproduire ce modèle in vitro. Néanmoins, des études in vitro et ex vivo seront réalisées pour valider le transfert de la thérapie génique au niveau cellulaire, et sélectionner les paramètres laser du dépôt ciblé, de la perméabilisation, et du gel contenant la thérapie génique.
Réduction
Avant de procéder aux expérimentations animales, des tests préliminaires seront effectués afin de fixer l’entièreté des paramètres de bioimpression (paramètres laser et composition de l’hydrogel) et afin de valider la méthode de perméabilisation. Chaque souris sera utilisée pour l’entièreté de la procédure correspondante afin d’en limiter le nombre. Nous utiliserons le plus petit nombre possible de souris par procédure. Le nombre total de 694 souris sur l’ensemble du projet permet de s’assurer de la répétabilité des manipulations avec une marge de manœuvre en cas d’échec, compte tenu du degré de variabilité inter-individuelle, mais un nombre plus faible d’animaux pourrait être suffisant pour obtenir un traitement statistique significatif des données obtenues.
Raffinement
Nous utiliserons des analgésiques en injection ou en gouttes dans toutes les procédures pour réduire la douleur. Les signes d’anesthésies seront monitorés visuellement pour assurer le meilleur confort possible à l’animal durant la procédure. Lors des procédures chirurgicales, selon une grille d’évaluation, l’expérimentateur pourra augmenter la force de l’anesthésie, administrer un bonus d’analgésiques ou bien interrompre l’intervention pour épargner une nuisance trop importante à l’animal. En amont, les gestes opératoires seront mis au point et répétés sur des animaux morts. Dans les jours suivant la chirurgie, la surveillance des animaux sera régie par une grille d’évaluation pour détecter toute forme de nuisances et y remédier : des soins adéquats seront apportés, soit par médication, soit par désinfection de la plaie. Un niveau maximum de score de nuisances est établi à partir duquel on considère que la souffrance de l’animal ne peut plus être jugulée. Le porteur de projet prend alors la décision de la mise à mort de l’animal. Une communication soutenue avec les zootechniciens garantit un suivi qualitatif des animaux. Le stress sera réduit en manipulant régulièrement les animaux dès leur naissance et avant l'anesthésie pour qu'ils s'habituent aux expérimentateurs.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle idéal pour explorer les surdités génétiques humaines. Son patrimoine génétique est identique à 99% à celui de l’espèce humaine. De nombreuses lignées de souris portant des mutations sur des gènes responsables de pathologies chez l’humain existent. L’évaluation de l’impact de la bioimpression assistée par laser sur la fonction auditive et l’efficacité de la thérapie génique dans l’oreille interne nécessite de réaliser des expérimentations sur l’animal. La caractérisation des surdités d’origine génétique et les mesures de l'audition associées ne peuvent se faire sur des animaux non-mammifères car leur système auditif est trop éloigné de celui de l'homme. Chez la souris, l’anatomie cochléaire est également similaire, et la fenêtre ronde est bien accessible par voie chirurgicale. Des études présentent les voies d’accès à la membrane de la fenêtre ronde chez la souris, afin d’avoir une chirurgie reproductible et le moins traumatique possible. Les chirurgies pour la bio-impression concernent des souris âgées de 13 jours, stade qui correspond à l'entrée en fonction du système auditif chez la souris et où l’audition commence à être évaluable. De plus, les souris plus âgées présentent une structure anatomique limitant l’accès à la fenêtre ronde. Les chirurgies de thérapies géniques sont efficaces dès 3 jours, permettant l’apparition de l’effet souhaité dès le 6éme jour et le maintien de cet effet pendant plusieurs mois. Les stades 1 mois et 2 mois correspondent au début des pertes auditives dans certaines souris étudiées. Les stades 3 mois, 6 mois et 1 an nous permettront de caractériser l'évolution des pertes auditives durant le vieillissement naturel des souris.
Caractérisation de mutants de la protéine découplante UCP1 en prévention des désordres métaboliques, EU1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Pour mesurer ce que deux versions mutées d'une protéine de la graisse brune changent au métabolisme, 3 456 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus. Elles sont soumises à des tests de 150 minutes avec administration de glucose ou d'insuline, à des mesures de composition corporelle en tube de contention, à un régime enrichi en lipides destiné à les rendre obèses, et à des séjours au froid, isolées jusqu'à cinq heures ou en groupe pendant sept jours. Le porteur reconnaît que l'isolement de 96 heures imposé par la mesure de dépense énergétique "va nuire au bien-être des animaux", que les mises au froid génèrent "sûrement le plus grand stress" et que le réveil après chirurgie "peut s'avérer douloureux même si des antalgiques sont administrés". Face à ces atteintes, le bénéfice annoncé reste au conditionnel : ces souris "pourraient également servir à cribler des molécules d'intérêt" contre le diabète lié à l'obésité chez l'humain.
Objectifs
CCe projet a pour objectif de caractériser les effets potentiels de mutants d’une protéine dans la physiologie et la pathologie, notamment dans la prévention du diabète associé l’obésité, autrement appelé Diabésité. Cette protéine est la protéine majoritairement présente dans le tissu adipeux brun des rongeurs, tissu véritable régulateur du métabolisme énergétique, notamment grâce à la présence en abondance de mitochondries. Cette protéine est localisée dans la membrane interne de ces organites, véritable usine énergétique des cellules. Elle est également retrouvée dans des dépôts adipeux humains sous certaines conditions et notamment chez des volontaires sains plongés dans des eaux froides de manières aigue ou chronique (à 17°C durant 2h ou pendant 6 semaines par exemple). Elle intervient donc dans la chaîne de production de l’énergie. Récemment, des études ont mis en évidence l’importance de mutants de cette protéine, grâce à un modèle de sphéroplastes de levure. Ces premiers résultats in vitro ont permis de sélectionner des mutants de cette protéine qui seront créés par la technologie Crispr-Cas9 (plus communément connue sous le terme de ciseaux moléculaires) puis analysés dans des modèles cellulaires puis murins transgéniques. Ces analyses comprendront divers tests de tolérance à différentes molécules, des mesures de composition corporelle et de dépense énergétique, sur des animaux hébergés à plusieurs températures et dans des conditions nutritionnelles standard ou obésogènes. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle in vivo d’une protéine thermogénique majeure du tissu adipeux brun dans la régulation du métabolisme énergétique à travers l’analyse de mutants. Ces modèles murins trangéniques pourraient également servir à cribler des molécules d’intérêt dans le traitement de la « Diabésité » chez l’Homme.
Procédures
Tous les animaux, quelles que soient les procédures réalisées dans l’EU-0549 subiront : 1. des tests in vivo d’une durée de 150 min chacun avec administration de glucose ou d’insuline par voie orale ou par voie intrapéritonéale; 2. des mesures de composition corporelle en début, moitié et fin de protocole, soit 3 x 2 min par animal. Des animaux seront isolés de leurs congénères pour mesure de leur dépense énergétique à trois températures différentes durant une période de 96h. D’autres animaux seront mis au froid isolés pendant une durée maximale de 5h (test aigu) ou gardés ensemble pendant 7 jours (test chronique). Enfin, il est possible que des animaux soient traités de manière aigue ou chronique, selon la nature de la molécule administrée, les traitements sont généralement réalisés de manière quotidienne. Si une chirurgie devait être pratiquée, elle serait unique et durerait environ 1h par animal, de l’administration d’un antalgique en pré-opératoire au réveil. Les tests de sensibilité à l'insuline et de transport du glucose réalisés le jour des nécropsies et nécessitant l'utilisation de molécules radiomarquées seront menés dans l'EU2/2.
Impact sur les animaux
Les nuisances potentielles associées aux expérimentations incluent : les effets liés au régime alimentaire enrichis en lipides, entraînant un risque d’inconfort de l’animal avec une prise de poids qui ne limitera cependant pas sa mobilité ; les prélèvements répétés de sang au niveau de la veine caudale lors des tests in vivo provoquent un stress modéré chez les souris; les mesures de composition corporelle occasionnent un léger stress dû à l’isolement des animaux dans un tube de contention pendant environ 2 minutes seulement ; les gavages peuvent également induire un inconfort voire un léger stress ; les mesures de dépense énergétique nécessitent un isolement des animaux, ce qui va nuire au bien-être des animaux ; les mises au froid lors des tests de tolérance ou lors des mesures de calorimétrie indirecte génère sûrement le plus grand stress, le réveil post-chirurgie peut s’avérer douloureux même si des antalgiques sont administrés, enfin le transport d’un établissement utilisateur à l’autre peut entraîner de l’inconfort même si la distance est restreinte et sera réalisé selon des procédures établies et bien éprouvées.
Devenir
Comme indiqué dans les pagraphes concernant chacune des procédures expérimentales, les animaux seront nécropsiés en fin de procédure pour récolter des tissus d'intérêt.
Remplacement
Les approches de remplacement ont été soigneusement considérées dans le cadre de ce projet. Les résultats in silico de modélisation de nombreux mutants de notre protéine d’intérêt ont donné lieu à une parution abondante en 2023. Certains de ces mutants ont été testés in vitro dans des sphéroplastes de levure ou après reconstitution de liposomes. Nous allons ainsi nous focaliser sur deux d’entre eux. Comme ces modèles restent insuffisants pour analyser l’importance des mutants de notre protéine d’intérêt dans un contexte physiologique ou pathologique nous allons créer des animaux génétiquement modifiés par la technique « des ciseaux moléculaires » et déclencher par une mise en régime enrichi en lipides et/ou par un hébergement à thermoneutralité des conditions pathologiques.
Réduction
Le principe de réduction a été appliqué dans ce projet pour limiter le nombre d’animaux utilisés tout en assurant la robustesse scientifique des résultats. Le nombre d’animaux par groupe a été basé sur des données existantes de la littérature et des études menées par l’équipe sur d’autres sujets. Une taille de groupe de 32 animaux (16 mâles et 16 femelles répartis dans les deux génotypes d’intérêt) a été retenue pour garantir une puissance statistique suffisante tout en minimisant le nombre d’animaux nécessaires. Des approches complémentaires ont été mises en œuvre pour réduire encore davantage le recours aux animaux. Par exemple, des analyses bio-informatiques ont été utilisées en amont pour rationnaliser le choix des mutants et orienter les expérimentations in vivo. En cas d’effets imprévus ou de résultats statistiquement concluants obtenus avec un sous-groupe, les expériences seront immédiatement réévaluées pour affiner le nombre d’animaux encore à utiliser.
Raffinement
Afin de maintenir le bien-être animal, les souris seront observées quotidiennement par les zootechniciens, ce qui permettra de déceler très rapidement toute souffrance. Un suivi du poids régulier (hebdomadaire) viendra compléter ces observations. Les souriceaux mâles seront regroupés au moment du sevrage de manière à éviter d’avoir un animal isolé durant la durée de la procédure. Les souris seront placées, au maximum par 5, dans des cages comprenant des enrichissements, dont le choix est fait en accord avec la Structure du Bien Etre Animal (SBEA) des sites (feuille d’essuie-mains, coton, bâtonnet de bois, bandes de papier KRAFT = sizzle-nest, igloo). Les animaux ne seront pas isolés, à l’exception de leur utilisation aiguë dans certaines procédures de ce projet ; ils resteront malgré tout en contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les classes de gravité des procédures utilisées dans le projet sont modérées et ne sont pas répertoriées comme engendrant des pertes d’animaux. Les injections ou gavages seront réalisées par des personnes formées et compétentes. Enfin, le transport inter-sites n’excèdera pas 10 minutes, les deux sites étant distants d’environ 100 m et sera réalisé selon la charte de transport mise en place par les deux établissements utilisateurs et signée par les expérimentateurs. Les animaux seront transportés dans leur cage d’origine dans des sacs exclusivement prévus à cet effet afin de minimiser leur stress durant cette période.
Choix des espèces
L’espèce Mus musculus (Souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature, notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Cette pertinence est améliorée par l’humanisation des modèles murins au niveau génétique et environnemental, ce dont nous tenons compte grâce à l’utilisation de divers régimes alimentaires, températures d’hébergement, âges et sexes. À travers l’utilisation du modèle Souris, nous pouvons travailler sur des modèles génétiquement modifiés qui présentent une ou des modifications pour le/les gène(s) d’intérêt et en analyser les conséquences phénotypiques. Les souris seront étudiées entres les âges de 8 à 24 semaines, car c’est la tranche d’âge la plus étudiée dans la littérature, notamment pour les études physiologiques et métaboliques. Cependant, et selon les résultats obtenus sur les premières cohortes, des analyses sur des animaux âgés entre 12 et 18 mois n’est pas à exclure. Les souris seront majoritairement étudiées entre les âges de 8 à 24 semaines, car c’est la tranche d’âge la plus étudiée dans la littérature, notamment pour les études physiologiques et métaboliques. Cependant, et selon les résultats obtenus sur les premières cohortes, des analyses sur des animaux âgés entre 12 et 18 mois n’est pas à exclure.
Etude du développment du septum interventriculaire
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
Gavées pendant leur gestation, 255 souris femelles portent les embryons qui sont l'objet réel de l'étude. Au total 450 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées par dislocation cervicale à la fin des procédures pour prélever leurs tissus. Cent cinquante d'entre elles subissent quatre électrocardiogrammes sous anesthésie gazeuse espacés d'un mois, deux de cinq minutes et deux de vingt-cinq minutes, avec deux injections intrapéritonéales, l'ensemble visant à comprendre comment se forme la cloison entre les deux ventricules du cœur et comment s'y installe le circuit électrique. Le porteur affirme étudier "des embryons de souris non impactés directement par les procédures", tout en gavant leurs mères pendant la gestation et en annonçant une perte de fonction de gènes chez la souris.
Objectifs
Les malformations cardiaques affectent une naissance sur cent avec un impact sociétal majeur. Les défauts de formation du septum ventriculaire, autrement dit la paroi qui sépare le sang riche en oxygène dans le ventricuale gauche du sang pauvre en oxygène dans le ventricule droit, comptent parmi les malformations les plus courantes observées chez l’homme. Ces malformations sont souvent accompagnées de troubles du rythme avec des arrythmies ventriculaires pouvant entrainer la mort subite. Cette association s’explique par le fait que le septum ventriculaire sert de support au développement du système de conduction ventriculaire, le circuit électrique responsable de la synchronisation des battements du cœur. Malgré l'importance clinique des malformations septales et des arythmies ventriculaires, il reste des questions majeures pour comprendre leurs étiologies. 1. Comment se forme le septum ventriculaire ? La signalisation de l'acide rétinoïque (AR) jouant un role important pour la septation ventriculaire, le but de ce projet est d'identifier les régions du septum et les gènes cibles de l'AR nécessaires à la septation grâce à des techniques de traçage génétique combiné à une perte de fonction de ces gènes chez la souris. 2. Comment l'association entre le septum et le système de conduction se produit-elle au cours du développement ? Nous étudierons l'émergence des différents composants du septum et du système de conduction à l'aide de nouveaux outils génétiques et d’analyse de traçage génétique. 3. Comment le système de conduction se développe- t-il dans les cœurs présentant des malformations du septum ventriculaire ? Nous caractériserons le système de conduction dans deux modèles murins de malformations septales ventriculaires : les cœurs de souris modèles du syndrome de délétion 22q11.2 (DiGeorge), et les cœurs déficients en signalisation de l’AR. L'ensemble de nos résultats permettra de mieux comprendre les liens entre la forme et la fonction du cœur en développement, ainsi que les mécanismes pathologiques qui sous-tendent les malformations du septum et les arythmies ventriculaires.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet vise à apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes qui sous-tendent le développement normal et pathologique du septum ventriculaire. Ces connaissances sont essentielles pour comprendre l'étiologie des malformations cardiaques congénitales humaines (1 sur 100 naissances vivantes) et des syndromes génétiques humains avec des malformations cardiaques, tels que ceux observés dans le syndrome de délétion 22q11.2 (DiGeorge) ou les cardiomyopathies congénitales. Vu la conservation de la structure du cœur chez l'homme et la souris, la souris constitue un modèle génétiquement puissant pour répondre à ces questions fondamentales et cliniquement pertinentes. Dans le long terme, ces résultats pourraient avoir des répercussions dans le développement des nouvelles approches diagnostiques et thérapeutiques de ces malformations cardiaques.
Procédures
Dans ce projet, nous étudierons essentiellement des embryons de souris générées par croisement de souris adultes sans phénotype dommageable. Les interventions dans de notre projet concernent le gavage de souris femelles gestantes (une fois 1 minute dans leur vie N=255, ou deux fois concernant une partie des souris de la procédure 2 N=15) et l’enregistrement d’un électrocardiogramme sous anesthésie gazeuse de 4 ECG par souris espacé d’un mois entre chaque enregistrement, deux fois pendant 5 minutes et deux fois 25 minutes dans leur vie (N=150). Une injection IP (5 secondes) sous anesthésie gazeuse sera réalisée deux fois dans leur vie pendant l’enregistrement de l’ECG.
Impact sur les animaux
Les lignées de souris avec lesquelles nous travaillerons n'ont pas de phénotype dommageable chez les adultes. Dans ce projet, nous étudierons essentiellement des embryons de souris non impactés directement par les procédures. Les effets indésirables sur les animaux adultes seront réduits au stress lors de la contention pour le gavage ou enregistrement d’un électrocardiogramme. Les injections IP réalisées sous anesthésie gazeuse sont indolores pour les souris et n’ont pas d’impact à long terme. Nous appliquerons les mesures adéquates pour réduire leur stress et veiller à leur bien-être.
Devenir
Tous les animaux adultes seront euthanasiés par dislocation cervicale à la fin des procédures pour le prélèvement des tissus.
Remplacement
Les méthodes in vitro (culture de cellules ou organoïdes) ne peuvent remplacer ni la morphogénèse du cœur dans l’embryon aux stades étudiés, ni la fonction cardiaque comme la synchronisation des battements du coeur, en raison de l’isolement des cellules du contexte physiologique et de l’impossibilité d’analyser conjointement differentes destinées cellulaires.
Réduction
Nous nous efforçons de limiter le nombre d’animaux par groupe en tenant compte des contrôles et en utilisant le maximum de données de chaque animal. Nos expériences précédentes dans ces expérimentations sur des souris transgéniques montrent une certaine hétérogénéité dans les résultats. Nous en avons tenu compte dans l’estimation de l’effectif nécessaire pour obtenir un minimum de 3 répétitions pour chaque résultat.
Raffinement
Nous sommes attentifs à limiter le stress (souris maintenues en groupe, avec enrichissement de l’environnement), les souris ayant subi un gavage ou suite à un enregistrement d’électrocardiogramme seront placées en milieu enrichi (coton, dôme) dans une zone de stabulation dédiée, avec moins de bruit et de passages, et seront observées quotidiennement par un animalier ou l’expérimentateur. Nous insistons sur la formation et l’expérience des personnes pratiquant les injections et le gavage. La maîtrise de ces gestes réduisent d’une part le temps de contention, diminuant ainsi les effets stress chez les animaux, et garantissent la bonne tolérance de la procédure et une meilleure reproductibilité auprès des animaux. Nous établissons les points limites les plus précoces possibles en fonction de l’objectif de l’expérimentation.
Choix des espèces
L’expérimentation animale qui utilise des souris sauvages et génétiquement modifiées est indispensable à l’étude et à la réalisation de notre projet. Les souris génétiquement modifiées fournissent des modèles de cardiopathies congénitales et des troubles du rythme cardiaque. Les animaux génétiquement modifiés sont un atout majeur pour nos projets afin d’identifier l’origine embryonnaire de ces anomalies, de suivre le devenir des cellules au cours de la formation du coeur, et d’intégrer les processus développementaux. Les résultats doivent permettre des avancées majeures pour la compréhension et le traitement à long terme de ces pathologies chez l’homme. Chez la souris, le développement et le fonctionnement physiologique du cœur sont similaires à ceux décrits chez l’Homme. Ceci est particulièrement vrai pour le septum interventriculaire et le système de conduction ventriculaire. L’utilisation de souris génétiquement modifiées représente donc le modèle le plus pertinent en ce qui concerne la compréhension de ces maladies humaines. Procédures 1 et 2 : femelles adultes gestantes. Procédure 3 et 4 : Souris adultes.
Potentiel thérapeutique de tissus nerveux 3D issus de la bio-ingénierie pour le traitement des lésions traumatiques cérébrales 2/2
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- Recherche fondamentale
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Macaques rhésus : 2
4 macaques vont être utilisés, deux à longue queue et deux rhésus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, alors que le porteur annonce n'employer que "deux singes adultes", l'une ou l'autre espèce devant être utilisée "en fonction de leur disponibilité". Chacun reçoit un traitement immunosuppresseur pendant toute la durée de l'étude et subit deux chirurgies de deux heures, l'une pour provoquer un traumatisme crânien, l'autre pour greffer des neurones dans la lésion ainsi créée. S'y ajoutent des IRM sous anesthésie avec injection de produit de contraste, des prises de sang, et des séances de comportement de trente minutes à une heure passées en chaise de contention, dont le résumé ne précise pas la nature. Tous seront tués pour l'examen de leur cerveau, le porteur justifiant de ne recourir qu'au primate non-humain par l'absence de "modèles mathématiques valide et réaliste" des lésions du traumatisme crânien.
Objectifs
Cette étude se déroulera sur deux établissements utilisateurs. Cette étude pilote s’inscrit dans un projet plus vaste d’évaluation thérapeutique de greffe de neurones corticaux dans le but d’une réparation de lésion cérébrale. Pour cette étude, deux singes adultes seront utilisés afin de modéliser le traumatisme crânien, d’évaluer les conséquences post traumatiques sur le comportement, d’évaluer l’étendue des lésions en imagerie et de valider la technique de greffe de neurones. Nous évaluerons également quelle est la récupération fonctionnelle, par des tests de comportement et par imagerie afin de caractériser complètement le modèle avant de passer à l’étude thérapeutique plus complète.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de définir les caractéristiques du modèle de traumatisme crânien en termes de comportement et d’imagerie cérébrale des lésions mais aussi de la récupération post traumatique en vue d’une étude thérapeutique utilisant la greffe de neurones.
Procédures
Administration orale du traitement pour l’immunosuppression (Etablissement Utilisateur 1, toute la durée de l’étude), à l’anesthésie pour l’IRM par injection intramusculaire, injection intraveineuse pour le produit de contraste (Etablissement utilisateur 2, 2 heures). Prélèvements sanguins (Etablissement Utilisateur1, 15 minutes), traumatisme crânien (Etablissement Utilisateur 1, 2 heures). Comportement (30 minutes à 1 heure, Etablissement Utilisateur 1).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont liés 1) aux conséquences du traitement pour l’immunosuppression (toute la durée de l’étude, inconfort), à l’anesthésie pour l’IRM et aux douleurs liées aux 2 chirurgies (2 heures pour chaque, modérée). Les nuisances sont liées aux prélèvements sanguins (sous anesthésie, légère, 15 minutes, stress), à la chirurgie pour mimer le traumatisme crânien (stress, modérée, 2 heures), au comportement (durée du test de 30 minutes à 1 heure, en chaise).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure pour une étude post-mortem du cerveau
Remplacement
Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du Primate non-humain (PNH) car il n’existe pas de modèles mathématiques valide et réaliste permettant d’étudier les lésions dues à un traumatisme crânien. Nous recherchons à travers l’utilisation des modèles animaux complexes et intégrés à coller à la réalité de la pathologie humaine, impossible à trouver dans des modèles cellulaires. De ce fait, le recours à l’animal et tout particulièrement le PNH (du fait de sa proximité avec l’homme) pour étudier les mécanismes impliqués dans ces processus lésionnels et réparateurs, est une étape préliminaire nécessaire à la mise en place de nouvelles thérapies.
Réduction
Nos modèles sont générés sur un plateau de haute technicité, nous permettant la manipulation des animaux dans les meilleures conditions (chirurgie, déplacement…) et une grande reproductibilité dans les différents modèles ce qui limite le nombre d'animaux. Les prélèvements cérébraux réalisés à chaque fin d’étude sont destinés de prime abord aux études post-mortem visant à identifier des marqueurs pour déterminer de nouveaux traitements, et servent également à renforcer notre banque de tissus (cérébrothèque) afin de proposer à la communauté scientifique des tissus de (Primates non-humains) PNH et ainsi réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
A leur arrivée, les singes sont acclimatés pendant 2 à 3 semaines dans l’animalerie en volière. Les chirurgies sont faites sous anesthésie générale et avec une couverture antalgique permettant de réduire le plus possible les douleurs ressenties, avec des points limites associés spécifiques de la chirurgie, des soins appropriés en cas d’atteinte de ces points limites, avec un scoring permettant de décider des actions conservatoires à apporter, et des dispositifs de raffinement (monitoring cardiaque et respiratoire, maintien de la température corporelle, asepsie). Le transport du singe pour réaliser l’IRM s’effectue sous anesthésie dans une cage dédiée, sur chariot et protégée des regards extérieurs par une housse. Il est maintenu au chaud sous une couverture et bordé d’une bouillotte, ses paramètres vitaux sont surveillés.
Choix des espèces
La proximité d’espèce avec l’homme fera toujours du primate non-humain un modèle de choix dans la phase finale de détermination de nouveau traitements thérapeutiques, ceci est encore plus vrai dans ce cas précis avec ce modèle de lésions cérébrale et en tant qu’étude pilote en vue d’une greffe de neurones issue de cellules souches humains. Deux espèces de macaques, proches l’une de l’autre, seront utilisés, car ils sont effectivement très proches sur le plan évolutif et génétique, ils appartiennent au même genre (Macaca), ce qui explique leurs nombreuses similitudes morphologiques, comportementales et biologiques. L’une ou l’autre des espèces sera utilisée en fonction de leur disponibilité.
Une nouvelle approche pour protéger les cellules nerveuses de la dégénérescence
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une partie des souris appartient à une lignée dont le porteur écrit qu'elle "pourra ressentir des troubles au cours du développement : manque de coordination, problèmes de vision qui progresseront au cours du projet". 138 souris vont être utilisées, toutes tuées sous anesthésie terminale pour prélever leurs organes. Elles subissent cinq tests de comportement portant sur l'apprentissage moteur, la coordination, l'équilibre et la locomotion, tests que le résumé ne nomme pas et qu'il qualifie d'indolores et sans stress, ainsi qu'une injection avant la chirurgie finale de quinze minutes. Le niveau de souffrance déclaré pour l'ensemble du projet est léger, alors que le porteur annonce par ailleurs des problèmes de vision et un manque de coordination qui s'aggravent sur toute sa durée.
Objectifs
Les maladies neurodégénératives sont des maladies graves qui touchent le cerveau. Elles concernent un grand nombre de personnes dans le monde et sont en constante augmentation, notamment en raison du vieillissement des populations. Par ailleurs, il n’existe pas encore de traitement. Ces maladies où les cellules des neurones se dégradent, sont en partie liées à un problème dans certaines protéines appelées tubulines. Ces protéines servent à construire les microtubules, qui sont comme le “squelette” des cellules et les aident à garder leur forme et à fonctionner correctement. Quand les tubulines sont abîmées, les neurones (les cellules du cerveau) se détériorent. Le but de ce projet est de démontrer que ces problèmes de tubulines provoquent la dégradation des neurones. Nous souhaiterions in fine trouver des molécules capables de protéger ces protéines, pour éviter que la maladie se développe. Cela pourrait permettre de développer de nouveaux traitements ciblant des maladies telles que la maladie d’Alzheimer. En plus, cette mise au point de traitements ciblés pourrait aider à diagnostiquer ces maladies plus tôt et à suivre leur évolution.
Bénéfices attendus
Ce projet présente un fort impact pour la santé humaine en permettant tout d’abord l’identification d’une cause potentielle et d’un marqueur de diagnostic précoce de la dégénérescence neuronale. Il ouvrira également de nouvelles perspectives thérapeutiques, en ciblant des protéines capables de modifier le squelette des cellules, afin de prévenir ou limiter le développement des maladies neurodégénératives. Pour ce faire, nous développons en collaboration avec des chimistes, des molécules capables de bloquer l’action des protéines cibles. Nous avons déjà obtenu des molécules actives dans des cellules et des neurones en culture.
Procédures
Les animaux seront soumis 5 tests de comportement indolores et sans stress de quelques minutes, afin de tester à la fois les fonctions sensorielles et motrices (évaluation de l’apprentissage moteur, la coordination, l’équilibre, la locomotion). Une anesthésie terminale avec chirurgie permettra de récupérer les organes d’intérêt (1 x 15 minutes).
Impact sur les animaux
Les animaux recevront une injection unique d’anesthésiant/analgésiant entrainant un stress léger et une douleur légère de courte durée. La lignée à phénotype dommageable pourra ressentir des troubles au cours du développement : manque de coordination, problèmes de vision qui progresseront au cours du projet.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses de tissus.
Remplacement
Bien que des équipes tentent de cultiver des mini-cerveaux en laboratoire, cette technologie ne permet pas encore de reproduire fidèlement les mécanismes complexes du développement et la dégénérescence des neurones. Ces processus impliquent de nombreux facteurs interconnectés et restent difficiles à modéliser in vitro. A ce jour, il n’existe pas de modèle non animal capable de reproduire l’ensemble des interactions biologiques nécessaires pour étudier ces mécanismes. C’est pourquoi l’utilisation d’animaux vivants reste essentielle pour conduire ce projet de recherche.
Réduction
Ce projet utilisera 138 souris. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, chaque souris participera à plusieurs étapes de l’étude : des tests de comportement puis des analyses de certains tissus. Ainsi, plusieurs informations pourront être obtenues à partir d’un même animal. Les accouplements seront organisés de manière à utiliser le plus possible les souris issues d’une même portée. Cela permettra d’éviter de produire des animaux qui ne seraient pas utilisés dans l’étude. Le nombre de souris a été calculé à partir des résultats d’études scientifiques déjà publiées et de calculs statistiques. Ces calculs montrent qu’un petit nombre de souris par groupe est suffisant pour mettre en évidence les effets recherchés de manière fiable. Si les premiers résultats le permettent, le nombre de souris utilisées pourra encore être réduit. Cette démarche respecte le principe des « 3R », qui vise à utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant la qualité des résultats scientifiques.
Raffinement
Chaque souris sera manipulée délicatement, le mélange anesthésiant/analgésiant sera injecté pour une anesthésie sans réveil. Pendant la procédure, l’anesthésie sera suivie en surveillant la respiration et les battements cardiaques.
Choix des espèces
La souris est souvent utilisée en recherche, car l’appartenance de ces rongeurs à la classe des mammifères les rend proches de l’homme. Son système nerveux est complexe, comme le nôtre, et on peut modifier ses gènes pour mieux comprendre certaines maladies. Dans ce projet, nous voulons empêcher la détérioration de protéines appelées tubulines. Ces protéines servent à construire les microtubules, qui sont comme le “squelette” des cellules. Nous voulons vérifier que l’empêchement de cette détérioration, faite grâce à des molécules protectrices, permettra d’éviter des maladies du cerveau. Pour cela, nous allons utiliser deux types de souris : Le premier type de souris correspond à une maladie proche d’une maladie rare chez l’enfant. Etant donné que les premiers signes apparaissent à l’âge de 1 mois, nous allons donc vérifier si la maladie apparaît à cet âge, puis nous vérifierons vers l’âge de 4 mois, pour voir si la maladie arrive plus tard. Le deuxième type de souris correspond au développement de la maladie d’Alzheimer. Etant donné que cette maladie se caractérise par l’apparition de plaques à 2 mois puis une dégénérescence neuronale à 4 mois, nous allons chez ces souris, vérifier ces similitudes aux mêmes âges. Nous étudierons donc l’effet de l’absence de dégradation de la tubuline à ces deux stades de développement.
Évaluation de l’efficacité de molécules thérapeutiques dans un modèle de psoriasis induit chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
L'application d'imiquimod sur la peau provoque rougeurs, desquamation, épaississement et parfois excoriations, avec des démangeaisons, pendant environ huit jours : c'est ainsi qu'un psoriasis est déclenché chez 2 350 souris, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes seront tuées en fin de procédure pour prélever le sang total et des tissus. S'y ajoutent une application de microbiote cutané humain, des séances d'imagerie sous anesthésie gazeuse et une prise de sang, l'ensemble servant à tester des molécules candidates contre le psoriasis, y compris chez des souris porteuses d'une protéine humaine impliquée dans l'inflammation. Le porteur affirme conduire chaque geste de façon à "garantir à la fois le bien-être animal et la qualité des données produites", et vante un "excellent modèle de psoriasis" sans jamais nommer l'espèce dans le passage qui justifie ce choix, où il parle au pluriel de "ces espèces".
Objectifs
Le psoriasis est une maladie auto-immune de la peau qui touche 1 à 3 % de la population mondiale. Chez l’homme, le psoriasis se caractérise par des lésions cutanée du cuir chevelu, des genoux et des coudes, associée à une atteinte des ongles. Dans les cas graves, l'atteinte cutanée peut être généralisée (érythrodermie) et il peut exister des atteintes des articulations. Cette dermatose évolue de façon chronique avec des poussées entrecoupées de périodes de rémissions de durée variable au cours desquelles les lésions sont minimes. Aucun traitement curatif n’est connu actuellement, mais des traitements symptomatiques existent. Il est donc important d’avoir un modèle préclinique prédictif du psoriasis et afin d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques, il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle. Le projet sera conduit chez des souris sauvages et chez des souris transgéniques exprimant une protéine humaine impliquée dans les processus inflammatoires et dont le rôle dans la physiopathologie du psoriasis suscite un intérêt croissant. L’utilisation conjointe de ces deux types d'animaux vise à mieux comprendre l’impact de l’expression de cette protéine sur l’intensité de la réponse inflammatoire cutanée et sur la réponse aux traitements testés.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de faire progresser les connaissances scientifiques et appliquées dans le domaine du psoriasis en évaluant l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques dans un modèle préclinique pertinent. Il permettra d’identifier des composés innovants (ou repositionnés) présentant un potentiel anti-psoriasique, ainsi que d’évaluer différentes formulations et voies d’administration, en particulier topiques, adaptées à cette pathologie cutanée. De plus, il permettra de mieux comprendre l’impact de l’expression d'une protéine spécifique sur l’intensité de la réponse inflammatoire cutanée et sur la réponse aux traitements testés. Pendant la durée du projet, les études conduites permettront de sélectionner les molécules les plus prometteuses sur la base de critères objectifs d’efficacité et de tolérance. L’évaluation de différentes doses et schémas d’administration contribuera à l’optimisation des fenêtres thérapeutiques. Le projet permettra également d’explorer des effets de synergie entre plusieurs molécules ou entre une molécule et une formulation spécifique. Les données cliniques, biologiques, histologiques et d’imagerie générées amélioreront la compréhension des mécanismes inflammatoires impliqués dans le psoriasis et de leur modulation pharmacologique. À plus long terme, ce projet apportera des preuves d’efficacité précliniques indispensables au développement clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le psoriasis. L’identification de molécules plus efficaces, de formulations optimisées et de doses mieux adaptées pourrait conduire à des traitements plus ciblés, mieux tolérés et plus efficaces pour les patients. Les connaissances acquises sur l’optimisation des associations thérapeutiques pourront également être transposées à d’autres maladies inflammatoires chroniques, avec un bénéfice potentiel élargi pour la santé humaine.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis à un ensemble d’interventions techniques brèves, non chirurgicales , nécessaires à l’induction et au suivi de la pathologie. Les interventions réalisées lors de l’induction et du suivi du modèle sont les suivantes : manipulation quotidienne des animaux (1 à 2 minutes maximum), contention pour administrations de molécules à visée thérapeutique (durée d’intervention de 30 à 60 secondes en fonction de la voie d’administration), examens d’imagerie non invasive par Tomographie Optique de Cohérence ou OCT / par imagerie de fluorescence / par imagerie de bioluminescence sous anesthésie gazeuse (une à deux fois par animal ; durée de la session d’imagerie : 5 minutes maximum), un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (une fois au cours de la procédure d’induction, durée d’environ 3 minutes). Chaque intervention est conduite par un personnel qualifié, en conditions contrôlées, afin de garantir à la fois le bien-être animal et la qualité des données produites.
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales prévues dans ce projet sont susceptibles d’entraîner des effets indésirables transitoires chez les animaux, principalement liés à l’induction du psoriasis, aux manipulations répétées et aux administrations de traitements. L’application topique de microbiote cutanée humain peut provoquer un stress ponctuel lié à la contention de l’animal ainsi qu’un inconfort, sans entraîner de lésions cutanées et/ ou d’infections chez les animaux. L’induction du psoriasis par application topique d’imiquimod entraîne l’apparition de lésions cutanées inflammatoires localisées (érythème, desquamation, un épaississement de la peau et parfois des excoriations). Ces lésions peuvent être associées à un inconfort local et à des démangeaisons. Leur intensité est variable et elles persistent pendant la phase d’induction, d’une durée d’environ 8 jours, puis régressent progressivement lors de la phase de traitement ou après l’arrêt de l’induction. Les manipulations répétées (applications topiques, évaluations cliniques, imagerie non invasive) ainsi que les anesthésies gazeuses répétées peuvent induire un stress modéré et transitoire, pouvant se traduire par une diminution temporaire de l’activité ou une modification passagère du comportement. Un retour à un comportement normal est attendu rapidement après chaque intervention. Les administrations de traitements par voie orale, parentérale ou topique, ainsi que les prélèvements sanguins de faible volume, peuvent provoquer un inconfort ponctuel et un stress léger, sans douleur prolongée attendue. Une perte de poids modérée et transitoire peut être observée chez ces animaux au cours de l’étude. L’ensemble de ces effets est réversible et fait l’objet d’un suivi quotidien (poids, hydratation et comportement), avec application de points limites prédéfinis afin de prévenir toute souffrance excessive.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure car des prélèvements de sang total seront réalisés. Des prélèvements tissulaires post-mortem pourront également être réalisés.
Remplacement
Afin d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques, il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas de modèle in vitro de psoriasis pouvant remplacer complètement le micro-environnement cutané en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux appliqués directement sur la peau en application externe (topique) - L’efficacité ne pouvant être testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’homme).
Réduction
La stratégie d’expérimentation consiste à suivre les mêmes animaux dans le temps (étude longitudinale) par observation répétée avec ou sans procédure d’imagerie. Chaque animal devient son propre contrôle car il est observé une première fois avant de commencer les traitements (observation à T=0) puis à différents temps. Cette approche expérimentale permet d’obtenir des résultats plus fiables avec moins d’animaux. Le nombre d’animaux sera de 10 animaux maximums par groupe de traitement (groupe d’animaux devant recevoir la molécule à tester ou le traitement thérapeutique). Ce nombre est le minimum statistiquement nécessaire pour avoir des résultats robustes. Des analyses seront réalisées à la fin de(s) la procédure(s) sur les tissus provenant des animaux afin d’obtenir le plus d’informations possibles relatives à l’efficacité des molécules administrées ou des traitements thérapeutiques effectués sur les animaux et d’éviter l'utilisation d'animaux supplémentaires.
Raffinement
Conformément à la réglementation en vigueur, ce projet est conçu afin de réduire au minimum la douleur, la souffrance, l’angoisse et toute nuisance durable infligées aux animaux, tout en garantissant la validité scientifique des résultats. Le recours à l’imagerie non invasive (par exemple l'imagerie par bioluminescence ou fluorescence) permet un suivi longitudinal des lésions chez les mêmes animaux, limitant ainsi le nombre de manipulations terminales et la répétition de procédures invasives. Une surveillance clinique quotidienne est mise en place pendant toute la durée des procédures, incluant l’évaluation du poids, de l’état d’hydratation, du comportement, de l’activité et de l’état des lésions cutanées. Des points limites précoces et prédictifs ont été définis afin de permettre une interruption rapide de la procédure ou une mise à mort anticipée en cas de dégradation de l’état général de l’animal. En cas de signes de déshydratation ou de perte de poids, des mesures correctrices immédiates seront mises en œuvre (apport alimentaire humidifié, gels nutritionnels, réhydratation par sérum physiologique). Les conditions d’hébergement sont enrichies (igloos, tunnels, matériaux de nidification) afin de réduire le stress. Les manipulations potentiellement stressantes (imagerie, prélèvements, administrations) seront réalisées sous anesthésie gazeuse, permettant une induction et un réveil rapides, avec un inconfort limité. Les volumes et fréquences de prélèvements sanguins sont strictement limités. Tout au long de la durée de vie du projet, une veille scientifique et réglementaire sera assurée. Les animaux seront manipulés par du personnel formé et expérimenté, afin de limiter la durée et l’impact des interventions.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée dans ce projet représente un excellent modèle de psoriasis. Il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives à l'évaluation du psoriasis induit dans ces espèces. Ces animaux développent des symptômes de psoriasis très semblables à ceux observés chez l'humain. De plus, ces modèles présentent certains intérêts pratiques indéniables : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (8-12 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. Ce stade de développement correspond à l’âge de maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Tous les animaux auront le même âge. Les résultats publiés avec ce modèle utilisent des animaux de cet âge.
MODIFITCATION Rôle de la mort cellulaire programmée dans le développement des circuits corticaux normaux et pathologiques du cerveau de souris.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Ouverture de l'abdomen sous anesthésie générale sur des femelles gestantes, injection dans le cerveau des embryons puis cinq impulsions électriques de cinq millisecondes : 2 952 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. Les souriceaux subissent une biopsie de la queue, d'autres souris une chirurgie d'une heure suivie d'injections sous-cutanées trois jours de suite, d'autres encore une injection intracardiaque de vingt minutes sous anesthésie. Le projet cherche à savoir ce qu'une population de neurones normalement vouée à disparaître au cours du développement fait au cerveau, et ce qui se passe quand ces cellules survivent anormalement. Le bénéfice annoncé tient en une ligne, "étendre nos connaissances" sur ces neurones et leur rôle, sans retombée médicale avancée, pour près de trois mille souris tuées.
Objectifs
Notre projet a pour objectif de mieux comprendre l’influence d’une population neuronale transitoire sur le développement du cerveau. Nous voulons également explorer les conséquences de la survie anormale de ces cellules sur la formation du cerveau.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu du projet est d’étendre nos connaissances sur la génération et la mort de nos neurones d’intérêt et quel est leur rôle dans le développement du cerveau.
Procédures
MODIFICATION Les souriceaux des lignées subiront une biopsie à la queue pendant une contention de quelques secondes. Des souris subiront une injection intrapéritonéale et une intervention chirurgicale de 60 minutes sous anesthésie générale, puis une injection sous cutanées d'une durée de deux minutes une fois par jour pendant 3 jours. Les femelles gestantes subiront une injection intrapéritonéale et une intervention chirurgicale de 45 minutes sous anesthésie générale, comprenant une ouverture de l'abdomen et des points de sutures, puis une injection sous cutanées sous anesthésie d'une durée de deux minutes une fois par jour pendant 3 jours. Les embryons subiront une injection intra-cérébrale d'une durée de 5 secondes et 5 pulses de 5ms de courant électrique. Des animaux subiront une anesthésie générale suivie d'une injection intracardiaquependant 20 minutes.
Impact sur les animaux
La biopsie à la queue provoque une douleur légère. Les injections peuvent induire une douleur légère et brève. Les actes chirurgicaux des procédures peuvent entrainer une souffrance qui est minorée ou évitée par le traitement analgésique. Les étapes d’anesthésie et de contention peuvent également provoquer un stress chez l’animal.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de la procédure pour prélèvement d'organes et analyses phénotypiques et génétiques.
Remplacement
Les questions scientifiques que nous nous posons ne peuvent être étudiées qu’in vivo sur des cerveaux. Il s’agit ici d’études sur le développement et le fonctionnement du cerveau, qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère. Aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de son développement dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part.
Réduction
Pour le maintient des lignées génétiquement modifiées, nous nous limiterons à la production des animaux nécéssaires en limitant les accouplements au maximum. Les effectifs ont été déterminés par une approche statistique, ainsi que par nos expériences antérieures sur ce type d’études de modèles animaux. L’analyse statistique sera réalisée par un test statistique adéquat.
Raffinement
Tous les animaux vivent en groupes familiaux ou sociaux dans un environnement enrichi avec eau et nourriture illimitées. Lors de la chirurgie les souris placées sur une plaque chauffante sont anesthésiées et reçoivent des injections d'analgésiques avant et après l'opération. Un gel ophtalmique est également utilisé pour éviter un dessèchement des yeux. Après l'opération, la surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance. Une grille d'évaluation de la santé des animaux est mise en place. Une administration d'analgésique ou la mise à mort de l'animal est envisagée en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le développement et le fonctionnement du système nerveux, principalement en raison de sa similarité avec l’Homme. En effet, seuls les mammifères présentent un cerveau organisé en 6 couches inversées. Pour le marquage et la biopsie, les souriceaux ont entre 5 et 10 jours, âge auquel on peut tatouer les coussinets des phalanges. Les femelles gestantes sont des adultes de 2 à 6 mois. Les expérimentations sont menées sur des animaux aux stades de développement embryonnaire où interviennent les phénomènes étudiés.
Caractérisation chez la souris des atteintes du cerveau et du coeur lors d’une infection systémique
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Infectées par le méningocoque, bactérie que le résumé décrit comme capable de se multiplier dans le sang, 810 souris sont suivies à 5 minutes, 30 minutes et 2 heures après l'inoculation, le prélèvement des organes intervenant à 19 h. Elles subissent au total six injections et deux prélèvements sanguins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des effets néfastes, le porteur ne retient que le stress et la douleur légère liés aux injections, aux prises de sang et à la contention, sans un mot sur ce que produit l'infection, alors que le projet porte précisément sur les atteintes du cerveau et du cœur qu'elle provoque. Les souris sont tuées par dislocation cervicale pour prélever le cœur et par exsanguination pour prélever le cerveau.
Objectifs
La méningite peut survenir suite à une infection bacrtérienne à méningocoques . En France, le taux de mortalité reste élevé à 8% des cas malgré l'existence de traitements. De plus, même en cas d'évolution non fatale, les séquelles sont fréquentes et graves (amputations et atteinte neurologique). Cette bacterié a le pouvoir de se multiplier dans le sang. Le but de ce projet est de comprendre les atteintes de la infection systemique de cette bacterié dans le corps. Les souris seront infectées avec des bactéries, et nous observerons l’évolution de l’infection à 5 , 30 minutes et 2 heures post-infection, après quoi à 19h les organes seront prélevés. Les souris seront mises à mort par dislocation cervicale pour prélever le coeur et par exsanguination pour le prélèvement du cerveau. Les lésions tissulaires et les infiltrations de cellules immunitaires pourront ainsi être analysées.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'étudier les atteintes au cerveau et au coeur lors de l’infection par le méningocoque permettant à terme le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques
Procédures
La souris recevra un total de 6 injections. Deux prélèvements sanguins seront effectués chez la souris.
Impact sur les animaux
Les différentes injections peuvent induire un stress et une douleur légère de courtes durées . Le prélèvement de sang peut induire aussi un stress de courte durée. La contention peut induire un stress de courte durée.
Devenir
À l'issue de chaque procédure expérimentale, tous les animaux seront mis à mort afin de permettre la réalisation des prélèvements terminaux indispensables aux analyses histologiques, moléculaires et biologiques des tissus d'intérêt (cœur et/ou cerveau). Ces prélèvements nécessitent le recueil d'organes entiers et ne sont pas compatibles avec le maintien en vie des animaux. En conséquence, aucune réutilisation, remise en liberté ou placement des animaux n'est envisageable. Par ailleurs, tout animal atteignant un point limite prédéfini au cours de la procédure sera mis à mort de manière anticipée.
Remplacement
Ce projet vise à comprendre comment une infection à méningocoque affecte l’organisme et provoque la maladie. À ce jour, aucun modèle alternatif validé n’est décrit dans la littérature pour étudier ces mécanismes en remplacement de l’animal. Ainsi, afin de mesurer les paramètres métaboliques, le recours à des modèles animaux est nécessaire.
Réduction
Pour ce projet, nous utiliserons des souris males et femelles 7-10 semaines sur 5 ans. Le nombre de souris qui sera inclus dans chaque groupe sera le plus faibles possible pour pouvoir assurer la reproductibilité des expériences et répondre aux questions scientifiques. Des prélèvements auront lieu pour des analyses histologiques et de biologie cellulaire afin d’extraire le maximum de données de chaque expérimentation.
Raffinement
Afin de limiter la douleur de l’animal, une grille de score pour la détermination de points limites a été définie.
Choix des espèces
La souris est un bon modèle d’infection à méningocoque, largement décrit dans la littérature. Des souris âgées de 7 à 10 semaines seront utilisées, car leur système immunitaire est mature et fonctionnel. Cela permettra de mieux comprendre les atteintes lors de l’infection sanguine et pourrait conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Etude du lien causal entre tissu adipeux intramusculaire (IMAT) et fonctions métabolique et régénérative du muscle squelettique dans les contextes de vieillissement et/ou d’obésité EU3/3.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
Cinq jours de gavage quotidien, puis une injection de glycérol ou de cardiotoxine dans le quadriceps sous anesthésie pour y provoquer une lésion musculaire : 2 232 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. S'y ajoutent deux tests métaboliques avec injection intrapéritonéale et prélèvements de sang à la queue, un régime enrichi en lipides dont le porteur indique que l'inconfort "pourrait durer plusieurs semaines", et des tests d'agrippement, de cadre inversé et d'endurance sur tapis roulant. L'objectif déclaré est d'établir un lien de cause à effet entre la graisse logée dans le muscle et deux mécanismes, la régulation du glucose et la régénération musculaire, chez des souris tuées à 2-3, 6-7, 12-13 ou 18-19 mois selon les groupes. Le porteur justifie le recours à Mus musculus en le décrivant comme "le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature", ce qui permettrait "de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats".
Objectifs
L'augmentation du nombre de personnes âgées et/ou obèses constitue un enjeu majeur de santé publique. Ces 2 situations ont des conséquences (i) individuelles, favorisant la fragilité et la dépendance et (ii) sociétales, entrainant une augmentation des dépenses de santé. De plus, ce sont des facteurs de risque de pathologies telles que le diabète de type 2 (DT2), lié à des désordres du métabolisme glucidique, et la sarcopénie, liée à une diminution de la masse et de la force musculaire. Le vieillissement et l’obésité représentent deux contextes dans lesquels il y a émergence, au sein du muscle squelettique, d’un tissu adipeux intramusculaire (IMAT) dont les cellules matures sont les adipocytes intramusculaires. Ce tissu a été bien documenté dans les muscles squelettiques des animaux de rente, puisqu’il donne son goût à la viande, mais il n’existe que peu de données chez l’Homme. Toutefois, des données corrélatives semblent indiquer que la présence chronique d’IMAT pourrait participer à la perte de sensibilité à l’insuline musculaire participant à l’étiologie du DT2. Nos données préliminaires chez la souris sont encourageantes et vont dans le même sens. D’un autre côté des données observationnelles dans différents modèles murins de lésions musculaires, révèlent une émergence transitoire d’IMAT qui pourrait participer à la régénération musculaire nécessaire au maintien de la masse et de la force de ce tissu. C’est l’hypothèse que nous avançons. Il semble donc que l’IMAT via son abondance, sa cinétique d’apparition/disparition et/ou son phénotype soit un acteur important des fonctions métabolique et régénérative du muscle squelettique. Ce projet a comme objectif principal de montrer le lien causal entre (i) IMAT et désordres métaboliques glucidiques, principalement musculaires et (ii) IMAT et régénération musculaire ; ceci à l’aide d’un modèle murin transgénique dans lequel l’ablation spécifique et contrôlée des adipocytes intramusculaires, constituant l’IMAT, est possible. Afin d’avoir une étude la plus complète possible et étant donné le dymorphisme sexuel existant à la fois dans la composition corporelle (i.e. masses grasse et maigre), la régulation des métabolismes ou les capacités régénératives, des animaux femelles et mâles seront inclus dans cette étude. Ils seront étudiés à des âges physiologiques différents, afin de reproduire les effets de l’avancée en âge chez l’Homme. CE PROJET EST MULTISITE, IL SERA REALISE DANS 3 ETABLISSEMENTS UTILISATEURS.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra, pour la première fois, de mettre en évidence les effets d’un dépôt adipeux ectopique méconnu, l’IMAT sur l’homéostasie du muscle squelettique en fonction du sexe et de l’âge. Le muscle squelettique représente, en masse, le tissu le plus abondant de l’organisme et joue un rôle majeur dans certaines fonctions clés telles que la locomotion mais aussi dans la gestion de l’énergie, i.e. le métabolisme. Il devrait permettre, d’une part, d’obtenir des données nouvelles sur le contenu lipidique et le phénotype de l’IMAT (i.e. hypertrophie/ hyperplasie adipocytaire, inflammation, sécrétions, etc…), son évolution avec l’âge et/ou l’obésité mais également avec le sexe des individus. D’autre part, grâce à l’originalité du modèle de souris double transgénique permettant une diminution partielle ou totale de l’IMAT, il devrait permettre d’établir un lien causal (délétère ou bénéfique) entre ce tissu et les fonctions musculaires étudiées (i.e. métabolisme glucidique et régénération) selon le sexe, l’âge, le régime alimentaire et/ou le statut régénératif. Ce projet pourrait en particulier faire émerger des molécules actives (lipides, cytokines, etc…) explicatives des effets observés lors de l’obésité, du vieillissement ou bien de la régénération. A plus long terme, les connaissances générées par cette étude pourraient être exploitées en santé humaine puisque de nombreuses conditions pathologiques musculaires aiguës ou dégénératives sont caractérisées par un dépôt important d’IMAT. Nous anticipons que ces travaux pourraient donc avoir des répercussions sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques du patient en situation de fragilité musculaire résultant de l’avancée en âge, d’obésité ou même de myopathies.
Procédures
Dans les établissements utilisateurs 1 ou 3, la partie 1 du projet s’attellera à caractériser les désordres métaboliques glucidiques et l’IMAT en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique comprenant chacun 1 injection intrapéritonéale et des prélèvements sanguins caudaux (20 sec à 2 min/prélèvement, 130 μL de volume cumulé maximal). La partie 2 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin de lésion musculaire induite par l’injection intramusculaire de glycérol ou de cardiotoxine, facilitant le développement d’IMAT. Les animaux seront soumis à 1 injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Suivi, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 3 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, d’une injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Puis, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 4 du projet concernera le lien causal entre la présence d’IMAT et la régénération musculaire dans un modèle de souris double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, de 2 injections consécutives séparées de 4 jours dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). La fonction musculaire d’une partie des animaux sera ensuite évaluée par différents tests non invasifs : agrippement, cadre inversé et endurance sur tapis roulant. Dans le second établissement utilisateur, des tests terminaux d’évaluation du métabolisme utilisant des radioélements seront réalisés à la place des tests classiques afin d’affiner la caractérisation des désordres métaboliques en lien avec l’IMAT et utilisant des radioélements seront réalisés. Ces tests comprennent 1 injection intrapéritonéale et deux prélèvements sanguins à la queue (20 sec à 2 min/prélèvement, 10 μL de volume cumulé maximal).
Impact sur les animaux
Plusieurs nuisances ou effets indésirables pourraient être observés dans cette étude : 1- Stress lié à la contention lors des gavages et lors des injections. La durée de cet effet indésirable sera réduit au minimum de part l’expérience de l’expérimentateur ; 2- Stress lié à l'isolement, lors des expériences de mesure de la composition corporelle, de la force musculaire ou lors du test d'endurance ; 3- Inconfort voire douleur lors du réveil des animaux anesthésiés pour la réalisation des injections intramusculaires ou pour leur identification par tatouage. Dans premières heures suivant la réalisation de l'injection intramusculaire, une mobilité réduite pourra être observée. Le geste chirurgical étant réalisé le matin et cet état de mobilité réduite n’étant que passager, il n’entrave pas la prise alimentaire la nuit suivante ; 4-Inconfort engendré par l’obésité résultant de la mise en régime enrichi en lipides. Cet inconfort pourrait durer plusieurs semaines ; 5- Stress lié au transport entre les deux des établissements utilisateurs (EU1 et 2) (5 à 10 min max).
Devenir
Comme indiqué dans les pagraphes concernant chacune des procédures expérimentales, les animaux seront nécropsiés en fin de procédure pour récolter des tissus d'intérêt. Ils seront mis à mort en fonction des groupes d'âge inclus dans les procédures: à 2-3 mois, à 6-7 mois, 12-13 mois ou à 18-19 mois.
Remplacement
A l’aide d’expériences réalisées in vitro avec des cellules humaines nous avons précédemment publié que les sécrétions des adipocytes musculaires obtenus en culture étaient capables de diminuer la réponse à l’insuline des cellules musculaires également obtenues en culture, appuyant l’hypothèse que l’IMAT pourrait être un régulateur du métabolisme glucidique musculaire et plus particulièremet des perturbations de ce métabolisme. Par ailleurs, nous avons également mis en évidence plus recemment des modifications du phénotype des adipocytes musculaires obtenues in vitro en fonction de l’age des volontaires dont étaient issues les biopsies musculaires. Ce sont ces données qui nous ont conduits à nous tourner vers l’animal. En effet, il est bien connu que la culture à a ses limites qui sont clairement ici (1) que les cellules (adipocytes et myocytes) n’arrivent jamais au stade terminal de différenciation donc sont des formes immatures des cellules observées in vivo et (2) qu’il est impossible dans un tel modèle d’imaginer l’impact sur le muscle en entier et sur l’organisme. Il est cependant évident qu’en fonction des résultats obtenus dans ce projet des expériences complémentaires sur des points mécanistiques précis seront réalisées sur des cultures primaires humaines et/ou murines qui permettent de par la capacité de prolifération des cellules de réaliser un certain nombre d’analyses.
Réduction
Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales, des expériences préliminaires et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en oeuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en oeuvre seront des tests pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, un test différent pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, un autre test à une ou deux voies pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans la Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés dans les cages. Un suivi quotidien sera réalisé soit par le personnel de la zootechnie soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permettra une habituation à l'Homme et, le stress ainsi diminué, devrait diminuer la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées. Le réveil de l'animal, après injection musculaire, se fera dans une cage posée sur un tapis chauffant ; du collyre sera appliqué sur l'oeil de l'animal qui aura été injecté. L'observation et la surveillance des animaux permettent d’appliquer des points limites précis et des critères d’arrêt des souffrances. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages d'origine des animaux sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettent un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est pré-déterminé et évite la rencontre avec le public.
Choix des espèces
L’espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux de différents âges seront inclus dans les procédures : 2-3 mois, 6-7 mois, 12-13 mois ou 18-19 mois. L'utilisation de ces différents groupes d'âge permettra, dans certaines procédures, d'étudier la cinétique d’évolution « naturelle » de certains paramètres (i.e. régulation du métabolisme, composition corporelle, développement du tissu adipeux intramusculaire, etc....) au cours d’une diète normale ou riche en graisses. Dans d'autres procédures, l'utilisation des animaux de différents groupes d'âge permettra de mettre en évidence l'impact du vieillissement sur certains processus (i.e. processus d'installation du diabète et rôle du tissu adipeux intramusculaire, processus régénératifs musculaires, etc ...). Les âges des souris de chaque procédure ont été choisis en fonction de résultats d’expériences préliminaires du laboratoire et de données rapportées dans la littérature.
Régulation de l’empreinte lors du développement préimplantatoire des embryons de mammifères
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Mises à mort après accouplement pour que leurs embryons soient collectés, 550 souris femelles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. La procédure déclarée tient en deux injections hormonales sous-cutanées espacées de 48 heures, destinées à déclencher une ovulation multiple. L'étude porte sur un gène dont l'inactivation désorganise la structure de la chromatine et bloque le développement de l'embryon, question que le porteur juge impossible à reproduire en culture parce que la protéine visée n'existe que chez les mammifères euthériens. Le classement en gravité légère ne couvre que ces deux piqûres, et aucun calcul ne vient justifier le chiffre de 550 femelles, le porteur se bornant à indiquer que la superovulation et la mise en commun des embryons entre membres du laboratoire diminuent le nombre de souris utilisées.
Objectifs
Ce projet vise à améliorer la compréhension de ce qui contrôle l’expression des gènes lors des phases précoces du développement des mammifères. L’orchestration spatio-temporelle précise de l’expression des gènes est essentielle pour éviter des pathologies du développement, Ce processus implique des réseaux complexes de régulation entre les gènes. Une couche additionnelle de régulation des gènes est due au contrôle de l’accessibilité des gènes. Ainsi, en jouant sur le repliement de l’ADN au niveau d’un gène, il est possible de contrôler son usage. Le repliement de l’ADN est organisé dans une structure appelée « chromatine ». Nous avons identifié un gène dont l’inactivation a des conséquences majeures sur la structure de la chromatine. En son absence, les embryons sont incapables d’orchestrer correctement l’expression des gènes entrainant un arrêt du développement. Nous souhaitons étudier le mécanisme d’action de ce gène. Notre projet vise à mieux comprendre la contribution de la régulation de la chromatine au contrôle de l’expression des gènes durant les premiers jours du développement.
Bénéfices attendus
Cette étude apportera une meilleure compréhension des mécanismes de transmission d’information sur le contrôle de l’expression des gènes d’une génération à l’autre, et en particulier du rôle de la régulation de la chromatine dans ce processus. Par ailleurs, le gène étudié a un rôle bien établi dans le développement de l’embryon mais également dans la transformation de cellules normales en cellules cancéreuses. Les conclusions de cette étude contribueront donc à la compréhension des mécanismes qui contrôlent l’expression des gènes lors du développement et de comment ce contrôle est altéré pour permettre la transformation cancéreuse des cellules.
Procédures
Les souris seront soumises à une injection sous-cutanée à deux reprises, les injections étant espacées de 48h.
Impact sur les animaux
La procédure effectuée est de classe légère et ne devrait pas occasionner de douleur à l’animal autre que la douleur ponctuelle liée à l’injection (gène de courte durée), les hormones injectées ainsi que leurs effets ne provoqueront pas de douleurs.
Devenir
Toutes les femelles injectées seront mises à mort après accouplement et leurs embryons seront collectés.
Remplacement
La protéine d’intérêt n’est présente que chez les mammifères euthériens limitant le recours à des organismes modèles plus simples. Nous nous intéressons à son rôle dans la transmission d’information sur le contrôle de l’expression des gènes d’une génération à l’autre (ici de l’oocyte à l’embryon), processus qu’il n’est pas possible de reproduire in vitro actuellement.
Réduction
La superovulation permet de déclencher l’ovulation par injection d’hormones. Cette méthode augmente la probabilité qu’une souris ait des embryons et le nombre de ces embryons permettant ainsi de diminuer de manière très importante les souris qui seront utilisées pour ces expériences. La mise en commun des embryons obtenus entre les différents membres du laboratoire permet également de limiter le nombre de souris qui vont faire l’objet de cette procédure.
Raffinement
La procédure de superovulation pour notre projet consiste en deux injections d’hormones non douloureuses et espacées de 48h. Aucune douleur n’est attendue suite à ces injections, toutefois, les animaux seront suivis selon les critères généraux classiques préconisés par la SBEA (expressions faciales, aspect général, comportement).
Choix des espèces
Le choix du modèle d’étude est limité par le fait que le gène étudié n’est présent que chez les mammifères euthériens. Par ailleurs, le choix du modèle murin repose sur la physiologie de ce mammifère, sa morphogenèse très proche de celle de l’humain et sur la connaissance du génome murin. La souris est une espèce très bien caractérisée en termes de génétique, de biologie du développement et de la reproduction, qui est de plus accessible pour l’obtention de modèles génétiquement modifiés par génie génétique. Ces critères en font donc un modèle de choix pour notre projet d’étude. La superovulation ne concerne que des souris femelles adultes car nous les utilisons pour leur fonction reproductrice.
Impacts d’une exposition chronique périnatale à deux additifs alimentaires inorganiques riches en aluminium : évaluation de la toxicité chronique périnatale sur les fonctions cognitives et la sensibilité colique chez la souris. EU 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
696 souris au maximum vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère. Exposées à deux additifs alimentaires riches en aluminium depuis la vie in utero jusqu'à l'âge adulte, elles subissent un test de nage forcée que le porteur décrit comme "une procédure sévère, induisant un stress aigu important, une contrainte physique et une phase de résignation comportementale", un labyrinthe en croix surélevé, et une mesure de sensibilité colique par distension de 20 à 80 mmHg sous contention. Les femelles gestantes sont isolées à partir du quinzième jour de gestation et jusqu'au sevrage de leurs petits. L'objet déclaré est d'aider les agences de sécurité alimentaire à fixer des teneurs en aluminium "sans danger pour la femme enceinte, le nouveau-né, l'enfant et l'adulte", démonstration qui passe ici par la nage forcée et la distension du côlon de souris exposées avant leur naissance.
Objectifs
La population est exposée à l’aluminium (Al) surtout via l’alimentation, les produits transformés en étant les plus riches du fait d’additifs contenant ce métal. Chez l’Homme, des particules d’Al ont été observées dans le placenta et le méconium, démontrant une exposition fœtale. L’Al peut être neuro‑ et immunotoxiques, et son transfert maternofœtal peut induire des troubles cognitifs et comportementaux chez l’animal. Toutefois, la plupart de ces travaux utilisent du chlorure d’aluminium ou des nanoparticules d’aluminium, qui ne reflètent pas les formes physico‑chimiques des additifs alimentaires riches en Al, susceptibles de présenter une biodisponibilité et une distribution différentes. De plus, l’autorité européenne de sécurité des aliments souligne l’absence de données toxicologiques spécifiques pour l'Al provenant des additifs alimentaires, couvrant l'exposition pendant le développement et les conséquences potentielles sur la santé adulte. Du fait de l’immunotoxicité de l’Al, nous faisons l’hypothèse qu’une exposition dès la gestation à des additifs riches en Al pourrait perturber l’axe microbiote‑intestin‑cerveau, dont le déséquilibre est impliqué dans des pathologies chroniques comme les maladies inflammatoires intestinales ou les maladies comportementales. Le projet qui se déroulera dans 2 établissements (EU1 et EU2), visera à évaluer chez la souris les effets d’une exposition, depuis la vie in-utéro à l’âge adulte, à deux additifs riches en Al. Nous explorerons si une exposition à ces additifs induit i) des modifications du microbiote intestinal et ii), le développement de troubles anxio-dépressifs et une hypersensibilité colique à différents âges (post-sevrage et adulte). Pour ce projet, des souris femelles seront exposées pendant la gestation et la lactation à ces additifs via l’alimentation à des doses pertinentes pour l’Homme. La descendance sera ensuite exposée aux mêmes régimes jusqu'à l'âge adulte pour étudier les impacts sur le comportement et la sensibilité colique. Pour chaque sexe, les petits seront répartis en plusieurs groupes, comprenant un groupe non traité, des groupes exposés aux additifs, et un groupe exposé au chlorure d’aluminium, utilisé comme référence soluble de l’Al. Ce dernier groupe permettra de comparer les effets des additifs riches en Al à ceux d’une forme dissoute de l’élément, et ainsi de discriminer dans les effets observés la part liée à l’Al en tant que tel.
Bénéfices attendus
Ce projet chez la souris nous permettra d’approfondir nos connaissances sur l’impact d’une exposition orale chronique à deux additifs contenant de l’Al sur la barrière intestinale et ses conséquences sur le développement de maladies chroniques comme le syndrome de l’intestin irritable et les pathologies anxiodépressives. Les données obtenues dans ce projet réalisé à des doses d’exposition humaine permettront également d’aider les agences de sécurité alimentaire et les responsables des politiques publiques à formuler des recommandations sur les limites de teneur en Al des additifs alimentaires pour une utilisation sans danger pour la femme enceinte, le nouveau-né, l’enfant et l’adulte.
Procédures
Site 1/2 Des prélèvements de fèces sur les mères (sauf pendant la gestation et la lactation) et sur la descendance (après le sevrage) seront effectués une fois par semaine tout au long de l’expérience. Les souris seront isolées pendant 5 minutes dans des cages classiques sans sciure pour permettre de récolter les fèces. Les femelles gestantes seront mis en hébergement individuel du 15ème jour de gestation soit 6 jours jusqu’au sevrage des petits. Conformément au schéma go/no-go du projet, un minimum de 56 et un maximum de 168 femelles gestantes seront mis en hébergement individuel. Site 2/2 : Des prélèvements de fèces seront réalisés une fois par semaine tout au long de l’étude. Chaque animal sera soumis à deux tests comportementaux réalisés une seule fois chacun à 24 heures d’intervalle : le premier test nous renseignera sur la dépression (durée : 5 minutes) alors que le second (durée : 6 minutes) nous permettra d’explorer l’état d’anxiété des animaux. En amont de la mesure de sensibilité colique qui sera réalisée une seule fois par animal, une phase d’habituation progressive au dispositif de contention sera réalisée sur 5 jours. Pour cette mesure, il sera appliqué 4 paliers de 20 secondes, répétée toutes les 5 minutes, avec des pressions intra coliques croissantes de 20 à 80 mmHg, à l’aide d’un capteur inséré sous anesthésie gazeuse brève dans la partie distale de la lumière colique. La durée totale de la phase de distension est d’environ 20 minutes, durant lesquelles l’animal reste en contention, hors phase d’habituation initiale.
Impact sur les animaux
Sur le site 1 et 2, les animaux seront exposés aux additifs à des doses définies à partir de l’exposition humaine, susceptibles d’induire des modifications fonctionnelles sans apparition de signes cliniques évidents de mal‑être, correspondant à des nuisances légères. Les prélèvements de fèces induiront un stress léger lié à un hébergement individuel transitoire de quelques minutes. Sur le site 1 : L’hébergement individuel des femelles gestantes à partir du 15ème jour de gestation constitue une source de stress modéré compensé par un enrichissement renforcé et le maintien de contacts visuels et vocaux. Sur le site 2, le test du labyrinthe en croix surélevé induit un stress léger à modéré, de courte durée, lié à l’exposition à un environnement anxiogène. Le test de nage forcée constitue une procédure sévère, induisant un stress aigu important, une contrainte physique et une phase de résignation comportementale. La sensibilité colique provoque un inconfort modéré à sévère, limité aux phases de mesure. L’insertion du capteur induira un stress léger et transitoire lié à la manipulation et à l’anesthésie. Elle est associée à un dispositif de contention qui constitue une contrainte modérée liée à l’immobilisation partielle de la souris indispensable à la fiabilité de la mesure. Prises individuellement, les nuisances attendues seront transitoires et relevant d’un caractère léger à modéré pour la plupart, elles pourront pour certaines s’avérer aigues. L’accumulation de certaines d’entre elles relèvera donc d’un degré « sévère ».
Devenir
Les mâles reproducteurs, les mères ainsi que les descendants surnuméraires seront mis à mort pour prélèvement de tissus (biodistribution, organoïdes). A l'issue des procédures, tous les animaux seront mis à mort pour prélever leurs tissus pour des analyses permettant de répondre à la question scientifique.
Remplacement
Les impacts directs des additifs alimentaires sur l’épithélium intestinal, le microbiote et les cellules immunitaires peuvent être évalués par des approches in vitro ou ex-vivo à l’aide respectivement d’organoïdes intestinaux, de lignées cellulaires immunitaires ou de digesteurs artificiels. Ces approches sont actuellement mises en place pour ce projet, toutefois elles ne permettent pas aujourd'hui de reproduire la complexité des échanges entre la mère et le fœtus et le dialogue microbiote-intestin-cerveau, ni même d’évaluer les effets comportementaux et la sensibilité colique consécutive à une exposition orale tout au long de la vie.
Réduction
Nous avons recours à une stratégie de réduction fondée sur un calcul de puissance réalisé à partir de nos résultats antérieurs d’études similaires. Le calcul a été mené sur les critères les plus variables, à savoir la distension colorectale et les paramètres comportementaux. Cela conduit à un effectif de 10 animaux par sexe et par groupe dans la descendance pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs. Le dimensionnement de la génération parentale repose sur un taux de fécondité d’environ 65% observé dans nos études précédentes : l’utilisation de 7 femelles et 2 males pour viser 5 gestations pour chaque groupe expérimental représente un compromis qui permet d’atteindre en moyenne les 20 descendants par groupe sans générer d’excès d’animaux. Sur l’ensemble du projet, un minimum 232 animaux et au maximum 696 animaux seront nécessaires.
Raffinement
1/2 : Dans le cas où un animal présenterait des signes de souffrance, il sera retiré de l'étude et des soins adaptés pratiqués. Le cas échéant une euthanasie sera pratiquée par le responsable du projet sur les conseils du vétérinaire référent. Le transfert vers le site 2, sera fait par un transporteur spécialisé. Les animaux seront transportés dans un véhicule climatisé dans des cages agréées avec l’aliment des régimes expérimentaux et gel d’hydratation. Puis une période d’acclimatation de 14 jours sera réalisée sur le site d’accueil. 2/2 : Afin de réduire une éventuelle souffrance, nous utiliserons des grilles de score et l’application de points limites adaptés. les animaux seront manipulés de manières douces. La douleur sera abrégée sans délai via l’administration d’antalgique dérivé de la morphine, ou si un animal présente une trop forte douleur, un comportement stéréotypé ou anormal, une posture anormale ou une réduction de poids de 20% sur 3 jours, celui-ci sera euthanasié par le personnel de l’unité de stabulation animale. Les animaux seront habitués aux expérimentateurs et aux manipulations (Préhension, contention pour la sensibilité colique, eau thermostatée pour le test de comportement). Lors du test comportemental réalisé dans l’eau, celle-ci est maintenue à température contrôlée (23–25°C) afin de limiter le stress thermique, et les animaux sont séchés délicatement à l’aide de papier absorbant puis replacés dans une cage propre maintenue sur tapis chauffant afin de favoriser leur récupération et le retour à une température corporelle normale.
Choix des espèces
La souris est un modèle reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier le microbiote, l’intestin, le foie et le cerveau. Les souris mâles et femelles seront utilisées à l’âge adulte (8 semaines) afin qu'elles soient capables de procréer et les descendants seront utilisés au jeune âge (post sevrage) et à l’âge adulte. Cela permettra d’étudier les impacts d’une exposition périnatale suivie d’une exposition post-sevrage sur le développement des fonctions cérébrales, intestinales, ainsi que son maintien chez l’adulte.
Effets des interactions intra- et interspécifiques sur la tolérance thermique des poissons d’eau douce
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Chauffés jusqu'à la perte d'équilibre, 440 poissons d'eau douce capturés en nasses subissent une élévation rapide de la température pendant 80 minutes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois espèces seront retenues parmi le gardon, la perche soleil, la grémille, le goujon, le rotengle et le gobie à tache noire, maintenues jusqu'à 48 heures en bourriche et à jeun, la manipulation pouvant leur faire perdre mucus et écailles. Tous sont ensuite tués pour des mesures sur les tissus. Le porteur qualifie pourtant le test employé, le CTmax, de "mesure de tolérance thermique non létale".
Objectifs
Les effets des changements climatiques se manifestent de manière particulièrement prononcée dans les écosystèmes d’eau douce, où les vagues de chaleur augmentent en fréquence et en intensité. Les organismes ectothermes (e.g. poissons) y sont particulièrement vulnérables, dans la mesure où leur température corporelle dépend de celle de leur environnement. En conséquence, la tolérance des organismes aquatiques aux variations rapides de la température dans leur environnement constitue un facteur déterminant de leur résilience et de leur survie. Toutefois, comment un individu répond au stress thermique dépend des interactions biotiques (interactions intra- et interspécifiques) inhérentes à tout écosystème et qui persistent pendant un épisode de vague de chaleur. En ce sens, des données indiquent que les interactions entre espèces peuvent influencer des processus physiologiques tels que la croissance, la reproduction et le taux métabolique. Cependant, les recherches sur la manière dont ces interactions influencent la tolérance thermique individuelle sont limitées, puisque les études se sont jusqu’à présent focalisées principalement sur des individus isolés, sans tenir compte des interactions intra- et interspécifiques. L’objectif du présent projet de recherche est de mesurer l’impact des interactions intra- et interspécifiques sur la tolérance thermique chez les poissons. Plus précisément, notre objectif sera composé de deux volets expérimentaux : (1) Établir si les interactions intra- et interspécifiques augmentent ou réduisent la tolérance thermique maximale (volet 1) (2) Déterminer si les interactions intraspécifiques augmentent ou réduisent la tolérance thermique maximale, selon le sexe (mâle vs. femelle), en tenant compte de l’âge, de la taille et de la charge parasitaire comme covariables. (volet 2). Afin de répondre à nos objectifs de recherche, nous mesurons la tolérance thermique maximale via le test CTmax ; une mesure de tolérance thermique non létale couramment utilisée chez les poissons. La mesure de CTmax permet d’estimer rapidement la température maximale au-delà de laquelle les performances physiologiques d’un organisme ne sont plus soutenues. Pour chaque objectif nous quantifierons la charge parasitaire de chaque individu car cette interaction biotique peut avoir un effet sur la tolérance thermique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'acquérir des connaissances fondamentales sur les limites thermiques des poissons, un aspect essentiel pour comprendre comment les organismes répondent au stress thermique dans leur environnement. Pour chaque espèce, il est possible de déterminer une température de tolérance maximale (CTmax), à partir de laquelle les performances de l'individu chutent fortement et comment la tolérance varie en fonction des facteurs biotiques (présence de congénères ou d’individu d’autres espèces). Dans un contexte de réchauffement climatique, la valeur de CTmax est particulièrement importante, puisqu’elle indique la température maximale que l'organisme peut supporter et donc prédire la résilience des populations face aux changements climatiques. Ce projet est novateur sur deux aspects, puisqu’il utilise des organismes issus de milieux naturels et réplique les interactions biotiques présentes dans l’écosystème, alors que la plupart des études sur la tolérance thermique maximale utilisent des organismes élevés en laboratoire et ne considèrent pas ces interactions.
Procédures
Pendant l’expérience de tolérance thermique, les individus subiront une augmentation rapide de la température jusqu’à perte d’équilibre : 1 seule fois pendant 80 minutes
Impact sur les animaux
La mise en place du protocole expérimental décrit ci-dessus peut amener les nuisances ou effets indésirables suivants sur les animaux : (1) Stress lié à la capture en nasses (2) Stress lié au maintien temporaire en bourriche et au jeûne (maximum 48h). (3) Stress lié à la manipulation qui peut entrainer une perte de mucus ou d’écailles. (4) Stress lié à l’augmentation rapide de la température pendant le protocole de CTmax
Devenir
Tous les poissons utilisés seront mis à mort pour effectuer des mesures sur tissus.
Remplacement
Le but de notre étude est de comprendre comment la dynamique entre espèces et au sein d’une même espèce affecte la tolérance thermique de l’individu. Cela apportera des informations sur la dynamique de l’écosystème auquel ces espèces appartiennent, susceptible de changer en réponse aux changements climatiques. Le modèle animal demeure indispensable puisque nous examinons les interactions biotiques et la manière dont la réponse comportementale à une vague de chaleur est affectée par celles-ci. En conséquence, le remplacement est impossible ici, puisqu'il s’agit d'analyser la réponse intégrale de l'organisme face à une vague de chaleur à l'aide de mesures comportementales. Nous privilégions l'utilisation des poissons, qui sont souvent les principaux prédateurs poïkilothermes dans les écosystèmes aquatiques et jouent un rôle fonctionnel clé.
Réduction
Afin de répondre au principe de réduction, le nombre d’individus a été calculé pour fournir un pouvoir statistique suffisant pour évaluer les variations de la tolérance thermique maximale entre les trois groupes expérimentaux. Sur la base de publications récentes, nous estimons le CTmax du gobie à tache noire (Neogobius melanostomus) autour de 35 °C, celle de la perche soleil (Lepomis gibbosus) à environ 34 °C, ainsi qu’à 30 °C chez la grémille (Gymnocephalus cernua), 32 °C chez le goujon (Gobio gobio) et 36 °C chez le rotengle (Scardinius erythrophthalmus).
Raffinement
Pour la stabulation, les poissons seront placés dans des bourriches immergées dans la rivière afin de maintenir les poissons en milieu semi-naturel avant le début du protocole expérimental CTmax. Entre le moment de la capture et le début du protocole expérimental (CTmax), un délai maximal de 48 h sera observé afin de limiter le temps passé en dehors de leur milieu naturel. Lors de la stabulation dans les bourriches, la densité sera limitée à un maximum de 12 individus pour permettre le maintien des interactions intra- et interspécifiques tout en évitant les interactions antagonistes. Les bourriches seront enrichies de rochers et de végétation pour refléter les conditions naturelles, tout en favorisant des zones de repli afin de réduire le stress. Pour les trois aquariums expérimentaux, nous utiliserons des aquariums non enrichis pour observer la perte des fonctions locomotrices, qui se traduit par un retournement indiquant que la limite de tolérance thermique maximale de l’individu est atteinte. Le protocole expérimental sera réalisé dans des glacières dont le fond et les quatre côtés seront opaques afin de limiter les stimulations visuelles liées à la présence humaine. La présence des manipulateurs sera limitée grâce à un système de surveillance vidéo à distance. Tous les aquariums seront équipés d’un bulleur afin de maintenir une concentration en oxygène dissous proche de 100 %. L’eau utilisée proviendra de la rivière. La température, le pH et l’oxygène dissous seront mesurés par sonde durant le test. Pour chaque test, les individus seront sous la surveillance d’un binôme formé et expérimenté en manipulation animal. Des limites établies pour assurer le bien-être animal permettront une intervention rapide en cas de signes indiquant que l’individu est en souffrance. Un arbre décisionnel guide les actions à entreprendre en fonction de l’état clinique observé. Si l’état des individus se dégrade, des critères d’arrêt peuvent entraîner la fin anticipée de l’expérience, conformément à la réglementation en vigueur. L’augmentation de la température sera planifiée de manière différenciée entre les trois set-up expérimentaux, de sorte que les individus d’une unité n’atteignent jamais simultanément leurs limites thermiques avec ceux d’un autre mésocosme, garantissant ainsi une prise en charge rapide et individualisée.
Choix des espèces
Afin de remplir l’objectif du volet 1, nous sélectionnerons parmi la liste d’espèces suivante, les trois espèces qui seront trouvées en abondance et dont la niche écologique est similaire : gardon (Rutilus rutilus) ; perche soleil (Lepomis gibbosus) ; grémille (Gymnocephalus cernua) ; goujon (Gobio gobio) ; rotengle (Scardinius erythrophthalmus) ; gobie à tache noire (Neogobius melanostomus) Les trois espèces seront choisies pour leurs caractéristiques écologiques communes et leur pertinence pour l’étude des réponses aux stress thermiques. Les trois espèces d’écrevisses sont des espèces exotiques à fort impact écologique. Il est donc particulièrement pertinent d’étudier leur limite thermique. Pour le volet 2, nous avons choisi le gobie à tache noire, une espèce exotique envahissante à fort impact écologique, dont l’étude de la tolérance thermique permet de mieux comprendre son potentiel de persistance et d’expansion dans un contexte de réchauffement climatique.