Recherche fondamentale

Des rats issus d'autres projets pourront être intégrés à celui-ci s'ils correspondent aux critères d'âge, de poids et de sexe. 336 rats vont être utilisés au total, tous tués à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous subissent au moins une chirurgie, et 168 d'entre eux reçoivent un cathéter intraveineux puis s'auto-administrent de la cocaïne ou de l'alcool pendant trois mois, avec chocs électriques sur les pattes pendant le protocole comportemental et syndrome de sevrage ensuite. Le porteur revendique une démarche réductive en testant les mêmes rats avant et après l'exposition, et affirme que le rat est "un modèle de choix, ne pouvant être remplacé" puisqu'il s'auto-administre les substances consommées par l'être humain.

Objectifs

Ce projet vise à améliorer notre compréhension de la susceptibilité individuelle à l’addiction à la cocaïne ou à l’alcool chez les rats, en identifiant des prédicteurs comportementaux de la vulnérabilité à la dépendance au sein des groupes sociaux de rats. L'analyse du comportement joue un rôle essentiel dans l'étude de la vulnérabilité à la dépendance, et les progrès récents dans les techniques de suivi de l'apprentissage automatique ont fourni des informations précieuses. Ce projet combinera des approches comportementales permettant de modéliser les critères d’addiction, observés chez l’homme, à des outils de pointes pour l'analyse comportementale, incluant le «Live Rat Tracker » (LRT) et le « Motion Sequencing (MoSeq2) ». Ces outils permettent d’enregistrer de façon automatique de nombreux comportements sociaux et individuels, au sein d’une cohorte d’animaux durant plusieurs jours. L’inclusion de rats mâles et femelles permettra d’explorer les différences potentielles de développement en matière de susceptibilité à la dépendance à la cocaïne ou l’alcool. Ce projet déterminera donc comment l’exposition à la cocaïne ou l’alcool modifie les comportements sociaux entre congénères. Une analyse fine des marqueurs comportementaux (en groupe vs. addiction) nous permettra de déterminer s’il existe des marqueurs comportementaux permettant d’identifier de façon précoce et non-invasive les individus vulnérables à l’addiction.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de découvrir s’il existe des marqueurs comportementaux, sociaux ou individuels, pouvant prédire la future vulnérabilité à la cocaïne ou l’alcool des individus testés. Ce projet permettra également de disséquer le rôle de certaines régions d’intérêts dans ces comportements. Ce projet génèrera des résultats comportementaux et moléculaires, permettant d’approfondir nos connaissances dans le domaine des sciences de l’addiction, tant au niveau fondamental que translationnel. En effet, sur la base de nos résultats, il sera possible d’étudier chez l’homme certains comportements spécifiques (sociaux et/ou individuels) afin de tester leur potentiel prédictif. Ainsi, ce projet pourrait apporter de nouvelles perspectives en termes de politique de prévention et de « dépistage » des individus vulnérables à l’addiction.

Procédures

L'ensemble des animaux (n=336) subira au moins une intervention chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie adaptée (implantation puce d’identification, 10min). 168 animaux seront soumis à un deuxième acte chirugical (implantation de cathéter intra-veineux, 45min). 168 animaux seront soumis au protocole d’auto- administration de cocaïne (3 mois). 168 animaux seront soumis au protocole d’auto-administration d’alcool (3 mois).

Impact sur les animaux

Légère: Perte de poids et/ou activité réduite suivant l'intervention chirurgicale, alimentation contrôlée après la phase de récupération chirurgicale, Stress induit par la remise en dyade après la phase de récupération chirurgicale, Syndrome de sevrage (perte de poids et/ou apathie et/ou agressivité) après le protocole d'auto-administration de cocaïne. Modérée: Douleur au niveau des cicatrices suivant la chirurgie, Choc électrique sur les pattes pendant le protocole comportemental.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever leur cerveau pour mener des études immunohistochimiques

Remplacement

Ce projet a pour but d'étudier l'état fonctionnel d'un réseau cérébral dans une pathologie précise. L'étude des comportements de consommation, qu'ils soient physiologiques ou pathologiques, requiert par définition que l'animal soit vigile et libre de ses mouvements et choix. Le rongeur, et plus particulièrement le rat, est donc un modèle de choix, ne pouvant être remplacé pour ce genre d’étude.

Réduction

De par sa nature exploratoire, et dans l’objectif de générer une grande quantité de données, nous utiliserons un nombre prédéfini de sujets (mâles et femelles), en se basant sur notre expérience, supportée par une analyse statistique a priori. Toutefois, dans une démarche réductive, les animaux seront testés plusieurs fois LRT, avant et après l’exposition aux protocoles d’addiction, permettant des analyses intra-sujet. De plus, après obtention de l’accord auprès de la SBEA (Structure du bien être animal de l’établissement), des animaux issus d’autres projets (âge, poids, sexe correspondant à nos conditions expérimentales) pourraient être intégrés au projet.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par 2 dans leur cage à l'animalerie, avec accès ad libitum à l'eau. La nourriture sera contrôlée afin de garder les animaux à un poids conforme à la législation en vigueur concernant les conditions d’hébergement en animalerie. Les cages sont enrichies grâce à la présence d'objets divers et variés (bâtonnets en bois, rouleau en carton…changés régulièrement afin de diversifier au maximum l’environnement des animaux). Durant les sessions LRT, les animaux sont monitorés en temps réel via une interface informatique par contrôle visuel, permettant d’intervenir rapidement en cas de besoin. La gestion de la douleur pendant et après les procédures douloureuses et les expérimentations est toujours prise en compte par des personnels compétents et sera améliorée si besoin par injection d'analgésiques spécifiques. L'état de santé général de tous les animaux de l'étude est suivi quotidiennement, ce qui nous permet de réagir immédiatement et de manière appropriée en cas de besoin. En cas de souffrance (prostration, poils hérissés, absence de toilettage, dos courbé...) et/ou de perte importante de poids, l’animal sera isolé et aura accès ad libitum à une nourriture enrichie et un traitement antidouleur sera mis en place si besoin. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie appropriée.

Choix des espèces

Le rat est un modèle animal de choix pour l'étude de l'addiction. Les modèles comportementaux de référence sont connus et maîtrisés, et il existe de nombreux tests comportementaux permettant de tester les différents symptômes de la pathologie. Par ailleurs, l'étude des comportements de consommation, qu'ils soient physiologiques ou pathologiques, requiert par définition que l'animal soit vigile et libre de ses mouvements. Le rongeur, et plus particulièrement le rat, est donc un modèle de choix, puisqu'il s'auto-administre l'ensemble des agents toxicologiques consommés par l'homme. Nous travaillerons chez le rat adolescent/jeune adulte (7-8 semaines), une période critique de vulnérabilité à l’addiction, au cours de laquelle les interactions jouent un rôle important dans le développement.

Pour suivre le trajet d'une protéine, OTX2, depuis les plexus choroïdes jusqu'aux interneurones du cortex, 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue et leur cerveau prélevé. Chacune subit une injection intracérébrale de trente minutes sous anesthésie, ou cinq injections intrapéritonéales quotidiennes, ou un prélèvement de liquide cérébrospinal de trente minutes, avec un risque de douleurs postopératoires et de fluctuations de poids. Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids de départ, ou qui ne s'améliorent pas après deux jours de traitement, sont mises à mort.

Objectifs

Dans le cerveau des mammifères, la protéine OTX2 est transférée des plexus choroïdes (structure qui sécrète le liquide cérébrospinal dans lequel baignent le cerveau et la moelle spinale) aux interneurones du cortex via le liquide cérébrospinal. OTX2 régule les périodes critiques de plasticité cérébrale juvénile qui permettent aux circuits neuronaux de se restructurer en réponse à l'expérience et qui sont impliquées dans certaines maladies psychiatriques. Ce projet examinera l’activité sécrétoire du plexus choroïde en utilisant des approches in vivo pour suivre avec précision la sécrétion et le transfert de protéines, et évaluer les mécanismes de leur transport. En combinant plusieurs analyses, ce projet permettra d'étendre nos connaissances sur l'activité d'OTX2 et des plexus choroïdes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre la sécrétion et distribution d’OTX2 dans le cerveau et son role dans la maturation des interneurones corticaux. Cette maturation régule les périodes critiques de plasticité cérébrale juvénile qui permettent aux circuits neuronaux de se restructurer en réponse à l'expérience et qui sont impliquées dans certaines maladies psychiatriques. A long terme, les résultats de ce projet impacteront notre compréhension des troubles du développement neurologique caractérisés par une maturation et un fonctionnement défectueux des interneurones corticaux.

Procédures

Une injection intracérébrale sera effectuée sur des animaux anesthésiés ; cette procédure chirurgicale dure environ 30 minutes et sera effectuée une seule fois. Une injection intrapéritonéale sera réalisée sur certains animaux vigiles ; la procédure dure environ 1 minute en moyenne et sera effectuée une fois par jour pendant 5 jours. Un prélèvement de liquide cérébrospinal sera effectué sur certains animaux anesthésiés ; cette procédure chirurgicale dure environ 30 minutes et sera effectuée une seule fois.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, il est possible que les animaux soient stressés après réveil, sujets à des fluctuations de poids ainsi que des douleurs post opératoires minorées par des antalgiques.

Devenir

A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort et leur cerveau sera collecté afin de permettre plusieurs analyses.

Remplacement

Nos recherches sur la distribution de protéine par le liquide cérébrospinal et les effets sur la plasticité du cerveau nécessitent des modèles de souris pour comprendre comment l'environnement juvénile affecte le comportement adulte. Ces expériences ne peuvent être reproduites in vitro car elles dépendent du développement du cerveau juvénile jusqu’à l'âge adulte.

Réduction

Nos travaux antérieurs sur des animaux soumis à des injections cérébrales suivies d’analyses nous ont permis de définir le nombre d’animaux par condition expérimentale afin d'obtenir une puissance statistique satisfaisante. Nous effectuerons plusieurs analyses sur certaines souris, ce qui nous permettra de réduire davantage le nombre d'animaux.

Raffinement

Toutes les expériences invasives sont réalisées sous anesthésie générale, associée à un traitement analgésique. Après la chirurgie, les animaux sont transférés dans une cage chauffée avec un tapis chauffant jusqu'à leur réveil. Ils sont ensuite hébergés dans leur groupe d'origine pour éviter le stress de l'isolement, puis observés et pesés quotidiennement pendant 2 jours. Pour évaluer les points limites, les souris seront inspectées quotidiennement afin de détecter les signes d'infection et de douleur (changement de posture, de pelage, d'expression faciales), et des mesures de poids seront prises au moins deux fois par semaine. En cas d'infection ou de signes de douleur, les animaux recevront un traitement approprié. En cas de perte de poids, les animaux seront placés dans des cages chauffées et recevront un régime alimentaire enrichi. Les animaux seront euthanasiés si aucune amélioration n'est constatée après 2 jours de traitement ou si la perte de poids dépasse 20% du poids de départ.

Choix des espèces

La génétique de la souris est très bien connue et proche de celle de l'homme, ce qui en fait un modèle privilégié pour l'étude de la plasticité cérébrale et des effets du stress en début de vie. C'est un animal avec lequel nous avons l'habitude de travailler et pour lequel nous avons une bonne expertise pour réduire les conditions de stress, d'inconfort et de douleur. Il nous permet également de créer des modèles pour l'étude des pathologies humaines. Ce projet porte sur l'analyse du cerveau de la souris adulte mature. Des injections stéréotaxiques dans les ventricules cérébraux seront effectuées sur des souris agées d’un minimum de 60 jours, lorsque le cerveau est peu plastique. Les analyses histologiques et biochimiques seront effectuées chez l’adulte (agées de 70 à 120 jours) pour évaluer la cinétique de distribution de protéines dans le cerveau.

800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour produire la version humaine d'une molécule de l'inflammation, elles reçoivent une puce sous-cutanée, un prélèvement au bout de la queue, une injection déclenchant soit une inflammation cérébrale soit une inflammation systémique avec insuffisance cardiaque et lésions multi-organes, puis un cathéter et une séance d'imagerie. Le porteur indique qu'elles peuvent cesser de manger et de boire, maigrir et rester prostrées, et précise qu'elles ne seront pas gardées au-delà des 24 heures que durent les modèles. Sur le remplacement, il affirme qu'il faut mesurer l'affinité de l'agent de contraste à l'échelle d'un "organisme entier" et conclut au "caractère de stricte nécessité" des procédures.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de valider une nouvelle technique d'imagerie ciblée sur une souris génétiquement modifiée qui exprime la version "humaine" de la cible d'intérêt. En effet, au sein de notre équipe de recherche, nous développons un nouvel agent de contraste, une substance qui augmente artificiellement le contraste d'une imagerie médicale. Cet agent de contraste est conçu pour se fixer sur des molécules qui apparaissent spécialement pendant l'inflammation. Nous avons développé une version de cet agent de contraste qui pourrait potentiellement être utilisable chez l'Homme, notamment pour évaluer l'inflammation cérébrale (dans le cadre du diagnostic de l'AVC par exemple) ou encore dans le cadre de l'inflammation cardiaque (infarctus du myocarde ou atteinte cardiaque inflammatoire). Cet agent de contraste a la particularité d'être "ciblé" c'est-à-dire qu'il reconnaît une molécule exprimée lors de l'inflammation. Le but de ce projet est de tester si cet agent de contraste est efficace pour imager l'inflammation cardiaque ou cérébrale chez des souris modifiées génétiquement pour exprimer (c'est-à-dire "produire") la version humaine de cette molécule cible.

Bénéfices attendus

Ce nouvel agent de contraste a montré une sensibilité et une spécificité élevées pour détecter l'inflammation cérébrale et cardiaque chez des souris non génétiquement modifiées et qui expriment donc la version murine de la molécule cible. Il est donc attendu que l'agent de contraste cible tout aussi bien la version humaine de la molécule exprimée par les souris modifiées génétiquement. Si les résultats de cette étude sont pertinents, cela permettrait d'ajouter des preuves solides au fait que l'agent de contraste développé ici pourrait être un jour utilisé en clinique chez l'Homme pour mieux diagnostiquer, évaluer et prendre en charge les pathologies inflammatoires cérébrales et cardiaques.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : o 1 prélèvement d'ADN pour confirmation du génotype (prélèvement d'un bout de queue) et insertion d'une puce en sous-cutanée (durée: 5min) o Induction du modèle inflammatoire par une unique injection d’un produit induisant l’inflammation (durée : inférieure à 20min) o Pesée lors des manipulations (durée : inférieure à 5 min) o 1 pose d’un cathéter sous anesthésie profonde (durée : environ 15min) o 1 imagerie avec injection de produit de contraste (durée : environ 20min).

Impact sur les animaux

L'étape de génotypage par puçage et prélèvement d'ADN peut induire un inconfort chez l'animal, tels que la douleur au niveau du site d'insertion de la puce sous-cutanée et des saignements, surtout au bout de la queue prélevée. Les deux modèles d'inflammation utilisées chez la souche de souris transgéniques peuvent produire des effets indésirables chez les animaux. Dans le premier modèle, une inflammation cérébrale créée pourra mener à des altérations de la signalisation neuronale et donc des problèmes cognitifs et comportementaux. Les animaux sont susceptibles d’éprouver une douleur de courte durée au niveau des points sutures et du site d’injection. Le deuxième modèle induit une inflammation systémique avec insuffisance cardiaque et des lésions multi-organes. Les animaux pourraient ressentir un inconfort physique et une souffrance de courte durée. Cette situation de mal-être et de stress pourra alors être repérée par une malnutrition liée à un arrêt de la prise alimentaire et de boisson suivie d'une perte de poids, de la prostration et une inactivité dans la cage.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les différents organes d'intérêt des animaux (cerveau, coeur, foie, rate), permettant ainsi de compléter les résultats obtenus in vivo par des résultats post-mortem (biodistribution, caractérisations immunohistologiques). De plus, les caractérisations histologiques sont très souvent demandées pour justifier les résultats obtenus lorsqu'une nouvelle technique d'imagerie pré-clinique est étudiée.

Remplacement

Des tests de ciblage in vitro ont été réalisés pour évaluer l'affinité de l'agent de contraste ciblant la molécule d'intérêt sur des cultures de cellules endothéliales humaines mises en conditions inflammatoires. Toutefois, les expériences in vivo ne peuvent pas être totalement remplacées par des études in vitro car il est nécessaire d'estimer l'affinité de l'agent de contraste pour la molécule humaine exprimée à l'échelle d'un organisme entier sans pouvoir pour autant tester chez l'Homme de suite. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures par rapport à nos précédents projets ayant utilisé les mêmes modèles animaux et les mêmes types d'agents de contraste. Dans ces deux études précédentes, différents groupes de souris avec des doses variables du produit induisant l’inflammation avaient été mis en place et il semble nécessaire de reprendre ces mêmes groupes afin de comparer rigoureusement l'efficacité de ciblage des agents de contraste entre les molécules d'intérêt murine (résultats des études précédentes) et humaine (nouveaux résultats attendus). De plus, il est nécessaire qu'un groupe contrôle soit mis en place avec des souris recevant des agents de contraste dits « contrôle » (non ciblés) pour mettre en évidence la spécificité de détection chez les souris transgéniques. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a en plus été confirmé par un calcul de taille d'échantillons.

Raffinement

Les animaux auront le temps d’acclimatation d’une semaine. Un enrichissement du milieu d'hébergement des souris est prévu. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 afin de conserver les interactions sociales. Avant toute mise en place des modèles, un génotypage des animaux sera réalisé par puçage et prélèvement d'ADN. Cela se fera sous anesthésie générale à l'isoflurane et au protoxyde d'azote. A partir du début de la mise en place des modèles, une attention particulière sera accordée à l'état général des animaux, notamment pour vérifier l'absence d'apparition de signes de détresse ou de douleur extérieure ainsi que la bonne prise alimentaire et de boisson. Une coupelle de croquettes humides aura été préalablement placée dans la cage afin de permettre aux animaux malades de s'alimenter et de s'hydrater plus facilement. Une attention particulière sera aussi accordée à l'évolution de la masse corporelle avec une pesée quotidienne afin de vérifier que la perte de poids n'est pas supérieure à 15%. Après induction des deux modèles, une surveillance sera faite 15 minutes après les injections du produit induisant l'inflammation, puis 1 heure après et 2 fois par jour jusqu’à la mise à mort des animaux. De plus, la douleur des animaux sera réduite au maximum en veillant à couvrir les temps d'étude par une analgésie. Enfin, les animaux ne seront pas gardés pour des études sur le long terme pour ne pas les laisser en souffrance au-delà des 24 heures que durent les modèles.

Choix des espèces

La souris (mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des pathologies de type inflammatoire. L’anatomie et la physiologie de la circulation sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’Homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier les pathologies inflammatoires. Nous utiliserons des souris mâles adultes de 8 semaines, en rapport avec l’âge des animaux utilisés dans les études pilotes.

Un agent cancérigène dans l'eau de boisson pendant seize semaines, ou une injection de cellules cancéreuses dans la bouche suivie d'une tumeur buccale qui gêne l'alimentation. 1 500 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des tumeurs et des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objet déclaré est de comprendre comment un composant de la matrice extracellulaire bloque les cellules immunitaires autour des cancers de la tête et du cou. Les atteintes décrites se limitent à l'anxiété et à la douleur transitoire des injections buccales, sans que soit précisé ce que quatre mois d'ingestion d'un cancérigène font subir aux 419 souris du modèle chimique.

Objectifs

Les cancers de la tête et du cou (ORL) représentent la 6ème cause de cancer humain avec une espérance de vie à 5 ans de 50%. On distingue ceux liés à une infection virale préalable et ceux provoqués par une exposition aux agents cancérigènes (tabac/alcool). La défense immunitaire permet de lutter contre le développement du cancer. Comprendre l’impact de l’environnement immédiat de ces cancers sur la défaillance immunitaire est donc cruciale. La Matrice Extra Cellulaire (MEC) structurant les tissus cancéreux a une constitution et une organisation spécifique qui favorise la progression cancéreuse. Nous avons identifié qu’un composant de la MEC des cancers ORL impacte la position des cellules immunitaires et la sévérité du cancer humain et d’un cancer ORL murin. Lorsque ce même modèle de cancer ORL se développe chez des souris qui n’expriment ce composant structurant, le cancer est moins grave et les cellules immunitaires ne sont pas séquestrées dans l’environnement de la tumeur. Notre objectif est de comprendre la nature des relations de contact entre les cellules immunitaires et ce composant au cours du développement du cancer et de déterminer quand et comment ce composant modifie les performances immunitaires. Ceci permettra d’améliorer nos connaissances sur les relations de proximité au sein des cancers ORL et sera important pour la recherche préclinique en identifiant de nouveaux traitements pour stimuler la défense immunitaire. Sur cinq ans, nous développerons trois modèles de cancers mimant les cancers ORL humains chez la souris normale, sans ce composant structurant ou sans un type immunitaire pour dévoiler les relations entre la défense immunitaire et notre composant structurant au cours de la croissance tumorale: Le premier modèle consiste en l’administration pendant 16 semaines d’un dérivé de la nicotine dans la boisson des souris pour mimer le cancer lié au tabac. Les tumeurs collectées en fin de procédure permettront d’identifier les défaillances de la défense immunitaire à différents stades du cancer; Deux modèles de greffe tumorale buccale par injection de cellules cancéreuses indépendantes d’une infection virale ou dépendante d’une infection virale. Ils permettront de comparer les mécanismes de défense immunitaire dans les cancers dépendant ou non d’une infection virale et leur défaillance. Ces modèles courts seront utiles pour déterminer le rôle de cellules particulières de la défense immunitaire et pour l’évaluation de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront d’identifier les relations microscopiques entre la défense immunitaire et un composant structurant et les conséquences de ces interactions sur la nature, la fonction des cellules immunitaires, la croissance cancéreuse et la structure du tissu malade. A terme, ces travaux permettront d’identifier des pistes nouvelles de stimulation du système immunitaire dans les cancers ORL afin de stimuler la défense immunitaire. Les modèles murins de développement de cancer ORL que nous proposons de développer et caractériser représente un outil indispensable pour déterminer les relations complexes et temporelles en place au sein des tumeurs. Ces études chez la souris poseront les bases d'une étude translationnelle chez l'Homme. Les résultats de cette étude serviront aussi au developpement de modèles in vitro pertinents.

Procédures

1 Modèle chimique: Administration d'un agent cancérigène dans l'eau de boisson pendant 16 semaines n'ayant pas d'impact direct sur l’alimentation (16 semaines par souris, 419 souris maximum). 2 Modèles de greffe buccale: 1 injection de cellules cancéreuses dans la bouche et une injection dans l'abdomen pour l'anesthésie pour contrôler la douleur et l’anxiété due à l'injection des cellules cancéreuses dans la bouche (2 injections totales par souris, 780 souris maximum). Elimination d'une population de la défense immunitaire pour évaluer son rôle dans la croissance cancéreuse par injection dans l'abdomen d'une drogue: 8 injections dans l'abdomen par souris (modèle chimique) sur 80 souris maximum et 2 injections dans l'abdomen par souris (modèles de greffe tumorale) sur 160 souris maximum.

Impact sur les animaux

les injections de cellules cancéreuses dans la bouche peuvent générer de l'anxiété et une douleur transitoire correspondant à une nuisance modérée. Lla croissance des tumeurs buccales peut avoir un impact sur l'alimentation correspondant à une nuisance modérée

Devenir

TOUS mis à mort en fin d'expérimentation afin de réaliser des gestes post-mortem (prélèvementsde tumeurs et d'organes pour analyses biologiques)

Remplacement

Ce projet a pour but de comprendre les relations complexes des cellules immunitaires avec l'environnement immédiat du cancer. Ce type d'étude est difficilement envisageable chez l'Homme car les prélèvements de cancer accessibles pour la recherche sont de très petites tailles et la rareté de nos cellules nous oblige à travailler sur du matériel biologique suffisamment important. Par ailleurs, nous ne pouvons pas étudier l’effet de traitements innovants visant soit à éliminer ou bloquer l’infiltration des tumeurs par certaines cellules dans des modèles in vitro. Or ce type d'analyse est un pré-requis pour pouvoir valider de nouvelles cibles d'immunothérapie chez l'homme. Ces travaux permettront également de mieux comprendre les relations complexes responsables de la croissance cancéreuse, ce qui permettra dans le futur de développer des modèles alternatifs in vitro découlant de nos résultats par ingenierie du tissu.

Réduction

Nous avons déterminé les effectifs de nos groupes de manière à obtenir une forte validité statistique (avec puissance de 0.8) avec un minimum d’individus et notre projet a été conçu pour optimiser la quantité d’informations analysables. Le nombre total d'animaux requis est de 1500 pour l'ensemble et la durée totale du projet. Afin de réduire au mieux le nombre d’animaux, nous procéderons à une analyse séquentielle. Une première série d’expériences permettra de développer les modèles murins et de définir les conditions optimales d'expérimentation (n: 260 souris/an sur deux ans). Nous utiliserons ensuite trois modèles tumoraux optimisés dans des souris sans composant structurant et leur contrôle. Le schéma d'accouplement de ces souris a été optimisé pour obtenir 50% de souris avec et sans composant structurant par couplage et les males et les femelles seront utilisés pour réduire le nombre d'animaux inutiles (n: 150 souris par an pendant 4 ans). De plus, nous utiliserons également des souris males et femelles dans laquelle une population immunitaire est éliminée et leur contrôle dans les trois modèles tumoraux (n: 480 souris maximum). Nous réduirons ce nombre de 160 souris si nos résultats antérieurs démontrent que le modèle chimique et un modèle de greffe ont des caractéristiques similaires. Dans ce cas les expériences ne seront menées que sur deux des trois modèles tumoraux.

Raffinement

Afin d’améliorer les conditions d’hébergement réglementaires des animaux (porteurs ventilés, 5 animaux par cage, objets déplacés régulièrement pour stimuler la curiosité) dans le contexte de cette pathologie buccale, du gel nutritif est ajouté dans la cage afin de faciliter l’alimentation après les injections de cellules cancéreuses. Les injections de cellules cancéreuses sont réalisées sous anesthésie en présence d'un médicament anti-douleur afin de contrôler l'anxiété et la douleur liée à l'injection. Les signes de l'évolution du cancer, le suivi des animaux seront effectués conformément à une grille d’évaluation permettant de définir un niveau de douleur/souffrance à partir duquel les animaux concernés seront mis à mort. Plus particulièrement, il est à noter que les modèles cancéreux seront établis de façon à limiter la croissance tumorale a un volume de 20% en deça du point limite éthique afin d’éviter une souffrance liée à un problème nutritionnel et le suivi quotidien du comportement et une pesée bi-hebdomadaire des animaux permettra de détecter les signes précoces de souffrance. Enfin les souris dans lesquelles notre population immunitaire d'intérêt peut être éliminée par injection d'une drogue ont un phénotype attendu non dommageable mais le bien-être des souris (poids, posture et mobilité) sera documenté hebdomadairement dès le début de l'expérimentation afin d'éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Les modèles murins de tumeurs ORL que nous proposons de développer et d'utiliser permettront de caractériser un environnement complexe qui mime les tumeurs humaines. Ce type d’analyse détaillée est un pré-requis pour pouvoir identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et identifier de nouvelles approches d’immunothérapie chez l’homme. Les souris seront mises en expérimentation à un âge de 8 semaines, âge auquel le système immunitaire est mature.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un tatouage des phalanges et le prélèvement d'un morceau d'oreille, cinq jours de gavage quotidien, une restriction alimentaire, puis un test comportemental de trente minutes par jour pendant onze semaines consécutives. L'enjeu déclaré est de savoir si des souris porteuses d'une mutation du gène FUS présentent des troubles de la motivation et de l'impulsivité, et si remettre la protéine dans le noyau des neurones les atténue. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire" de recourir à un modèle animal reproduisant la complexité comportementale et structurelle du système nerveux central humain.

Objectifs

La démence fronto-temporale (DFT) est une maladie maladie neurodégénérative incurable caractérisée par l’atteinte de deux structures majeures dans le cerveau. Les symptômes des patients atteints de DFT sont multiples et peuvent inclure des troubles liés au jeu d’argent, à l'hyperphagie et à la consommation de drogue. Tous ces comportements peuvent résulter d'une altération de la motivation et/ou de l'impulsivité. Ce type d’altérations est peu étudiée. Nous avons dans notre laboratoire un modèle de souris qui mime cette maladie en reproduisant la mutation d’une protéine mutée chez les patients. Ce projet a deux buts. Le premier est de regarder si ces souris présentent des problèmes de motivation et/d’impulsivité. Le second but est de voir si le fait de relocaliser cette protéine dans le noyau des neurones est suffisant pour atténuer ces problèmes comportementaux.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, les troubles des comportements compulsifs dans la DFT sont très peu étudiés alors qu’ils peuvent être à l’origine de souffrances physiques (alcoolisation, hyperphagie) et/ou mentale importantes. Ce projet pourrait permettre de mieux comprendre ces comportements. Par ailleurs, si le fait de remettre la protéine mutée à sa place s’avère efficace, cela pourrait orienter les prochaines recherches pharmacologiques ou pharmaceutiques vers une stratégie visant à relocaliser cette protéine à sa place normale chez les patients souffrant de maladie qui affectent le cerveau.

Procédures

Les animaux recevront un traitement (administration par gavage sur animal vigil afin de limiter les risques de fausse route) durant 5 jours, à raison de 1 fois par jour. La durée du gavage est d’environ 20 secondes. Nous réaliserons une tâche d’apprentissage qui nécessite que les souris soient motivées pour la réaliser. Pour atteindre ce niveau de motivation, la seule chose connue à ce jour est la mise en place d’une légère restriction alimentaire (qui vise à réduire le poids cible de l’animal est à 5%). Les souris passeront un test (non invasif) tous les jours pendant 11 semaines consécutive à raison de 30 minutes par jour.

Impact sur les animaux

6 types de nuisances sont attendues au cours de cette étude : 1- L’administration par gavage du traitement peut entrainer un stress lié à la contention transitoire et à l’administration du traitement ainsi que des fausses routes. 2- Le traitement en tant que tel pourrait avoir des effets secondaires mais de nombreuses études utilisent ce composé et aucune n’a fait remonter un effet secondaire notoire et délétère. 3- Le stress que pourrait causer la réalisation de la tache comportementale. 4- La restriction alimentaire nécessaire pour la réalisation de la tâche 5- Afin d’identifier les souris et de réaliser le génotypage, nous devons effectuer un tatouage (aux niveaux des doigts) et un prélèvement d’un morceau d’oreille (trou d’environ 1 mm de diamètre). Ceci entraine une douleur aiguë et transitoire.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à l’issue des procédures car nous avons besoin de prélever les tissus pour vérifier que notre protéine d’intérêt (FUS) soit à nouveau à sa place (dans le noyau des neurones) mais aussi pour étudier les impacts au niveau microscopique (moléculaire, cellulaire et biologique) de notre intervention.

Remplacement

Ce projet a pour but d’étudier si la DFT est associée à des troubles motivationnels et compulsifs et si l’on peut modifier l’apparition de ces troubles en annulant une mutation. Pour répondre à ces questions, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit à la fois la complexité comportementale mais aussi celle structurelle du système nerveux central, notamment avec les différents intervenants cellulaires retrouvés dans le système nerveux central chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires à la bonne réalisation de ce projet a été calculé, d’après nos travaux préliminaires, de manière à obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Par ailleurs, pour limiter le nombre total d’animaux générés, nous proposons ici de réaliser les analyses histologiques et moléculaires sur les mêmes animaux que ceux chez qui auront réalisé une des procédures. Pour limiter le nombre total d’animaux générés et améliorer nos connaissances de la maladie, nous proposons d’utiliser les mâles et les femelles. Par ailleurs, nous avons décidé de réaliser une première étude pilote qui sera un point de décision entre la suite de la réalisation, un non, du projet.

Raffinement

L’enrichissement de l’environnement des animaux (bâtonnets à ronger, coton compressé pour faire des nids, maisons de carton blanc), le maintien des interactions sociales (les souris sont gardées à plusieurs par cage tout au long de leur vie) et la surveillance quotidienne des animaux permettront d’assurer de leur bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée afin qu’il puisse être pris en charge. Nous avons établi des points-limites clairs afin de pouvoir soustraire l’animal à la souffrance si nécessaire. Les expérimentateurs en charge sont formés à chaque procédure et nous avons une très bonne connaissance du modèle utilisé. Nous pourrons ainsi facilement déceler un éventuel comportement anormal.

Choix des espèces

Les modèles de souris transgéniques sont les plus appropriés à notre étude car ils présentent le niveau de complexité structurelle du cerveau adéquat, une séquence de notre gène d’intérêt (Fus) bien concernée d’un point de vue phylogénétique et des capacités cognitives qui nous permettent d’évaluer des troubles retrouvés chez les patients. Les études seront réalisées sur des souris adultes (âgées de 2/3 mois au début des procédures) car les patients souffrant de DFT liée à FUS sont toujours des patients adultes.