Recherche fondamentale

4 800 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées pour les prélèvements finaux, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune est refroidie jusqu'à 32 °C par hypothermie provoquée, avec dix à quinze prises de température rectale espacées de quinze à trente minutes sur trois à cinq heures, une à trois administrations intraveineuses ou sous-cutanées et jusqu'à quatre prélèvements de sang, sans anesthésie ni analgésie. Cette hypothermie sert de signal pour mesurer si des molécules attelées à un médicament franchissent les barrières de l'organisme, sur une lignée dont le récepteur cible a été humanisé. Le porteur écrit travailler "faute d'alternatives de remplacement" et présente la souris comme "le seul système physiologique" intégrant les paramètres qu'il veut mesurer.

Objectifs

Les maladies neurologiques, musculaires et les maladies rares font partie des causes majeures de handicaps sévères dans le monde. À l'heure actuelle, les besoins médicaux actuels restent malheureusement très insatisfaits, sans aucun traitement curatif, ou palliatif. Une des raisons majeures réside dans l’inefficacité de nombreux médicaments à passer la barrière protectrice du cerveau et ainsi à accéder aux régions à traiter. Dans ce contexte, notre avons développé un savoir-faire qui consiste en l’association de molécules à des pro-drogues ou médicaments, capables de passer les barrières biologiques protectrices de l’organisme et ainsi atteindre plus efficacement les tissus cibles (cerveau, muscles…). Notre technologie repose sur une stratégie de cheval de Troie : Nos médicaments sont capables de reconnaître des partenaires spécifiques, au niveau des barrières protectrices de l'organisme et utilisent leurs mécanismes naturels de passage cellulaire pour atteindre le tissu cible. À travers cette demande de projet, nous souhaitons développer et optimiser de nouveaux médicaments afin d’améliorer la délivrance d’agents au fort potentiel thérapeutique. Par différentes voies d'administration, nous tenterons de potentialiser l’effet de nos médicaments, sur une lignée murine humanisée pour le récepteur cible de ce projet.

Bénéfices attendus

Choix d’une lignée murine humanisée pour notre récepteur d'intérêt : La transposition de nos recherches sur un modèle de souris humanisées, permet d’appréhender les futurs développements pré-cliniques de nos molécules et les possibles effets secondaires ou toxicités associées. De plus, elle assure de développer au maximum les études sur le modèle souris avant la phase préclinique et la transposition à l’homme, qui aurait nécessité des séries de tests sur divers modèles animaux. Enfin, le fait de pouvoir humaniser notre cible chez la souris constitue un excellent outil stratégique et scientifique, se traduisant par une réduction importante du nombre d’animaux au sein des études, par un gain de temps considérable (et de coût), tout en réduisant par la suite de potentiels essais sur modèles animaux plus gros. D'un point de vue médical, sur du plus long terme, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos médicaments constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.

Procédures

Les manipulations expérimentales seront réalisées sur animaux vigiles et de manière précises et rapides (≤ 2min). Elles incluent : L’annotation des queues au moyen d’un marqueur spécifique permettant l’identification des individus (1 fois /semaine). Les pesées : Une pesée sera réalisée avant chaque administration et une avant l’euthanasie des animaux. La prise de température rectale (10 à 15 prises espacées de 15 à 30 minutes sur une durée de 3 à 5 h). La mise en contention (avant toutes administrations (1 à maximum 3) ou prélèvements intermédiaires (maximum 4). Les administration(s) intraveineuse(s) ou sous-cutanée(s) : 1 à maximum 3. A noter : Dans le cas d’administration répétées, un délai de minimum 24 à 48h sera respecté entre deux administrations. Les administrations intrapéritonéales : 1 seul/individu (euthanasie). Les prélèvements intermédiaires : Des prélèvements sanguins intermédiaires seront réalisés en cours de cinétique (maximum de 4 prélèvements de 50µl/semaine). Cette procédure ne présente pas d’anesthésie, pas d’analgésie, ni de chirurgie avec réveil.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sont les suivants : Un stress physique peut être induit lors de la mise en contention des animaux, la réalisation des différentes administrations (une ou trois maximum par individu), l’introduction d’une sonde rectale (prise discontinue sur 5h maximum) lors du monitoring de la température et lors de la réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires (au maximum 4 prélèvements /individus, n’excédant pas 10% de la volémie sur 7jours). Un stress thermique pouvant quant à lui être généré par l’hypothermie induite (jusqu’à 32°C).

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront mise à mort pour réaliser les prélèvements tissulaires et sanguins finaux. Si, en cours de cinétique, un individu atteint un point limite, l'animal sera également mis à mort en urgence après validation du vétérinaire et porteur de projet.

Remplacement

Pour mener à bien nos projets, nous réalisons en amont de nos procédures toute une série de tests in vitro. Cette première série de tests permet notamment de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cellulaires, mais en aucun cas de prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques (mécanistiques, immunitaires, métaboliques et d'éliminations) qui conditionnent le succès de nos médicaments. Pour faire face à cette sélection physiologique, nous envisagerons donc de réaliser nos expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique, ou suffisamment informel. Le modèle vivant, ici la souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres mécanistiques précédemment cités, indispensables à l’étude d’une efficacité pharmacologique chez les mammifères. Dans notre cas, le principal désavantage concerne donc le recours à l’utilisation d’animaux. Il s’agit alors de définir à minima et au plus juste le nombre d’individus. L’utilisation de faibles cohortes d'animaux permettra d’aller en ce sens, tout en allant exploiter un maximum de résultats et par l’obtention de données statistiques significatives.

Réduction

L’optimisation de nos vecteurs en fonction de la voie d’administration permet d'envisager une médication optimisée et réduite (doses moins importantes), limitant de ce fait les possibles effets secondaires non souhaités (Raffinement), mais aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure (Réduction). Le nombre total d’animaux sera réparti sur de petits groupes mixtes 4 individus (2 mâles/2 femelles), à raison de maximum 8 groupes par étude et 15 études par an, sur chacune des deux lignées de souris. Aussi, nous n’aurons besoin que de 960 animaux par an (4 *8*15*2), soit un total de 4800 souris sur 5 ans (960*5). Il est important de noter que ce nombre total d’animaux sera mixte (50%mâles et 50% femelles (cages séparées). Le faible nombre d’individus (4, ici) sera suffisant pour obtenir une analyse statistique robuste. Les prélèvements de tissus en fin de procédure, nous permettrons d’optimiser cette dernière sur plusieurs types de post-expérimentations en apportant des données supplémentaires et ainsi, nous permettront d’éviter une utilisation abusive et inutile d’animaux (Réduction). De façon identique, la réalisation de prélèvements sanguins en cours de cinétique permet d'obtenir davantage de données pharmacocinétique, permettant ainsi de renforcer et d’optimiser l’étude et in-fine de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

La formation initiale et l’expérience du personnel sont nécessaires pour appréhender les moindres signes et/ou comportements caractéristiques d’une douleur ou gène chez l’animal. Nous porterons une attention particulière à la préparation en amont de l’expérimentation. Elle regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux (7 à 14 jours avant expérimentation). 48h à 72h avant les administrations, les souris sont sorties de l’animalerie dans une pièce avec un cycle de lumière obscurité (12h/12h), insonorisée, en armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Un maximum de 4 individus de même sexe par cage, maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), dans la même cage (taille standard pour portoir ventilé + couvercle filtrant), litières (copeaux de bois) avec un triple enrichissement. Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Le choix des cinétiques sera également affiné au plus juste pour éviter de longs tests inutiles et de possibles angoisses supplémentaires. De plus, travaillant sur animal sain, la simplicité des administrations uniques ou répétées sur animal vigile et le court laps de temps d’exposition des molécules, nous permettent d’éviter toute apparition potentielle de phénotypes dommageables chez les animaux. Dans cette procédure, nous utiliserons des animaux issus d’élevages extérieurs issus de deux fournisseurs différents.

Choix des espèces

Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, pratique pour les études de pharmacologies et comportementales, elle est donc idéale pour la mise en place de premières études précliniques (groupes de 4 individus). À l’heure actuelle, faute d’alternatives de remplacement, le modèle rongeur, ici la souris, reste le seul modèle accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de l’homme. Par sa petite taille, il devient également très intéressant pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques et diminution des posologies). Notre modèle de transposition sur la lignée humanisée est particulièrement avantageux, car il présente une cible humanisée (récepteurs) tout en gardant les avantages cités précédemment. Les données obtenues sur ce modèle permettront notamment une extrapolation plus pertinente au modèle humain, d’envisager un gain de temps dans le développement futur du projet, mais aussi, d’éviter un certain nombre d’études et une utilisation significative d’animaux. Les animaux seront utilisés pour réaliser des suivis pharmacologiques, des échantillonnages de tissus, d'organes ou de liquides physiologiques, ceci à des fins scientifiques. Pour notre procédure, nous utiliserons pour les deux lignées, des animaux dits « jeunes adultes », âgés en moyenne de 8 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter-individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Ce stade « jeune adulte » présente un poids moyen de 27-30g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).

Six micro-prélèvements de sang à la veine submandibulaire sur animal vigile, quatre échocardiographies sous anesthésie profonde et 21 semaines de protocole : 60 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré, avant d'être mises à mort pour prélèvement d'organes. Une injection dans le sinus rétro-orbitaire, sous anesthésie générale et analgésie locale, ouvre la séquence. L'objet est d'observer le rôle d'une protéine transportant le phosphate dans la calcification des vaisseaux au cours de l'athérosclérose, sur des souris génétiquement modifiées pour ce gène. Les douze souris par groupe ne sont justifiées que par des travaux antérieurs et une analyse statistique dont le RNT ne dit rien de plus.

Objectifs

L’athérosclérose est caractérisée par la formation de plaques lipidiques dans les vaisseaux sanguins et aboutit à la formation de dépôts calciques. Nous avons ici pour objectif d’étudier le rôle d'une protéine dans le développement des calcifications des vaisseaux sanguins au cours de l’athérosclérose en utilisant un modèle de souris génétiquement modifiée.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de de ce projet sont attendus à la fois dans le domaine de la recherche fondamentale et dans le domaine médical. Elle permettra de mieux comprendre les mécanismes qui sont responsable de l’apparition de calcifications vasculaires dans la maladie de l’athérosclérose

Procédures

- 1 injection intraveineuse au sinus retro-orbital sous analgésie locale et anesthésie générale (durée totale : 15 minutes) - 6 micro-prélèvements de sang (50µl) à la veine submandibulaire sur animaux vigiles pendant les 21 semaines du protocole (durée d'un prélèvement < 1 minute) - 4 séances d’échocardiographie sous anesthésie profonde (durée d'une échocardiographie : 15 minutes) - Pesée des animaux 1 fois par semaine pendant 21 semaines

Impact sur les animaux

Un stress modéré est attendu lors des micro prélèvements sanguins et lors de la pesée des animaux

Devenir

mis à mort pour prélèvement d'organe

Remplacement

Nos projets de recherche visent à comprendre le rôle d’une protéine multifonctionnelle, notamment connue pour transporter du phosphate de l’extérieur vers l’intérieur de la cellule. La régulation de l’homéostasie phosphocalcique est une composante importante pour nos problématiques ce qui nécessite de travailler sur l’organisme entier. De plus, la compréhension des mécanismes impliqués dans le développement complexe de l’athérosclérose nécessite de travailler sur animal vivant.

Réduction

Dès que cela est possible, nous utilisons des modèles cellulaires dédiés aux questions posées. Nos précédents travaux, ceux publiés dans la littérature et notre analyse statistique préalable, 12 souris par groupe est suffisant pour notre étude

Raffinement

Le suivi de l’animal par échocardiographie sera réalisé sous anesthésie générale. L’injection intraveineuse est effectuée sous anesthésie générale et analgésie locale. Les animaux sont surveillés par la mise en place d'une fiche de suivi de l'état général des souris du début à la fin du protocole. Les animaux seront hébergés par 5 en environnement enrichi.

Choix des espèces

Ce projet est basé sur le phénotypage de souris génétiquement modifiée sur notre gène d'intérêt pour comprendre le développement de l'athérosclérose. Ces modèles animaux sont des modèles intégrés, unique moyen d’observer les effets systémiques sur le développement de cette pathologie. L'athérosclérose est une pathologie cardiovasculaire apparaissant chez l'adulte. Nous utilisons donc des animaux adultes mâles et femelles âgés de 10 semaines.

Marquées par entailles aux oreilles, vaccinées trois fois par voie sublinguale et trois fois par voie nasale sous anesthésie, saignées jusqu'à neuf fois par ponction à l'œil, 1 020 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie d'entre elles est maintenue jusqu'à 22 mois pour tester les candidats vaccins sur des organismes vieillissants, le porteur signalant que cette durée d'hébergement peut entraîner alopécie, hypothermie et blessures de combat. La dernière étape est une trachéotomie terminale pour recueillir salive et mucus nasal, après quoi tous les animaux sont mis à mort pour prélever organes et fluides. Le porteur présente la lignée choisie comme proche de l'humain sur le plan immunitaire, tout en la décrivant comme une étape avant le passage à des animaux "plus pertinents et proche de l'humain", les primates non humains.

Objectifs

Actuellement, la vaccination classique dirigée contre la grippe utilise la voie d’injection par aiguille. Cependant, ce mode d’administration ne procure qu’une immunité partielle (production d’anticorps au niveau sanguin) ce qui n’empêche pas l’entrée des pathogènes dans notre corps. La voie muqueuse nez/bouche/gorge est une voie intéressante car ces muqueuses sont la porte d’entrée des pathogènes impliqués dans le cas de la grippe. Il a été décrit dans la littérature scientifique que la vaccination par cette voie peut permettre l’induction d’une double protection immunitaire dans le sang et dans les muqueuses, et ainsi diminuer le risque d’infection et de transmission du virus. Les objectifs de ce projet sont d’évaluer et de comparer la réponse immunitaire vaccinale dirigée contre le virus de la grippe après vaccination par voie muqueuse : la muqueuse sublinguale ou la muqueuse nasale. Un rappel vaccinal sera pratiqué par injection pour réactiver la réponse immunitaire et l’amplifier. Ces paramètres seront étudiés sur des souris de deux âges différents (8 semaines et 16 mois) afin de mesurer l’efficacité de différents candidats vaccins sur des animaux vieillissant. En effet, les personnes âgées sont une population particulièrement à risque dans les cas d’infection par le virus de la grippe. L’objectif au long terme de ce projet est d’élaborer un vaccin capable d’induire une immunité durable dans le sang et les muqueuses à la fois chez les individus jeunes et âgées.

Bénéfices attendus

Les bénéfices scientifiques du projet concernent majoritairement la compréhension des mécanismes de la réponse immunitaire vaccinale au niveau des muqueuses, en fonction de l’âge et des différents candidats vaccins étudiés. Le bénéfice majeur du projet à long terme est le développement d’un vaccin à administration muqueuse qui réduira drastiquement l’infection et la transmission des virus respiratoires. En cas de succès, ce projet sera étendu à d’autres virus respiratoires (SARS-Cov-2, Virus Respiratoire Syncytial…).

Procédures

Ci-dessous, la liste des interventions réalisées sur l’animal à chaque étape du projet : - L’identification : le marquage sera réalisé sur l'animal anesthésié par de petites entailles au niveau sur les bords des oreilles (1 fois/animal, durée : 1 minute). - Les administrations par voie sublinguale sont des actes induisant une douleur légère mais pouvant générer un stress supplémentaire pour l’animal notamment par la contention. Nous effectuerons donc ce geste sous anesthésie gazeuse (3 fois/animal, durée : 15 minutes). - Les administrations par voie intranasale sont des actes induisant une douleur légère mais pouvant générer un stress supplémentaire pour l’animal notamment par la contention. Nous effectuerons donc ce geste sous anesthésie générale (3 fois/animal, durée : environ 30 minutes). - Les injections par voie sous-cutanée sont des actes induisant une douleur légère et ne nécessitant pas d’anesthésie au préalable (1 fois/animal, durée : 5 minutes). - Le prélèvement sanguin à l’œil est un geste qui dure 30 secondes maximum. Ce geste est une technique pouvant induire une douleur modérée et un stress supplémentaire à l’animal, notamment par la contention. Nous effectuerons donc ce geste sous anesthésie générale additionnée d’une anesthésie locale (1 à 9 fois/animal, durée : 5 minutes). - Les prélèvements de salive et du mucus nasal nécessitent une trachéotomie et une immobilisation de l’animal. Pour ces raisons, nous réaliserons ces prélèvements en phase terminale sous analgésie et anesthésie (1 fois/animal, durée : 40 minutes).

Impact sur les animaux

- Identification des animaux : ce geste d’inconfort peut entrainer la fragilisation de l’oreille et augmenter les risques de blessure en cas de combats. - Prise de température : la prise de la température au niveau de l’abdomen nécessite une contention pouvant générer un stress chez l’animal. - Administration sublinguale et intranasale : ces gestes seront réalisés sur l’animal anesthésié et peuvent induire un inconfort léger après leur réveil. - Injection en sous-cutané et dans l’abdomen : ces gestes seront réalisés sur animaux vigiles et sous contention pouvant générer un stress chez l’animal. - Immunisation : Une petite fièvre passagère est envisageable après les vaccinations. - Prélèvement de sang en rétro-orbitaire : Ces prélèvements sont réalisés sous anesthésie et peuvent induire des lésions au niveau de l’œil ainsi un inconfort léger après leur réveil. - Vieillissement des animaux : pour les expériences concernant les animaux de 16 mois, les souris seront réceptionnées à l’animalerie à l’âge de 8 semaines et seront hébergées jusqu’à un âge maximal de 22 mois. Cette durée prolongée d’hébergement peut être la source de stress et d’anxiété chez l’animal pouvant entrainer divers symptômes liés au vieillissement (alopécie, hypothermie, blessure liée au combat…). Pour éviter cela, une surveillance hebdomadaire et un enrichissement de l’environnement sera appliqué.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort en fin de procédure pour procéder à des prelèvements d’organes et de quantités importantes de fluides (sang, mucus).

Remplacement

Avant l’utilisation des candidats vaccins sur l’animal, des études de toxicité et de réponse inflammatoire ont été menées sur des cultures cellulaires épithéliales et immunitaires. De manière générale, la vaccination repose sur la mise en place d’une réponse immunitaire faisant appel à l’ensemble des organes lymphoïdes, dont les ganglions lymphatiques et la rate, et dans différents organes ciblés. Le recours à l’animal est donc incontournable, nous n’avons donc pas d’autre solutions que d’utiliser l’animal dans son entier pour étudier la réponse immunitaire de nos candidats vaccins.

Réduction

Dans l’ensemble, le nombre d’animaux utilisé a été réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet et la significativité statistique des expérimentations. Il a été évalué pour 5 ans à 1020 souris. Pour les 3 procédures, des groupes de 10 souris/lot ont été calculés pour répondre à l’objectif. Les analyses se feront avec des statistiques classiquement décrites pour les études vaccinales. Un choix restreint de groupes expérimentaux a été fait après sélection de candidats vaccins in vitro. Les temps de chaque procédure ont été sélectionnés d’après nos précédentes expériences et par la littérature scientifique pour se focaliser uniquement sur les 3 temps d’analyses les plus pertinents. Nous avons également réduit le nombre d’animaux contrôles au strict minimum : 10 animaux contrôles « naïf » pour chaque âges (8 semaines et 16 mois) soit deux groupes par procédure. C’est-à-dire que dans chaque procédure, tous les groupes expérimentaux se réfèrent au groupe contrôle du même âge. De plus, selon l’avancée du projet, le nombre d’animaux est susceptible d’être réduit. En fonction des groupes expérimentaux, si les résultats obtenus lors des premières expérimentations ne donnent pas de données robustes, alors les expériences prévues pour les groupes similaires à des temps plus tardifs ne seront pas réalisées.

Raffinement

Dans ce projet, des points limites assez prédictifs ont été établis pour pouvoir anticiper tout stress et souffrance des animaux. Dans l’ensemble du projet, voici les mesures appliquées afin de limiter la souffrance et le stress des animaux : - De l’enrichissement du milieu sera appliqué dès la réception de animaux. - Une période d’acclimatation d’une semaine dans l’animalerie sera respectée après la réception des animaux. - L’identification individuelle des animaux sera réalisée grâce à des petites entailles au bord de l’oreille (moins sensible) et sous anesthésie générale. - La période de vieillissement (de 2 à 16 mois) sera ponctuée par des observations et des pesées hebdomadaires, additionnées à partir de 15 mois de mesures de la température corporelle. - Les administrations sublinguales et intranasales se feront sous anesthésie générale. - Les prélèvements sanguins et des mucus se feront sous analgésie et anesthésie générale. - Après chaque anesthésie, le bon réveil des souris sera vérifié (mouvement de la souris, comportement, prise de boisson ou de nourriture, etc) avant de les renvoyer dans leur pièce d’hébergement. - Un suivi des animaux à 4h/24h après chaque étape des procédures (identification, immunisations, prélèvements) et/ou au moins une fois par semaine sera réalisé. Ce suivi comprend : la réalisation d’une pesée de l’animal et l’observation de l’activité/comportement (isolement, dos vouté, etc…), des modifications physiques (inflammation/rougeur au niveau des sites d’administration : gueule/langue, museau ou abdomen) et des modifications végétatives (respiration anormale). En complément, une prise de la température de l’animal sera effectuée, à 24h après chaque immunisation afin de détecter d’éventuelle montée de température. Concernant les souris âgées de plus de 16 mois, une prise de la température sera aussi réalisée au moins une fois par semaine afin de détecter une éventuelle hypothermie. - En cas de perte de poids importante, de la nourriture se mise à disposition au sol dans la cage. - En cas de variation importante de la température, une nouvelle mesure sera effectuée toutes les 24h et des moyens seront mis en œuvre pour la rétablir (anti-inflammatoire, armoire chauffante). - En cas de lésion cutanée, une pommade nettoyante et cicatrisante sera appliquée sur la zone et si besoin un isolement de l’animal sera effectué.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris qui sont un modèle très adapté aux études de l’immunité car il existe beaucoup d’outils biologiques d’analyses de la réponse immunitaire chez la souris, qui est bien caractérisée. Les souris seront utilisées à partir de 10 semaines de vie, ce qui correspond à un jeune adulte avec une système immunitaire mature. De plus, la lignée choisie présente des caractéristiques immunitaires proches de l’humain. Cette faculté est primordiale pour l’analyse de candidat vaccin. Ces modèles sont essentiels avant de passer à des animaux plus pertinents et proche de l’humain dans un contexte d’infection viral, tel que le primate non humain.