Recherche fondamentale

Provoquer une arthrite chez des rongeurs pour voir si un vaccin l'empêche : 300 souris et 100 rats vont être utilisés dans ce but, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour analyse de leurs tissus. Les souris reçoivent deux doses de vaccin sous la peau, les rats une administration sous-cutanée et nasale, avec des prélèvements de sang et de salive sous anesthésie à trois reprises en un mois. Les rats sont ensuite exposés par la bouche à une bactérie, quatre jours sur sept pendant un mois, jusqu'à développer une inflammation articulaire que le porteur prévoit de traiter par anti-inflammatoires. Cette bactérie n'est jamais nommée, désignée d'un bout à l'autre du résumé par les seuls mots "cette bactérie".

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont : -Determiner le meilleur schéma d’immunisation ainsi que la voie d’administration adaptée chez le rat et la souris -Determiner les conséquences cliniques de l’immunisation sur la survenue d’arthrites chez les rongeurs.

Bénéfices attendus

L’impact fondamental de notre étude est de montrer qu’une immunisation contre cette bactérie présente un avantage majeure dans la prévention des maladies articulaires inflammatoires via une vaccination anti-bactétien et une alternative aux biothérapies.

Procédures

Vaccination sous cutannée Prélèvements sanguins et t salivaires: J0, J15, J30 Les prélèvements sanguins et salivaires sont réalisés sous anesthésie 2 doses vaccinales seront effectués chez la souris sous cutané + intre nasale chez le rats 2 doses de vaccin, la voie sera determiné en fonction des résultats chez la souris. La durée des prelèvements salivaire est de 5 à 10 minutes maximum. L'administration des vaccins chez la souris et le rat dure pour chaque animal environ 1 minute. L'exposition à cette bactérie chez le rat est de 1 mois, il s'agit d'une administration orale (le rat lèche une solution contenant cette bactérie), le rat est exposé 4 jours sur 7 pendant 1 mois. La durée d'exposition quotidienne est d'environ 5 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Effet indésirable : douleur lors de la réalisation des prélèvements sanguin et des vaccinations sous cutané : à cet effet une analagésie efficace sera mis en place lors de l’expérimentation En cas de survenue d'arthrite, une analgésie par anti inflammatoire non stéroidien (AINS) connus pour leurs effets efficaces sur les arthrites inflammatoires sera mis en place.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience pour prélèvement de tissus afin d’effectuer des analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet est une étude préclinique visant à évaluer l’efficacité vaccinale muqueuse et sous cutanée d’une nouvelle stratégie. Ces modèles animaux sont les modèles de référence pour l’évaluation de stratégies vaccinales anti-bactérienne. Ils sont l’étape indispensable avant le passage chez l'Homme. Il n’existe pas de méthodes alternatives in vitro pour étudier la réponse immunitaire induite par un vaccin.

Réduction

Ce nombre a été déterminé en tenant compte des différentes voies d’administrations des vaccins, en tenant compte du nombre de vaccins à tester (5 vaccins différents) et des groupes à tester. Nous avons utilisé le minimum possible par groupe afin de pouvoir mettre en évidence des différences significatives éventuelles. Nous avons aussi tenu compte du nombre de fois nécéssaire à répéter l’expérience afin de montrer que la mise en évidence d’un quelconque effet ne soit pas lié au hasard

Raffinement

Les animaux seront suivis régulièrement pendant toute la durée du projet (l’ensemble des éléments contenus dans la grille de scoring seront intégrés dans les points limites : -Des mesures en amont seront pris pour la douleur comme une analgésie et une sédation efficace, une surveillance accrue lors de la phase de réveil post prélèvement, ainsi qu’une surveillance du comportement et une analyse par echelle visuelle analogique, une surveillance pondérale sera effectuée les jours suivants et durant la permanance des animaux à l’animalerie. -Les éventuels effet indésirable des vaccins chez les animaux sains seront monitorés et si ces effets conduisent à un état douloureux important, une analgésie adéquate sera effectuée. Les différents modèles animaux sont par ailleurs connus pour developper une inflammation articulaire importante lors de l’exposition bactérienne. Une surveillance biologique et par imagerie régulière sera effectuée afin de détecter rapidement la survenue d’arthrite et de prendre en charge par des moyens thérapeutiques (exemple des analgésies) - Les animaux seront manipulés sans stress, par des personnes compétentes. Surveillance adaptée des animaux. Naturellement nous avons introduits dans ce projet une grille de points limites qui seront surveillés strictement dans la réalisation de notre expérimentation .

Choix des espèces

Les animaux choisis dans ce projet sont les modèles les mieux adaptés pour le développement de modèles immunologiques. Nous avons sélectionné ces deux espèces pour étudier l’immunogénicité des stratégies vaccinales (procédure expérimentale). En effet la souris représente le modèle idéal d'étude des schémas d'immunisation avec les différents voies d'administration, la production d'anticorps neutralisant et les différents vaccins contre cette bactérie. Après validation du schéma vaccinal et d'immunisation chez la souris, on passera à l'étude chez le rat, il présente la caractéristique intéressante de présenter une arthrite strictement inflammatoire, proche des arthrites inflammatoires humaines, quelques mois exposition gingivale à cette bactérie ainsi la réalisation d'un vaccin de vaccin sur la survenue de la maladie. Age souris 8 semaines - rats 4 semaines:il s’agit de modèle d’arthrite survenant précocement d’où l’intérèt d’un modèle immunisant juvénile.

Une partie des souris utilisées est dépourvue de système immunitaire, donc exposée aux infections, et une autre partie est castrée avant même sa maturité sexuelle. 3 720 souris au total vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des tumeurs de mélanome ou de cancer du sein, un implant sous la peau, des injections jusqu'à trois fois par semaine, une prise de sang hebdomadaire et deux séances d'irradiation, la croissance des tumeurs pouvant gêner leurs déplacements, se nécroser et gagner les poumons. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure, l'objet déclaré étant de comprendre pourquoi les femmes résistent mieux au cancer que les hommes.

Objectifs

En France, les cancers sont non seulement plus fréquents mais aussi plus mortels chez les hommes que chez les femmes. Les mécanismes responsables de ces différences liées au sexe dans les cancers sont peu documentés et probablement complexes. A côté du mode de vie (consommation d'alcool, de tabac ...) qui peut varier entre les hommes et les femmes, nous pensons que des facteurs biologiques qui sont différents en fonction du sexe tels que les hormones sexuelles (estrogènes, androgènes) ou encore des facteurs génétiques (gènes du chromosome X ou du chromosome Y) pourraient aussi contribuer à expliquer la meilleure résistance des femmes au cancer en augmentant leur réponse immune anti-tumorale. Les grands objectifs de notre projet sont doubles. D’une part, nous identifierons si des facteurs génétiques liés au sexe contribuent aux meilleures réponses anti-tumorales chez les femelles et influencent leur réponse aux immunothérapies. D’autre part, nous évaluerons si les hormones sexuelles féminines (estrogènes) participent aux meilleures réponses immunitaires chez les femelles.

Bénéfices attendus

Bien qu'observables pour la plupart des cancers, les mécanismes à l'origine des différences dans le cancer entre les hommes et les femmes sont encore très peu explorés et largement négligés dans le diagnostic et la prise en charge thérapeutique. Il est en effet admis que la plupart des cancers se déclarent non seulement plus tôt chez les hommes mais que leur incidence et leur taux de mortalité associée sont plus élevés chez les hommes en comparaison aux femmes, supposant de meilleures réponses immunes antitumorales chez les femmes. Notre projet permettra de contribuer à identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires à l'origine de ce dimorphisme sexuel dans l'immunité anti-tumorale. Ces mécanismes pourraient être exploités pour les thérapies de nouvelle génération et la gestion du cancer en fonction du sexe.

Procédures

Les animaux pourront subir : - Une castration, réalisée chez des animaux sous anesthésie générale (injection, 30 sec), opération qui dure moins de 10 min par souris mâle ou femelle - Implant sous la peau réalisée sous anesthésie générale ( 30 sec), dure moins de 5 min - - des injections sous-cutanées et intraveineuses (durée moins de 1 min) au maximum 3 fois par semaine - - des prélèvements veineux de sang - 1 min - au maximum 1 fois/semaine pendant la procédure - deux irradiations de moins de 4 minutes chacune

Impact sur les animaux

Les lignées génétiquement modifiées que nous utiliserons, et dont nous disposons d’ores et déjà au laboratoire dans ce projet n’ont pas de phénotype dommageable hormis les souris immunodéficientes. Ces souris dépourvues de système immunitaire sont plus sujettes aux infections. Une partie des animaux sera ovariectomisée ou castrée. Les animaux récupèrent parfaitement de ces opérations. Cependant, la chirurgie peut induire des douleurs abdominales modérées post-opératoires. Les injections réalisées aux animaux sont associées à des douleurs locales modérées et transitoires au point d’injection. La croissance des tumeurs primaires de mélanome et de cancer du sein peut induire des difficultés de déplacement. La croissance tumorale peut aussi être associée au développement de nécrose. Le lieu préférentiel de métastase du mélanome est le poumon et peut donc être accompagnée de troubles respiratoires. Globalement, la pousse tumorale et le développement de métastases peuvent être associés à une altération de l’état général (absence de nidification, absence de toilettage, asthénie, léthargie, tremblement, dos arqué) et à une perte de poids. De plus, un stress peut être généré chez l’animal par les manipulations répétées (contention lors des injections et de la mesure du volume tumoral). Une grille de scoring decrit avec précision les actions à mener.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Les réponses immunes anti-tumorales misent en place pour l’élimination efficace des cancers sont complexes. Elles nécessitent l’implication de plusieurs types de cellules immunitaires qui agissent de manière coordonnée dans le temps (avec des cinétiques précises) et dans l’espace (site tumoral, site de dissémination métastatique, ganglions lymphatiques drainant). Ces différentes étapes ne peuvent pas être mimées in vitro.

Réduction

Une étude approfondie de la littérature a été réalisée. Elle nous a permis de choisir les modèles les mieux adaptés pour répondre à nos questions scientifiques mais aussi d’adapter le nombre minimal d’animaux nécessaires. Nous avons aussi interrogé des chercheurs maitrisant ces modèles et leur robustesse. Nous en avons conclu que le nombre minimal d’animaux est de 10 par groupe. Le calcul d'effectif a été réalisé en utilisant un test non paramétrique de rang. Les expériences seront reproduites 2 fois. Un maximum d’étude sera réalisé sur le même animal : étude longitudinale de mesure de la pousse tumorale et étude cytométrique/transcriptomique/histologique sur les tissus post-mortem.

Raffinement

Toutes les procédures seront réalisées par du personnel formé à l'expérimentation animale et détenteur du diplôme de chirurgie expérimentale quand cela le nécessite (ovariectomie, castration). Lors de la réalisation des procédures, des précautions et mesures adaptées seront prises pour réduire au mieux le stress et la souffrance des animaux. Afin de limiter les risques d'infection des animaux, en particulier les animaux immunodéficients, les animaux seront placés dans des cages placées sur portoir ventilé et les expérimentateurs seront munis de protection personnelle (combinaison, masque, charlotte, surchaussures, gants). L’environnement de toutes les cages sera enrichi (igloos, sizzelnest pour la nidification, rouleaux en carton) et de la nourriture/eau gélifiée rajoutée dans la cage si nous notons que les souris perdent du poids sans que les points limites ne soient atteints. Du serum physiologique tiédi pourra être injecté en cas de déshydratation. Un collyre anésthésiant sera appliqué sur l'oeil avant les injections en retro-orbitaire. L’ovariectomie, la castration et l’implantation des cellules tumorales mammaires sera réalisée sous anesthésie générale. Un anesthésique local sera administrée au point d'incision pour limiter la douleur. Durant l’opération du gel oculaire sera appliqué afin d’éviter tout dessèchement de la cornée. Durant et après la chirurgie, les animaux sont placés sur un tapis chauffant afin de limiter l’hypothermie et ce jusqu’à leur réveil. En péri-opératoire (avant et après la chirurgie), les animaux seront analgésiés pendant 24 heures. Une surveillance accrue pendant les 3 jours post-chirurgie sera réalisée afin de détecter tout signe de douleur et de détresse. Des points limites spécifiques ont été établis et sont décrits pour chaque procédure. S’ils devaient être atteints, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Les acteurs de la réponse immunitaire anti-tumorale chez la souris sont très similaires à ceux de l'Homme. A ce jour, la souris représente le meilleur modèle animal pour étudier la réponse immunitaire anti-tumorale qui est une réponse intégrée dans le temps (précoce avec la réponse immunitaire innée, plus tardive avec la réponse immunitaire adaptative) et dans l'espace (sur le site tumoral ou dans les organes lymphoïdes). Une partie des souris devra être castrée avant maturité sexuelle (4-6 semaines), donc avant toute sécrétion d'hormones sexuelles. Toutes les autres procédures seront réalisées sur des animaux agés de 8-30 semaines. Cet âge correspond à l'âge adulte chez la souris, période durant laquelle nous souhaitons étudier l'impact des facteurs liés au sexe sur la réponse immune anti-tumorale.

Les femelles sont tuées pour qu'on récupère leurs embryons, et les embryons pour qu'on prélève leur cerveau. 964 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 164 femelles gestantes subissent une ouverture de l'abdomen sous anesthésie, jusqu'à quarante-cinq minutes, puis vivent seules en cage de une heure à une semaine, et 800 embryons reçoivent dans le cerveau, à travers un capillaire de verre, une injection que le porteur qualifie lui-même de douleur aiguë et modérée. Sur ce total, 20 femelles et 160 embryons servent à former de nouveaux intervenants aux gestes.

Objectifs

Notre recherche est orientée vers l’étude des maladies du développement du cerveau d’origine génétique. En particulier, l’objectif principal de notre travail est de mieux comprendre, au cours de ce processus complexe de développement, les mécanismes nécessaires à la maturation des cellules souches neuronales en neurones. Ici nous souhaitons comprendre comment le contrôle de la synthèse protéique participe au développement du cerveau. Nous avons récemment mis en évidence un rôle clé des acides ribonucléiques de transfert qui sont des petites molécules adaptatrices de la traduction protéique. Cependant, il reste à étudier comment les voies moléculaires liées à ces molécules adaptatrices contribuent à la génération des neurones. Nous souhaitons donc étudier la teneur en molécules adaptatrices dans les cellules souches neuronales et les neurones à différents stades du développement du cerveau in vivo chez la souris. Pour isoler les différentes populations cellulaires présentes à des stades clés, nous nous appuyons sur une technologie dite FlashTag qui consiste en l’injection, dans les cerveaux d’embryon de souris, d’une molécule fluorescente. En mettant à mort les animaux à des temps variés après injection nous pouvons marquer différentes populations cellulaires dont la date de naissance correspond au stade auquel l’injection a eu lieu. En combinant FlashTag et le tri de cellules basé sur la fluorescence (FACS) , nous souhaitons isoler des populations pures de cellules à différents stades du développement sur lesquelles nous réaliserons un séquençage des acides nucléiques de transfert. Nous avons 3 objectifs : 1. déterminer si, au sein des cellules proneuronales, les quantités d’acides ribonucléiques de transfert varient au cours du développement 2. déterminer si, au cours de la spécialisation de la cellule en neurone, les quantités d’acides nucléiques de transfert sont différentes. 3. déterminer si, au cours de la maturation du neurone, les quantités d’acides nucléiques de transfert varient Au total, un nombre de 144 souris gestantes, soit environ 640 embryons (+512 embryons de stade inférieur aux 2/3 de gestation) seront utilisés dans cette étude. Nous ajouterons 20 femelles et 160 embryons pour la formation de nouveaux intervenants

Bénéfices attendus

Notre étude permettra de comprendre la fonction du contrôle de la synthèse protéique dans le développement du cerveau.

Procédures

164 femelles gestantes vont subir une chirurgie abdominale (laparotomie) unique, réalisée sous anesthésie générale et analgésie. La durée totale de la chirurgie n'excèdera pas 45 minutes. La cicatrisation peut induire une douleur modérée et une plus grande sensibilité aux éventuelles infections. Elles seront par la suite placées dans des cages individuelles, mais auront toujours un contact visuel et auditif avec leurs congénères pour des durées variant entre 1 h et 1 semaine selon l’objectif visé. Les souriceaux (n=640) vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin au stade embryonnaire (entre 1 et 5 secondes) entrainant une douleur aigue et modérée.

Impact sur les animaux

La barrière cutanée des femelles gestantes sera rompue en plusieurs endroits, il en résulte une douleur modérée lors de la cicatrisation et une plus grande sensibilité aux éventuelles infections. Elles seront par la suite placées dans des cages individuelles et de ce fait privées de congénère pendant quelques jours de convalescence, en gardant un contact visuel et auditif, induisant un stress léger. Les souriceaux vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin aux stades embryonnaires (E12, E13, E14, E15, E16 et E17), entrainant une douleur aigue et modérée.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet. Les femelles sont mises à mort pour collecter les embryons ou après la collecte des nouveaux nés. Les embryons ou nouveaux nés sont mis à mort pour prélever les cerveaux.

Remplacement

L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement du cortex cérébral qui ne peut pas être recréé par des approches in vitro. Le développement du cerveau est très bien caractérisé chez la souris, ce qui nous permet de déterminer les stades du développement auxquels nous intervenons.

Réduction

Nous garderons à l’esprit notre responsabilité de diminuer au maximum le nombre d’animaux expérimentés tout en atteignant la significativité statistique avec le test adéquat. De plus, certaines expériences seront utilisées dans 2 objectifs : nous pourrons utiliser les données de l’objectif 1 dans l’objectif 2.

Raffinement

Nous prendrons en compte avec la plus grande attention le bien être de nos animaux. L’élevage et la reproduction de nos animaux se font dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress pour l’animal, notamment avec l’ajout de nid et de tunnel dans les cages d’hébergement. L’intervention chirurgicale sera effectuée sous anesthésie générale avec prise en charge de la douleur. Nous vérifions que les animaux mangent, s’abreuvent et se toilettent normalement. La cicatrice au niveau du ventre de la mère et le site d’injection sont surveillés et en cas d’infections importantes à ce niveau, ou de douleur manifeste, les animaux sont euthanasiés immédiatement. Des points limites ont été déterminés et seront appliqués.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour comprendre la fonction du contrôle de la synthèse des protéines dans le développement du cerveau. Les étapes du développement du cerveau sont très bien caractérisées chez la souris ce qui nous permet de déterminer les stades auxquels nous intervenons. La chirurgie pratiquée dans ce projet est réalisée en routine au laboratoire sur cet animal. Les femelles gestantes seront utilisées à maturité sexuelle car elles doivent être gravides. Les embryons seront injectés à différents stades du développement du cerveau avec une molécule fluorescente. Ils seront mis à mort à des stades précis, et les cellules fluorescentes triées pour répondre aux questions des différents objectifs : 1. déterminer si, au sein des cellules proneuronales, les quantités d’acides ribonucléiques de transfert varient au cours du développement 2. déterminer si, au cours de la spécialisation de la cellule en neurone, les quantités d’acides nucléiques de transfert sont différentes. 3. déterminer si, au cours de la maturation du neurone, les quantités d’acides nucléiques de transfert varient

Les ovaires de 1 200 souris leur sont retirés en dix à vingt minutes, avant la pose sous la peau d'une capsule diffusant des hormones. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis tuées pour prélever leurs tissus. L'objet est de comprendre pourquoi les plaques d'athérome évoluent différemment selon le sexe et de mesurer l'effet des œstrogènes sur ce processus, y compris chez des souris privées du récepteur qui les reconnaît. La liste des procédures ne mentionne que la chirurgie et la capsule, alors que les effets attendus décrivent aussi un régime obésogène capable de faire dépasser 40 grammes aux animaux et de gêner leurs déplacements.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité en France chez les femmes, pourtant, elles restent encore sous-estimées. Les femmes présentent souvent des symptômes atypiques, un diagnostic et une prise en charge plus tardive et des différences dans l'évolution clinique des pathologies cardiovasculaires par rapport aux hommes. Les hormones sexuelles peuvent expliquer en partie ces différences, notamment les œstrogènes chez les femmes. En effet, au-delà de leur rôle majeur dans les fonctions de reproduction, leurs actions s’étendent également aux tissus non reproducteurs et en particulier aux artères. Chez la femme en période d’activité génitale, le 17β-estradiol (E2), produit par les ovaires, est l’œstrogène majoritaire. Durant cette période, ces hormones confèrent une protection artérielle à l’origine du moindre risque cardiovasculaire de femmes par rapport aux hommes. Au moment de la ménopause, qui correspond à l’arrêt de la production d’œstrogènes et qui survient en moyenne entre 49 et 52 ans chez la femme, la protection diminue considérablement ce qui entraine une augmentation significative du risque cardiovasculaire à partir de cette période. Le but de ce projet est de comprendre le dimorphisme sexuel dans l’évolution des plaques d’athérome (à l’origine de la plupart des maladies cardiovasculaires) et d’étudier l’impact des œstrogènes dans ce processus. Enfin nous évaluerons les mécanismes d’actions des œstrogènes en utilisant des souris déficientes pour leur récepteur.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet portent sur la santé humaine et plus particulièrement la santé féminine. Cette étude permettra de mieux comprendre le rôle des hormones féminines dans les pathologies cardiovasculaires, en particulier chez la femme au moment de la ménopause. En effet les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité chez la femme.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1-Ovariectomie (10 à 20min) 1200 animaux 2-Pose de capsule à libération prolongée (5min) 1200 animaux

Impact sur les animaux

Les chirurgies sur la souris telles que l’ovariectomie ou la pose de pellet peuvent engendrer une douleur, une légère perte de poids et un stress en post-opératoire durant les premières 24 à 48h. Le régime obésogène provoque une prise de poids qui peut engendrer une gêne de mobilité chez la souris (si le poids de la souris dépasse 40g de poids corporel).

Devenir

A l’issu de chaque procédure les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses sur les tissus prélevés.

Remplacement

L’évaluation des plaques d’athérome dans la paroi des vaisseaux est un phénomène complexe qui ne peut pas être mimé in vitro. De plus, aucun système de culture cellulaire n'a pu reproduire des variations hormonales et ceci d’autant plus que l’ensemble des lignées cellulaires présentent dans le vaisseau « perdent » l’expression du récepteur des œstrogènes.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimal nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Ainsi il ressort que 10 animaux/groupe seront nécessaires.

Raffinement

Les souris subiront des chirurgies dans une salle séparée de la salle d’euthanasie, elle-même séparée de leur pièce d’hébergement. Pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale + anesthésie locale avec analgésique (morphinique) sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués en utilisant une grille d’évaluation de la douleur après chaque chirurgie.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle permettant une modification génétique aboutissant à un dépôt de plaque dans les artères. Ces souris sont un modèle reconnu dans l’étude des maladies cardiovasculaires. Les animaux seront utilisés à partir de 7 semaines d’âge (après pic de croissance et puberté).

10 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 8 640 reçoivent des cellules tumorales sous la peau du flanc et 2 160 se les font injecter dans le foie au cours d'une chirurgie abdominale, avant des séances de plasma froid appliqué directement sur la peau, jusqu'à sept fois dix minutes, qui peuvent l'assécher jusqu'à la nécrose. S'y ajoutent quatre à cinq imageries par animal et deux à trois prises de sang. Le porteur écrit qu'on peut "raisonnablement espérer" une régression des tumeurs, affirme qu'il est impossible de recréer in vitro la complexité d'un "organisme entier", et indique développer en parallèle des modèles en trois dimensions pour réduire le nombre de souris.

Objectifs

Les cholangiocarcinomes (CCA) sont un type de cancer rare qui atteint le foie et les voies biliaires. A ce jour, seule l’ablation chirurgicale apparaît comme une thérapie efficace mais elle n’est envisageable que dans 20 pourcents des cas, avec sur 5 ans un taux de survie estimé entre 15-40 pourcents. La majorité des patients ne pouvant bénéficier d’intervention chirurgicale reçoit alors une chimiothérapie. En cas de progression tumorale consécutive à cette première ligne de traitement, il n’existe à ce jour pas de thérapie complémentaire approuvée. Par conséquent, l’émergence de nouvelles approches thérapeutiques est plus qu’attendue. Les plasmas froids atmosphériques (PFA) sont des gaz faiblement ionisés, constitués d’électrons, d’espèces radicalaires et excitées et possédant des propriétés de champ électrique et de rayonnement. Les PFA constituent une stratégie physique innovante et prometteuse pour le traitement des carcinomes puisque leurs capacités à réduire la croissance tumorale a récemment été démontrée dans des études in vitro et in vivo. Cependant, le développement et l’efficacité d’une stratégie PFA sur les cholangiocarcinomes (CCA) n’ont pas encore été testés. La finalité du projet est donc d’évaluer l’efficacité de la thérapie PFA comme alternative à l’ablation chirurgicale ou comme approche complémentaire à des traitements conventionnels. L’utilisation PFA permet raisonnablement d’espérer une régression significative de la taille des tumeurs, voire même une régression importante en combinant cette approche innovante à l’approche conventionnelle de la chimiothérapie. Par ailleurs, on peut s’attendre à un « effet sélectif » du plasma, c’est-à-dire qu’appliqué sur une zone présentant des cellules tumorales et saines, le plasma pourrait favoriser la mort des cellules cancéreuses sans endommager les cellules saines. Les objectifs sont de tester l’efficacité antitumorale du PFA et de mieux comprendre les mécanismes d’action du PFA, en particulier sur le phénotype des cellules tumorales, les cellules du microenvironnement tumorale et sur les composants de la matrice extracellulaire (MEC), dans des modèles précliniques de CCA ectopique. La caractérisation des échantillons sera réalisée par des approches multiples de biologie moléculaire et cellulaire. Ce projet sera mené dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les tumeurs des voies biliaires ou cholangiocarcinome (CCA) sont de très mauvais pronostiques et très agressives. Les traitements sont limités, seule la résection chirurgicale est efficace mais seuls 20 à 30 % des patients sont éligibles, les autres recevront une chimiothérapie palliative. La recherche sur traitements dit innovants dans un but de traiter localement la tumeur est nécessaire pour proposer de nouvelles options thérapeutiques pouvant être proposée seule ou en combinaisons avec des thérapies systémiques déjà en place. Dans son ensemble, ce projet est de tester dans des modèles expérimentaux murins, l’effet du plasma froid atmosphérique (PFA) sur le CCA. Les bénéfices attendus sont de démontrer un effet antitumoral du plasma froid atmosphérique dans des modèles bien décrits de CCA représentatifs de la maladie humaine. Si l’effet anti-antitumoral s’avérait efficace, ce projet pourrait permettre de développer un nouvel outil thérapeutique anti-cancéreux applicable en santé humaine dans le cadre des cancers des voies biliaires. Au-delà du cancer des voies biliaires, les PFA pourraient jouer un rôle important dans le développement de nouvelles applications médicales. Par exemple, les résultats pourraient orienter la création de nouvelles thérapies pour d’autres cancers ou d’autres applications comme la cicatrisation des plaies et l'ingénierie tissulaire.

Procédures

- Procédure 1 (EU1). 1. Injection sous cutanées des cellules (n=8640) sur souris vigiles, durée 10 secondes/animal - Procédure 2 (EU1). 1 chirurgie pour injecter dans le foie des cellules sur souris anesthésiées et sous analgésie (n=2160), durée 15-20 minutes/souris - Traitement au plasma froid atmosphérique (EU1/EU2) sur souris anesthésiées (n=1080 procédure 1 et n=540 procédure 2) 10 minutes/souris, répété 6 à 7 fois max. - Imagerie (EU2). Anesthésie + imagerie (4-5 fois sur même souris) (n=6480), durée 15 min/souris - Prélèvements sanguins (EU1/EU2) sur animal vigile (2-3 par souris) (n=6480), durée 10 min/souris - Prélèvement terminal (EU1/EU2). A l’issue des traitements, tous les animaux seront anesthésiés et analgésiés puis soumis à un prélèvement sanguin et tissulaire pour effectuer les analyses et ne durera pas plus de 10 minutes entre de début de l’anesthésie et l’euthanasie de l’animal.

Impact sur les animaux

-le développement des tumeurs : -le modèle ectopique implique une injection des cellules sous cutanée dans le flanc/dos de l’animal ce qui peut engendrer un stress à l’animal en raison de la contention et d’une douleur de courte durée lors de l’introduction de l’aiguille, et un inconfort au fur et à mesure du développement tumoral. -Le modèle orthotopique (injection dans le foie) implique une chirurgie abdominale pour injecter dans un lobe du foie les cellules tumorales, ce qui engendre donc des nuisances liées à l’anesthésie (stress thermique, risque d’arrêt cardio-respiratoire) et à la chirurgie elle-même (douleurs post-opératoires malgré la prise en charge réalisée, inflammation locale, risque de dessiccation de la plaie). - Le traitement par plasma froid. L’utilisation de ce gaz faiblement ionisé appliqué directement sur la peau de l’animal peut générer un assèchement de la peau pouvant aller jusqu’à la nécrose dans les cas les plus extrêmes (peu probable). - Pour les traitements administrés par injection au niveau de l’abdomen ou dans la veine de la queue ou par gavage, les nuisances pourraient être un éventuel durcissement abdominal ou de la queue, une inflammation de l’abdomen, queue ou gorges). Les contraintes liées au gavage sont la contention qui constitue un facteur de stress. - Les traitements seront effectués sous anesthésie (sauf pour le gavage) et impliqueront donc également les contraintes/risques liées à l’anesthésie elle-même.

Devenir

A l’issue des procédures, les animaux seront tous euthanasiés par des méthodes réglementaires afin de prélever le sang et les tissus pour réaliser différentes analyses biologiques. Ces analyses permettront d’évaluer l’impact « biologique » des différents traitements, en utilisant les différents marqueurs de progression de la pathologie.

Remplacement

Dans la mise en œuvre de ce projet, un organisme vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement et l’évaluation de thérapies innovantes anti-cancéreuses. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu dans le développement du cancer. Le modèle animal est donc indispensable dans le cadre de ce projet.

Réduction

Le projet impliquera un total de 10800 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique G*Power a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude qui est de 15 par groupe. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyses à effectuer (les différents types de tests donnant des résultats soit qualitatifs, soit quantitatifs). D’une façon générale, les modèles seront testés avec un seuil de validité de 5%. Lorsque ces conditions ne seront pas vérifiées, des tests non paramétriques seront effectués. En parallèle des animaux, nous développons des modèles in vitro en 3 dimensions afin de tester nos thérapies, ce qui permetra de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, enrichissement). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum, le milieu est enrichi. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie). Un analgésique, notamment la buprénorphine, sera utilisé en pré-opréatoire 20 minutes avant et post-opératoire pour limiter la douleur et garantir un bien-être optimal des animaux. Un protecteur oculaire en gel sera aussi utilisé lors de l'anesthésie pour éviter tout assèchement des yeux. Pour le transport des animaux, celui-ci est effectué dans le respect du bien-être animal (mise à disposition d'eau sous forme de gel et de nourriture) et est réalisé par un transporteur agréé.

Choix des espèces

Les cellules en culture ne permettent pas de tester des nouveaux traitements anti-cancéreux dans sa globalité. Aussi, la souris est utilisée pour mimer un cancer avec des caractéristiques de la maladie proche de celles observées chez l’homme. Plusieurs modèles animaux de cancers biliaires (ectopique ou orthotopique) existent chez la souris récapitulant les différentes formes observées chez l’homme. Les souris seront utilisées à l'âge adulte/jeune adulte : 5 à 8 semaines pour les animaux commerciaux dont 1 semaine d’acclimatation. Nous n'utilisons pas d'animaux trop vieux afin de nous affranchir des problèmes de prise de greffes dans le cas des xénogreffes ectopiques et modifications des fonctions hépatiques dues à l'âge dans le cas des greffes syngéniques orthotopiques qui pourraient interférer avec nos résultats.

Les souris de ce projet sont des femelles génétiquement modifiées, dépourvues de système immunitaire et si sensibles aux agents pathogènes qu'elles sont élevées en milieu stérile. 101 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements de tissus ou dès qu'un point limite est atteint. Elles reçoivent sans anesthésie une injection intraveineuse de cellules tumorales et une de cellules tueuses reprogrammées, passent jusqu'à 12 séances d'imagerie sous anesthésie générale et subissent 6 à 7 prises de sang sans anesthésie, la tumeur pouvant provoquer une perte de poids ou, si elle atteint la moelle osseuse des membres, un déficit moteur. Le porteur n'utilise que des femelles, chez qui les tumeurs se développent selon lui "de manière plus régulière, homogène et prévisible".

Objectifs

Notre corps possède des défenses naturelles contre les maladies : le système immunitaire. Celui-ci est constitué notamment de cellules tueuses, qui peuvent éliminer des cellules infectées ou anormales. Cependant lors d’un cancer, ces cellules n’ont pas forcément la capacité de reconnaître les cellules cancéreuses. Ainsi le cancer se propage. Une nouvelle approche de thérapie cellulaire, appelée CAR-T, améliore cette capacité à cibler les cellules cancéreuses. Les cellules tueuses issues d’un patient atteint d’un cancer sont modifiées génétiquement pour que celles-ci ciblent au mieux les cellules cancéreuses. Cependant, cette approche est 100% personnalisée : longue, coûteuse et incertaine. Pour contourner ces limites, nous développons une alternative : des cellules tueuses reprogrammées « universelles » issues d’un donneur sain et non pas d’un patient. Ces cellules universelles peuvent s’adapter au système immunitaire de chaque patient sans risque de rejet, rendant le traitement plus rapide et accessible. L’objectif de cette étude est de tester ces cellules universelles dans un modèle de souris afin d’observer leur comportement et leur efficacité contre le cancer. Nous voulons notamment vérifier si une modification spécifique améliore leur action anticancéreuse en bloquant un certain mécanisme biologique. À terme, ce projet pourrait ouvrir la voie à des thérapies plus efficaces et accessibles contre le cancer, en simplifiant la production des cellules CAR-T pour une utilisation en clinique.

Bénéfices attendus

Les résultats positifs de ce projet pourraient aboutir à la mise sur le marché d'un nouveau médicament de thérapie cellulaire pour les patients en impasse thérapeutique. Ce médicament sera à la fois plus puissant et plus sûr que les traitements actuels, produit à des coûts drastiquement diminués (puisqu'il s'agit d'une thérapie cellulaire universelle) et donc disponibles à l'ensemble des patients qui en ont besoin. De plus, cela permettra d’avoir un modèle de souris pertinent pour les études des cellules tueuses reprogrammées.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Injection de cellules tumorales par voie intraveineuse, sans anesthésie (1x/souris, durée ~5 minutes). Injection de cellules thérapeutiques matures ou immatures par voie intraveineuse, sans anesthésie (1x/souris, durée ~5 minutes). Injection d’un médicament afin de permettre la prise de greffe des cellules thérapeutiques immatures (1x/souris, durée ~1 minutes). Imagerie sous anesthésie générale, jusqu’à 12 fois par souris (durée ~10 minutes par session, 1x/semaine), précédée de l’injection d’un agent de détection de la tumeur sur souris vigile (jusqu’à 12x/souris, durée ~1 minute). Prélèvements sanguins, réalisés sans anesthésie (6-7x/souris, ~1 minute, 1x/2semaines) soit sous anesthésie générale (1x/souris, ~5 minutes, pour le dernier prélèvement).

Impact sur les animaux

Stress : l’ensemble des manipulations, contentions et transports peut engendrer un stress chez les souris. Douleurs légères : potentiellement présentes après injection intraveineuse (de cellules CAR-T matures, non matures) ou abdominale et prélèvements sanguins sous antidouleur. Probables maux de tête et nausée par suite du traitement avec un médicament. Altération de l’état général : possible en lien avec le développement tumoral exemple : perte de poids. Déficit moteur des membres inférieurs : possible si la tumeur atteint la moelle osseuse des membres.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort car nous prélèverons des tissus post-mortem pour analyse ou si un point limite est atteint en cours de procédure.

Remplacement

Les cellules tueuses du cancer ont été étudiées en laboratoire. Cependant, la réponse du système immunitaire est très complexe, car elle implique différents types de cellules et des interactions spécifiques. Cela rend difficile d’étudier la réponse complète seulement en laboratoire. Pour cette raison, nous devons utiliser des souris pour ces recherches thérapeutiques, car on ne peut pas encore se passer d'un modèle préclinique avant les essais clinique chez l'Homme. De plus, on utilise des souris modifiées et disponibles à l'achat pour avoir un système immunitaire humain, ce qui permet de tester des cellules humaines directement applicables ensuite en essai clinique. Avant d'être testées chez la souris, les cellules ont été validées dans notre laboratoire selon nos meilleures connaissances. Nous obtenons ainsi des informations qui ne peuvent être obtenues que chez la souris et nous les utiliserons pour réduire encore davantage le recours aux expérimentations animales à l'avenir.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au minimum sans toutefois compromettre l’analyse statistique des résultats. En effet, un outil statistique a été utilisé pour calculer le bon nombre d’animaux à utiliser. Suivre les animaux au fils du temps par des analyses répétées comme l’imagerie (grossissement de la tumeur) et le contrôle du sang entraîne une meilleure analyse de l’effet biologique, ce qui permet des expériences à haute puissance avec un faible nombre de souris.

Raffinement

Tout au long de ce projet, nous serons attentifs au bien-être des animaux grâce à un suivi quotidien des animaux afin de d’observer leur comportement, leur apparence et tous signes qui permettraient d’identifier des indications révélatrices de souffrance animale. Des points limites clairs sont définis pour arrêter le projet afin de limiter la souffrance des animaux. Un tapis chauffant afin d’éviter l’hypothermie de l’animal sera mis en place et du gel hydratant oculaire sera appliqué afin d’éviter un dessèchement lors des séances d’imagerie. Les animaux seront placés sous anesthésie générale et auront des antidouleurs adaptés. De plus, ce projet fait suite à une étude bibliographique afin de raffiner au maximum les expériences, les injections et les prélèvements. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement.

Choix des espèces

Nous utiliserons exclusivement des souris femelles génétiquement modifiées dépourvues de système immunitaire. Ces modèles permettent la greffe de cellules humaines, le développement d’un système immunitaire humanisé, ainsi que la croissance de tumeurs humaines. En plus de leur grande sensibilité aux agents pathogènes, nécessitant des conditions d’élevage en milieu stérile, ces souris présentent une apparence et un comportement comparables à ceux de leurs congénères non modifiées. Le choix d’utiliser uniquement des femelles est motivé par nos observations expérimentales précédentes: chez les femelles, les tumeurs se développent de manière plus régulière, homogène et prévisible, ce qui améliore la reproductibilité et la fiabilité des résultats. Des souris âgées de 4-8 semaines sont utilisées, afin d’observer si le développement des cellules humaines s’effectue de manière plus optimale en l’absence d’interaction avec les cellules immunitaires de souris.