Recherche fondamentale

Soumises à une chirurgie d'une heure au maximum pour déclencher la formation d'un caillot dans une artère, 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent jusqu'à six injections sous la peau et une injection derrière l'œil sous anesthésie, le porteur indiquant que des saignements oculaires peuvent apparaître après l'administration des antiplaquettaires et que le caillot peut migrer et provoquer un accident vasculaire cérébral chez la souris. L'objet du projet est de suivre l'évolution d'un caillot occlusif sur un jour puis sur une semaine et de tester des molécules ciblant les plaquettes. Les retombées annoncées pour les patients sont renvoyées au long terme, quand la carotide et le cerveau de chaque souris sont prélevés après sa mise à mort.

Objectifs

L’hémostase est le processus biologique assurant l’arrêt des saignements. Elle implique notamment les plaquettes sanguines, qui, suite à une lésion du vaisseau, vont former un agrégat, appelé clou plaquettaire, qui limite le saignement. Un processus similaire intervient lors de la thrombose artérielle qui survient dans une artère malade présentant une plaque d’athérosclérose. Suite à la rupture de cette plaque, les plaquettes forment un agrégat pouvant entrainer des pathologies graves comme un accident vasculaire cérébral (AVC). Dans certains cas, l’agrégat peut boucher le vaisseau ce qui stoppe totalement la circulation sanguine. Le but de ce projet est de mieux comprendre l’évolution d’un agrégat occlusif au cours du temps, sa sensibilité à des traitements contre les plaquettes ainsi que sa potentielle évolution vers un AVC.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de mieux comprendre l’évolution d’une thrombose occlusive ainsi que d’étudier l’impact du ciblage de différents récepteurs plaquettaires sur celle-ci. A long terme, cela nous permettra d’améliorer la prise en charge des patients présentant une thrombose artérielle occlusive et de réduire les séquelles à long terme de cette pathologie, comme l’AVC ischémique.

Procédures

Le modèle nécessite une procédure chirurgicale pour induire la thrombose, celle-ci sera de maximum 60 min. Les animaux seront soumis à des injections sous-cutanées (maximum 6) et rétro-orbitales (maximum 1) (animal anesthésié).

Impact sur les animaux

Une des complications attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée). Des saignements pourraient apparaitre au site d’incision ou site chirurgical. Des signes de douleur peuvent également apparaitre après l’intervention chirurgicale, notamment au niveau du site chirurgical. On pourrait observer des saignements au niveau de l’œil suite à l’administration des traitements antiplaquettaires. De plus, le thrombus pourrait emboliser et entraîner un accident vasculaire cérébral (AVC) chez la souris.

Devenir

Les souris sont mises à mort à la fin de la procédure afin de récupérer la carotide et le cerveau pour réaliser des analyses histologiques.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’étudier l’évolution d’une thrombose occlusive au cours du temps ainsi que le rôle de différents récepteurs plaquettaires. La pathologie étudiée, la thrombose artérielle, étant un processus particulièrement complexe faisant intervenir plusieurs types cellulaires (plaquettes, globules rouges, globules blancs) ainsi que les conditions hémodynamiques (vaisseau, pression artérielle, flux sanguin), les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués pour reproduire toute la complexité de ce processus. De plus, nous ne disposons pas à l’heure actuelle de modèle de thrombose occlusive in vitro. Nous souhaitons également évaluer l’évolution du thrombus sur de longue période (1j et 1 semaine), ce qui est impossible in vitro du fait que le sang doit être utilisé dans les 4h suivant son prélèvement.

Réduction

Le projet se fera par étapes, comme indiqué dans le déroulé du projet. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 10 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Les effectifs sont calculés par des tests statistiques adaptés, le critère recherché est la comparaison de moyennes.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Aucun geste n’est réalisé sur animal vigile, nous n’avons donc pas prévu d’habituation. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum: • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 3 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. • Par une habituation au gel nutritif 3 jours avant l’opération • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de l’opération • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin de lutter contre l’hypothermie pendant la chirurgie ainsi que son réveil en boite thermostatée à 37°C • Par l’injection d’analgésique et d’anesthésique local avant chaque procédure en sous-cutanée et également appliqué sur l’œil après injection intraveineuse. • Par application de gel ophtalmique sur les yeux lors de l’anesthésie afin de les protéger, et par injection d’1 mL de sérum physiologique à la fin de la procédure chirurgicale pour assurer l’hydratation de l’animal en plusieurs points d’injection (au moins 2). Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.

Choix des espèces

La souris est un animal pour lequel les modèles d’études in vivo sont largement maitrisés et caractérisés, notamment les modèles de thrombose artérielle. De plus, les techniques de mutation ont permis de générer des souris exprimant certains récepteurs plaquettaires humains, permettant ainsi de tester de nouveaux traitements de la thrombose artérielle. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement. Une exception sera faite pour un type de souris car leur carotide est plus grosse à âge égal, elles seront utilisé à 1 mois afin de générer une thrombose suffisante.

Pour vérifier chez l'animal vivant qu'un gène de l'horloge biologique commande les flux d'ions du cœur, 18 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Chacune reçoit un capteur implanté sous la peau au cours d'une chirurgie de vingt minutes, capteur qui reste en place onze à douze jours, durée pendant laquelle le porteur reconnaît un inconfort permanent et des bagarres entre animaux le temps de la cicatrisation. Six injections dans l'abdomen complètent le protocole. Les 60 000 morts subites cardiaques annuelles en France servent à situer l'enjeu, la protéine étudiée n'étant présentée comme cible thérapeutique possible qu'à plus long terme.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde. Parmi elles, l’insuffisance cardiaque a un pronostic grave, avec plus de 75% des hommes et plus de 50% des femmes décédant 5 ans après le diagnostic, la mort subite cardiaque restant la cause majeure des décès. La mort subite est due à des arythmies, c’est-à-dire des anomalies dans le rythme des battements cardiaques. Il est aujourd’hui connu que ces arythmies mortelles sont plus fréquentes à certains moments de la journée, particulièrement le matin au moment du réveil, et à un moindre degré dans la soirée. En revanche, on ne comprend pas complètement pourquoi ce sont ces moments en particulier. Même si l’activité du cerveau et d’autres variations d’hormones sont impliquées dans ces rythmes de la journée, un mécanisme moléculaire au niveau des cellules cardiaques, l’horloge biologique, pourrait également être impliqué. En effet, bon nombre de fonctions biologiques et de maladies, incluant l’activité électrique cardiaque, suivent une horloge biologique journalière interne. Ce système est double : il y a une horloge principale centrale située dans le cerveau, et des horloges présentes dans presque tous les tissus et cellules de l’organisme, dont le cœur. Le fonctionnement de ces horloges repose sur l’expression locale de gènes « horloge » selon un rythme régulier, d’environ 24h. Nous avons prouvé in vitro qu’un des gènes de cette horloge cardiaque serait le dernier maillon qui contrôle les variations des flux d’ions des cellules du cœur. Ces flux d’ions sont essentiels à la fonction cardiaque et leurs perturbations engendrent les arythmies. Nous avons mis en évidence ce nouveau lien entre l’horloge journalière et la fonction cardiaque au niveau cellulaire et le but de ce projet est confirmer cela in vivo.

Bénéfices attendus

De nombreuses fonctions du corps (sommeil, température, fréquence cardiaque...) sont régulées selon un rythme de 24h. Les battements cardiaques sont notamment rythmés par nos phases d’activité et de repos, elles-mêmes commandées par une horloge biologique. Cette horloge repose sur l’expression de gènes « horloge » dans le cerveau et les cellules cardiaques. De même, les maladies cardiovasculaires sont plus fréquentes à certains moments de la journée : les morts subites cardiaques sont dues à des anomalies des battements cardiaques et sont plus nombreuses au moment du réveil. Ces morts subites cardiaques touchent environ 60 000 personnes par an en France et sont encore incomprises. Nous avons mis en évidence dans des études in vitro et ex-vivo un gène qui serait le médiateur final contrôlant les variations journalières des flux d’ions dans les cellules du cœur. La confirmation in vivo de ce rôle offrirait non seulement une meilleure compréhension du contrôle selon le rythme journalier du rythme cardiaque normal et mais aussi des pathologies qui découlent de sa dérégulation, comme les morts subites. A plus long terme, cette protéine pourrait être une nouvelle protéine clé à la fois pour le diagnostic prédictif des morts subites et comme nouvelle cible thérapeutique dans le champ des maladies cardiaques mais pas seulement.

Procédures

Tous les animaux vont être implantés sous la peau avec un capteur qui permet de mesurer et transmettre l’activité électrique cardiaque ; c’est une opération chirurgicale d’environ 20 minutes; le capteur reste en place environ 11 à 12 jours. Des mesures par télémétrie sont ensuite effectuées pendant 24h sans isoler les animaux. Tous les animaux recevront 6 injections intra-péritonéales d’un agent pharmacologique ou de son véhicule; chaque injection dure moins de 5 secondes.

Impact sur les animaux

La chirurgie pour l’implantation de capteurs peut entrainer une douleur dues aux sutures ainsi qu'un inconfort de l'animal. La douleur suite à l’intervention chirurgicale peut durer quelques jours jusqu’à cicatrisation complète. L’inconfort dû au capteur est présent tout le temps d’implantation c’est-à-dire 11 jours (1 semaine de repos après implantation, 3 jours de traitement et 24h d’enregistrement). Pendant la phase de cicatrisation, on observe parfois des comportement d’agressivité entre animaux. Les injections intrapéritonéales avant l'enregistrement du rythme cardiaque peuvent induire un stress léger chez l'animal, dû à la contention, de très courte durée.

Devenir

A la fin de la préocédure, tous les animaux sont euthanasiés car nous avons besoin de prélever les organes pour des analyses de biologie moléculaire.

Remplacement

Cette étude est un complément à une étude in vitro sur cellules très poussée, qui a permis d’identifier un nouvel acteur de l’horloge biologique dans le cœur. Néanmoins, au vu du niveau de complexité et de la spécialisation des cellules cardiaques, aucun système cellulaire (lignées, organoïdes, organes bio-artificiels ou organs-on-a-chip) ne permet de récapituler totalement la fonction et le dysfonctionnement cardiaque. Les modélisations par ordinateur ne sont pas non plus suffisantes pour mimer une telle complexité. Le cœur est un organe complexe, composé anatomiquement de plusieurs compartiments et physiologiquement de plusieurs tissus spécialisés. En complément des études déjà réalisées in vitro, il est indispensable d’étudier le cœur intégré à l’organisme. La souris est un bon modèle car les gènes étudiés sont conservés

Réduction

Une planification à l’aide de logiciels de statistiques nous a permis de déterminer le nombre d’animaux minimum nécessaires pour obtenir des résultats fiables. En fin d’expérimentation, les animaux seront euthanasiés et des expériences de biologie moléculaire seront effectuées afin d’optimiser les ressources à notre disposition.

Raffinement

Les animaux élevés au sein de l’animalerie seront pris en charge et observés de leur naissance à leur euthanasie. Les cages des animaux seront enrichies et les animaux seront suivis par un personnel spécifiquement formé. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles, dans une pièce où les paramètres environnementaux (Température, hygrométrie, lumière) et sanitaires sont contrôlés. Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne et de pesées régulières en fonction des procédures. Une grille de score a été définie, évaluant les paramètres suivants: apparence, comportement naturel, hydratation, signes cliniques et comportement provoqué. Des points limites, en fonction du score obtenu selon cette grille, ont été décidés, menant à l’administration d’analgésie supplémentaire ou à l’euthanasie. Toutes les procédures impliquant une chirurgie sur l'animal seront pratiquées en utilisant des anesthésiques et analgésiques.

Choix des espèces

La souris constitue un bon modèle cardiovasculaire car c’est un mammifère possédant un cœur à 4 cavités et une physiologie semblable à l’être humain. De plus, les gènes horloge sont hautement conservés entre tous les mammifères. Enfin, cette espèce est la plus couramment utilisée comme modèle d'étude de la fonction cardiovasculaire. Ainsi, ces animaux représentent un bon modèle sur le plan physiologique et génétique. Nous souhaitons étudier des animaux adultes, avec un cœur complètement développé, donc d’environ 8 semaines.

Soumis à une ligature du nerf situé sous l'orbite, sous anesthésie générale, 400 rats sont ensuite testés tous les deux jours pendant soixante jours pour mesurer leur hypersensibilité de la face. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré et tous les rats sont tués, une partie après une trachéotomie, une canulation de la carotide et de la jugulaire et une craniotomie menées sans réveil. Le projet vise à décrire la réorganisation du cortex somato-sensoriel dans une névralgie du trijumeau. Le porteur écrit que les résultats "ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux mis à part le développement d'une allodynie faciale", allodynie qui est précisément la douleur que la ligature sert à produire.

Objectifs

Les douleurs neuropathiques faciales issues d'atteintes nerveuses périphériques se révèlent très difficiles à soulager et/ou guérir lorsqu'elle mettent en jeu une sensibilisation centrale, c'est à dire une modification du fonctionnement du système nerveux central induisant des douleurs spontannées (en l'absence de stimulus) ou suite à des stimuli non douloureux (caresses, brossage de dents...). Cela peut se produire dans le cadre de compression de nerfs faciaux comme observé dans la névralgie du trijumeau. Le but de ce projet est d'étudier la mise en place de la sensibilisation centrale dans le cortex somato-sensoriel primaire dans un modèle murin de neuropathie faciale.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes de sensibilisation corticale impliquée dans les phénomènes d’hypersensibilité douloureuse. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux douleurs chroniques, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont : • Injections intra-péritonéales (

Impact sur les animaux

Utilisant un modèle de douleur neuropathique, nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse lors d'une stimulation tactile. Les résultats obtenus ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux mis à part le développement d'une allodynie faciale suite à une stimulation tactile. La douleur occasionnée à l’animal est estimée comme étant « modérée » (retrait de la face). Ces mesures sont peu douloureuses puisqu’elles consistent en la mesure d’un seuil avec possibilité d’échappement et n'entrainent pas de réactions visibles autres que le retrait moteur de la zone stimulée.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une analyse immunohistochimique.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique (fibres afférentes). Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique après ligature du nerf infra-orbitaire. Cependant, en parralèle de cette étude expériementale, une étude computationnelle basée sur les résultats expériementaux afin de modéliser les modifications corticales associées à la mise en place de la douleur neuropathique. Nous espérons que dans le futur, un tel modèle permettra de tester des hypothèses in silico afin de permettre de remplacer certaines expérimentations.

Réduction

Le nombre d’animaux a été établi par l'utilisation de tests statistiques préalables et en tenant comptee des divers risques liés aux différentes approches expérimentales (mauvaises injections, problème d’habituation lors des études comportementales, difficultés d'enregistrements). Ce nombre sera susceptible de changer si au cours de l’expérience nous observons une différence significative avant d’atteindre le nombre maximal d’animaux autorisés. Pour la partie comportement (A), consistant à valider que la ligature du nerf infra-orbitaire induit une allodynie faciale, nous allons utiliser 10 animaux par groupe (témoins mâle, ligature mâle, témoins femelle, ligature femelle). Pour les parties patch-clamp), nous allons utiliser 15 animaux par groupe (témoins mâle, ligature mâle, témoins femelle, ligature femelle) et par mesure effectuée. Pour la partie patch-clamp axonale ex vivo, nous allons utiliser 30 animaux par groupe (témoins mâle, ligature mâle, témoins femelle, ligature femelle). Nous avons prévu plus d'animaux pour ces expériences car les enregistrements axonaux étant très complexes, le taux de succès est plus faible que pour les autres enregistrements. Pour la partie enregistrements électrophysiologiques in vivo, nous allons utiliser 15 animaux par groupe (témoins mâle, ligature mâle, témoins femelle, ligature femelle).

Raffinement

Préalablement à toutes les études, les animaux sont (i) hébergés dans des cages à environnement enrichi (tunnel pour grignotage, enrichissement social) dans notre animalerie, pendant une semaine, et (ii) soumis à des séances d’habituation, pendant 4 jours, afin de diminuer le stress lié au nouvel environnement et à la manipulation par l’expérimentateur. Pour les injections, les rats sont préalablement anesthésiés. L’anesthésie adéquate des animaux est confirmée par l’absence de réflexe de retrait de la patte en réponse à un pincement de la patte postérieure. De plus, après la ligature du nerf infraorbitaire, le suivi post-opératoire, avec un examen minutieux de la zone ligaturée, est poursuivie dans les jours suivants. L'état général de l'animal est surveillé tous les jours avec contrôle du poids. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. Le poids est mesuré quotidiennement. La nourriture sera humidifiée pour faciliter son absorption. Si la perte de poids excède 20% du poids initial, les animaux seront mis à mort. Nous regarderons également l’apparence et le comportement (poils ébouriffés, animal prostré, posture anormale, vocalisations, agitation, toilettage). S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation.

Choix des espèces

La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années. C’est par ailleurs un bon modèle pour les études comportementales. Les animaux utilisés seront des rats adultes, par comparaison avec les autres données de la littérature.