Recherche fondamentale

36 souris privées d'un fragment d'ADN vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent huit heures à 4 °C, suivent quatorze semaines de régime riche en graisses, subissent deux prélèvements de sang sur animal vigile et deux anesthésies de quinze minutes, avec un isolement en cage individuelle pouvant durer quatre jours. Les bénéfices avancés, de nouvelles cibles contre l'obésité, le diabète ou les troubles rénaux, tiennent au conditionnel et supposent que ce fragment d'ADN joue bien le rôle qu'on lui prête. Le porteur affirme que ces fonctions métaboliques ne sont modélisables que dans un organisme complet, et que seul un mammifère permet une première collecte de données.

Objectifs

Ce projet a pour but de mieux comprendre le rôle d’une partie de l’ADN qui ne code pas pour une protéine, et qui était autrefois considérée comme peu utile. Pourtant, des recherches récentes suggèrent qu’elle pourrait jouer un rôle important dans le fonctionnement du corps, notamment dans la gestion de l’énergie, la régulation de la température corporelle et le bon fonctionnement des reins. Pour étudier cela, nous utiliserons des souris chez lesquelles cette portion de l’ADN a été supprimée. Elles passeront une série de tests pour évaluer leur métabolisme, leur comportement, leur poids et d’autres aspects de leur santé. Elles seront ensuite soumises à un régime alimentaire enrichi pendant 14 semaines, avec un suivi régulier. À la fin de l’étude, plusieurs organes seront analysés afin de mieux comprendre les effets de cette absence. Ce projet pourrait ainsi ouvrir la voie à de nouvelles pistes de recherche sur les maladies métaboliques ou rénales.

Bénéfices attendus

Dans ce projet, nous utilisons une approche complète pour étudier l’impact d’une portion particulière de l’ADN qui ne produit pas de protéine. En combinant des tests sur le comportement, l’activité du métabolisme, des analyses sanguines et l’étude de plusieurs organes à la fin de l’expérimentation, nous espérons obtenir une vision globale de son rôle dans le corps. Si cette partie de l’ADN est effectivement impliquée dans la régulation de la température, la production d’énergie ou le bon fonctionnement des reins, elle pourrait devenir une cible intéressante pour développer de nouveaux traitements contre des maladies comme l’obésité, le diabète ou les troubles rénaux. Les résultats de cette recherche pourraient aussi nous permettre d’améliorer la détection de certains problèmes de santé grâce à de nouveaux marqueurs biologiques, ou même de proposer des traitements plus ciblés à l’avenir.

Procédures

Les animaux seront exposés à un environnement à 4 °C pendant 8 heures. Ils suivront ensuite un régime riche en graisses pendant 14 semaines. Deux prélèvements sanguins seront réalisés sur animaux vigiles par contention, chaque prélèvement durant environ une minute. Les animaux seront également soumis à deux anesthésies médicamenteuses d’une durée de 15 minutes chacune.

Impact sur les animaux

Parmi les nuisances attendues, des contentions seront pratiquées, ce qui entraîne un stress léger. Les prélèvements sanguins peuvent entraîner une légère douleur. Les animaux seront isolés, ce qui entraîne un léger stress. Les animaux seront soumis au froid, pouvant entraîner une diminution transitoire de leur température corporelle.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de collecter les tissus pour réaliser des analyses moléculaires.

Remplacement

Ce projet vise à mettre en évidence l’impact de l’inhibition d’un gène sur des fonctions métaboliques complexes. Celles-ci ne sont modélisables que dans un organisme complet, capable d’exprimer l’ensemble des fonctions physiologiques de régulation (thermorégulation, fonction hépatique, fonction rénale). Seule une approche sur un mammifère permet une première collecte de données concernant les mécanismes physiologiques complexes mis en jeu dans cette étude (régulation des lipides, des glucides, dérèglements mitochondriaux et biochimiques, balance inflammatoire), fournissant de nombreuses informations qui pourront ensuite être utilisées dans une approche translationnelle visant à mieux comprendre la physiologie humaine..

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été déterminé au fur et à mesure de notre expérience. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 9 par groupe constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction de nombre d'animaux utilisés. Durant cette étude, nous allons générer des données qui seront analysées à l'aide de tests statistiques. Nous avons aussi conçu notre protocole afin d'utiliser une seule cohorte d'animaux qui suivra un ensemble de tests, afin de réduire autant que possible les animaux employés pour répondre à notre problématique scientifique

Raffinement

Nous suivrons l'état général des animaux, incluant le toilettage, la posture et la présence de vocalisations. Tous ces éléments nous permettront d'évaluer l'atteinte de points limites, pouvant entraîner l’euthanasie de l'animal afin d'éviter toute souffrance. Les animaux seront maintenus en groupes dans des conditions d'animalerie optimales, avec un accès illimité à la nourriture, à l'eau et à un environnement enrichi (nids en quantité suffisante, bâtons et balles à ronger). Si nécessaire, des soins locaux seront administrés. En cas de douleur, un antalgique pourra être administré conformément aux recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés chaque semaine, en plus du suivi quotidien habituel. Lors des prélèvements sanguins, le volume prélevé sera compensé par l'injection de sérum physiologique. Concernant les tests deux d’entre eux se déroulent dans des cages d’hébergement individuelles. La seule contrainte est donc l’isolement des animaux pendant 4 jours maximim. A la fin de ces tests, les animaux sont remis dans leurs cages d’origine avec les mêmes dispositions d’avant le test (les mêmes souris dans la même cage, et les cages sont gardées dans le même état qu’avant le début du test, et ceci afin que les animaux retrouvent leur environnement), les animaux sont surveillés afin de vérifier qu'ils ne se battent pas. . Les souris seront soumises à une température de +4 °c pendant 8h. Les souris s’adaptent bien au froid, leur température corporelle pouvant descendre de 37°C à 34°C. Néanmoins, tout animal dont la température corporelle chuterait en dessous des 34°C, montrant son incapacité à s’adapter au froid, sera sorti du test et remis quelques minutes dans un environemment à 37°C.

Choix des espèces

La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons justement du modèle d'intérêt porteur de modifications génétiques sur le gène d'intérêt. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine Les animaux démarreront leur protocole en tant que jeune adulte, à partir de 10 semaines. A ce stade, ils ont déjà une régulation métabolique qui est mise en place.

800 souris vont être utilisées, chacune mise à jeun quinze à seize heures avant de subir neuf prélèvements de sang au cours d'une séance de deux à six heures, l'opération étant répétée une semaine plus tard. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour prélever leur pancréas. Après anesthésie locale, la queue est incisée, puis vient une injection de glucose et, pour certains lots, un gavage avec une solution lipidique. Le porteur reconnaît que les contentions et le jeûne stressent les animaux, que les incisions font mal et que le gavage irrite l'œsophage. Les retombées annoncées, savoir s'il suffira un jour de greffer les seules cellules productrices d'insuline chez des personnes diabétiques, restent une perspective lointaine face à ces atteintes immédiates.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de comprendre l’influence d'un type particulier de cellules des îlots pancréatiques sur le maintien du taux de sucre sanguin dans des valeurs « normales » à la fois dans les conditions physiologiques (régime normal) et dans les conditions physiopathologiques (régime gras classiquement utilisé pour mimer des conditions diabétogènes).

Bénéfices attendus

Le diabète est une maladie grave qui s’étend. Il est lié à une augmentation anormale et prolongée de la concentration de sucre dans le sang : c’est l’hyperglycémie. Les petits organes qui libèrent les hormones régulant la concentration de sucre dans le sang (la glycémie) s’appellent les îlots du pancréas. Ils sont constitués de plusieurs types des cellules, les principales cellules des îlots sécrétent l’insuline, la seule l’hormone qui diminue la glycémie. Dans le diabète de type 1, ces cellules sont absentes. Dans le diabète de type 2, elles fonctionnent mal. En ce sens, ces cellules ont toujours été au centre des études sur la régulation glycémique en conditions normales et pathologiques. On connait donc très peu le rôle des autres cellules du pancréas dans ces mécanismes et surtout la manière dont elles influencent les cellules produisant l’insuline. Une autre limite de la plupart des études est d’avoir été centrées uniquement sur les effets du sucre (le glucose). En effet, l’alimentation contient d’autres nutriments : protéines, lipides…. Dans le présent projet, les chercheurs disposent de souris dont la particularité est de pouvoir supprimer certaines des autres hormones pancréatiques que l’insuline. La manière dont ces souris régulent leur glycémie suite à une administration de glucose combiné ou non avec d’autres nutriments pourra donc être étudiée et surtout comparée avec celle des souris « normales » qui ont dans leurs îlots tous les types d’hormones. Ceci apportera des informations cruciales sur le rôle de ces cellules dans ces processus. Pour mieux comprendre les interactions entre les différents types de cellules pancréatiques dans le diabète, certaines souris seront soumises à un régime gras qui mime certaines conditions favorisant le diabète de type 2. Les informations fournies par ce projet seront aussi cruciales par rapport au diabète de type 1. En effet, dans la perspective des futures thérapies cellulaires, nous saurons s’il suffit de greffer seulement les cellules produisant l’insuline ou un mélange équilibré des différentes cellules pancréatiques.

Procédures

Pour les tests de tolérance au glucose, 2 expériences effectuées à 1 semaine d’écart (durée du test de 2 à 6h) : animaux mis à jeûn la veille au soir (durée 15 à 16h), le jour J, une incision (2 secondes) de la queue sera faite après anesthésie locale , s’en suivra une injection (10 secondes) de glucose avec ou sans autres nutriments, 6 prélèvements très légers de sang (10 à 30 secondes) pour détermination glycémie (espacés de 15min à 1h) seront effectués et 3 prélèvements (1 à 2minutes) un peu plus importants de sang pour la détermination d’hormones (espacés de 15min à 45min), prélèvements de sang effectués dans le respect de la réglementation. Pour les animaux de certains lots, 1 gavage (20 secondes) avec une solution lipidique sera effectué (après injection de glucose).

Impact sur les animaux

Les contentions pourront être sources de stress, les mises à jeûns source de faim et de stress, les injections et les incisions sources de douleur et les administrations orales d'irritation de l’œsophage. Nous veillerons à réduire le stress au maximum, tous les gestes seront effectués par une personne formée et expérimentée et un anesthésique local sera appliqué avant les incisions. Dans les 24h suivant les expérimentations, si une perte de poids >10% est constatée, une alimentation enrichie sera mise à disposition des animaux concernés. Cette alimentation enrichie sera maintenue jusqu’à ce que ces animaux aient recouvré leur poids d’avant les tests. Des souris de ce type sont actuellement en élevage pour un autre projet, et d'après notre expérience avec ce type de protocoles, aucun effet délétère n’a été observé chez ces animaux.

Devenir

A l'issue de la procédure, les souris seront mises à mort en utilisant une méthode réglementaire et leur pancréas sera prélevé pour diverses expérimentations ex-vivo.

Remplacement

Même si des modèles in vitro à 2 organes se développent, les systèmes d’organes sur puce sont pour l’instant incapables de reproduire la complexité de l’homéostasie nutritionnelle des mammifères impliquant des interactions entre de nombreux organes (tractus digestif, îlots pancréatiques, foie, tissu adipeux, muscle, cerveau, rein…). Ces expériences ne peuvent donc se faire que sur un modèle de mammifère. Le modèle souris est le plus adapté car c’est le seul à ce jour permettant la suppression sélective des cellules dont nous voulons étudier le rôle dans les îlots pancréatiques. Il n’existe actuellement aucun simulateur modélisant l’homéostasie nutritionnelle qui est au cœur de cette étude. Toutefois, nous travaillons justement sur un simulateur de l’homéostasie glucidique. Les données acquises dans ce projet sur ces animaux seront entre autres destinées à enrichir ce simulateur renforçant ainsi la puissance de cette approche de simulation afin de réduire encore le recours à l’expérimentation animale dans le futur.

Réduction

Une réflexion approfondie a été effectuée pour réduire le nombre d’animaux tout en préservant une puissance statistique nécessaire sans laquelle il faudrait refaire l’étude. Les expériences effectuées lors de précédents tests montrent sans réserve la faisabilité du projet. Les tests in vivo décrits dans cette étude sont réalisés de manière courante depuis des années par notre équipe dans d’autres projets, mais sont aussi des tests courants largement utilisés dans les laboratoires qui travaillent sur le diabète au travers le monde, ils sont donc très standardisés. Il n’y a donc plus de mise au point technique et aucune perte d’animaux n’est à prévoir à ce niveau, ce qui contribue à limiter également le nombre d’animaux. Pour réduire encore le nombre de souris produites en élevage, nous réutiliserons les animaux d’un même lot pour 2 séries d’expériences ce qui permet de diminuer encore notre besoin total d’animaux, et enfin, après les tests in-vivo, les animaux produits seront utilisés pour récupérer leurs pancréas pour des investigations sur ces tissus au sein de la même étude. Ceci permet encore une réduction de moitié des animaux utilisés. Ainsi, 800 animaux des 2 sexes maximum avec l’application des mesures précédentes seront utilisés. Chaque lot sera optimisé pour que le nombre d’animaux utilisés assure une significativité statistique. Les règles statistiques communément admises seront appliquées (à savoir : si la répartition des résultats suit une loi normale, des tests statistiques paramétriques seront employés. Si la distribution des données ne suivait pas une loi normale, les tests non paramétriques appropriés seront appliqués).

Raffinement

Les animaux seront regroupés entre 5 et 10 animaux par cage pour éviter les effets délétères de l’isolement de ces animaux. Leur habitat sera enrichi des dômes et carrés de ouate pour la nidification. Un suivi quotidien des animaux sera effectué par le personnel de l'animalerie. Une habituation des animaux aux manipulations, contentions sera effectué la semaine précédant les tests. Les animaux seront pesés 1 fois par semaine et les 3 jours suivant les expérimentations pour les lots concernés. Une crème anesthésiante sera appliquée sur la queue des animaux avant les incisions et une crème cicatrisante sera appliquée en fin d'expérience avec un suivi et nursing si besoin des animaux. Des points limites adaptés sont établit et seront appliqués si l'état des animaux le nécessite.

Choix des espèces

Le modèle souris adulte est le plus adapté car c’est un mammifère dont le fonctionnement de l’organisme est transposable à celui de l’Homme adulte, notamment pour la régulation du glucose sanguin. C’est aussi le seul animal à ce jour permettant une suppression sélective de certaines hormones dans les îlots pancréatiques dans le modèle transgénique que nous proposons d’étudier dans ce projet. Les études in vivo sur ces animaux seront faites au stade jeune adulte, de 14 à 22 semaines.

Les souris de ce projet développent seules une maladie neurologique, avec perte de poids, retard de croissance, faiblesse musculaire et troubles de l'équilibre ou de la marche. 180 d'entre elles vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et tuées à un âge choisi ou dès qu'un point limite est atteint, pour que leurs organes soient examinés. Le porteur écrit pourtant que "les animaux ne vont pas subir d'intervention", la procédure consistant à les laisser tomber malades et à les observer. Leurs géniteurs, eux, retournent à l'accouplement pour produire d'autres animaux atteints.

Objectifs

Il existe plus de 1 000 maladies neurologiques d'origine génétique, dont plus de 500 affectent l’appareil neuromusculaire. La grande majorité d’entre elles ne disposent d’aucun traitement. Pour une fraction significative des cas (>30 %), l'origine moléculaire reste inconnue. L'objectif de ce projet est d'identifier de nouveaux modèles de maladies neurogénétiques apparaissant spontanément chez les souris de laboratoire élevées couramment pour d'autres projets. L’identification des défauts moléculaires chez la souris est partiellement facilitée par l’uniformité du fond génétique des souris de laboratoire.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont l’identification des nouveaux défauts moléculaires responsables de maladies neurologiques utilisables comme nouveaux modèles de maladie neurologique pour la recherche biomedicale. L’identification de nouveaux modèles de maladies neurogénétiques est une étape indispensable pour progresser dans la compréhension des mécanismes des maladies et pour favoriser le développement de nouveaux traitements.

Procédures

Les animaux ne vont pas subir d'intervention. Ils seront suivis régulièrement afin mettre en évidence l'apparition ou non de phénotypes dommageables puis ils seront mis à mort dès qu'ils atteindront l'âge requis pour un prélèvement d'organes post-mortem ou s'ils atteignent les points limites établis dans cette procédure. Leurs géniteurs seront remis en accouplement afin de générer d'autres animaux malades.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet pourront développer des problèmes neurologiques se manifestant avec une perte de poids, un retard de croissance, une faiblesse musculaire, des troubles locomoteurs ou de l'équilibre.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure et prélevées à différents âges pour vérifier les changements histologiques et biochimiques associés à leur pathologie.

Remplacement

Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle par un modèle in vitro, car les modèles cellulaires ne peuvent pas reproduire des problèmes neurologiques.

Réduction

Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux à utiliser, en nous limitant à utiliser seulement la fratrie, ainsi que les géniteurs des animaux développant des nouveaux phénotypes neurologiques d’apparition spontanée qu’on avèrera être d’origine génétique. Les fratries composées d'aucun animal à phénotypes dommageable ne seront pas étudiées.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la SBEA (Structure chargée du Bien-Être Animal), les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel compétent. En cas d’apparition de symptômes, nous ajoutons de la nourriture directement dans les cages, et utilisons des biberons avec tétine longue, pour permettre aux animaux de s'alimenter plus facilement. Si l'état des animaux atteint les points limites fixés, ils seront euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour les maladies neurologiques humaines, car l'organisation de son système nerveux est très similaire à celles de l'homme. A priori, il est impossible de savoir si les nouvelles souches auront une diminution de l’espérance de vie. Il est donc impossible d'établir à quel âge les animaux vont développer un phénotype neurologique, quel phénotype neurologique, ni si cela sera sévère. Il sera nécessaire de poursuivre une étude d’observation clinique dans le temps pour déterminer ces éléments. Les souris seront utilisées à divers stades post-naissance, avant qu’elles ne développent les points limites définis.

3 496 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune peut recevoir jusqu'à cinq gavages de bactéries, jusqu'à trois vaccinations, et une chirurgie d'ouverture de l'abdomen pour qu'on injecte des cellules tumorales dans la paroi de son cæcum. D'autres se voient déclencher un cancer colorectal par trois injections de produits chimiques, avec des douleurs abdominales, des diarrhées et une perte de poids attendues, plus une gêne de l'œsophage à chaque gavage. Le vaccin testé est fabriqué à partir d'organoïdes intestinaux, que le porteur décrit par ailleurs comme "ce qui se rapproche le plus d'un modèle de remplacement", tout en concluant que l'animal vivant reste "indispensable".

Objectifs

Le cancer colorectal est l'une des tumeurs malignes les plus courantes et la principale cause de morbidité associée au cancer dans le monde. De nouvelles stratégies sont justifiées pour prévenir ce cancer. Nous avons montré dans une étude précédente que la combinaison d'entéroïdes traités à l'oxaliplatine et de bactéries pro-inflammatoires pouvait induire une immunité contre les cellules de ce cancer dans des modèles murins, ce qui indique que les organoïdes dérivés de l'intestin pourraient constituer un nouveau vaccin pour la protection contre ce cancer. De nouvelles données indiquent que les patients atteints avec des tumeurs à forte instabilité ont une réponse supérieure au blocage des points de contrôle immunitaire. Nous avons également constaté un enrichissement différentiel de la composition du microbiote intestinal dans les biopsies de patients atteints du syndrome de Lynch par rapport à ceux qui n'en sont pas atteints. L'infection des entéroïdes par certaines espèces bactériennes a entraîné une mort cellulaire immunogène. Ainsi, la combinaison d'organoïdes et d'espèces du microbiote pourrait déclencher une réponse immunitaire anti-tumorale et servir de vaccin pour protéger l'hôte contre ce cancer.

Bénéfices attendus

Plusieurs stratégies de vaccinations seront utilisées ici, en combinaison avec ou sans immunothérapies, avec ou sans gavage oral de bactéries, avec ou sans antibiotiques, pour voir si le vaccin est capable de protéger la souris du cancer. Ce projet permettra de développer un vaccin visant à protéger les patients atteints du syndrome de Lynch du cancer colorectal.

Procédures

Les souris recevront jusqu'à 5 gavages oraux (bactéries ou sérum physiologique espacé de 3 jours entre chaque), durée 10 secondes, et jusqu'à 3 vaccinations (1 semaine de délai entre 2 vaccinations), durée 15 secondes sous anesthésie locale, Les souris auront une chirurgie pour la tumeur en orthotopique, par incision de la paroi abdominale antérieure pour injection sera réalisée dans la sous séreuse du caecum, sous analgésie et anesthésie générale, durée maximum 10 minutes. Certaines souris auront une induction de cancer colo-rectal par produits chimiques, 3 injections, durée 10 secondes, anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Les chirurgies abdominales, impliquant une incision dans la peau et le péritoine, peuvent provoquer des douleurs postopératoires modérées et de courte durée. Le traitement inducteur de cancer colorectal peut entraîner divers symptômes, tels que des douleurs abdominales, des changements dans les habitudes alimentaires, des diarrhées, une perte de poids et une altération de l'état général de l'animal, de façon transitoire, avec dese symptômes de gravité modérée. L'injection tumorale orthotopique, en raison de sa localisation, peut également provoquer des douleurs abdominales modérées. De plus, les antibiotiques peuvent induire des diarrhées d'intensité modérée et de courte durée, tandis que les gavages oraux provoquent une gêne légère et passagère au niveau de l'œsophage de la souris.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure pour analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale et l’effet des immunothérapies sur la réponse antitumorale dans un contexte de dysbiose intestinale, avec toutes les interactions nécessaires, impossible à reproduire in vitro. Les organoides sont ce que ce qui se rapproche le plus d'un modèle de remplacement, mais à l'heure actuelle, ce n'est pas encore assez développé pour comprendre toutes les interactions impactantes ayant lieu avec l'organisme, ainsi que le micro-environnement tumoral spécifique in vivo.

Réduction

Le nombre de a été déterminé au minimum nécessaire et suffisant par calcul de puissance. Les résultats seront analysés par tests de comparaison de moyenne ou analyse de variance non paramétriques.

Raffinement

Une surveillance quotidienne sera effectuée, et des mesures spécifiques de suivis seront appliquées suivant les procédures. Toutes les interventions seront faites sous anesthésie locale ou générale avec analgésie adpatée aux gestes. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation de souris est dicté par le fait que les organoïdes utilisées dans cette stratégie de vaccination sont développés sur souris. De plus, les souris présentent des similitudes génétiques et physiologiques importantes avec les humains, en particulier dans le domaine de la biologie du cancer. Le tractus gastro-intestinal des souris, bien que plus petit, fonctionne de manière similaire à celui des humains, et les structures cellulaires et tissulaires des intestins murins sont très proches de celles des humains, ce qui permet de reproduire de manière réaliste les processus tumoraux observés dans le cancer colorectal humain. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 8 semaines, ce qui correspond à leur maturité sexuelle et assure une stabilité hormonale. Cet âge est optimal pour garantir une réponse biologique cohérente et réduire les variations liées aux fluctuations hormonales. De plus, leur système immunitaire est pleinement développé, ce qui est essentiel pour l’étude de la progression tumorale et des réponses aux traitements, tout en permettant des interventions expérimentales.

Cinquante injections dans le ventre pour cent d'entre elles, vingt-trois pour cent autres, neuf pour les trente-six dernières : les 236 souris de ce projet reçoivent d'abord toutes une greffe de peau, un morceau de dos de la taille d'une demi-pièce d'un centime prélevé sur une congénère. La chirurgie dure trente minutes sous anesthésie et le pansement reste sept jours, gênant les déplacements et l'alimentation. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour prélever leur sang, la zone greffée et leur tube digestif. Le porteur cherche à savoir si une molécule produite par le microbiote intestinal protège du rejet de greffe, et compte parmi les retombées possibles le dépôt d'un brevet.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre comment éviter les rejets de greffe qui peuvent survenir dans les premiers mois suivant une transplantation. Le rejet est une réaction du système immunitaire du patient, qui considère l’organe greffé comme un corps étranger et essaie de le détruire. Cette réponse peut entraîner une dégradation rapide du greffon et compromettre la réussite de la greffe. Le traitement étudié dans ce projet est un médicament immunosuppresseur appelé CTLA4-Ig, déjà utilisé chez certains patients. Il a l’avantage de provoquer moins d’effets secondaires que les traitements traditionnels, mais il semble que chez certains patients, il ne soit pas suffisant pour empêcher un rejet aigu, surtout dans les premières semaines après la greffe. Nos recherches ont montré que le microbiote intestinal (les bactéries naturellement présentes dans notre tube digestif) pourrait influencer cette réaction de rejet. En effet, dans une étude portant sur 60 patients, ceux qui ne faisaient pas de rejet présentaient dans leur sang des traces de bactéries spécifiques et un niveau plus élevé d’une molécule produite par l’intestin. Nous avons testé cette molécule chez la souris, dans un modèle de greffe de peau. Les résultats ont montré que cette molécule pouvait prolonger la survie de la greffe lorsqu’elle était utilisée seule. En revanche, lorsque cette molécule était utilisée en même temps que le traitement immunosuppresseur, il n’y avait pas d’effet protecteur supplémentaire. Nous supposons que le modèle utilisé provoquait une réaction immunitaire trop intense. Dans ce projet, nous allons approfondir ces résultats en utilisant des souris génétiquement modifiées qui ne répondent pas à cette molécule, ainsi que différents types de greffes, déclenchant des réponses immunitaires plus ou moins fortes. L’objectif est de mieux comprendre comment adapter les traitements pour améliorer la tolérance des greffes.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude nous aideront à comprendre comment les molécules associées au microbiote peuvent influencer la survie des greffes. Nous pourrions ainsi prouver que des niveaux élevés de ces molécules sont liés à l'absence de rejet chez les patients traités avec une immunothérapie. Cela permettrait de prévoir le risque de rejet chez ces patients, ce qui aiderait à mieux évaluer si l'immunothérapie est bénéfique ou risqué pour chaque patient. Ces découvertes pourraient aussi soutenir le dépôt d'un brevet. Ces résultats aideront à comprendre le mode de fonctionnement des molécules associées au microbiote et comment elles agissent pour bloquer le système immunitaire. À long terme, ces recherches pourraient conduire au développement de traitements qui modifient le microbiote ou utilisent des molécules du microbiote pour prévenir le rejet des greffes.

Procédures

Nous réaliserons une greffe de peau sur 236 souris, la chirurgie durera 30 min par animal sous anesthésie. Le jour précédant cette greffe, 100 animaux recevront une injection. Après la chirurgie, ces animaux recevront des injections tous les deux jours dans l’abdomen. Les injections dureront 2 à 3 minutes. Deux jours avant la chirurgie, un prélèvement de sang à la joue sera réalisé sur ces mêmes animaux, sous anesthésie. Un prélèvement durera 5 minutes et sera répété deux fois par mois, soit 4 prélèvements par animal. Après la chirurgie, 136 animaux recevront une injection, dans l’abdomen, tous les deux jours pendant 8 jours puis deux fois par semaine. En résumé : 100 animaux auront une greffe de peau, 50 injections et 4 prélèvements ; 100 animaux auront une greffe de peau et 23 injections ; 36 animaux auront une greffe de peau et 9 injections.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, une opération sera réalisée sur des souris : un morceau de peau du dos de la souris, de la taille d’une demi pièce d’un centime, sera retiré et remplacé par un morceau de peau d’une autre souris. Les animaux seront anesthésiés pendant l’intervention, c’est-à-dire endormis, ce qui peut être stressant pour eux au réveil. Comme pour toute opération, cela peut provoquer une gène pendant quelques jours (2 à 4 jours) à cause de la cicatrisation. Un pansement sera mis en place pour protéger la greffe. Ce pansement aide à la guérison, mais il peut gêner les mouvements et l’alimentation, ce qui peut faire que les animaux prennent un peu moins de poids que d’habitude. Il est retiré après 7 jours. Après l’opération, certaines souris recevront un ou deux traitements pour empêcher leur corps de rejeter la greffe. Ces traitements seront injectés dans le ventre plusieurs fois par semaine. Ces piqûres ne sont pas très douloureuses, mais comme elles sont répétées au même endroit, elles peuvent devenir gênantes pour l’animal. La dose de traitement ne provoque pas d’effets secondaires connus. Si le corps de la souris rejette la greffe, cela peut aussi causer de la douleur, qui sera surveillée et soulagée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin d'expérience afin de réaliser les prélèvements terminaux. Du sang sera prélevé pour étudier les molécules en lien avec l'immunité. Nous analyserons les cellules immunitaires de la zone de la greffe et du tube digéstif. Enfin, les organes contenant un grand nombre de cellules immunitaires seront prélevés afin d'analyser ces cellules. Ces prélèvements sont nécessaires pour répondre à notre question scientifique.

Remplacement

Nous avons jusqu'alors utilisé des échantillons provenant des patients traités contre le rejet après une greffe. Nos précédentes études utilisaient des cellules humaines issus de ces échantillons. L'utilisation de souris nous aidera à confirmer nos observations dans un contexte où la greffe interagit avec les molécules produites par l'ensemble des cellules de l'organisme. Une étude en laboratoire (in vitro) ne reproduit pas cette interaction complexe et ne permet pas d'étudier toutes les connexions entre le traitement, les cellules et le rejet de greffe. De plus, la dose de traitement anti-rejet est similaire à celle donnée aux patients transplantés, à la fois au site de la greffe et dans les ganglions voisins.

Réduction

Nous nous sommes attachés à réduire le nombre d'animaux dans cette expérimentation. Nous avons utilisé des méthodes statistiques, nos précédents résultats et la littérature scientifique afin de déterminer un nombre d'animaux par groupe permettant de répondre à notre question scientifique. Dès que possible les groupes d'animaux contrôles ont été réduit ou mis en commun pour réduire le nombre d'animaux.

Raffinement

Les greffes seront réalisées sous anesthésie générale, ce qui signifie que les souris seront complètement endormies pendant l’opération et ne ressentiront aucune douleur. Pour leur confort, elles seront placées sur un tapis chauffant pendant toute la durée de l’intervention et jusqu’à leur réveil, afin de maintenir leur température corporelle. Un traitement contre la douleur sera donné avant et après l'opération. Les souris recevront également une nourriture adaptée, posée au sol, surtout si elles ont du mal à se déplacer. Le bien-être des animaux sera contrôlé tous les jours pendant la première semaine, puis au moins trois fois par semaine par la suite. Une grille d’évaluation spécifique sera utilisée pour repérer les signes de douleur ou d’inconfort. En fonction du score obtenu, des soins ou un traitement contre la douleur seront apportés.

Choix des espèces

Le modèle souris est essentiel pour cette étude, car il permet de bien contrôler les conditions de l’expérience. On peut choisir avec précision les différences entre la souris qui reçoit la greffe et celle qui la donne, notamment au niveau du système immunitaire. Cela permet de mieux comprendre comment le corps réagit contre la greffe. Les autres méthodes, comme les tests sur des cellules en laboratoire, ne permettent pas de reproduire toutes les interactions entre les différentes cellules du système immunitaire, ni leurs déplacements dans le corps. Enfin, les animaux non mammifères n’ont pas un système immunitaire comparable à celui de l’humain. La souris est donc le modèle le plus adapté pour répondre aux questions de cette recherche. Les animaux seront utilisés à un âge de 2-3 mois, au stade de jeune adulte. En effet, le traitement anti-rejet est plus efficace sur des animaux jeunes.

Deux semaines d'acclimatation, puis une chirurgie du crâne sous anesthésie pour injecter un virus dans le cerveau et poser une fenêtre crânienne ou un implant. Trois à quatre semaines de récupération, un déménagement vers un second établissement, sept jours pour s'y faire, une nouvelle anesthésie pour fixer une barre en titane sur la tête. Vient enfin le contrôle hydrique, un à deux mois de restriction d'eau pendant lesquels les 750 souris, la tête immobilisée, travaillent jusqu'à une heure par jour à une tâche de choix, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont ensuite tuées pour qu'on vérifie au microscope si les injections avaient bien atteint les coordonnées visées.

Objectifs

La prise de décision est un processus crucial qui régit chacun de nos comportements les plus évolués. Tandis que nous apprenons de notre environnement et prenons des décisions sur la base de ces connaissances, nous conservons également la capacité d’adapter notre comportement face aux modifications soudaines de l’environnement. Cette adaptation serait favorisée par l’équilibre entre les comportements d’exploitation (c'est-àdir l'utilisation des connaissances déjà disponibles pour obtenir un gain connu) et ceux d’exploration (c'est-à-dire la recherche d’options plus favorables). Cette hypothèse résulte des études cognitives menées chez l'homme, les primates non humains et les rongeurs. L’objectif général de ce projet est d’étudier les mécanismes cérébraux responsables de la transition entre comportements d’exploitation et d’exploration chez la souris. De nombreuses structures corticales et sous-corticales pourraient participer à ce phénomène. En particulier, des recherches récentes proposent que le cortex moteur secondaire (M2) des rongeurs constitue un noeud critique permettant le contrôle flexible des actions volontaires. Ce constat est étayé par la spécificité de cette structure ayant un rôle démontré dans les comportements flexibles. Ce projet qui se déroule dans deux établissements utilisateurs vise donc à éclairer le rôle du cortex moteur secondaire pour décider quand explorer ou quand exploiter l'environnement. Pour cela, nous utiliserons l’imagerie cérébrale des structures d’intérêts lorsque la souris est soumise à un test comportemental permettant de quantifier les comportements d’exploitation et d’exploration. Enfin, nous testerons le rôle causal des connexions neuronales identifiées pendant l'exploration et l'exploitation en effectuant des manipulations sélectives des différentes voies sous-corticales.

Bénéfices attendus

Cette étude est avant tout un projet de science fondamentale visant à comprendre les principes neuronaux permettant l’adaptation de la prise de décision dans des environnements changeants. Au-delà de cet aspect fondamental, ce projet possède une forte composante translationnelle. En effet, l'accent mis sur l'exploitation-exploration des actions volontaires est central dans les neurosciences cognitives, en particulier pour la recherche sur les primates humains et non humains. En outre, l'incapacité à résoudre efficacement le compromis exploitation-exploration est une caractéristique frappante de plusieurs troubles mentaux comme la schizophrénie, les troubles de l’attention et de l’hyperactivité et la depression. En conséquence, ces patients présente moins de flexibilité d’apprentissage, s’adaptent moins aux nouveaux environnements, utilisent des strategies habituelles et présentent une extinction plus rapide des apprentissages. Notre projet permet d’étudier ces paramètres chez l’animal lors d’une tâche comportementale pour comprendre le rôle des régions cérébrales impliquées.

Procédures

Les animaux seront d’abord acclimatés à leur hébergement dans le premier établissement utilisateurs pendant 2 semaines. Puis les animaux seront soumis à une chirurgie avec injection d’un virus puis pose d’une fenêtre crânienne ou pose d’un implant. Ces chirurgies se feront sous anesthésie, tous les animaux auront une injection de virus, 250 animaux auront une chirurgie avec pose d’une fenêtre crânienne et 500 animaux la pose d’un implant. Après 3 à 4 semaines de récupération et de surveillance post-opératoire, les animaux seront déplacés dans le deuxième établissement utilisateurs puis acclimatés à leur nouvelle animalerie pendant 7 jours. Ensuite, les animaux auront une anesthésie pour permettre la pose d’une barre en titane nécessaire au comportement qui se fait en « tête restreinte », ils seront soumis à contrôle hydrique qui durera entre 1 et 2 mois. Pendant cette période, les animaux auront l’étape de comportement avec 3 phases : l’habituation (7 jours), l’apprentissage (10 jours) et le contrôle (au minimum 1 mois). Pour la phase d’habituation les animaux auront des essais durant 20 minutes. Pendant la phase d’habituation et de contrôle, les animaux auront au maximum une session d’une heure par jour.Les chirurgies pour l'injection du virus puis la pose d'une fenêtre crânienne ou la pose d'un implant se feront dans le premier établissement utilisateur. La pose de la barre en titane, le contrôle hydrique ainsi que le comportement auront lieu dans le second établissement utilisateur.

Impact sur les animaux

Le projet peut induire des effets indésirables sur les animaux : ● Le risque de douleur durant la chirurgie● Le risque de douleur aiguë liée à la récupération post-opératoire. ● Le risque d’infection des implants. ● Le contrôle hydrique ● Contention « tête-restreinte »

Devenir

A l’issue des procédures les animaux sont mis à mort. Il est nécessaire de réaliser des contrôles histologiques ou des expériences d’immunohistochimie sur les cerveaux fixés afin de valider les coordonnées des sites d’injection des virus et des sites d'enregistrement.

Remplacement

L’étude des mécanismes de la prise de décision est un enjeu sociétal et économique majeur des neurosciences modernes, comme le relèvent de nombreuses situations humaines inadaptées (prise de risque, addiction au jeu, compulsivité, troubles psychiatriques). Par définition, ces mécanismes ne peuvent être étudiés que chez des animaux vigiles confrontés à une situation de choix. Dès lors, aucun des modèles in vitro ne peut être utilisé ici. Par ailleurs, les mêmes mécanismes comportementaux (transition exploitation / exploration) sont en jeu chez les primates humains, non-humains, et les rongeurs, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez le rongeur à l’espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques en jeu dans la prise de décision et permettra de jeter les bases d'études plus appliquées.

Réduction

La nature innovante des méthodes utilisées (imagerie biphotonique chronique, et optogénétique chronique), ainsi que la qualité de la mise en œuvre des procédures (basée sur une expertise reconnue de l’expérimentateur) permettront de réduire significativement le nombre des animaux. En effet, certaines tâches dans les procédures mettent en jeu des techniques non invasives et non douloureuses qui seront réalisées de façon quotidienne pendant le comportement chez le même animal. Ces techniques modernes permettent donc de façon intrinsèque de réduire dramatiquement le nombre d'animaux utilisés, avec une qualité de mise en pratique assurant la reproductibilité des expérimentations entre les laboratoires. Par ailleurs, afin de limiter le nombre d’expériences et donc d’animaux, la taille de nos groups expérimentaux est définie par l’utilisation de tests statistiques.

Raffinement

Le projet comprend des chirurgies qui se feront sous anesthésie générale avec une couverture antalgique grâce à la buprénorphine injectée avant et après la chirurgie. Une injection de Mélloxicam en sous cutanée sera réalisée après la chirurgie pour augmenter la durée de la couverture analgésique. La couverture antalgique agira dès le réveil de l’animal et sera maintenue avec une injection de Buprénorphine et de Méloxicam24h post chirurgie. Si l’animal montre des signes de souffrance de nouvelles injections seront réalisées toutes les 24h. La procédure d’implantation, bien que non invasive et non douloureuse se fera malgré tout sous anesthésie générale avec une couverture antalgique qui agira dès le réveil de l’animal et qui sera maintenue si l’animal montre des signes de souffrance. La procédure d’anesthésie a été raffinée et permet d'être rapidement inversée par l’injection d’une solution de réveil, permettant ainsi d’éviter au maximum les problèmes et inconforts liés à une anesthésie pharmacologique. Les animaux ne sont jamais isolés mais maintenus en groupe sociaux (5 par cage avec nourriture adaptée et enrichissement : nid, maison et tunnel) et manipulés/habitués quotidiennement par le même expérimentateur. Les tests comportementaux sont ainsi réalisés lors des phases actives des souris et elles ne sont pas dérangées lors de leurs phases inactives. Les résultats avec des souris en cycle inversé seront plus pertinents sur le plan éthologique et fourniront des données plus fiables si elles sont menées pendant la phase sombre, alors que les souris sont normalement éveillées et actives. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée (2 fois par jour) après le contrôle hydrique. Les animaux sont transférés entre les deux EU qui sont situés dans le même bâtiments dans leurs cages d'hébergement avec des chariots spécifiques. Les cages sont placées dans des sacs en kraft pour les isoler de la lumière et de tout contact visuel.Des points limites spécifiques suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des Vertébrés. L’organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l’homme, les propriétés du néocortex de la souris ont de nombreuses similitudes avec le néocortex des autres mammifères, y compris les humains. Par ailleurs, les mêmes mécanismes comportementaux qui nous intéressent ici (transition exploitation / exploration) sont en jeu chez les primates humains, non-humains, et les rongeurs, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez le rongeur à l’espèce humaine sans avoir recours à des primates non-humains. Les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris seront donc largement transférables à l'homme, et permettront de mieux comprendre les mécanismes synaptiques en jeu dans la prise de décision en général tout en jetant les bases d'études plus appliquées chez les humains. Le projet sera réalisé sur des animaux de 6 semaines ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stables le temps de nos protocoles, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection.