Recherche fondamentale

1 019 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir douze prélèvements de sang par incision du bout de la queue, douze à seize jours d'isolement pour la mesure du métabolisme et jusqu'à douze séances d'imagerie sous anesthésie. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et commencent par une chirurgie cérébrale de vingt minutes sous anesthésie générale, suivie d'injections dans l'abdomen. Certaines lignées développent à partir de neuf mois des problèmes musculaires ou une paralysie, que le porteur présente comme une caractéristique de la lignée. Toutes sont tuées pour prélever cerveau, muscle, tissu gras et foie, la question posée étant de relier le dérèglement du métabolisme à la maladie d'Alzheimer.

Objectifs

Les maladies liées à l'âge constituent l'un des principaux défis des sociétés modernes, à mesure que l'espérance de vie augmente. C’est notamment le cas des maladies neurodégénératives, comme la maladie d’Alzheimer, la plus répandue dans le monde. Malgré des avancées importantes, les mécanismes pathologiques de la maladie d’Alzheimer restent mal compris et les options thérapeutiques insatisfaisantes. De nombreux éléments suggèrent que la maladie d’Alzheimer n'est pas seulement caractérisée par un dysfonctionnement neurologique mais également par des troubles métaboliques. Un dysfonctionnement métabolique est un trouble du corps qui perturbe la manière dont il transforme les aliments en énergie, pouvant mener à des maladies telles que le diabète ou l'obésité. Ce projet vise à comprendre comment la dérégulation du métabolisme est liée aux maladies neurodégénératives. Pour atteindre cet objectif, nous allons caractériser l'impact du dysfonctionnement métabolique sur la progression de la neurodégénérescence chez des modèles animaux de souris atteintes de maladies neurodégénératives. Nous étudierons également la régulation du métabolisme au cours de la progression de la neurodégénérescence chez ces modèles. Afin de prendre en compte des facteurs liés au sexe et au stade de développement de la maladie, l’étude sera menée sur des mâles et des femelles, et sur des groupes ayant deux âges différents. Enfin, nous proposons de valider une nouvelle méthode pour suivre la progression de la maladie par imagerie. Le projet se déroulera dans 2 Établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mieux comprendre l’implication du contrôle métabolique sur les mécanismes pathologiques de la neurodégénérescence et vice-versa. À plus longue-terme, nous espérons que ces connaissances aideront à révéler de nouvelles perspectives thérapeutiques, ciblé sur l’amélioration de la fonction métabolique, pour prévenir ou ralentir le déclin cognitif liée à la maladie d’Alzheimer et d’autres maladies neurodégénératives. Enfin, nous espérons valider une nouvelle méthode pour suivre la progression de la neurodégénérescence par imagerie, ce qui pourra réduire significativement le nombre d’animaux utilisés dans la recherche préclinique à l’avenir.

Procédures

- Chirurgie sous anesthésie générale et analgésie afin d’injecter des composés dans le cerveaux (durée: 20 minutes) - Détermination du poids, da composition corporelle et de la fonction métabolique sur souris vigile (durée : 4 jours). - Isolement des souris pour l’étude individuelle de la fonction métabolique (durée: 12 a 16 jours). - injection péritonéale sur la souris vigile (1-3 injections par souris ; durée : 30 secondes). - Prélèvement de sang sur animaux vigiles, par incision du bout de la queue. Fréquence : 12 fois par souris, reparti en 6 fois à l’intervalle de 15 ou 30 minutes pendant 2h ; et 6 fois une semaine après, à l’intervalle de 15 ou 30 minutes pendant 2h. - Imagerie de la souris sous anesthésie générale (4-12 fois par souris, 1 fois / semaine sur 1 ou 3 mois; durée : 3 minutes). L’étape de chirurgie se déroulera dans l’établissement EU1 puis, les analyses de la fonction métabolique et l’imagerie se feront dans l’établissement EU2. Les deux établissements sont attenants.

Impact sur les animaux

- Douleur locale transitoire après injection et en post-opératoire ; - Après la chirurgie, il est possible que certains animaux développent une infection, présentent des problèmes de cicatrisation, ainsi qu'une perte de poids ou du stress. - le transport des animaux du fournisseur vers l’animalerie et d’une animalerie à l’autre peut induire du stress. - Stress ou anxiété à cause de l’isolement pour la mesure de la fonction métabolique chez les souris en isolement - Certains animaux plus âgés (à partir de 9 mois) appartenant à l'une des lignées de souris utilisées peuvent développer des problèmes musculaires ou une paralysie, caractéristiques de cette lignée.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour le prélèvement de tissus (cerveau, muscle, tissu gras, foie) pour analyse des molécules clés dans la régulation du métabolisme et des protéines pathologiques liées au processus de neurodégénérescence.

Remplacement

L’utilisation d'un modèle animal est indispensable pour étudier le métabolisme énergétique. Des expériences sur cellules ont déjà été réalisées et ont validé notre hippothèse sur l’effet inhibiteur des facteurs pathologiques sur la fonction métabolique et sur l’activité des cellules neuronales. Pour continuer notre étude, nous avons maintenant besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée du métabolisme en lien avec la progression des maladies neurodégénératives. Cela ne peut se faire que sur l’animal vigile. La souris représente un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements métaboliques et des maladies neurodégénératives, car les modèles utilisés ont été générés chez la souris.

Réduction

Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Les mesures de la fonction métabolique et d’imagerie de bioluminescence sont effectuées sur plusieurs jours sur le même animal, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Plusieurs mesures spécifiques seront prises pour minimiser les nuisances causées aux animaux, telles que : - anesthésie et analgésie pour limiter la douleur; - des mesures spécifiques pour éviter l'hypothermie; - des mesures spécifiques pour diminuer le stress et l’angoisse des souris pendant le transport des animaux entre les deux établissements; - les animaux sont hébergés groupés (sauf si une nécessité d’individualisation se présente), dans un milieu avec enrichissement approprié, et avec de la nourriture et d'eau ad-libitum; - Tout au long de la procédure, les souris seront observées quotidiennement conjointement par les soigneurs et/ou les expérimentateurs; - application de points limites stricts et spécifiques au projet; - Ce projet privilégie les techniques non invasives d'analyse métabolique globale et d'imagerie.

Choix des espèces

L’espèce Mus Musculus a été choisie car plusieurs modèles de souris présentant des caractéristiques similaires à celles des patients atteints de maladies neurodégénératives ont été développés et validés. De plus, la souris représente un modèle de choix pour l'étude de la fonction métabolique car la régulation métabolique est similaire entre la souris et l’homme, permettant ainsi une extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes (dans le contexte des maladies métaboliques et neurodégénératives) sur la souris est un atout majeur dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Les souris seront utilisées à l’âge adulte, lorsque leurs comportements alimentaires et locomoteurs, ainsi que leur masse, sont stables. Les souris seront utilisées à l’âge de 3, 6 et jusqu’à 9 mois. Ce choix se justifie par le fait qu’à l’âge de 3 mois les souris transgéniques sont à un stade précoce de la maladie, tandis que à 6 mois et 9 mois les troubles de mémoire et d’apprentissage sont bien documenté dans la littérature.

La restriction alimentaire imposée aux rats ne doit pas leur faire perdre plus de 15 % de leur poids, seuil au-delà duquel le porteur rétablit l'accès à la nourriture. 1 920 rats vont être utilisés sur cinq ans, tous tués pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit un cathéter dans la veine jugulaire posé en trente minutes, des injections intracérébrales et une fibre optique implantée en une heure et demie, et les femelles subissent un prélèvement vaginal quotidien pendant sept jours. Le projet cherche à savoir si la progestérone protège de la rechute à la cocaïne, un bénéfice thérapeutique pour l'humain que le porteur situe explicitement à long terme.

Objectifs

Les objectifs de ce protocole sont triples : - Premièrement, tester l’effet des hormones sexuelles sur la rechute à la cocaïne - Deuxièmement, étudier comment l’activité des neurones d'une partie du cerveau, appelée insula, est modulée par les hormones sexuelles lors de la rechute à la cocaïne - Troisièmement, étudier si la manipulation de l’activité des neurones de cette partie du cerveau influence la rechute à la cocaïne.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’étudier le rôle des neurones d'une partie du cerveaux (insula) dans l’effet protecteur des hormones sexuelles sur la rechute à la cocaïne chez les rats mâles et femelles. A long terme, ce projet a le potentiel d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques applicables à l’humain (homme et femme) pour prévenir la rechute à la cocaïne grâce à un traitement basé sur les hormones sexuelles qui sont déjà des molécules pharmacologiques approuvées par l’ANSM (Agence Nationale de la Santé et du Médicament).

Procédures

Les animaux subiront deux types d’intervention chirurgicales, la pose d’un cathéter dans la veine jugulaire qui durera 30 minutes et des injections intracérébrales ainsi qu’une implantation de fibre optique (durée 1h30) quand nécessaire pour enregistrer d’activité des neurones. Enfin, chez les femelles, le cycle hormonal sera suivi pendant 7 jours par un prélèvement vaginal (durée 10 secondes) quotidien. Les males seront manipulés de la même façon sans prélèvement pour éviter tous biais expérimentaux.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut engendrer des douleurs post-opératoires au niveau des sites d’incision, l’injection, ou d’implantation de matériel (crâne, cou, abdomen). La prise de cocaïne peut engendrer une perte de poids lors des premières sessions, mais cette perte n’excède pas 3 ou 4 jours à l’issus desquels les animaux retrouvent un poids initial. La cocaïne peut également engendrer une hyperactivité des animaux qui disparaît 1 heure après la fin de la prise de drogue. La littérature ne montre pas de stress lié à la prise de cocaïne et il n’y a pas de syndrome de sevrage (tremblement, perte de poids) dans les modèles animaux de prise de cocaïne. La restriction alimentaire engendre une perte de poids de l’animal qui sera contrôlée quotidiennement par l’expérimentateur. Cette restriction ne devrait pas engendrer plus de 15% de perte de poids par rapport au poids initial, si la perte de poids dépasse 15% alors l’animal aura accès immédiatement à la nourriture ad libitum et ne subira pas d’autre privation tant qu’ils n’auront pas repris leur poids initial.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de procéder à des analyses sur les tissus cérébraux.

Remplacement

Le projet porte sur une analyse de la connexion des neurones et de leurs propriétés de transmission d’informations au cours du comportement. Par conséquent cette procédure doit être effectuée chez des animaux vivants. L’étude de ces phénomènes n’est donc pas possible sur des cellules isolées, car elles ne permettent pas la quantification des connections neuronales ou la mesure de l’activité en réponse à une stimulation sensorielle.

Réduction

Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux afin d’obtenir une analyse fiable (le nombre d’animaux estimé permet d’effectuer des tests statistiques) et complète de la connectivité et de l’activité de la région cérébrale d’étude. Nous avons utilisé un logiciel statistique pour calculer le nombre d’animaux nécessaires pour chaque procédure en prenant en compte la quantité de conditions expérimentales pour chacune d’elle. Nous utiliserons ainsi 1920 animaux sur cinq ans.

Raffinement

Hébergement en cages collectives pour limiter le stress de l’isolement. Réduction au strict minimum les animaux hébergés individuellement pour raisons expérimentales (dérogation 4.5). Les cages seront enrichies en nid cotonné et bois. Avant chirurgie et après anesthésie, un antalgique sera administré en sous-cutané (s.c.) afin d’éviter la souffrance opératoire. Un anesthésiant local en crème sera appliqué (en plus de l’anesthésie à l’isoflurane) 10 min avant l’incision. La chirurgie sera effectuée en conditions stériles. Si infection, le vétérinaire mettra en place un traitement antibiotique approprié. Après chirurgie, l’expérimentateur suivra quotidiennement l’animal (alimentation, qualité du poil, locomotion) et le pèsera 4 jours jusqu’à stabilisation. Du baume cicatrisant sera appliqué sur les sites d’incision si mauvaise cicatrisation. Si douleur post-opératoire : Points limites, critères d’arrêt : Stade 1 : Normal. Si perte de poids jusqu’à 10% du poids initial une injection s.c. de saline sera réalisée et de la nourriture humidifiée sera au sol. Stade 2 : Perte de poids persistante 24h post chirurgie avec signes de douleurs (prostration, mauvaise qualité de poil, hypoactivité). Injection s.c. d’antalgique et de saline et nourriture humidifiée au sol. Stade 3 : Perte de poids qui persiste 48h avec signes de douleurs (prostration, mauvaise qualité de poil, hypoactivité). Injection s.c d’antalgique, de saline, et intrapéritonéale de glucose 5% et nourriture humidifiée au sol. Une seconde injection d’antalgique et de saline pourront être réalisées à 72h si pas d’amélioration. L’animal sera euthanasié si état prolongé au-delà de 72h sans amélioration. Stade 4 : Etat de l’animal ne pouvant être pris en charge par médication et engendrant de la souffrance, ou état non amélioré voire dégradé au-delà de 72h même avec prise en charge. Euthanasie immédiate par décapitation ou exsanguination si animal a réalisé des tests comportementaux nécessitant le prélèvement du cerveau pour analyses histologiques. Dans les deux, injection s.c. d’antalgique puis i.p. d’euthanasiant avant sacrifice. Afin que la restriction alimentaire impacte au minimum le bien-être, si perte de plus de 15% du poids initial (mesuré pendant 3j avant début de restriction), accès immédiat à la nourriture ad libitum sans privation tant que les rats n’auront pas repris leur poids initial. Le poids des animaux sera suivi durant les 5j d’acquisition.

Choix des espèces

Les rats sont un modèle largement utilisé pour l’étude des neurones impliquées dans les troubles de la consommation de drogues. L’administration de cocaïne est utilisée depuis de nombreuses années et largement décrit dans la littérature, et l’injection d’hormones sexuelles est une manipulation facile à conduire. De plus, les régions cérébrales d’intérêt de notre étude possèdent la même structure chez le rat que chez l’humain. Les animaux seront utilisés au stade adulte, afin de travailler sur des neurones des aires cérébrales ciblées matures. Les procédures chirurgicales seront réalisées chez des animaux âgés de 10 semaines.

870 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe de tumeur par injection sous-cutanée, puis un gavage quotidien pendant deux semaines et des injections intrapéritonéales, quotidiennes ou réparties sur la semaine selon le traitement testé, avant un prélèvement de sang sous anesthésie le jour de sa mise à mort. Le porteur reconnaît que sur les trois semaines de l'expérience, les souris porteuses de tumeurs peuvent perdre du poids et montrer des signes de souffrance, immobilité, isolement, dos voûté, poil terni. L'objet est de comparer plusieurs traitements anti-angiogéniques associés à des immunothérapies afin de "mieux les prescrire", et l'atteinte d'un point limite qui ne peut pas être soulagé conduit à tuer l'animal avant la fin du protocole.

Objectifs

La formation de nouveaux vaisseaux sanguins, est nécessaire au développement tumoral. Les cellules tumorales, ainsi que les cellules du microenvironnement tumoral produisent des facteurs favorisant la formation de nouveaux vaisseaux sanguins au sein de la tumeur. Mais il a été observé que ces facteurs agissaient également sur le système immunitaire de souris porteuses de tumeurs et de patients atteints de cancer, et aboutissaient au blocage de la réponse immunitaire. Or, la réponse immunitaire contre la tumeur est nécessaire à l’élimination de celle-ci. Des traitements ciblant ces facteurs sont utilisés pour traiter certains cancers. Ils réduisent non seulement les vaisseaux sanguins au niveau de la tumeur mais aident également à améliorer la réponse immunitaire contre la tumeur. Ces traitements sont associés à des immunothérapies en particulier dans le cancer du rein résultant en une augmentation des effets anti-tumoraux observés. Plusieurs traitements ciblant la formation des vaisseaux sanguins sont actuellement associés à des immunothérapies sans avoir vraiment d’argument pour privilégier l’un de ces traitements. Il est important de comprendre l’impact de ces traitements sur la réponse immunitaire pour permettre de mieux les prescrire et de proposer de nouveaux traitements aux patients atteints de cancer.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra donc à la fois de faire progresser les connaissances concernant l’interaction entre l’angiogenèse (formation des vaisseaux sanguins) et la réponse immunitaire anti-tumorale et pour les patients atteints de cancer de mieux prescrire les traitements anti-angiogéniques en association avec des immunothérapies. Cette étude pourrait également permettre de proposer de nouvelles combinaisons d’anti-angiogéniques et d’immunothérapies.

Procédures

Injection sous-cutanée 1 fois au début de la procédure sur animaux vigiles ; durée totale du geste : 1-2 min Gavage 1 fois par jour tous les jours sur 2 semaines sur animaux vigiles ; durée totale du geste : 1-2 min Injection intrapéritonéale 1 fois par jour tous les jours sur 2 semaines ou 2 ou 3 fois par semaine selon le traitement administré sur animaux vigiles ; durée totale du geste : 1-2 min Prélèvement de sang sous anesthésie générale le jour de la mise à mort (durée totale environ 10 min puis mise à mort)

Impact sur les animaux

L’injection des cellules tumorales se fait par voie sous-cutanée. L’injection par voie sous-cutanée cause un stress et une douleur légère de courte durée. Le gavage cause un stress et une douleur légère de courte durée. L’injection par voie intra-péritonéale cause un stress et une douleur légère de courte durée. Les prélèvements de sang peuvent induire des douleurs légères et transitoires. Sur la durée entière de l’expérience (3 semaines environ), les souris avec des tumeurs peuvent perdre du poids ou présenter des signes évocateurs de souffrances tels que des troubles du comportement (immobilité, isolement...) et de l’aspect physique (dos vouté, apparence du poil...).

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes pour l'étude de la réponse immunitaire.

Remplacement

Le microenvironnement tumoral est complexe, les modèles in vitro ne permettent pas de le mimer fidèlement. Les modèles organoïdes ne reproduisent pour l’instant pas la complexité du microenvironnement tumoral. Il est en effet possible de faire se développer de petites sphères de cellules tumorales in vitro, mais il est très difficile de faire se développer des vaisseaux sanguins et d’y ajouter les différentes populations immunitaires. Les cellules immunitaires survivent très mal dans ces conditions. La présence de la tumeur et le développement des vaisseaux sanguins vont modifier le microenvironnement tumoral en induisant en particulier le développement de cellules immunosuppressives. C’est ce développement et l’impact des traitements anti-angiogéniques sur ces processus que nous étudierons dans ce projet, ce qui ne peut donc se faire qu’in vivo. C’est pourquoi l’expérimentation utilisant un modèle animal mimant le plus fidèlement le microenvironnement tumoral est indispensable. En parallèle à ce projet d’expérimentation animale, des expérimentations seront réalisées à partir de prélèvements humains (sanguins ou tumoraux).

Réduction

L'implantation des cellules tumorales est mise au point. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Pour chaque expérience, le maximum de tissus est prélevé afin de maximiser les analyses biologiques possibles.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les animaux sont surveillés tout au long du projet. Une grille de score et de points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. L'atteinte d'un point limite qui ne pourra être soulagé entrainera une mise à mort anticipée de l'animal avant la fin du protocole.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour le suivi de la croissance tumorale. De nombreux outils sont disponibles pour analyser la réponse immunitaire chez la souris (en particulier des anticorps). D’autre part, les anti-angiogéniques utilisés dans ce protocole ont déjà été utilisés chez la souris et ont montré un impact sur la croissance tumorale. Des souris adultes à partir de 6-8 semaines seront utilisées car c’est à cet âge que le système immunitaire est complètement développé.

Chacun des 8 singes verts d'Afrique utilisés subit environ quinze anesthésies, quinze prélèvements de sang, quatre ponctions de moelle osseuse et sept retraits chirurgicaux de ganglions lymphatiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont d'abord infectés par le virus de l'immunodéficience simienne, l'espèce étant choisie parce qu'elle héberge naturellement ce virus sans développer le sida. Le porteur annonce comme effets possibles une perte de poids, des diarrhées, une baisse sévère des lymphocytes, des lésions cutanées, une anémie transitoire, des hématomes, et un stress lié à l'hébergement individuel des animaux qui présentent des symptômes. Tous seront tués en fin de projet pour accéder à l'ensemble de leurs organes lymphoïdes, les tissus prélevés étant ensuite "mis à disposition pour d'autres études".

Objectifs

Actuellement, il n'existe ni vaccin, ni traitement curatif contre le VIH. Pour avancer dans ce domaine, nous utilisons le singe vert africain (AGM) comme modèle. Ces singes, hôtes naturels d’un virus proche du VIH appelé SIV (virus de l'immunodéficience simien) ne développent pas le SIDA malgré une charge virale élevée. Cette résistance remarquable est due à leur capacité à éviter l’activation immunitaire chronique et à contrôler efficacement le virus dans les ganglions lymphatiques, des organes clés du système immunitaire. Un acteur essentiel de cette défense est un type de cellules immunitaires appelées cellules NK (Natural Killer pour tueuses naturelles), capables de reconnaître et de détruire rapidement les cellules infectées. Ces cellules jouent un rôle déterminant dans le contrôle du virus au tout début de l’infection. Nous pensons qu’une sous-population spéciale de cellules NK, dites adaptatives, acquiert directement cette capacité dans les ganglions lymphatiques. Nos recherches visent à comprendre comment ces cellules NK adaptatives se développent et agissent. Nous cherchons à : 1. Identifier les mécanismes qui rendent ces cellules si efficaces. 2. Étudier l’environnement des ganglions avant et après l’infection pour découvrir les signaux qui les activent. 3. Tester leur capacité antivirale en laboratoire. Ces recherches pourraient offrir de nouvelles pistes pour le développement de traitements contre le VIH.

Bénéfices attendus

Cette étude sur les singes verts africains vise à mieux comprendre comment certaines cellules immunitaires, appelées cellules NK adaptatives, parviennent à contrôler l'infection par le virus SIV, un équivalent du VIH chez ces animaux. En combinant des expériences en laboratoire et des observations directes sur les singes, nous cherchons à découvrir comment ces cellules se développent et comment elles parviennent à supprimer l'infection. Pour cela, nous utilisons des techniques de pointe, comme la cytométrie de flux et le séquençage de l'ARN à l'échelle d'une seule cellule, afin d'analyser en détail les cellules NK durant l'infection. Ces méthodes nous fourniront des informations précieuses sur la diversité et le rôle de ces cellules chez les singes verts, qui ne développent pas de maladie malgré la présence du virus. L'objectif à long terme est d'identifier les facteurs qui rendent ces cellules NK particulièrement efficaces chez le singe vert pour éliminer les cellules infectées. Ces découvertes pourraient aider à développer de nouvelles stratégies de traitement pour le VIH chez l'humain, en ciblant les réservoirs du virus dans le corps et en contribuant à une rémission durable de l'infection.

Procédures

Les différentes interventions dans ce projet sont : - Infection par le virus SIV (une fois, 5 min, tous les animaux) - Anesthésie des animaux (15 fois environ, 30 minutes, tous les animaux) - Prélèvements de sang (15 fois environ, 5 min, tous les animaux) - Prélèvement de moelle osseuse (4 fois, 10 minutes, tous les animaux) - Retrait chirurgical de ganglions lymphatiques périphériques (7 fois environ, 20 minutes, tous les animaux)

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables peuvent survenir selon le type d’intervention : Nuisances suite à l’infection (peu attendu car les AGM sont les hôtes naturels du virus) : Perte de poids, diarrhée, baisse sévère des lymphocytes, observation de nodules à la palpation, lésions cutanées Nuisances suite aux prélèvements de sang, moelle osseuse et anesthésies répétées : Troubles de l’appétit avec plus ou moins des pertes de poids mineures, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Nuisances suite à l’hébergement individuel : L’hébergement en individuel peut entraîner un stress. Nuisances possibles suite à l’exérèse de ganglions : Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie rare, durée de 1 à 5 jours.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de projet afin d’avoir accès à tous les organes lymphoïdes primaires et secondaires où l’activité des NK pourrait être essentielle au contrôle du virus

Remplacement

Les expériences uniquement in vitro ne peuvent pas refléter le comportement de la cellule dans son contexte physiologique, ni mimer les conditions de fonctionnement d’un organisme entier. C’est pourquoi les études in vivo sont nécessaires. Le primate est, pour toutes ses proximités avec l’humain, le plus adapté aux études physiopathologiques. Par ailleurs, pour le SIDA, il n’existe pas d’autre modèle animal que le primate non humain. Par opposition aux études menées chez l’humain infecté par le VIH, l’utilisation des modèles primates où l’infection est non-pathogène nous permet d'analyser et de comprendre, en absence de traitement les réponses cellulaires efficaces dans différents tissus en plus du sang, notamment les ganglions lymphatiques, l’intestin et la rate qui jouent un rôle essentiel dans l’infection SIV/VIH. L’analyse des interactions hôte/virus chez l’hôte naturel nous permet d’identifier les facteurs d’hôte qui pourraient aboutir à l’élimination des réservoirs viraux (et qui ne sont pas atteints par les traitements antirétroviraux actuels).

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum nécessaire à une analyse statistique fiable des résultats par des tests adaptés aux petits échantillons. L’élaboration et l’analyse des résultats de cette étude sont réalisées en collaboration avec une équipe de Bioinformatique et Biostatistique . Les tissus prélevés à l’euthanasie seront mis à disposition pour d’autres études.

Raffinement

Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie pour éviter d’éventuelles douleurs. Si possible, les prélèvements seront groupés lors d’une seule anesthésie. Si des troubles alimentaires apparaissent suite aux anesthésies répétées, une diversification/complémentation alimentaire sera instaurée (monkey dough, fruits secs, fruits frais additionnels, fortimel etc.). Les volumes de sang et de moelle osseuse prélevés seront réduits au minimum. Si apparition de réaction locale un traitement symptomatique pourra être instauré. Les animaux sains seront hébergés en groupe; les animaux chroniquement infectés seront hébergés en groupe sauf en cas de symptômes ou avis contraire des vétérinaires de l’installation: dans ce cas, ils seront hébergés en modules individuels permettant des interactions sociales avec un enrichissement augmenté. Les animaux seront observés quotidiennement. Des points limites sont prévus et le vétérinaire de l’installation sera alerté en cas d’apparition de signes cliniques inattendus afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux.

Choix des espèces

Les singes d'Afrique, comme le singe vert possèdent une protection naturelle unique contre le SIDA. Ces singes sont les porteurs naturels des virus de l'immunodéficience simiens (SIV), qui ont donné naissance au VIH chez l'humain. Ils ne développent jamais la maladie malgré la présence du virus en grandes quantités dans le sang. Cela fait d'eux un modèle précieux pour étudier comment le système immunitaire peut se défendre efficacement contre le SIDA. Les recherches se concentrent sur les singes adultes, car leur système immunitaire est pleinement développé, ce qui permet de mieux comprendre les mécanismes de protection. En étudiant ces animaux, les scientifiques espèrent découvrir des pistes pour renforcer la réponse immunitaire contre le VIH chez l'humain.

Pour vérifier chez la souris l'effet contre les tumeurs d'ARN thérapeutiques ciblant RBM39, observé jusqu'ici in vitro, 1 300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Greffées de cellules tumorales dans les flancs, elles subissent cinq à six séances d'imagerie de 30 minutes sous anesthésie, trois prises de sang derrière l'œil et des injections de traitement répétées trois à cinq fois, dans une veine, dans la tumeur ou dans l'abdomen. Le porteur prévoit une perte de poids, de la fatigue et une anémie liées aux tumeurs, et indique ne pas avoir encore évalué la toxicité des ARN. Il écrit que le "bien-être de l'animal au quotidien est nécessaire au bon déroulement de nos expériences". Aucun point limite n'est décrit, et les analgésiques "pourront" être donnés "en fonction de l'expérience et de la souffrance de l'animal".

Objectifs

Ce projet de recherche a pour but d'évaluer le potentiel antitumoral d’ARN thérapeutiques sur des modèles précliniques de cancer. Malgré de nombreuses avancées, en particulier avec l’arrivée des thérapies ciblées puis des immunothérapies, les thérapeutiques anticancéreuses actuellement disponibles restent limitées et des résistances émergent le plus souvent, nécessitant un changement de stratégie thérapeutiques. Il est donc essentiel de développer des nouveaux traitements, dont les mécanismes d’actions seraient différents des traitements actuellement utilisés, afin d’élargir le spectre des options thérapeutiques ais également de pouvoir adapter le traitement au patient et aux caractéristiques biologiques et moléculaires tumorales. Les arylsulfonamides sont une classe de drogue dont l’intérêt pour le traitement des cancers a été évalué. Nous avons récemment développé une approche thérapeutique via des ARN thérapeutiques, et avons fait la preuve de concept in vitro de leur activité antitumorale. Nous souhaitons donc avec ce projet valider nos observations in vitro.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider l'utilisation d'ARN thérapeutiques pour le traitement des cancers, en particulier le cancer colorectal. A plus long terme, ce projet pourrait aboutir au développement en clinique de ces mêmes ARN thérapeutiques.

Procédures

- Greffe de cellules tumorales sous-cutanée dans les flancs : Durée 10 minutes - 1 fois par animal / Injection intrapéritonéale de luciferine pour bioluminescence : Durée 1 minute - 5 à 6 fois par animal - Anesthésie gazeuse durant l'imagerie : Durée 30 minute - 5 à 6 fois par animal / Prélèvements sanguins retroorbitaires - Durée 2 minutes - 3 fois par animal / Injection de traitements par voie IV - Durée 2 minutes - 3 à 5 fois par animal / Injection de traitements par voie intratumorale - Durée 2 minutes - 3 à 5 fois par animal / Injection de traitements par voie intrapéritonéale - Durée 2 minutes - 3 à 5 fois par animal

Impact sur les animaux

La greffe de lignées cellulaires tumorales, suivi de la croissance des tumeurs, engendreront une altération de l'état général des animaux avec perte de poids, fatigue, et anémie principalement. Le traitement par indisulam pourrait engendrer certaines toxicités, même si la littérature décrit des toxicités systémiques limitées chez l'homme et la souris (rares anémies). Nous n'avons pas encore évalué la toxicité potentielle des ARN thérapeutiques, mais celle-ci sera évaluée grâce aux expériences de mise au point.

Devenir

Des tests sur des cellules tumorales et des cellules normales en culture in vitro nous ont déjà permis de déterminer certains effets de nos traitements. Cependant, l’utilisation de modèles in vivo comme la souris est indispensable à la compréhension des mécanismes d’action du traitement dans un organisme entier proche de l'homme, incluant des paramètres comme le développement tumoral, le microenvironnement, les contraintes physiques etc. qui ne sont pas retrouvés in vitro. Cette étape est également nécessaire puisque nous envisageons une potentielle et future utilisation chez l’homme comme thérapie. Afin de caractériser l'effet de nos traitements; nottament l'effet biologique, nous devons récupérer en fin d'expérience les tumeurs des animaux traités et non non traités. Nous devons pour cela procéder à l'euthanasie sysématique de l'ensemble des animaux du projet. L'étude moléculaire des tumeurs, ainsi que celles des tissus des autres organes est indidspensable pour évaluer les effets antitumoraux mais également la toxicité des traitements testés.

Remplacement

Des tests sur des cellules tumorales et des cellules normales en culture in vitro nous ont déjà permis de déterminer certains effets de nos traitements. Cependant, l’utilisation de modèles in vivo comme la souris est indispensable à la compréhension des mécanismes d’action du traitement dans un organisme entier proche de l'homme, incluant des paramètres comme le développement tumoral, le microenvironnement, les contraintes physiques etc. qui ne sont pas retrouvés in vitro. Cette étape est également nécessaire puisque nous envisageons une potentielle et future utilisation chez l’homme comme thérapie.

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d'animaux, nous utiliserons les mêmes animaux pour évaluer à la fois la prise et la croissance tumorale, la dose des traitements et leur toxicité. Nous utiliserons également les mêmes souris pour nos contrôles positifs et négatifs dès que ce sera possible. Cette association nous permet de réduire le nombre de souris contrôles utilisées. Le nombre d’animaux par lot sera également réduit au maximum afin d’avoir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Le bien-être de l’animal au quotidien est nécessaire au bon déroulement de nos expériences, mais également à la reproductibilité de nos résultats. Des enrichissements (maisons rouges) sont présents dans les cages. Au cours de nos expériences, de la nourriture humidifiée sera accessible directement dans la cage pour éviter la déshydratation des souris. Des tapis chauffants seront également utilisés dès l’anesthésie des souris, pendant les injections, et lors de la phase de réveil. Des injections d'analgésique pré et postopératoire pourront être réalisées en fonction de l'expérience et de la souffrance de l'animal. Un suivi attentif quotidien par du personnel compétent et formé, weekend compris, sera également mis en place. L'environnement des animaux sera enrichi par des tunnels en polycarbonate. Au moindre doute, nous ferons appel aux conseils de notre vétérinaire ou de la structure du Bien-Etre Animal (SBEA).

Choix des espèces

La souris représente l'animal classiquement décrit dans littérature pour ce type d'éxpérimentation. Nous utiliserons des lignées génétiquement modifiée immunodéprimées afin de permettre la bonne prise tumorale des xénogreffes de cellules humaines. L'utilisation d'un modèle syngénique nous permettra de valdier nos observations dans un système immunocompétent ce qui est essentiel pour envisager un dévellopement chez l'homme par la suite. Comme ce qui est classiquement décrit dans littérature pour ce type d'expérimentation, les animaux utilisés seront de 8 à 12 semaines.