Recherche fondamentale

2 464 souris sont utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie de 15 à 20 minutes applique du chlorure de fer ou d'aluminium sur l'artère cérébrale moyenne pour provoquer un accident vasculaire cérébral, suivie de la pose d'un cathéter dans la veine caudale et de cinq passages en IRM 7T sous anesthésie jusqu'à J14, avant une laparo-thoracotomie donnant accès au cœur pour une ponction cardiaque. Le porteur annonce une "batterie de test comportementaux indolores" répétée à huit reprises, trois tests par animal, sans préciser lesquels. Les molécules viennent de partenaires industriels et passeront en essais cliniques en cas de résultats encourageants, "avec pour objectif la mise sur le marché dans les années à venir", quand l'occlusion artérielle et la ponction cardiaque terminale sont programmées pour l'ensemble des souris.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologie neurologique causée par la formation d’un caillot (thrombus) entraînant l’occlusion partielle ou totale d’une artère cérébrale. Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA ainsi que de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (

Bénéfices attendus

Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi riches en fibrine, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA et de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (

Procédures

Les 2464 animaux de cette demande d’autorisation de projet seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête pour appliquer une solution de chlorure de fer ou de chlorure d'aluminium au niveau de l’artère cérébrale moyenne (ACM) pour aboutir à l’occlusion de l’ACM. Cet acte chirurgical, se déroulant à J0, durera 15 à 20 minutes et l’animal restera endormi environ 1 heure. La pose d’un cathéter dans la veine caudale sera nécessaire pour tous les animaux afin d’administrer un ou plusieurs traitements en intraveineux ainsi que les agents de contraste nécessaires à la réalisation de séquences IRM s’intéressant à la neuroinflammation et l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique. La pose de cathéter prendra environ 5 minutes. À J0, J1, J2, J5 et J14, les animaux seront soumis à l'IRM-7T sous anesthésie générale, pour une durée variant de 15 à 45 minutes en fonction des séquences réalisées. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière à ce que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Les animaux passeront également une batterie de test comportementaux indolores visant à tester les déficits et la récupération sensorimotrice au cours du temps, jusque 7 jours avant l’induction de l’AVC pour déterminer l’activité basale, puis à J1, J2, J3, J5, J7, J14 et J21. Chaque animal passera moins de 10 minutes pour chacun des trois tests. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière à ce que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au cœur et faciliter le prélèvement sanguin par ponction cardiaque. Viendra ensuite soit une perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant son prélèvement soit un prélèvement du cerveau frais. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC ischémique, à savoir des déficits sensorimoteurs induits par les lésions cérébrales au niveau du cortex somatosensoriel et prémoteur. Les déficits fonctionnels sont considérés comme léger à court et moyen terme dans ce modèle d’AVC, mais peuvent occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion chez l’animal. A long-terme, les déficits fonctionnels ne sont plus que légèrement perceptibles. Aucun test comportemental n’est voué à induire volontairement un stress ou une angoisse chez les souris. Les expérimentateurs sont formés et habitués à ce genre d’évaluations fonctionnelles, et prendront toutes les dispositions nécessaires à la bonne réalisation de celles-ci (limitation du bruit et des vibrations, manipulation des animaux avec soin, vérification des points limites, etc..). Tout au long de l’étude l’animal peut aisément continuer à s’alimenter, s’abreuver et se fabriquer un nid avec les enrichissements mis à disposition dans la cage.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Ce projet correspond aux étapes des tests d’innocuité et d’efficacité de thérapeutiques in vivo faisant suite aux expérimentations et validations réalisées in vitro par les partenaires industriels. Actuellement, il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant d’obtenir le même niveau d’information obtenue avec l’expérimentation animale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature et au sein de notre laboratoire font de la souris le modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, mus musculus est l’une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ischémique, permettant une analyse comparative et critique des résultats obtenus.

Réduction

Les données extraites de la littérature scientifique préclinique, combinées à une étude de détermination de la puissance statistique régulièrement mise à jour avec nos données permettent de définir un nombre minimal d’animaux de 18 par groupes dans nos conditions protocolaires. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Afin d’anticiper les exclusions d’animaux dues à des erreurs techniques ou à de la mortalité, l’augmentation de l’effectif de 22 par groupes expérimentaux est obligatoire pour atteindre un effectif final satisfaisant de 18 animaux par groupe. Maintenir cette marge de sécurité contribue à assurer la validité scientifique de notre projet tout en respectant les normes éthiques et les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche. Ainsi, en optimisant le nombre d'animaux utilisés, nous parvenons à concilier l'efficacité de notre projet avec sa valeur scientifique, conformément aux principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous les bruits extérieurs. Au sein de chaque cage, les animaux auront toujours accès à divers types d’enrichissements : kraft, dôme en carton + brique aspen ainsi qu’accès ad libitum à la nourriture et à l’eau pendant toute la durée de stabulation. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Durant toute la durée de l’étude, les animaux seront également régulièrement pesés (2 fois par semaine au minimum). Ils seront systématiquement pesés le jour de la chirurgie et le lendemain.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) occupe une place prépondérante dans la recherche sur les maladies neurodégénératives, particulièrement dans le développement de stratégies thérapeutiques. Cette prééminence découle de divers facteurs comme les homologies vasculaires et génétiques entre l’Homme et la souris, la facilité de manipulation génétique, le coût relativement bas, et la logistique aisée associée à l'élevage et la stabulation de ces rongeurs. Ces caractéristiques (entre autres) font de la souris un modèle animal privilégié pour la recherche préclinique. Dans le contexte spécifique de l'AVC ischémique, l'utilisation de la souris devient incontournable car elle offre la possibilité d'une analyse comparative et critique des résultats avec ceux obtenus dans notre laboratoire et ailleurs, renforçant ainsi la fiabilité des conclusions et leur applicabilité potentielle chez l'Homme. Les animaux utilisés seront âgés d’environ 10 semaines le jour de l’induction de l’AVC pour un poids moyen de 45g. Nous effectuerons notre modèle sur des jeunes adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec celles déjà disponibles dans notre laboratoire et dans la littérature scientifique du domaine.

528 souris subissent l'implantation de cellules tumorales dans le cerveau sous anesthésie générale, 456 reçoivent trois séances d'irradiation de 4 Gy sur trois jours consécutifs, et 120 une injection intracardiaque pour provoquer des métastases cérébrales. 648 souris en tout sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur attend chez les souris porteuses de glioblastome une perte de poids, de motricité et de sensibilité, qu'il annonce limitée à 24 heures par le respect des points limites. L'injection intracardiaque, elle, apparaît dans la liste des procédures sans durée ni mention d'anesthésie, et les séances d'IRM sans nombre ni durée.

Objectifs

Ce projet a pour but d’évaluer les effets de vésicules extracellulaires (EV) sur les tumeurs cérébrales hypoxiques, décrites dans la littérature comme résistantes aux traitements actuels et notamment à la radiothérapie. Devant le manque d’efficacité des thérapies standards, ce projet se justifie par le besoin d’améliorer, par des approches innovantes, l’efficacité des thérapies actuelles. L’objectif dans la première procédure est de déterminer, dans un modèle de glioblastome murin, le mode d’administration le plus pertinent et la dose d’EV les plus efficaces. Puis dans les procédures suivantes, d’analyser l’efficacité des EV dans 3 autres modèles animaux de glioblastome murin ou humain ou métastatique, présentant des spécificités différentes.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu à court terme est une amélioration des stratégies thérapeutiques conventionnelles du glioblastome en utilisant des EV qui ont montré, par des études précédentes dans d’autres pathologies, leur capacité à améliorer les thérapies actuelles. A long terme, le bénéfice attendu est l’administration de ces EV lors des stratégies thérapeutiques conventionnelles chez l’Homme.

Procédures

Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : -Chirurgie (implantation cérébrale de cellules tumorales sous anesthésie générale) : 30 minutes maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal, 528 animaux sont concernés. -Injection intracardiaque pour les 120 animaux des procédures concernées par les métastases cérébrales. -Irradiation (sous anesthésie générale) : 3 séances de 4 Gy sur 3 jours consécutifs : 10 minutes maximum par animal, 456 animaux sont concernés. -Injection d’analgésique (animal vigile) : 1 fois avant la chirurgie et 1 fois avant la mise à mort pour tous les animaux ; 2 minutes maximum par animal, tous les animaux sont concernés. -Imagerie IRM pour suivi de croissance tumorale

Impact sur les animaux

Les séances fractionnées de radiothérapie n’induisent pas en elles-mêmes de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal. Les séances d’imagerie (IRM) n’induisent pas en elles-mêmes de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal. Le degré de sévérité de ces interventions est donc léger. La procédure chirurgicale pour l’établissement du modèle de tumeurs cérébrales et la procédure d’injection du traitement peuvent induire des douleurs. Ces nuisances sont atténuées par l’utilisation d’un agent anesthésique et l’administration d’analgésiques et leur durée est de quelques minutes. Ces interventions sont donc de sévérités modérées. Nous nous attendons à avoir une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux qui auront un développement de GBM ; ces effets indésirables surviennent en fin de protocole et grâce au respect des points limites, leur durée est de maximum 24h . A ce titre la procédure dans son ensemble de suivi d'efficacité thérapeutique a été classée modérée.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort dans le but de récupérer des organes pour analyses post-mortem.

Remplacement

Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, c'est-à-dire qu’au-delà du simple compartiment de la cellule tumorale existent la vascularisation, l’hypoxie et l’inflammation qui influent fortement sur la croissance tumorale. L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et aux réponses aux différents traitements. Ce projet intervient après plusieurs étapes de validation in vitro ayant permis de retenir les meilleures EV (taille, aspect de toxicité,) mais ne peut pas s’effectuer intégralement sur des modèles de remplacement in vitro ou in silico.

Réduction

L’utilisation des méthodes d’imagerie non invasive se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité de mettre à mort plusieurs animaux à chacun des temps. Chaque animal est dans ce cas son propre contrôle et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. De plus, nous avons réalisé des simulations statistiques à l’aide des données précédemment acquises au sein de l’équipe. Ces simulations ont été réalisées à l’aide de l’outil BiostaTGV disponible sur le site internet https://biostatgv.sentiweb.fr/?module=etudes/sujets#. Ces simulations ont permis de mettre en évidence qu’il faudrait un maximum de 12 animaux par groupe afin d’obtenir une différence significative . Ce nombre d’animaux pourra être revu à la baisse durant l’étude après une analyse statistique séquentielle.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux (5 souris par cage) dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation et également d’enrichissements des cages. Les animaux seront surveillés de leur arrivée à la fin du protocole par un personnel compétent afin de déterminer leur état (poids, apparence physique, respiration) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée 2 à 3 fois par semaine. Les animaux disposeront de croquettes humidifiées dans le fond de la cage ainsi que de complément alimentaire afin de limiter la perte de poids due aux procédures expérimentales. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents.

Choix des espèces

Afin d’étudier l’effet des traitements sur les cellules tumorales au sein même de leur microenvironnement, il est nécessaire d’utiliser des modèles murins, les modèles in vitro ne répliquant pas toutes les composantes étudiées (hypoxie, inflammatoire et vasculaire). Les modèles animaux de tumeurs sont nécessaires afin d’évaluer l’effet du traitement sur la croissance tumorale tout en prenant en compte toutes les composantes du microenvironnement tumoral. Nous utiliserons donc des souris immunocompétentes car ces souris présentent la composante inflammatoire. Les modèles de tumeur cérébrale murin utilisés repose sur l’implantation de cellules de gliome issues de ces souris immunocompétentes. De plus, l’efficacité du traitement sera évaluée sur des modèles de tumeurs cérébrales humaines et métastases qui seront alors implantés chez des souris immunodéficientes permettant ainsi le développement de la tumeur d’origine humaine. Ce projet consiste en une évaluation de l’effet d’un traitement sur un modèle animal de glioblastome. Le choix de la souris est alors idéal pour obtenir des résultats fiables et reproductibles, permettant de réduire à un minimum le nombre d’animaux utilisés. De plus, ces modèles sont déjà maîtrisés dans notre laboratoire.

Jusqu'à dix séances de tests comportementaux, que le porteur qualifie de non invasifs, évaluent la sociabilité, l'anxiété et la mémoire de souris vigiles. 4 080 souris sont utilisées sur cinq ans dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, avec jusqu'à 18 administrations de composés, une chirurgie intracérébrale de 45 minutes au plus pour certaines, et des prises de sang. Ces mêmes tests sont ensuite décrits comme une source de stress modéré, liée à "la douleur ressentie au niveau des pattes lors des stimulations nociceptives désagréables". Toutes sont mises à mort pour prélever le cerveau, y compris celles retirées de l'étude après trois jours de douleur manifeste, qui pourront servir à des mises au point de protocoles d'analyse.

Objectifs

Notre cerveau contient des cellules appelées microglies. On peut les comparer à des « gardiennes » du cerveau : elles aident les neurones (les cellules qui transmettent les informations dans le cerveau) à bien se connecter entre eux pendant la croissance, et elles interviennent aussi quand le cerveau doit se défendre, par exemple en cas d'inflammation. Ce projet a pour but de mieux comprendre comment ces cellules fonctionnent, et quel rôle elles jouent dans le comportement. Des recherches, chez l'animal et chez l'humain, montrent que lorsque les microglies fonctionnent mal, cela pourrait favoriser l'apparition de certains troubles, comme la dépression, l'anxiété, ou l'autisme. Ces cellules semblent aussi jouer un rôle dans la mémoire et dans des maladies comme Alzheimer, ainsi que dans d'autres maladies du cerveau comme la sclérose en plaques. Il est donc important de comprendre comment ces cellules sont contrôlées, et quels sont les éléments, dans leur fonctionnement interne, qui influencent la façon dont le cerveau se construit et s'adapte. Ce projet comporte deux parties. La première partie cherche à comprendre comment la sérotonine, une substance produite par le cerveau qui sert à transmettre des messages entre les cellules, agit sur les microglies pendant les premières semaines de vie, et quelles conséquences cela peut avoir plus tard, à l'âge adulte. Nous regarderons l'effet sur le comportement habituel (par exemple la sociabilité, l'anxiété, la mémoire) et sur la réponse du cerveau face à une inflammation. Pour cela, nous utiliserons des médicaments qui agissent sur la sérotonine, comme certains antidépresseurs bien connus. La seconde partie cherche à comprendre le rôle de certains éléments internes aux microglies, déjà repérés lors d'études précédentes. Pour cela, nous modifierons leur fonctionnement uniquement dans ces cellules, chez des souris, puis nous observerons les conséquences, à la fois sur les microglies elles-mêmes et sur le comportement, en conditions normales et lors d'une inflammation. Ces expériences seront réalisées chez des animaux jeunes et chez des animaux adultes, afin de voir si les effets sont différents selon l'âge. Ce projet vise donc à mieux comprendre comment les microglies et la sérotonine agissent ensemble pour le bon fonctionnement du cerveau, afin, à terme, de mieux comprendre l'origine de certaines maladies psychiatriques humaines.

Bénéfices attendus

La microglie est un acteur essentiel du développement et du fonctionnement du système nerveux central, notamment par son implication dans la mise en place, la maturation et la plasticité des circuits neuronaux. Des altérations précoces de ses fonctions peuvent entraîner des perturbations durables de l’organisation de ces circuits, susceptibles de contribuer à l’apparition de troubles du neurodéveloppement. Par ailleurs, plusieurs gènes associés à des pathologies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer, sont majoritairement exprimés dans la microglie et interviennent également au cours du développement cérébral, suggérant l’existence de liens entre altérations précoces et vulnérabilité ultérieure. Le présent projet a pour objectif de caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la régulation de la microglie, en particulier en lien avec la signalisation sérotoninergique. Les données obtenues permettront de préciser le rôle de cette interaction dans la formation et le fonctionnement des circuits neuronaux, ainsi que dans la réponse à des stimuli inflammatoires. À court terme, ce projet contribuera à l’acquisition de connaissances fondamentales sur les déterminants moléculaires et fonctionnels de l’activité microgliale au cours du développement et à l’âge adulte. À plus long terme, ces résultats pourraient favoriser l’identification de nouvelles cibles d’intérêt pour la compréhension, la prévention et la prise en charge de pathologies neurodéveloppementales, psychiatriques et neurodégénératives. Enfin, le développement et l’utilisation d’approches innovantes, telles que les nanoparticules lipidiques pour la modulation ciblée de l’expression génique dans la microglie, pourraient à terme permettre de limiter le recours à des modèles génétiques complexes, contribuant ainsi à une réduction du nombre d’animaux utilisés en expérimentation.

Procédures

Les animaux pourront recevoir des administrations de composés pharmaceutiques par différentes voies (injection ou administration orale), de manière ponctuelle ou répétée selon les groupes expérimentaux. Une injection par jour est réalisée sur des animaux vigiles. Le protocole peut comporter jusqu’à 18 administrations successives réparties sur plusieurs semaines. Chaque injection ne dure que quelques secondes. Certains animaux participeront à des tests comportementaux non invasifs (10 au maximum) permettant d’évaluer leur sociabilité, leur anxiété, leur mémoire. Ces évaluations sont réalisées sur des animaux vigiles et chaque séance dure environ 15 minutes. Certains animaux subiront une intervention chirurgicale afin d’administrer un composé dans une région précise du cerveau. Cette intervention, réalisée sous anesthésie générale et analgésie-anesthésie locale de la zone concernée par la chirurgie, dure au maximum 45 minutes. Une prise de sang pourra également être réalisée chez certains animaux, soit vigiles lorsqu’il s’agit d’étudier la réaction à un stimulus inflammatoire, soit anesthésiés profondément quand le prélèvement est réalisé en fin d’étude. Les prélèvements durent moins d’une minute. À l’issue des procédures expérimentales, des euthanasies par une méthode réglementaire effectuée sous anesthésie générale profonde et analgésie seront réalisées afin de permettre les analyses scientifiques nécessaires à l’étude.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont : lors des injections, une douleur de courte durée ; lors de l’administration du composé pharmacologique par voie orale, un stress lié à la contention de l’animal et un risque mineur de fausse route ; lors des prélèvements de sang, un risque d’hémorragie si l’animal a un problème de coagulation ; lors des anesthésie générales et analgésies, un risque de détresse respiratoire du fait de l’injection des anesthésiants et analgésiques ; pendant et après la chirurgie, un risque de douleur liée à l’acte d’incision et d’injection. Par ailleurs, les tâches comportementales génèrent un stress modéré, du fait d’un nouvel environnement et de la douleur ressentie au niveau des pattes lors des stimulations nociceptives désagréables).

Devenir

À l'issue des différentes étapes du projet, l'ensemble des animaux utilisés sera euthanasié. Cette étape est nécessaire pour permettre les analyses qui constituent le cœur de notre étude. En effet, pour comprendre comment la sérotonine agit sur la microglie, ou comment certains gènes influencent le fonctionnement de ces cellules, il est indispensable d'examiner directement le cerveau des animaux. Ces analyses portent notamment sur l'observation des cellules microgliales elles-mêmes (leur nombre, leur forme, leur état d'activation), sur l'expression de gènes spécifiques dans le tissu cérébral, ou encore sur la structure des connexions entre neurones. Ce type d'examen nécessite de prélever le cerveau, ce qui implique l'euthanasie préalable de l'animal. Il n'existe à ce jour aucune méthode alternative permettant d'obtenir ces informations chez l'animal vivant : les techniques d'imagerie actuelles ne permettent pas d'observer les microglies avec la précision cellulaire et moléculaire requise pour ce projet. Le prélèvement du tissu cérébral post-mortem reste donc l'unique moyen d'accéder à ces données. Par ailleurs, les animaux étant étudiés à différents âges (de la période néonatale à l'âge adulte) afin de distinguer les effets sur le développement du cerveau de ceux observés chez l'animal mature, chaque groupe d'animaux ne peut être analysé qu'à un stade donné : un même animal ne peut donc pas servir de son propre témoin à plusieurs âges, ce qui justifie également le nombre d'animaux prévus dans le projet. L'euthanasie sera pratiquée selon des méthodes conformes à la réglementation en vigueur, choisies pour limiter au maximum toute douleur ou détresse chez l'animal.

Remplacement

Ce projet vise à étudier les modifications des cellules microgliales induites par un apprentissage, une mémorisation (de l’association contexte ou stimulation). En préparation et en parallèle de ce projet sur l’animal éveillé, nous faisons des expériences sur des cultures primaires de cellules, pour des mises au point ou pour tester des hypothèses. Cependant, l’apprentissage et la mémorisation, de l’association contexte ou stimulation (et donc « peur »), comme le test pour déterminer le niveau de mémorisation de cette association, reposent sur le comportement de l’animal, qui doit être éveillé et pouvoir bouger ou rester immobile, et se servir de ses sens (vue, toucher…). Au niveau cérébral, il s’agit d’un phénomène complexe faisant intervenir plusieurs types de cellules, dont neurones et microglie, dont on ne peut modéliser fidèlement les interactions ni in vitro ni in silico. Le travail sur l’animal éveillé est donc indispensable pour comprendre comment la microglie participe aux processus mnésiques. De plus, il est nécessaire d'utiliser un modèle animal mammifère afin d’obtenir des résultats transposables à l'Homme car les structures cérébrales impliquées et étudiées (ex : l’hippocampe) ne sont pas présentes chez les invertébrés. La souris représente un modèle de choix car le fonctionnement du cerveau et les tests comportementaux que nous allons utiliser sont bien caractérisés. L’autre avantage du modèle souris est qu’il existe des lignées transgéniques permettent de modifier les cellules microgliales pour étudier leur rôle, en invalidant ou en exprimant des gènes spécifiquement dans ces cellules.

Réduction

Afin de déterminer le nombre minimal d’animaux pour obtenir des résultats significatifs et reproductibles, une analyse statistique utilisant des tests de puissance a été effectuée. D’une manière générale, nous estimons qu’avec notre type d’expériences où nous comparons différents génotypes, il faut au moins 12 animaux de chaque sexe (soit 24 animaux) par condition expérimentale et/ou génotype pour avoir une puissance statistique correcte. De plus, nous devons prévoir des animaux pour ajuster les protocoles, car même si les expériences ont déjà été réalisées au laboratoire précédemment, il est important de refaire des expériences test pour que les nouveaux expérimentateurs amenés à faire l’expérience se familiarisent avec les différentes étapes. Cela permet que les expériences avec les animaux d’intérêt se déroulent bien et soient fiables, donc au total cela limite les répétitions et le nombre d’animaux utilisés. En tout nous estimons l’utilisation de 4080 animaux sur 5 ans.

Raffinement

Conditions d’hébergement : Les animaux sont hébergés en groupes sociaux de 5 individus maximum et ils disposent dans chaque cage d’un à deux enrichissements de nidification. Procédures : Les expérimentateurs sont sensibilisés à l’importance du bien-être animal, à la fois pour les animaux et pour la qualité des résultats. Les manipulations des animaux sont donc réalisées en limitant au maximum (durée et intensité) la douleur et ou le stress. Avant chaque geste, l’état général de l’animal est vérifié afin de s’assurer qu’il est compatible avec la poursuite de l’expérimentation (cf points limites ci-dessous). Les administrations et prélèvements sont effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. En ce qui concerne la chirurgie sans réveil, afin de réduire les nuisances, les animaux seront injectés avec l’anesthétique et l’analgésique dans une pièce séparée, et apportés dans la salle juste pour la chirurgie, après avoir vérifié leur état de sédation par pincement de la patte. Points limites : Le bien-être des animaux sera surveillé régulièrement conformément aux règlementations, et de manière particulièrement rapprochée après les administrations, les tests comportementaux, et les prélèvements de sang. Des critères d'arrêt sont définis si une souffrance ne peut pas être soulagée. La détection d’une possible souffrance est basée sur un suivi quotidien (posture, aspect du pelage, poids corporel, avant et après intervention), de sorte à administrer un traitement adapté si besoin (nourriture plus appétante, enrichissement, injection de solution saline et ou glucosée), et à sortir un animal de l’étude en cas d’atteinte des points limites. Notamment, en cas de douleur manifeste (dégradation de l’état du pelage, manque d’intérêt pour la nourriture, posture anormale), ou blessure, persistant 3 jours, les animaux seront euthanasiés par une chirurgie sans réveil. Ils ne seront alors pas forcément utilisés pour l’étude en elle-même mais pourront être utilisés pour des mises au point expérimentales (optimisation des protocoles d’analyse des cerveaux).

Choix des espèces

La souris a été choisie comme modèle pour ce projet en raison des grandes similarités entre son cerveau et celui de l'humain, notamment dans le fonctionnement de la microglie et du système sérotoninergique. Les mécanismes que nous cherchons à comprendre – comment ces cellules et cette molécule influencent le développement du cerveau et le comportement – sont largement conservés entre la souris et l'humain, ce qui rend cette espèce particulièrement pertinente pour notre étude. Un autre atout majeur de la souris est la possibilité de modifier précisément son patrimoine génétique. Grâce à des techniques bien établies chez cette espèce, il est possible d'agir sur un gène donné uniquement dans certaines cellules – ici, la microglie – et à un moment précis du développement. Cette précision est essentielle pour notre projet : elle nous permet d'étudier le rôle d'un gène spécifiquement dans le cerveau, sans perturber son fonctionnement dans le reste de l'organisme, ce qui limiterait les effets indésirables et compliquerait l'interprétation des résultats. Aucun autre modèle expérimental ne permet aujourd'hui d'étudier le cerveau avec un tel niveau de précision. Les interventions seront réalisées à différents âges, depuis les premières semaines de vie jusqu'à l'âge adulte. Ce choix est directement lié à notre objectif scientifique : la microglie et la sérotonine jouent des rôles différents selon le stade de développement du cerveau, et seule une comparaison entre plusieurs âges permet de distinguer les effets propres à la maturation cérébrale de ceux observés chez l'animal adulte déjà formé. Enfin, la souris est une espèce dont les besoins physiologiques et comportementaux sont bien connus, ce qui permet d'adapter au mieux les conditions d'élevage et d'expérimentation afin de limiter autant que possible toute douleur, souffrance ou inconfort durant les procédures.

Percées à l'oreille pour identification, pesées seize fois en seize semaines, 360 souris mâles sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, dont 270 rendues obèses par une alimentation riche en graisses et en sucres. Viennent jusqu'à 80 injections sous-cutanées ou 80 gavages par animal, deux passages de moins de deux minutes dans un tube d'analyse corporelle, six périodes de jeûne de six heures, des injections de glucose puis d'insuline, et six incisions au bout de la queue pour prélever le sang, aucun test comportemental n'étant prévu au-delà d'un contrôle de l'état général et du comportement trois fois par semaine. Les molécules évaluées viennent de l'industrie et trois d'entre elles sont déjà en phase avancée d'essai clinique chez des patients, le porteur justifiant le passage par la souris par l'impossibilité de pratiquer des biopsies hépatiques chez l'être humain. Toutes reçoivent en fin de protocole un analgésique puis un anesthésique, le temps d'un prélèvement de sang au niveau du foie, avant d'être mises à mort pour la collecte des tissus.

Objectifs

Le diabète de type 2 et la stéatose hépatique d’origine métabolique (appelée aussi « foie gras ») sont des maladies très fréquentes qui représentent aujourd’hui un enjeu majeur de santé publique. Ces deux maladies sont souvent associées : de nombreux patients atteints de diabète présentent également une accumulation excessive de graisse dans le foie. Même si plusieurs traitements existent déjà, ils ne permettent pas toujours de contrôler efficacement la maladie et peuvent parfois provoquer des effets indésirables. Il est donc important de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Le modèle de souris rendues obèses par une alimentation riche en graisses et en sucres reproduit les principales caractéristiques observées chez les patients atteints de diabète de type 2 et de stéatose hépatique. Dans ce projet, l’efficacité de plusieurs molécules prometteuses sera évaluée. Trois d’entre elles sont actuellement en phase avancée d’évaluation clinique en mode curatif chez l’Homme pour le diabète de type 2 et/ou le foie gras et seront comparées à un traitement déjà utilisé en pratique médicale. Deux autres molécules d’origine végétale, identifiées lors de nos travaux de recherche, seront également étudiées. L’objectif est de déterminer si ces traitements améliorent les troubles métaboliques associés à ces maladies et de mieux comprendre leurs mécanismes d’action au niveau hépatique (biopsie hépatique trop invasive chez l’homme). Les traitements seront administrés selon deux approches : soit dès le début de l’alimentation riche en graisses et en sucres afin d’évaluer leur capacité à prévenir l’apparition de la maladie, soit après l’installation de la maladie afin d’évaluer leur capacité à la traiter. Cette stratégie permettra d’étudier leur intérêt à la fois en prévention et en traitement, ce qui n’est pas le cas des études cliniques en cours qui sont réalisées chez des patients déjà malades.

Bénéfices attendus

À court terme, ces études permettront de mieux comprendre comment agissent de nouveaux traitements prometteurs contre le diabète de type 2 et la stéatose hépatique. Elles aideront notamment à déterminer si leurs effets bénéfiques sont associés à une amélioration de certaines molécules circulant dans l’organisme ainsi qu’à une restauration du bon fonctionnement des cellules du foie. À plus long terme, ces travaux contribueront à l’évaluation de ces candidats médicaments avant leur utilisation chez l’Homme. Les connaissances acquises pourront soutenir leur développement clinique et participer à l’identification de nouvelles options thérapeutiques pour les patients atteints de ces maladies.

Procédures

Les 360 animaux subiront un perçage de l’oreille pour leur identification (- de 30 sec avec contention) et seront pesés 1X/semaine pendant 16 semaines, soit 16 pesées/animal (- de 30 sec chacune). Parmi eux, 270 animaux recevront pendant 16 semaines une alimentation riche en graisses et en sucres induisant une prise de poids progressive. Concernant les traitements, 75 animaux recevront une injection sous la peau quotidienne (hors week-ends) pendant 16 semaines, soit 80 injections/animal, et 75 autres pendant 6 semaines, soit 30 injections/animal. Chaque injection durera moins de 30 secondes, contention comprise. Par ailleurs, 105 animaux recevront un gavage dans l’estomac quotidien (hors week-ends) pendant 16 semaines, soit 80 administrations/animal, et 105 autres pendant 6 semaines, soit 30 administrations/animal. Chaque gavage durera moins de 30 secondes, contention comprise. Les 360 animaux bénéficieront de deux mesures de composition corporelle, espacées de 13 semaines. Pour chaque mesure, ils seront placés moins de 2 minutes dans un tube cylindrique permettant leur introduction dans l’appareil d’analyse. Les 360 animaux subiront six périodes de jeûne (de 7 h à 13 h), espacées d’au moins une semaine. Ils recevront ensuite une injection dans le ventre de glucose pour évaluer la tolérance au glucose puis, une semaine plus tard, une injection dans le ventre d’insuline pour évaluer la sensibilité à l’insuline (- de 30 sec par injection, contention comprise). Les 360 animaux subiront six petites incisions à l’extrémité de la queue (- de 1 mm, - de 30 sec, sans contention), espacées d’au moins une semaine, afin de permettre les prélèvements sanguins. Ces prélèvements comprendront six gouttes de sang lors du test de tolérance au glucose, six gouttes lors du test de sensibilité à l’insuline et une goutte lors du suivi de la glycémie (- de 30 sec par prélèvement, sans contention). En fin de protocole, les 360 animaux recevront une injection d’analgésique puis, 30 minutes plus tard, une injection d’anesthésiques permettant le prélèvement sanguin au niveau du foie, suivi de la mise à mort (- de 30 sec par injection, contention comprise).

Impact sur les animaux

Les pesées entraînent un stress léger et temporaire. La consommation d’un régime riche en lipides entraîne une prise de poids sans altération de la mobilité ou du comportement. Lors des mesures de composition corporelle, les souris sont placées pendant moins de deux minutes dans un tube adapté à leur taille, ce qui génére un stress temporaire. Trois molécules sont administrées quotidiennement par injection. Ces injections répétées sur plusieurs semaines provoquent un stress lié à la manipulation et à la contention, ainsi qu’un inconfort local au point d’injection. Trois molécules seront administrées quotidiennement par gavage. Cela engendre un stress et un inconfort liés à la contention et à l’introduction de la sonde. Les tests métaboliques réalisés au cours de l’étude entraînent un inconfort ponctuel. Les périodes de jeûne de six heures sont source de stress. Les injections de glucose ou d’insuline utilisées lors de ces tests sont associées à une douleur légère et transitoire. Les prélèvements sanguins sont réalisés à partir d’une petite incision de moins d’un millimètre à l’extrémité de la queue, provoquant une légère douleur momentanée. À la fin de l’étude, les animaux recevront deux injections (antidouleur puis anesthésique) pour permettre le prélèvement de sang terminal. Ces injections provoquent une légère douleur et un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des expériences afin de collecter les tissus d’intérêt et de procéder aux analyses permettant de répondre à l’objectif du projet.

Remplacement

Des méthodes alternatives, réalisées sur cellules en laboratoire ou à l’aide d’outils informatiques, ont été utilisées dans un premier temps pour sélectionner et étudier les molécules. Cependant, ces approches ne permettent pas de reproduire le fonctionnement complet d’un organisme vivant ni les interactions entre les différents organes, tels que le foie, les muscles, le tissu graisseux et l’intestin. Or, le diabète de type 2 et la maladie du foie gras résultent de mécanismes complexes impliquant l’ensemble de l’organisme. L’utilisation d’un modèle animal est donc nécessaire pour évaluer de manière fiable l’efficacité et les effets des traitements dans des conditions proches de celles observées chez les patients. Bien que certaines des molécules étudiées soient actuellement évaluées chez l'Homme dans des essais cliniques, ces essais ont pour objectif principal de démontrer leur efficacité et ne permettent pas d'explorer de façon approfondie leurs mécanismes d'action. Le modèle souris permet la réalisation d'analyses invasives impossibles chez l’Homme (nous ne pouvons pas faire de biopsies hépatiques) mais indispensables pour caractériser les mécanismes d'action hépatiques de ces traitements.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé à l’aide d’une méthode statistique permettant d’utiliser le plus petit effectif possible tout en garantissant des résultats fiables et exploitables. Ce calcul s’est appuyé sur la capacité à détecter des différences de glycémie lors d’un test évaluant la tolérance au glucose. Cette approche a conduit à retenir un effectif de 15 souris par groupe, soit le nombre minimal nécessaire pour répondre aux objectifs de l’étude tout en limitant l’utilisation d’animaux. Les données recueillies seront ensuite analysées à l’aide de méthodes statistiques adaptées afin de déterminer si les différences observées entre les groupes sont réelles et non dues au hasard.

Raffinement

L’état général et le comportement des animaux seront contrôlés trois fois par semaine. Le poids corporel sera mesuré individuellement une fois par semaine et la consommation alimentaire sera suivie pour chaque cage. Une surveillance renforcée sera mise en place au début des traitements ainsi qu’au cours des tests métaboliques. Les différents tests seront espacés d’une semaine afin de laisser aux animaux un temps de récupération suffisant. Une attention particulière sera portée aux animaux pendant les tests et dans les heures qui suivent. Les prélèvements sanguins seront réalisés en limitant au maximum les manipulations et les quantités de sang prélevées. Une anesthésie de la queue sera réalisée avant les prélèvements de sang. Les administrations de traitements par gavage ou par injection seront réalisées avec du matériel adapté et les plus petits volumes possibles. Les animaux seront systématiquement surveillés après chaque administration afin de détecter rapidement tout signe d’inconfort. Avant les mesures de composition corporelle, les animaux seront progressivement habitués au dispositif utilisé afin de réduire leur stress. En fin de procédure, les animaux recevront un traitement antidouleur puis une anesthésie profonde avant le prélèvement terminal, garantissant l’absence de douleur lors de cette intervention. L’ensemble des procédures sera réalisé par du personnel formé et expérimenté afin de limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux. Des points limites précis, prédictifs et précoces ont été définis afin d’éviter toute souffrance et angoisse chez les animaux.

Choix des espèces

La souris est un modèle couramment utilisé pour étudier l’obésité, le diabète de type 2 et la stéatose hépatique (« foie gras »). Son organisme présente de nombreuses similitudes avec celui de l’Homme pour ces maladies, ce qui permet d’obtenir des résultats pertinents pour la recherche biomédicale. De plus, une alimentation riche en lipides et en sucres permet de reproduire de manière fiable les principales caractéristiques de ces pathologies. Ce modèle est largement utilisé par la communauté scientifique ce qui facilite la comparaison des résultats. Les souris seront âgées de 5 semaines au début de l’étude. À cet âge, elles sont particulièrement sensibles aux effets d’une alimentation riche en lipides et en sucres. Ce choix permet de reproduire de manière fiable les principales caractéristiques de l’obésité, du diabète de type 2 et de la stéatose hépatique observées chez l’Homme. Il est également conforme aux pratiques couramment utilisées dans la recherche scientifique.

Quatorze jours consécutifs d'injections sous-cutanées d'hormones, six prélèvements de sang, une transplantation de cellules mammaires dans le coussin adipeux de souris receveuses de trois semaines : 5 072 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort pour prélever leurs glandes mammaires et leurs tumeurs. Le projet relève de la recherche fondamentale, comprendre comment le gène p16 limite la plasticité des cellules mammaires hors de son rôle dans le cycle cellulaire. Le porteur estime à un à deux mois l'inconfort lié au développement des tumeurs mammaires, et à 24 ou 48 heures la douleur modérée qui suit la pose d'un implant ou la greffe. Il justifie le recours à la souris par les cinq paires de glandes collectables sur un même individu, et étudie des femelles vierges, gestantes, allaitantes, ou âgées de 18 mois selon le stade visé.

Objectifs

La glande mammaire est un organe doté d’une plasticité exceptionnelle et d’un développement postnatal dynamique. Elle contient des types cellulaires spécifiques, essentiels pour les remaniements morphologiques postnataux. Cependant, les mécanismes permettant à ces cellules de maintenir leur plasticité restent encore mal compris. Le cancer du sein de type basal, un sous-type particulièrement agressif, se caractérise par la perte d'expression des récepteurs hormonaux et du récepteur du facteur de croissance épidermique humain. Certaines cellules ont été identifiées comme les cellules d’origine de ce cancer, suggérant qu’elles acquièrent une plasticité anormale lors de la tumorigenèse. Ainsi, l’un des objectifs centraux de ce projet est d’élucider comment ces cellules limitent leur plasticité en situation d’homéostasie. Nos résultats préliminaires indiquent qu’un gène pourrait réguler la plasticité de cellules mammaires qui nous intéressent même en dehors de son rôle classique dans le contrôle du cycle cellulaire. Ce projet s’articule autour de deux questions majeures : 1. Comment notre gène d’intérêt régule-t-il la plasticité dans un contexte normal ? 2. Quelles sont les conséquences d’une dérégulation de cette plasticité sur les processus physiologiques (comme la lactation et/ou l’involution) et pathologiques (comme la tumorigenèse) de la glande mammaire ? En répondant à ces questions, nous espérons approfondir notre compréhension des mécanismes qui gouvernent la plasticité cellulaire mammaire et leurs implications dans la tumorigenèse.

Bénéfices attendus

La souris est fréquemment utilisée pour étudier le développement de la glande mammaire après la naissance, car il s’agit d’un mammifère dont l’organisation de la glande mammaire présente de nombreuses similarités avec celle de l’être humain. De plus, il existe des modèles de souris génétiquement modifiées qui permettent d’étudier précisément le rôle de certains gènes, dans différentes étapes de la vie de la glande mammaire comme la gestation, la lactation et l’involution (retour de la glande à son état normal après l’allaitement). Ces modèles permettent également d’étudier les mécanismes impliqués dans la régénération des tissus et dans le développement des cancers du sein. La souris possède également plusieurs glandes mammaires, ce qui permet de réaliser différentes analyses à partir d’un même animal afin de limiter le nombre de souris utilisées. Les tissus prélevés permettront d’étudier la structure des glandes, l’expression de certains gènes ainsi que l’activité de mécanismes biologiques impliqués dans le fonctionnement normal ou pathologique des cellules mammaires. Ce projet de recherche fondamentale vise à mieux comprendre comment certaines cellules de la glande mammaire conservent leurs caractéristiques tout en étant capables de s’adapter aux besoins du tissu au cours de la vie. Nous cherchons également à comprendre pourquoi des dérèglements de ces mécanismes peuvent favoriser l’apparition de cancers du sein. Plus précisément, nous étudierons le rôle d’un gène qui produit une protéine connue pour limiter la multiplication des cellules et prévenir la formation de tumeurs. Nos premiers résultats obtenus en laboratoire suggèrent que cette protéine pourrait aussi jouer un rôle important dans le maintien de l’identité des cellules mammaires.

Procédures

Dans ce projet, 9 types de manipulations sont prévues : 1/ Implantation ou retrait d’implants hormonaux : 1 fois, 15 minutes par souris 2/ Injection de substance en intrapéritonéal (dans la cavité abdominale) : 1 à 4 jours consécutifs sur souris vigiles, quelques secondes par souris 3/ Administration de substance par gavage : 1 à 4 jours consécutifs sur souris vigiles, quelques secondes par souris 4/ Injection sous cutanée d’hormones : 14 jours consécutifs sur souris vigiles, quelques secondes par souris 5/ Procédure chirurgicale de transplantation sous anesthésie gazeuse, de cellules mammaires dans le coussin adipeux de souris receveuses pré-pubères de 3 semaines : 1 fois, 15 minutes par souris 6/ Prélèvement de sang : 6 fois sur plusieurs semaines, quelques secondes par souris 7/ Injection d’une autre substance en intrapéritonéal : 1 à 4 jours consécutifs sur souris vigiles, quelques secondes par souris 8/ Injection de cellules tumorales dans la glande mammaire (sous cutanée) : 1 fois, quelques secondes par souris 9/ Procédure chirurgicale de retrait de tumeur primaire sous anesthésie : 1 fois, 15 minutes par souris

Impact sur les animaux

Pour les femelles qui entreront dans ces procédures, ce projet occasionnera essentiellement un stress léger à modéré dû : 1- à l’administration des différentes molécules destinées à moduler l’expression d’un gène ou d’une protéine (introduction d’une aiguille ou d’une sonde de gavage). La durée de ce stress est estimée à quelques secondes lors de l’introduction de l’aiguille ou de la sonde de gavage. 2- à la procédure chirurgicale de transplantation cellulaire ou de greffe d’implant (gène de déplacement lié à l’implant dorsal). La durée de ce stress (inconfort et douleur modérée) est estimée à 24h (implant) à 48h (greffe), mais sera contrôlée par la mise en place d’un traitement analgésique 3- au développement des tumeurs (gène de déplacement lié au développement du tumeurs mammaires). L’inconfort lié à cette procédure expérimentale est estimé à 1 à 2 mois

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car pour l’ensemble des procédures expérimentales, le but est de collecter les glandes mammaires et/ou tumeurs en vue de leurs analyses.

Remplacement

Pour étudier le rôle de p16 dans le développement et la tumorigenèse de la glande mammaire, nous ne pouvons pas utiliser exclusivement la culture cellulaire in vitro. En effet, nous n’avons pas réussi pour le moment à mimer fidèlement l’organisation 3D du tissu et à reproduire l’ensemble du cycle reproductif de la glande mammaire ainsi que du développement tumoral. Nous souhaitons donc utiliser la souris comme organisme modèle. Cet animal présente de nombreux avantages pour notre étude. C’est un mammifère dont l’organisation du tissu mammaire est similaire à celle de l’être humain.

Réduction

Toutes les souris utilisées seront du même fond génétique entre les groupes contrôles et les groupes traités ou génétiquement modifiés, ce qui préviendra la fluctuation des résultats due aux variations génétiques entre les animaux et permettra d’obtenir des résultats fiables tout en utilisant moins d’animaux. Le nombre nécessaire et suffisant d’animaux est déterminé par rapport aux expériences préliminaires ne nécessitant pas d’autorisation (mise à mort des animaux afin de collecter leurs tissus sans utilisation de gestes technique au préalable), ainsi que sur les méthodes employées dans la littérature scientifique relative à l’élaboration de ces modèles animaux. De plus, la souris possède 5 paires de glandes mammaires, permettant de réaliser à partir d’une seule souris de nombreuses analyses et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Nous allons utiliser le nombre minimum d’animaux nous permettant d’obtenir des résultats homogènes et suffisant pour obtenir des différences statistiquement significatives entre les groupes contrôles vs les groupes expérimentaux (Mutants ou traités). Les animaux seront générés à partir de croisement nous permettant de garder le maximum d’animaux d’une même portée pour les utiliser soit dans des procédures expérimentales, soit maintenir les génotypes pour les accouplements. Par conséquent, la majorité des animaux obtenus à partir des accouplements pourront être utilisés dans des expériences en évitant ainsi la surproduction inutile de souris. Les mâles seront utilisés comme mâles reproducteur afin d’induire les gestations. Lors de procédures nécessitant des gestations synchronisées de façon très précises entre 2 groupes et éviter de faire se reproduire des animaux qui ne pourraient finalement pas être inclus dans notre études, nous mettrons également en place une procédure chirurgicale légère consistant à l’introduction d’un implant en silicone permettant la libération d’hormones en continue afin de mimer une pseudo gestation et garantir la synchronisation des animaux.

Raffinement

La manipulation des animaux sera strictement limitée aux interventions décrites dans les protocoles et aux soins, afin de limiter leur stress. Nous surveillerons régulièrement les souris et respecterons les points limites définis pour limiter la souffrance des animaux. Quelles que soit les procédures mises en place : injection intra-péritonéale, gavage, transplantation dans le coussin adipeux et prélèvement sanguin, les souris serons systématiquement évaluées quotidiennement pendant 3 jours, puis de façon hebdomadaire ou bi-hebdomadaire dans les procédures induisant un développement tumoral mammaire et des points limites spécifiques et précoces seront mis en place. La douleur chez les souris sera évaluée selon l’apparence (normale, pelage ébouriffé avec expression modérée, dos voûté avec expression sévère), le score de condition corporelle, le poids corporel et l’apparition de lésion nécrotique. Du gel nutritif sera mis à disposition des animaux dès l’apparition des signes cliniques afin de favoriser leur hydratation et un traitement avec un désinfectant sera appliqué sur les petites lésions nécrotiques. De plus, une litière douce et adaptée sera utilisée lorsque les souris commenceront à développer des tumeurs.

Choix des espèces

En tant que mammifère, la souris est le modèle animal le plus approprié pour étudier le développement de la glande mammaire car la structure du tissu mime fidèlement celui retrouvé chez la femme. De plus, il existe déjà de nombreux modèles murins génétiquement modifiés mimant les altérations existantes dans les pathologies humaines, notamment pour le cancer du sein. Enfin, la souris possède 5 paires de glandes. A partir d’un seul individu, nous pouvons donc collecter une grande quantité de matériel, réduisant ainsi la quantité d’animaux utilisés dans cette étude. Les animaux utilisés pour les expériences seront pour la plupart des souris adultes âgées de plus de 8 semaines. Nous étudierons soit des souris vierges et donc avant leur mise en accouplement, soit des souris qui auront été accouplées et que nous analyserons au cours du cycle de développement de la glande mammaire, à savoir : la gestation, la lactation et l’involution. De plus, certaines procédures expérimentales incluront des souris de 6 semaines afin d’analyser les glandes mammaires au cours de la puberté. Le choix de ces stades de développement est totalement dicté par le développement de la glande mammaire qui est essentiellement post natal et qui subit de nombreuses modifications au cours des cycles reproductifs que nous souhaitons étudier. Enfin, nous utiliserons également des souris âgées de 3-4 semaines dans les expériences de transplantation (souris receveuses) et des souris de 18 mois afin de suivre le développement des tumeurs.