Recherche fondamentale

Gavées cinq jours d'affilée, opérées pour certaines, échographiées et piquées jusqu'à deux fois par semaine pendant cinq semaines, 3 864 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une modification génétique qui leur fait développer spontanément un cancer du pancréas. Toutes sont tuées pour analyser leurs tumeurs, leur foie, leurs poumons et leur diaphragme, le projet cherchant à comprendre pourquoi les chimiothérapies atteignent mal ces tumeurs. Le porteur écrit que "le développement des tumeurs n'a pas d'impact sur l'animal", sauf au moment où un point limite est atteint.

Objectifs

Les animaux utilisés dans ce projet correspondent à des modèles d’étude du cancer du pancréas pour lequel aucun traitement efficace n’est à l’heure actuelle disponible et qui est le 4ième cancer le plus mortel. Quatre-vingt-dix pour cent des patients diagnostiqués sont décédés à 5 ans, qu’ils aient été opérés ou non, et l’incidence de ce cancer est en hausse. Il s’agit donc d’une pathologie de santé publique. Comprendre la résistance aux traitements est un axe de recherche qui devrait permettre d’améliorer ce terrible pronostic. Des études récentes démontrent que l’inaccessibilité des drogues à la tumeur serait au moins en partie responsable de l’absence d’effet thérapeutique des chimiothérapies dans ce cancer, et ce du fait d’une très faible vascularisation de ces tumeurs. Cette faible vascularisation serait la conséquence d’une fibrose (la transformation du tissu en un tissu composé de fibres) dont l'origine est l'activation des fibroblastes. Le projet proposé consistera en l’identification de potentielles cibles thérapeutiques (exprimées soit par les cellules tumorales, soit par les cellules stromales) impliqués dans la résistance aux traitements du cancer du pancréas. Notre objectif est de tester l'hypothèse du rôle clé du microenvironnement tumoral du cancer du pancréas, et plus particulièrement des fibroblastes, dans la résistance aux traitements, et d'identifier et comprendre le rôle de chacun des types cellulaires impliqués (notamment les cellules immunitaires) afin de développer de nouvelles thérapies. Dans ce contexte nous avons déjà identifié, in vitro, plusieurs potentielles cibles thérapeutiques exprimées par les fibroblastes (soit les pancreatic stellate cells (PSC) soit les cancer-associated fibroblasts (CAFs)) et impliquées dans la résistance aux traitements.

Bénéfices attendus

Identifier et comprendre les processus mis en place dans le microenvironnement tumoral aboutissant au développement de résistances aux thérapies afin de développer de nouvelles stratégies.

Procédures

Dans cette étude, un traitement est donné par la bouche (gavage) aux souris pendant cinq jours (moins de 30 secondes). Certaines souris subissent une chirurgie (30 min). Une échographie pourra être réalisée une à 2 fois par semaine (10 minutes). Les animaux pourront recevoir jusqu’à deux injections par semaine pdt cinq semaines maximum (3 à 5 minutes). Une prise de sang pourra être réalisée, maximum une fois par semaine (1 à 2 secondes ou 2 min pour prélèvement terminal.

Impact sur les animaux

Dans cette étude, certaines souris développeront naturellement des tumeurs du pancréas en raison de leur modification génétique. Le développement des tumeurs n’a pas d’impact sur l’animal, sauf possiblement au moment de l’atteinte d’un des seuils critiques (appelés "points limites") où une modification de l’état général pourrait être observée. La chirurgie pourra provoquer un léger inconfort. Les traitements par chimiothérapie peuvent provoquer certains effets secondaires chez les souris, comme une perte de poids, de la douleur ou dans certains cas rares une atteinte cutanée de la queue.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de procéder à l’analyse des tissues. En effet, nos recherches nécessitent l’analyse des organes des animaux. Les expériences sont conçues pour permettre la récupération de la tumeur ainsi que des organes de métastases. Les tumeurs seront collectées soit pour des analyses histologique, soit pour l’analyse des cellules immunitaires présentes dans la tumeur.

Remplacement

L'identification des phénomènes de résistances aux thérapies ne peut être réalisée que directement chez l’animal car il met en jeu des intéractions entre de nombreuses populations cellulaires (interactions cancer / microenvironnement (réaction fibreuse) / réaction de l’hôte) qui ne peuvent pas encore être mimées in vitro, notamment le rôle complexe du système immunitaire. Cependant, dès que possible, nous remplacerons les études faites sur les modèles murins par des expérimentations réalisées sur des cultures de cellules isolées de nos modèles murins, qui peuvent être maintenues plusieurs semaines en culture et permettront de tester nos hypothèses. Ce projet est multidisciplinaire et vise à mieux comprendre le rôle des cellules du système immunitaire dans le contrôle d'un modèle murin mimant le cancer du pancréas. De ce fait nous devrons travailler avec des animaux vivants afin de pouvoir analyser le rôle des différents organes et différents types cellulaires suspectés d'être impliqués dans le développement de cette pathologie et dans l'immuno- et chimioresistance.

Réduction

Nous avons calculé que le nombre minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables, reproductibles et statistiquement interprétables est de 8 souris par groupe, avec trois répétitions indépendantes de chaque expérience afin de valider la robustesse des résultats. Nous avons pris plusieurs mesures pour réduire autant que possible le nombre d’animaux utilisés, tout en maintenant la qualité des données : 1- maximisation des analyses par animal en réalisant plusieurs types d’analyses sur un même animal afin d’optimiser chaque inclusion expérimentale, incluant des analyses histologiques sur plusieurs tissus atteints (pancréas, foie, poumon, diaphragme), des analyses immunologiques multiparamétriques par cytométrie en flux pour caractériser la nature, le phénotype et la fonctionnalité des cellules immunitaires post-mortem, ainsi que des analyses sanguines ; 2- optimisation du design expérimental, avec un protocole conçu pour limiter la variabilité inter-individuelle, permettant ainsi d’avoir un nombre réduit d’animaux par groupe tout en conservant une puissance statistique suffisante ; 3- réutilisation de données biologiques, les mêmes échantillons biologiques (sang, tissus) pouvant dans certains cas être utilisés pour plusieurs types d’analyses complémentaires. Le nombre total d’animaux a donc été défini en tenant compte d’un équilibre rigoureux entre nécessité scientifique, réduction des effectifs animaux et qualité des données attendues.

Raffinement

Afin de minimiser les effets indésirables liés aux procédures expérimentales, plusieurs mesures spécifiques de raffinement sont mises en œuvre à chaque étape du protocole. À leur arrivée, les animaux sont placés en pièce d’acclimatation et observés quotidiennement par le personnel zootechnique. Ils sont logés par groupes de 5 dans des cages enrichies (abris, matériaux de nidification, objets à ronger), favorisant leur bien-être et réduisant le stress. Tous les actes expérimentaux sont réalisés par du personnel formé et expérimenté. Le gavage est effectué avec des sondes souples à extrémité arrondie, réduisant les risques de lésion œsophagienne. L’administration par gavage est limitée à 5 jours consécutifs avec un volume adapté au poids de l’animal. Lors des greffes, les animaux sont prémédiqués avec un antalgique et une anesthésie locale est réalisée. L’anesthésie générale est assurée par inhalation avec contrôle du plan anesthésique et prévention de l’hypothermie grâce à un tapis chauffant. Une pommade oculaire est appliquée pour prévenir le dessèchement des yeux. Les chirurgies sont limitées à une seule par animal. En postopératoire, les animaux sont surveillés jusqu’à reprise complète d’activité, et une seconde injection d’antalgique est prévue 8h plus tard, puis selon les besoins. Les injections sont réalisées avec du matériel adapté et par du personnel entraîné. Les volumes administrés respectent les seuils recommandés. L'apparition d'effets secondaires (perte de poids, masses tumorales) est anticipée par un scoring de la douleur permettant une intervention rapide (analgésie, traitement local, ou mise à mort si seuil critique atteint). Le suivi des tumeurs par échographie est non invasif et réalisé sous anesthésie légère, deux fois par semaine au maximum. Des prélèvements sanguins de faible volume sont réalisés selon des intervalles sécurisés pour limiter la perte sanguine. Chaque animal est utilisé de façon optimale pour collecter un maximum de données afin de limiter le nombre total d’animaux requis.

Choix des espèces

Les études antérieures de la littérature et de notre équipe de recherche ont démontré que les modèles murins décrits dans ce projet étaient très proches de la pathologie humaine, et récapitulent la complexité du microenvironnement tumoral, ce qui n’est pas le cas des modèles in vitro ou ex-vivo. L'utilisation des souris permet d'avoir acces à des modèles proches de la pathologie humaine. Pour la majorité des expériences, les animaux seront utilisés entre 8 et 12 semaines ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature.

Incluses dans les études dès le sevrage, à partir de quatre semaines, 2 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie d'entre elles est immunodéficiente ou porte un système immunitaire et un foie humanisés, obtenus par greffe de cellules humaines. Elles reçoivent des injections de plasmides que le porteur reconnaît pouvoir provoquer des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l'état général, subissent des prélèvements de sang répétés avec risque d'anémie et d'hématome, et pour certaines un prélèvement terminal sous anesthésie suivi de leur mise à mort. Sur la réduction, le porteur écrit qu'aucune approche statistique n'a été réalisée et que l'effectif découle du nombre d'études des années précédentes, ajusté selon "le plan commercial". Deux cent cinquante de ces souris pourront ensuite être transférées vers un projet de formation interne aux gestes techniques.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’analyser la pharmacocinétique de composés de recherche après administration à des souris. En particulier, nous nous intéresserons à leurs absorptions, biodistribution, métabolisme et élimination. Ces analyses sont cruciales pour déterminer les doses efficaces et la posologie d’un médicament. Pour ce faire, nous utiliserons des souris immunodéficientes, immunocompétentes ou avec un système immunitaire et/ou un foie humanisé.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’obtenir des données essentielles sur la biodistribution et la durée de vie de composés de recherche dans l’organisme. Grâce à ces données, nous pourrons définir les doses et posologies à tester dans des études d’efficacité.

Procédures

Des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris avec ou sans anesthésie en fonction de la voie choisie. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids et à l’âge de l’animal avec une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlé par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement sans réveil suivi d’une euthanasie sous anesthésie gazeuse sera réalisé. Des prélèvements d’urines et de fèces pourront être pratiqués par contention et massage du ventre à la main. Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Ces injections, administrées uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Les injections pourront être répétées selon le protocole et dureront quelques secondes. Les administrations de traitements dureront quelques secondes et seront effectuées avec ou sans anesthésie en fonction de la voie choisie. Leur nombre dépendra du protocole ‘étude et sera validé par le vétérinaire. À l’issue des études, les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.

Impact sur les animaux

- Injection(s) de solution saline isotonique contenant des plasmidess (pour favoriser le développement de populations immunitaires humaines d’intérêt) : peut engendrer des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. Peut engendrer un hématome. - Administration de traitements ou de composés : effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées) - Prélèvements sanguins : hématome, anémie, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû aux contentions. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Les animaux ayant atteints les point limites ou sur demande du vétérinaire seront euthanasiés. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. Des souris issues de cette procédure pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris » sur décision vétérinaire.

Remplacement

Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible d’étudier l’absorption, la biodistribution, le métabolisme et l’élimination de composés de recherche sans les injecter in vivo. La souris constitue un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de thérapies innovantes pour les patients.

Réduction

Un total de 2200 souris seront utilisées, couvrant une période de 5 ans et permettant de réaliser 50 études précliniques de 44 souris. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum par des analyses rétrospectives systématiques.

Raffinement

En début d'étude, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables de 5 individus maximum. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux (ex : Diet Gel). La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Des traitements antalgiques préventifs et curatifs seront mis en œuvre dès que nécessaire, sous avis vétérinaire, administrée avant toute procédure potentiellement douloureuse. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Lorsqu’un animal rentre en salle d’euthanasie, il doit être immédiatement euthanasié. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction des scores cliniques et de la perte de poids.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain ou de manière fonctionnelle par greffe de cellules humaines dans une lignée immunodéficiente permet la création de lignées humanisées. De plus, le métabolisme des souris présente des similarités avec celui des humains, ce qui permet de prédire la distribution, biotransformation et élimination d’un médicament. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 4 semaines, ces souris pouvant être utilisées dès leur sevrage. Pour les souris humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules humaines dans le sang.

Pour documenter les effets cardiovasculaires des immunothérapies anticancéreuses chez des individus déjà hypertendus, 450 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. L'hypertension leur est imposée par une mini-pompe implantée sous la peau, qui diffuse une molécule pendant vingt-huit jours. Viennent ensuite des anticorps deux fois par semaine pendant deux semaines, trois prélèvements de sang de dix minutes, des échographies du cœur et des carotides, une imagerie de l'œil, une imagerie du mésentère et des mesures de pression à la queue. Le porteur écrit avoir "soigneusement optimisé" le nombre de rats par groupe, sans donner de calcul de puissance, et arrive à un effectif d'environ 450 à partir d'un minimum de dix rats par groupe.

Objectifs

Documenter les potentielles toxicités cardio-vasculaires liés aux traitements par inhibiteurs des points de contrôles immunitaires utilisés dans le traitement des pathologies malignes. Comprendre les mécanismes de toxicités cardio-vasculaires liés aux traitements par inhibiteurs des points de contrôles immunitaires. Identifier les pistes de travail pour prévenir cette toxicité cardio-vasculaire.

Bénéfices attendus

La compréhension des conséquences cardio-vasculaires liés aux traitement par inhibiteurs des points de contrôles immunitaires, traitement des pathologies malignes, nous permettra d'appréhender au mieux ces complications. La compréhension des mécanismes physiopathologiques de ces complications et l'identification des cibles pour l'initialement d'une potentielle prévention avant l'apparition des complications cardio-vasculaires sont les enjeux de ce travail. L'incidence des pathologies malignes dans le monde augmente, de part notamment le vieillissement de la population. Aujourd'hui l'utilisation d’inhibiteurs de points de contrôles immunitaires est une pierre angulaire dans le traitement des pathologies malignes et l’amélioration des connaissances sur les effets indésirables potentiels de ces traitements est indispensable.

Procédures

Les rats seront soumis à la mise de place de mini-pompes sous la peau ( temps du geste 10 minutes) pour diffuser une molécule qui les rend hypertendus pendant une période de 28 jours. De plus, des traitements par anticorps qui modulent le système immunitaire seront administrés deux fois par semaine pendant 2 semaines afin d'évaluer la toxicité de ces traitements. Les rats bénéficieront de prélèvements sanguins à J1, J15, J28 jours soit 3 au total pour réaliser des analyses diverses (10 mn par prélèvement). Les rats bénéficieront de plusieurs examens in vivo : - Echographie trans-thoracique et carotidienne à J1 et J28 (temps d’intervention estimé à 10-20 min à J1 et à J28) – une imagerie oculaire à J28 (temps d’intervention estimé à 10 min à J28) – une imagerie du mésentère à J28 (temps d’intervention estimé à 5 min à J28) – la mesure de la pression artérielle au niveau de la queue du rat à J1 et J28 (temps d’intervention estimé à 10 min à J1 et à J28)

Impact sur les animaux

Pose de la mini-pompe sur un animal anesthésié : cette intervention entraîne une douleur post-chirurgicale ainsi qu’une gêne liée à la présence du capteur sous la peau. Injections : elles génèrent du stress lors de la contention de l’animal éveillé et peuvent également entraîner une gêne au niveau du point d’injection. Pléthysmographie sur un animal vigile : cette procédure induit un stress chez l’animal.

Devenir

A l'issu de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de récupérer les différents organes pour des études biomoléculaires et histologiques. Ces tissus sont nécessaires pour valider les effets des traitements sur l'organisme.

Remplacement

Ce projet vise à étudier les effets cardiovasculaires des traitements par inhibiteurs des points de contrôle immunitaire dans des conditions de physiopathologie intégrées, autrement dit, chez des animaux présentant déjà un facteur de risque cardio-vasculaire, comme l'hypertension artérielle. De ce fait, l'utilisation de modèles cellulaires ou ex vivo n'est pas adapté pour répondre de façon pertinente aux questionnement scientifiques du projet.

Réduction

Le nombre de rats par groupe a été soigneusement optimisé afin de limiter l'utilisation d'animaux au strict nécessaire. Une stratégie spécifique a été mise en place pour réduire au maximum les prélèvements, que ce soit lors des analyses pharmacocinétiques ou au moment de la mise à mort. Cela permet de limiter à la fois le nombre d’animaux utilisés et les volumes prélevés sur chacun. Quelle que soit la conception des études exploratoires, nous nous engageons à utiliser le moins d’animaux possible. Pour garantir la robustesse des résultats, un minimum de 10 rats par groupe est requis. Au total, en incluant l’ensemble des procédures prévues dans ce projet, environ 450 rats seront utilisés.

Raffinement

Dans la mesure du possible, l'hébergement social est choisi afin de réduire le stress et l'angoisse, avec un enrichissement adapté à chaque espèce. Un suivi quotidien de l'état clinique des animaux est réalisé pendant toute la durée du projet. Tout au long de l’étude, les animaux seront nourris ad libitum et hébergés en groupes sociaux stables dans des portoirs conventionnés au nombre maximum de 3 à 4 par cage avec de l’enrichissement adapté à l’espèce. Les animaux seront maintenus avec un environnement contrôlé et stabilisé (température de 21°C, hydrométrie à 55% et luminosité à 100lux avec un cycle de lumière 12h/12h). Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation d’une semaine après réception des animaux sera maintenue avant le début du protocole. Les conditions de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Ainsi, un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée du protocole expérimental, ce qui permettra de déceler un éventuel signe de souffrance. Notre grille d’évaluation des point limites pour le bien-être animal est utilisée quand un animal présente un état de mal-être ou de souffrance, il est exclu de l'étude et euthanasié en fonction de son score et avis du responsable bien-être animal. L’anesthésie et l’analgésie sont rigoureusement respectées pour toutes les interventions effectuées sur les animaux tout au long de l’étude. À l’issue de chaque procédure, les rats seront euthanasiés conformément aux protocoles en vigueur.

Choix des espèces

Le choix d’espèces rongeurs est justifié par : - Les objectifs du projet : disponibilité d’un modèle de maladie déjà existant (hypertension artérielle par injection de traitement dans les mini-pompes sous cutanés) permettant d'étudier l'injection des traitements par inhibiteurs de points de contrôles immunitaires chez des animaux avec un facteur de risque cardio-vasculaire. - La comparaison possible avec d’autres études menées chez ces modèles animaux au laboratoire - Aspects pratiques de manipulation Des rats âgés de 12 à 18 semaines seront utilisés, car le protocole requiert des animaux adultes. Le choix de rats adultes permet d'établir un parallèle avec la situation humaine, dans laquelle les traitements sont généralement administrés à l'âge adulte. De plus, les individus adultes présentent un risque accru de développer des pathologies vasculaires, ce qui justifie l'utilisation de cette tranche d'âge dans notre modèle expérimental.

Une fibrose est provoquée dans les poumons de 1 024 souris par l'administration sous anesthésie d'un produit inducteur. S'ensuivent, selon les lots, un gavage quotidien de J8 à J20 ou sept injections intraveineuses, puis des séances d'imagerie sous anesthésie pouvant durer quarante minutes par souris, cathéter posé. Toutes ces souris, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, sont tuées à la fin pour mesurer la fibrose de leurs poumons par histologie. Le porteur décrit une inflammation des voies respiratoires et une perte de poids dans les jours qui suivent l'induction, puis écrit dans la même rubrique n'anticiper aucun effet indésirable au moment des traitements ou de l'imagerie.

Objectifs

La fibrose pulmonaire est une maladie pour laquelle il n’existe pas de traitements curatifs. Une des limites de la fibrose pulmonaire est le manque de marqueur permettant d’évaluer la réponse aux traitements. Nous avons démontré la possibilité de suivre l’évolution de la fibrose pulmonaire avec une méthode d’imagerie du métabolisme des lipides. Nous devons maintenant valider son utilisation comme outil pour vérifier l’efficacité des traitements actuels ou en développement de la fibrose pulmonaire. Les objectifs de ce projet sont d’évaluer une nouvelle technique d’imagerie du métabolisme lipidique: 1/ pour le suivi de l’efficacité des traitements approuvés de la fibrose pulmonaire 2/ pour le suivi de l’efficacité des traitements en cours de développement 3/ pour la possibilité de prédire l’efficacité des traitements testés Ce projet permettra de proposer un outil pour prédire et monitorer l’efficacité des traitements de la fibrose pulmonaire afin d’améliorer la prise en charge des patients avec cette maladie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet seront multiples grâce à une approche complète et robuste basée sur plusieurs modèles expérimentaux. Ce projet vise à améliorer la prise en charge des patients atteints de fibrose pulmonaire. A court terme, nous pensons que l’imagerie du métabolisme lipidique pourra être testée chez des patients avec fibrose pulmonaire pour valider son utilisation dans l’évaluation de l’efficacité des thérapies actuellement en clinique. A plus long terme, notre méthode d’imagerie permettra de faciliter le développement de nouvelles thérapies de la fibrose pulmonaire, au niveau préclinique et aussi des essais cliniques.

Procédures

Les souris recevront une administration d’un inducteur de fibrose. Cette intervention sous anesthésie générale dure 30 secondes maximum. Ce même type d’injection sera également utilisé, de façon répétée, pour l’administration des agents thérapeutiques dans la procédure 2. Aucune nuisance supplémentaire n’est anticipée du fait de la répétition. Une partie des animaux recevra des traitements par gavage oral (100µl, quotidiennement de J8 à J20). Ce geste sera réalisé sur animaux vigiles, après contention, et ne durera pas plus de 10 secondes. Une partie des animaux recevra des traitements par injection intraveineuse (100µl, tous les deux jours de J8 à J20, 7 injections au total). Ce geste sera réalisé après contention, et ne durera pas plus de 20 secondes. Tous les animaux seront suivis par imagerie. L'ensemble de cette procédure s'effectue sous anesthésie. Chaque animal aura un cathéter afin de permettre l’injection intraveineuse du marqueur (100 µl). Ceci n’excède pas 2 minutes par animal. Les animaux seront placés dans le système d’imagerie équipé d’un lit chauffant préchauffé et d’un système d’anesthésie gazeuse.La durée totale de la procédure n’excède pas 40 min par souris. A la fin du protocole, les animaux sont analgésiés puis anesthésiés profondément, avant que soit réalisé un prélèvement sanguin puis leur mise à mort.

Impact sur les animaux

Entre 2 et 7 jours après l’induction du modèle, une inflammation des voies aériennes peut avoir lieu et elle peut être associée à une perte de poids des animaux. Le modèle de fibrose est associé aussi à une inflammation des voies respiratoires au cours des 6 premiers jours après l’induction. Elle peut être associée à une perte de poids des animaux. Les administrations intraveineuses peuvent induire un stress lié à la contention ainsi qu’une douleur brève (1 sec) au moment de l’insertion de l’aiguille. Lors des réveils de l’anesthésie, les animaux connaissent quelques minutes de désorientation, rapidement résolues par la reconnaissance de leur environnement. Nous n’anticipons aucun effet indésirable après administrations des traitements anti-fibrotiques, ou à l’étape d’imagerie.

Devenir

Les animaux sont mis à mort afin de mesurer et quantifier la fibrose pulmonaire par des méthodes ex vivo classiques (histologie, dosage de protéines)

Remplacement

Le poumon est un organe complexe composé de plus de 40 types cellulaires différents et le phénomène de fibrose fait lui intervenir plusieurs processus (inflammation, remodelage tissulaire etc). Aucun modèle in vitro ne pourrait se substituer à une étude sur un animal entier. L’étude de la fibrose pulmonaire chez le rongeur est de ce fait le modèle d’étude de référence dans la littérature.

Réduction

Le nombre d’animaux indiqué correspond au nombre minimal requis pour remplir les conditions des tests statistiques. Ces chiffres ont été déterminé par test statistique, sur la base de données antérieures issues de l’équipe, pour valider la puissance des résultats attendus.

Raffinement

Le personnel impliqué dans ce projet, au-delà de la formation légale à l’expérimentation animal, aura une formation et l’habitude de l’application des procédures et du suivi des animaux spécifique des modèles murins de fibrose pulmonaire. Les transports des animaux seront réalisés dans des boites d’hébergement avec couvercle, entourées d’un sac opaque pour protéger les animaux des changements de luminosité et de température. Après exposition aux facteurs déclenchants de la fibrose, les animaux auront accès à un supplémentation d’alimentation (aliments gélifiés, morceaux de pommes, céréales) afin de limiter la perte de poids. Après chaque étape d’anesthésie à l’isoflurane, les souris seront placées sous lampe chauffante ou tapis chauffant pour favoriser le retour de l’anesthésie. Une attention particulière sera apportée à la reprise d’une activité normale des animaux après anesthésie. Avant la mise à mort, les animaux sont analgésiés et anesthésiés profondément et ne reprennent pas conscience.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car le processus de fibrose pulmonaire est bien documenté dans la littérature chez cette espèce, ce qui en fait un modèle d’étude validé par la communauté scientifique. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 14 semaines et avec un poids minimum de 21g. Ces critères correspondent à un stade de développement adulte de l’animal (développement des poumons, système immunitaire mature). D’après notre expérience des modèles, nous utiliserons des souris de poids supérieur à 21g afin de limiter la toxicité générale des produits inducteurs de fibrose.

Jusqu'à cinq séances de trente minutes d'enregistrement des démangeaisons, puis cinq autres séances de trente minutes de stimulation au toucher léger : 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Après un rasage sous anesthésie, elles reçoivent des injections locales d'une substance qui déclenche des démangeaisons chez l'humain, et le porteur décrit des démangeaisons spontanées d'intensité faible à modérée réparties sur les vingt à trente minutes qui suivent chaque injection. Le projet cherche à identifier quels nerfs de la peau cette substance active, avec l'espoir de traiter un jour les démangeaisons de l'eczéma ou du psoriasis. La substance n'est jamais nommée, désignée d'un bout à l'autre du résumé comme "la substance étudiée".

Objectifs

Ce projet a pour objectif d'identifier les nerfs de la peau activés par une substance induisant des démangeaisons chez l’homme. Pour cela, il étudiera si la substance étudiée est capable d'augmenter les démangeaisons induites par des substances de référence, qui induisent des démangeaisons en activant des nerfs bien identifiés. Inversement, il étudiera si ces substances augmentent les démangeaisons induites par la substance étudiée.

Bénéfices attendus

Actuellement, il n'existe aucun traitement spécifique des démangeaisons induites chez l’homme par la substance étudiée. Mieux connaître leurs mécanismes permettra à terme de développer des traitements spécifiques pour les soulager. Identifier les nerfs affectés est une première étape d'étude des mécanismes impliqués. Les bénéfices de ce projet en termes d’avancées scientifiques et thérapeutiques pourraient aussi s’étendre aux démangeaisons présentes dans d’autres maladies (eczéma, psoriasis).

Procédures

1) Rasage de la future zone d’injection, réalisé 1 fois sous anesthésie, éventuellement renouvelé 1 fois, durée maximale de 5 minutes. 2) Injection locale des substances de référence (1 ou 2 fois), de la substance étudiée (1 fois) et/ou d’une substance-contrôle (1 fois), durée maximale de 30 secondes.

Impact sur les animaux

1) Stress de faible intensité lors de l’anesthésie générale (durée < 5 min, réalisée 1 fois). 2) Stress et inconfort lors des manipulations et de l’injection (durée < 5 min, réalisées 2 fois ou 4 fois). 3) Stress lors de l’enregistrement des démangeaisons spontanées dans un espace dédié (durée 30 min ; réalisé 3 ou 5 fois). 4) Stress lors des mesures des démangeaisons induites par le toucher léger dans un espace dédié (durée 30 min, réalisées 3 ou 5 fois). 5) Démangeaisons spontanées localisées, d’intensité faible à modérée, intermittentes, d’une durée < 2 secondes chacune, réparties pendant 20-30 minutes suivant l’injection (réalisée 2 ou 4 fois). 6) Démangeaisons localisées induites par à un toucher léger, d’intensité très faible, d’une durée < 1-2 secondes uniquement en réponse au toucher léger appliqué. Épreuve réalisée 3 ou 5 fois, durée 30 min.

Devenir

En fin de procédure, il est prévu la mise à mort de tous les animaux (480) car leur exposition à la substance étudiée interdit leur réutilisation, replacement ou adoption et/ou ils sont destinés à des prélèvements post-mortem de tissus à des fins d'analyses.

Remplacement

Depuis plus de 10 ans, nous étudions les effets de la substance sur des modèles cellulaires. Nous avons montré l’implication de plusieurs mécanismes qui, cependant, peuvent aussi être à l’origine d’autres sensations que les démangeaisons, que nos modèles cellulaires ne permettent pas de distinguer. Nous continuerons à utiliser ces modèles cellulaires pour cette étude mais nous ne pouvons donc pas nous passer de l’expérimentation animale pour étudier les mécanismes des démangeaisons induites. Un 2ème aspect est l’implication de multiples types cellulaires dans les démangeaisons. Ces cellules ne peuvent pas être rassemblées dans un modèle cellulaire. Nous ne pouvons pas nous passer de l’expérimentation animale pour prendre en compte l’ensemble de ces types cellulaires.

Réduction

L’ensemble du projet a été conçu en vue de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés sans compromettre les objectifs ou l’analyse statistique des résultats. Étant donnée la variabilité́ des démangeaisons induites par la substance, nous prévoyons 20 animaux/groupe pour garantir des résultats robustes. Cependant, nous réaliserons toujours une 1ère série d’expériences sur 12 souris (minimum pour que des résultats se dessinent) suivie de son analyse, et ne complèterons que si nécessaire d’après ces 1ers résultats. Le nombre d’animaux prévu est un maximum qui sera réduit autant que possible en pratique.

Raffinement

Les responsables du projet mettront en œuvre des mesures pour assurer et maintenir le bien-être de chacun des animaux : enrichissement des cages (matériel de nidification et igloo), habituation des animaux aux manipulations et aux tests, renforcement positif (coupelle de gel appétant en récompense pendant l'habituation), points limites et stratégie d’analgésie. Des points limites prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus couramment utilisée comme modèle d’étude des démangeaisons. Le développement des nerfs impliqués dans les démangeaisons évolue chez la jeune souris jusqu’à l’âge de 3-4 semaines. Leur état de développement est stable à partir de l’âge de 5 semaines. Les souris âgées ne sont pas appropriées du fait de modifications physiologiques dues à l’âge. Nous utiliserons des animaux adultes âgés de 8 à 16 semaines.

Toutes tuées sous anesthésie à la fin d'une seconde chirurgie qui peut durer six heures, 120 souris transgéniques vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une première chirurgie d'environ 90 minutes leur injecte un vecteur viral, avec une douleur post-opératoire modérée attendue pendant 24 à 48 heures. Pendant la seconde, dont elles ne se réveillent pas, l'équipe stimule leurs neurones à dopamine et enregistre l'activité de l'hippocampe, puis, après leur mise à mort, prélève des organes pour des analyses histologiques. Le porteur affirme qu'aucune autre méthode, "ni modélisation ni culture cellulaire", ne permet cette étude, parce que les données sur le sujet sont "trop rares et parcellaires". Une meilleure compréhension de la maladie de Parkinson, de l'addiction ou du TDAH reste renvoyée "à plus long terme".

Objectifs

Dans ce projet nous explorerons par quels mécanismes la dopamine permet la plasticité neuronale responsable de la mémorisation chez la souris. Pour cela, nous provoquerons la modification des connexions entre neurones de l’hippocampe en stimulant les neurones à dopamine. Après la mise à mort des souris, nous prélèverons des organes pour étudier les modifications moléculaires et cellulaires déclenchées par de cette plasticité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes neurobiologiques de la mémoire chez les mammifères en général et chez l’homme en particulier. Il permettra d’identifier les mécanismes qui font qu’on se souvient de certaines choses et pas d’autres, et à plus long terme de mieux comprendre les troubles cognitifs associés à des dysfonctionements de la transmission dopaminergique, comme par exemple dans la maladie de Parkinson, dans l’addiction ou les désordre neurodéveloppementaux comme le Trouble du Déficit de l'Attention avec ou sans Hyperactivité (TDAH).

Procédures

Les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie générale, une première permettant l’injection d’un vecteur viral durera environ 90 minutes et une seconde pour les enregistrements électrophysiologiques et la stimulation des neurones à dopamine durera de 1 à 6 heures.

Impact sur les animaux

Les animaux seront exposés à deux anesthesies générales, une première d'une durée inferieure à 90 minutes et une seconde sans réveil (durée comprise entre 1h et 6h). La première chirurgie est susceptible d’induire une douleur post-opératoire modérée durant 24 à 48 heures. Les pesées nécessaires au suivi post-opératoire peuvent entraîner un stress léger de quelques dizaines de secondes.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure en vue d’analyses histologiques.

Remplacement

Le projet a pour objectif d’évaluer comment la dopamine déclenche la plasticité dans l’hippocampe. Ceci nécessite l’intégrité de l’ensemble du cerveau (l’hippocampe et le système à dopamine) et l’utilisation de souris transgéniques qui permettent de stimuler spécifiquement les neurones à dopamine avec une résolution de l’ordre de la milliseconde. Il n’est pas possible, à l'heure actuelle, d’étudier cela par d’autres moyens que l’expérimentation animale in vivo (ni modélisation ni culture cellulaire) car les données biologiques sur ce sujet sont trop rares et parcellaires.

Réduction

Cette étude étant exploratoire, le nombre d’animaux par groupe (n= 12) a été déterminé sur la base de d’études antérieures utilisant les mêmes techniques de mesure des modifications neurobiologiques induites par des plasticités synaptiques s’approchant de celle étudiée ici. Les tissus prélevés seront réutilisés pour mesurer plusieurs types de modifications moléculaires et cellulaires.

Raffinement

Pendant les jours qui suivent la première chirurgie, une fiche de suivi est remplie quotidiennement pendant tout le temps nécessaire à la récupération totale de l'animal. Si une altération de l’état de l’animal est observée suite à la chirurgie une grille de scoring sera utilisée pour déterminer la conduite à tenir. Les animaux seront anesthésiés et analgésiés avant le début de la première chirurgie. Des analgésiques seront également administrés en post opératoire le lendemain. Pendant les semaines qui suivront la chirurgie, les animaux seront inspectés tous les jours. Les animaux seront anesthésiés pendant toute la durée de la seconde chirurgie et tout au long des enregistrements électrophysiologiques, jusqu’à la mise à mort des animaux.

Choix des espèces

Dans cette étude, nous utilisons la souris en raison de sa pertinence comme modèle en neurosciences et de la disponibilité d’outils adaptés pour manipuler précisement les circuits neuronaux. Les animaux seront des jeunes adultes afin d’éviter les effets liés au développement ou au vieillissement.