Recherche fondamentale

Deux à quatre injections sous anesthésie et un prélèvement de sang qui expose à une infection de l'œil : 566 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort ensuite pour prélèvement d'organes. Elles reçoivent des cellules tumorales, qui forment une tumeur rejetée en quatorze jours, ou une infection virale, afin de comparer les cellules immunitaires mémoires produites dans les deux cas. Les bénéfices annoncés se limitent à une meilleure compréhension du développement d'un cancer. L'effectif de 566 animaux n'est justifié que par un "minimum nécessaire et suffisant" à l'analyse statistique, sans autre précision.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de déterminer si une tumeur transitoire, rapidement éliminée de l’organisme par le système immunitaire, est suffisante pour altérer la réponse immunitaire mémoires. Pour cela, les cellules mémoires générées en réponse à un virus ou un tumeur transitoire seront comparées.

Bénéfices attendus

L’objectif est d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes mise en place lors du développement d'un cancer.

Procédures

Chaque animal reçoit : 2 à 4 injections (15 secondes) sous anesthésie / 1 prélèvement sanguin (150 uL) sous anesthésie (10 secondes) / Anesthesie : 3 minutes pour anesthésie gazeuse , 30 minutes pour anesthésique injecté

Impact sur les animaux

Injection intraveineuse de cellules ou prélèvements : possibilité d'infection au niveau de l'oeil (très rare) Infection virale : Aucun signe clinique attendu Injection de tumeur : La tumeur n’est pas métastatique, n’excède pas 200 mm3 et est rejetée par les animaux en 14 jours.

Devenir

Mis à mort pour prélèvements des organes

Remplacement

La réponse immunitaire est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires dans différents organes. Les procédures ne peuvent donc être reproduites in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été defini au minimum nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique des résultats

Raffinement

Une semaine d'acclimatation sera réalisée avant la mise en place de chaque expérience. A la réception, des groupes seront réalisés et maintenus tout au long de la procédure pour créer des groupes sociaux et éviter le stress dû à l'isolement. Tous les traitements/prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie et en condition stérile afin de prévenir tout risque d’infection. Un collyre anesthésique est administré avant chaque prélèvement sanguin en prévention d'éventuelles infections. Des points limites bien définis et suffisament précoces permettent de limiter au maximum toute douleur ou souffrance des souris.

Choix des espèces

Le choix du modèle souris est imposé par la nécessité de pouvoir utiliser des animaux génétiquement modifiés. Les souris seront âgées de 7-12 semaines au moment de l’immunisation, le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant.

Le thon rouge n'étant pas manipulable en captivité, 24 bars d'élevage sont utilisés à sa place pour mettre au point une balise électronique implantée censée suivre les migrations d'un poisson de forte valeur commerciale. Ces 24 individus, tués à l'issue, subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré : implantation d'électrodes sous la peau et dans le muscle dorsal sous anesthésie, moins de trente minutes d'opération, 24 heures dans un couloir de nage, puis exposition à des courants électriques. Les électrodes sont récupérées sur les cadavres. Le porteur cale l'intensité des courants sur les consignes applicables aux êtres humains et en déduit qu'elle ne "devrait pas causer des nuisances", tout en indiquant qu'elle pourrait provoquer un picotement dans le muscle.

Objectifs

Les expérimentations décrites dans cette demande visent à avancer sur la compréhension du cycle de vie du thon rouge, un poisson migrateur de grand valeur culturel et économique en France. Il est proposé de développer des moyens d’observation pour comprendre la réponse physiologique des animaux à leur environnement. Nous travaillons au développement d’une marque électronique combinant une marque interne pour collecter des informations physiologiques (température corporelle, fréquence cardiaque…) et une marque satellite de type ‘pop-up’ permettant de collecter des informations environnementaux (température, pression, lumière …) pendant les migrations, et de les transmettre par satellite à l’issue du déploiement à la surface de la mer. Pour cela, il est nécessaire d’établir une communication intracorporelle entre le capteur implanté (marque interne) et le concentrateur des informations (marque externe). Notre choix s’est porté sur l'utilisation de la conductivité électrique des tissus biologiques pour transmettre un signal électrique de très faible intensité. Nous souhaitons donc mettre en œuvre deux expérimentations. Avant toute chose, une expérimentation sur le thon rouge n’est pas envisageable. Nous proposons de réaliser ces expérimentations sur une espèce élevée en captivité, le bar, Dicentrarchus labrax. La première expérimentation vise à confirmer que les très faibles courants utilisés restent imperceptibles pour le poisson. La gamme d'intensité des courants de stimulation est basée sur les consignes pour les êtres humains et donc ne devrait pas causer des nuisances. Pendant l'exposition aux courants électriques, nous évaluons leur innocuité avec des indicateurs physiologiques et comportementaux. La seconde expérimentation a pour objectif de mettre en œuvre une communication intracorporelle afin de valider son principe.

Bénéfices attendus

Ces mesures permettront d’une part de vérifier l'innocuité des dispositifs de communication intracorporelle. La deuxième phase permettra de valider la possibilité de faire communiquer deux dispositifs électroniques au travers du corps de l'animal en vue du développement d'un réseau de capteurs implantés. A l’issue de ces deux expérimentations, nous devrions pouvoir concevoir un premier prototype de marque implantée communicante pour le thon rouge.

Procédures

Les poissons seront équipés avec des électrodes en Inox très fines et flexibles, sous cutanées et dans le muscle dorsal, sous anesthésie générale. La durée de l'opération est inférieure à 30 minutes. Cette chirurgie sera suivie par 24 heures de récupération, protégé des perturbations humaines. Puis, chaque individu sera soumis à des stimulations par courant électrique à très faible intensité.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont le stress du poisson lors des manipulations et de l'anesthésie, puis la nuisance d'avoir des électrodes très fines sous la peau et à la surface du muscle. Les individus seront maintenus pendant 24 heures dans un couloir de nage. L'intensité maximale du courant pourrait provoquer un picotement dans le muscle mais cette intensité est imperceptible chez l'homme.

Devenir

A la fin de la procédure, les poissons seront euthanasiés pour récupérer les électrodes.

Remplacement

Cette étude, qui implique la mesure des facteurs de conditions corporelles et des réponses physiologiques doit être réalisée sur des animaux. Il n’est pas possible de remplacer les poissons par un autre modèle pour ce type de procédures.

Réduction

Le nombre de 12 individus pour chacune des procédures (12+12 = 24) est basé sur une analyse de puissance avec le logiciel G*Power.

Raffinement

Le protocole de manipulation et d’anesthésie est optimisé et parfaitement maîtrisé. Les électrodes sont très fines mais très résistantes et flexibles. Leur finesse et flexibilité minimisent la nuisance au poisson, et lui permettent une liberté de mouvement. Pendant les expériences les poissons seront protégés de toute nuisance visuelle et sonore. Pendant l'exposition aux courants électriques, nous évaluons leur innocuité avec des indicateurs physiologiques et comportementaux.

Choix des espèces

Le bar est une des principales espèces élevées en pisciculture et sa physiologie est bien étudiée. Les individus seront tous adultes et sexuellement matures, pour permettre le bon placement des électrodes.

Injectées d'acroléine directement dans un ventricule du cerveau, gavées six jours sur sept pendant quatre semaines, puis soumises à des injections quotidiennes dans le nez ou l'abdomen pendant deux semaines, 484 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des tests comportementaux sont annoncés à raison d'un par jour, sans que le RNT dise lesquels. L'objectif est de vérifier si une molécule dérivée d'un polyphénol protège du déclin cognitif un modèle de maladie d'Alzheimer construit par intoxication chimique. Toutes sont tuées à la fin pour analyser leur tissu cérébral.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est la forme la plus fréquente de maladie neurodégénérative associée à une démence chez les sujets âgés. L'élaboration et la mise sur le marché de nouveaux traitements pour lutter contre ce fléau est un défi sanitaire et économique majeur. Le stress oxydant induit par de nombreux facteurs environnementaux (notamment l'exposition à des polluants chimiques) est un évènement extrêmement précoce et jouant un rôle majeur dans la maladie. En effet, l’oxydation des lipides et du glucose favorise l’accumulation d’espèces carbonylées réactives (ECR, stress carbonylé) dont la réaction avec les acides aminés entraîne des modifications et pertes de fonctions irréversibles des protéines cellulaires. Parmi les molécules capables de combattre ce phénomène, les polyphénols, métabolites secondaires du règne végétal, présents dans de nombreux fruits et légumes de notre alimentation, ont été largement étudiés. L'obstacle majeur à l'utilisation de ces composés en thérapeutique est leur très faible biodisponibilité. Pour contourner ce problème, une équipe de chimistes a synthétisé un composé capable de réduire à la fois le stress oxydant et le stress carbonylé. Un polyphénol naturel, le phloroglucinol (Phloro) a été modifié chimiquement afin de pouvoir piéger les espèces responsables du stress carbonylé. Afin d’augmenter sa biodisponibilité, le phloroglucinol modifié a ensuite été couplé à un acide gras à longue chaîne (DHA) pour donner le Phloro-OiP-DHA. Son activité a été validée in vitro et in vivo dans un modèle murin présentant une dégénérescence des photorécepteurs induite par la lumière. L'objectif de ce projet est de déterminer le potentiel thérapeutique de ce composé dans un modèle de stress carbonylé induit par une exposition chronique à une ECR (l'acroléine), mimant le développement de la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra : -de confirmer que l'exposition chronique à l'acroléine, conduisant à l'apparition d'un stress carbonylé, s'accompagne de troubles comportementaux et de neurodégénérescence. -de déterminer le potentiel thérapeutique du lipophénol Phloro-OiP-DHA dans ce modèle. Avec cette étude, nous posons donc l'hypothèse d'un mécanisme reliant le stress carbonylé aux processus neurodégénératifs asssociés à la maladie d'Alzheimer, et en particulier ceux associés à la formation des dépôts amyloïdes et l'hyperphosphorylation de la protéine tau. Ce projet nous permettra d'en appréhender les mécanismes biochimiques sur le long terme et de tester le potientiel thérapeutique d'une molécule ciblant le stress carbonylé, le Phloro-OiP-DHA.

Procédures

Les animaux, en fonction de leur groupe, pourront être soumis à : -un gavage quotidien pendant 4 semaines (6j/7) -une injection intracérébroventriculaire d'acroléine -des injections intrapéritonéales ou intranasales quotidiennes pendant 2 semaines - des tests comportementaux (un test par jour) - ils seront euthanasiés en fin de projet.

Impact sur les animaux

La dose d'acroléine utilisée est basée sur des travaux précédemment publiés . Les animaux seront observés quotidiennement afin d'évaluer les potentiels effets indésirables. L'inconfort lié au traitement peut provenir de la répétition quotidienne du gavage pendant 4 semaines et/ou des administrations intranasales pendant 2 semaines. Ces administrations seront toutefois effectuées par une personne qualifiée et après une période d'habituation à l'expérimentateur.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de pouvoir procéder à des analyses biochimiques et immunohistologiques du tissu cérébral.

Remplacement

De manière générale, il est aujourd’hui très difficile en neurosciences d’étudier le fonctionnement du cerveau sur des modèles simplifiés (in vitro ou in silico) et donc de remplacer l’étude sur l’animal dans sa globalité. En effet, il n'existe pas de modèles alternatifs (in vitro ou in silico) validés pour étudier la neurodégénérescence et le déclin cognitif dans leur globalité. Il est primordial d’avoir des circuits neuronaux in vivo associés aux cellules gliales et vasculaires, pour caractériser les modifications moléculaires liées à la maladie d’Alzheimer d’un point de vue spatiotemporel. Les modèles utilisés sont acceptés, bien documentés, et très utilisés par la communauté des neurosciences.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum pour répondre aux objectifs du projet. Le nombre d'animaux dans chaque groupe, ainsi que le nombre de groupes est basé sur une connaissance approfondie des modèles et de l'expérience acquise par notre équipe et a été déterminé par une analyse de puissance statistique basée sur nos études précédentes. Pour les analyses comportementales, histologiques et biochimiques, les tests seront de type non appariés, paramétriques sur les moyennes à variances égales ou différentes suivants les résultats des analyses précédentes. Ici, 10 animaux par groupe seront nécessaires pour observer d’éventuels changements. A ce nombre d’animaux une marge de 10% sera ajoutée afin de compenser les aléas expérimentaux.

Raffinement

Afin de minimiser les effets du stress qui pourraient fausser les résultats (en particulier sur les analyses comportementales), mais également de contrôler l’état général des animaux, les souris seront manipulées chaque jour par l’expérimentateur en charge de l’expérience, avant la procédure expérimentale. Tous les incidents et toutes observations anormales (comportement, poids, pelage, plaie,…) seront transmis à l’expérimentateur afin d’être traités dans les plus brefs délais et seront notés dans un tableau de suivi expérimental.

Choix des espèces

Il s'agit d'une espèce de choix au niveau international pour l’étude de la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer. Ces études chez l’animal vigile sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements potentiels. De plus, l'utilisation d'animaux transgéniques (modèle Alzheimer) justifie également le choix de cette espèce. La maladie d'Alzheimer étant une maladie se déclarant chez l'adulte voire la personne âgée, les animaux seront utilisés et sacrifiés à l'âge adulte (6 mois). De plus, la caractérisation du modèle de souris transgéniques a déjà été effectuée dans notre laboratoire et nous avons montré que : -les déficits comportementaux commencent à partir de 3 mois -les modifications biochimiques (augmentation de la charge amyloïde, de la phosphorylation de la protéine tau, principaux marqueurs de la maladie d’Alzheimer) et histologiques (formation des plaques amyloïdes) sont visibles à l’âge de 6 mois

Pour établir le rôle d'une enzyme dans la résistance des mélanomes aux traitements, 1 728 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous la peau ou dans les poumons une greffe de cellules de mélanome, puis un gavage trois fois par semaine pendant cinq semaines ou des injections d'immunothérapie, avec un suivi de la rechute jusqu'à trois mois. Les tumeurs peuvent s'ulcérer et se nécroser, le gavage peut léser l'œsophage, et toutes les souris sont tuées pour prélever les tissus tumoraux. Le porteur conclut qu'en l'absence de système artificiel reproduisant l'environnement d'une tumeur, la souris constitue "un modèle sans alternative".

Objectifs

Le mélanome est un cancer de la peau qui reste difficile à traiter malgré les progrès récents grâce aux thérapies ciblées et aux immunothérapies. Globalement, plus de 50% des patients ont besoin de traitements supplémentaires, justifiant le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. La fonction des enzymes appelées déubiquitinases dans la réponse des mélanomes aux thérapies actuelles est très mal connue. Dans ce contexte, l’objectif du projet est de montrer l’importance de certaines enzymes comme RPN11 dans la réponse et la résistance thérapeutique des mélanomes.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra d’apporter la preuve de concept pré-clinique de l'importance de l’enzyme RPN11 dans la réponse des mélanomes aux thérapies ciblées et aux immunothérapies (bénéfices à court terme). A plus long terme, notre projet doit permettre d’identifier de nouveaux biomarqueurs de la réponse des patients aux thérapies actuelles ainsi que de nouvelles cibles thérapeutiques pour développer des stratégies innovantes permettant de combattre le mélanome métastatique résistant.

Procédures

Pour les greffes sous-cutanées, les animaux sont anesthésiés et reçoivent sur un flanc une injection de cellules de mélanome (1 minute/animal). La croissance des tumeurs est suivie trois fois par semaine par mesure au pied à coulisse (1 minute/animal) jusqu'à 3 mois après le début du traitement pour suivre la rechute tumorale. Pour les greffes pulmonaires, les animaux sont anesthésiés puis injectées avec des cellules de mélanome bioluminescent (1 à 2 minutes/animal). La croissance des tumeurs est suivie par analyse de la bioluminescence sur les animaux anesthésiés le jour de l’injection puis une fois par semaine pendant le traitement (durée de l'analyse 30 min/groupe d'animaux). L’expérience est poursuivie jusqu’à 12 semaines après le début du traitement pour suivre la rechute tumorale. Une partie des souris reçoivent les traitements par gavage oral (1 minute/animal). L’administration des substances se fait trois fois par semaine pendant 5 semaines. Une autre partie des souris sera traitée par l’immunothérapie par injection en intrapéritonéale (1 minute/animal) à raison de 3 injections pendant 1 semaine.

Impact sur les animaux

- Ulcération/nécrose des tumeurs sous-cutanées - Les injections intrapéritonéale peuvent provoquer une inflammation locale - Perte de poids anormale suite au traitement - Risque de lésion de l’œsophage lors du gavage oral.

Devenir

Dans tous les cas, à la fin de l’expérience ou lorsque les points limites sont atteints, il est nécessaire de prélever post-mortem les tissus tumoraux afin de réaliser des analyses complémentaires permettant de confirmer l’intérêt des cibles thérapeutiques identifiées. Tous les animaux sont donc mis à mort et ne seront pas réutilisés.

Remplacement

Dans le cadre du remplacement, nous avons réalisé un certain nombre d'expériences in vitro qui ont permis de déterminer les conditions optimales pour cibler l’enzyme RPN11 dans le mélanome. Cependant, en l’absence de système artificiel pouvant reproduire in vitro l’environnement complexe d’une tumeur, il est nécessaire de confirmer nos résultats dans des modèles pré-cliniques de réponse thérapeutique chez la souris. La combinaison de nos modèles permettra d’apporter une solide preuve de concept in vivo de l'importance de RPN11 pour l’amélioration des thérapies ciblées et des immunothérapies. En ce sens, le modèle murin constitue un modèle sans alternative pour les études pré-cliniques visant à valider de nouvelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Nos études sont réalisées dans le souci d'utiliser un nombre minimum d'animaux sans compromettre les objectifs du projet. Le nombre d'animaux nécessaires au projet a été calculé au plus juste afin d’obtenir des résultats exploitables. Le recours à des techniques d'imagerie non invasive réduit de façon importante le nombre d’animaux nécessaires dans chaque groupe expérimental. Dans tous les cas, les tissus tumoraux sont prélevés post-mortem à la fin de l’expérience afin de réaliser des analyses complémentaires permettant de valoriser au mieux les expériences chez la souris.

Raffinement

Nous hébergerons les animaux dans des conditions enrichies d’hébergement prenant en compte leur bien-être et de soins afin de réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable. L’hébergement et la manipulation en condition stérile permettra d’éviter toute contamination des animaux. Les souris seront observées quotidiennement et très attentivement par du personnel qualifié pour permettre la détection très précoce des signes de souffrance ou de mal-être, une réaction immédiate si le point limite est atteint, et une surveillance accrue en cas de doute. Le personnel participant à ce projet maîtrisent les expériences de greffe et les modes d'administration des drogues. Les transplantations de mélanome réalisées sont bien supportées par les animaux. Afin de réduire le stress ou la souffrance éventuelle, une anesthésie est effectuée avant les injections. Le risque d'inflammation associée aux injections intrapéritonéales est diminué en alternant les sites d'injection ou en privilégiant l’administration des drogues par gavage oral. Le gavage est amélioré par l’utilisation d’une canule courbée terminée par une olive qui permet de minimiser le risque de lésion de l’œsophage. Tout changement de comportement significatif, modification physique, variation anormale de poids ou signes de douleur conduiront à l’euthanasie des souris. Si des ulcérations des tumeurs sont observées, la tumeur est traitée avec une solution antiseptique jusqu'à la résolution de la plaie. L’ensemble de ces procédures nous permettra d'intervenir au plus tôt en cas de souffrance des animaux dans les phases avancées de la maladie.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale relativement proche de l’homme, systématiquement utilisée dans les études précliniques visant à étudier l'efficacité de nouveaux traitements anticancéreux. De plus, la souris présente plusieurs avantages comme un cycle de vie relativement court et une natalité importante. Nos expériences seront réalisées sur des modèles de souris permettant d'éviter le rejet des greffes de cellules tumorales humaines et sur des modèles de souris permettant d’étudier la réponse immunitaire contre la tumeur. En l’absence de système artificiel pouvant reproduire in vitro l’environnement complexe d’une tumeur, il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour mener à bien ce projet. Les expériences de greffes de mélanome seront réalisées sur des animaux âgés de 6 semaines, un âge auquel la prise tumorale est particulièrement efficace d'après les données de la littérature. Les souris sont commandées à l'âge de 5 semaines. A leur arrivée, elles sont acclimatées pendant une semaine à l'animalerie avant d'être utilisées.

58 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une colite est provoquée chez elles par traitement, avec inflammation de l'intestin et perte de poids possibles, et chacune subit cinq injections intrapéritonéales et six pesées. Le porteur indique que les données obtenues hors de l'animal ne suffisent pas, faute d'y retrouver le système immunitaire et les facteurs circulants. Le bénéfice annoncé se limite à identifier "potentiellement" des cibles thérapeutiques pour les troubles digestifs liés au stress.

Objectifs

Le système nerveux entérique (SNE) régule la motricité digestive et les fonctions de la barrière épithélio-intestinale. Il est admis que le stress altère l’axe cerveau-intestin et contribue à un large éventail de troubles gastro-intestinaux, incluant le syndrome de l’intestin irritable. La survenue d’évènements stressants ou traumatisants affecte les fonctions digestives, qui en pratique se manifestent par des flatulences, des douleurs abdominales, plus ou moins associées à une accélération ou à une diminution de la vidange gastrique. La réponse biologique au stress implique l’activation de l’axe hypothalamo-hypophysaire-surrénalien, initiant une sécrétion de glucocorticoïdes. Bien que la synthèse de glucocorticoïdes ait lieu principalement au niveau des glandes surrénales, il a été décrit de nombreux autres sites de production, associés à une action locale des glucocorticoïdes via le récepteur aux glucocorticoïdes. Dans l’intestin, le système nerveux exprime le récepteur des glucocorticoïdes ainsi que l’enzyme responsable de leurs synthèses. Une étude préliminaire in vitro de notre équipe de recherche a permis de mettre en évidence une synthèse de corticostérone par le système nerveux entérique et une augmentation de la synthèse de corticostérone en conditions inflammatoires. De plus, des modifications de l’expression de protéines impliquées dans l’activité neuronale ont également été mises en évidence en conditions inflammatoires et lorsqu’on bloque l’effet des glucocorticoïdes. L’objectif de ce projet est d’étudier comment l’inflammation module le système nerveux entérique in vivo, et si les conséquences fonctionnelles de l’inflammation passent par l’action des glucocorticoïdes.

Bénéfices attendus

Mieux comprendre les mécanismes de la synthèse locale des glucocorticoïdes au niveau de l’intestin afin de pouvoir potentiellement identifier des cibles thérapeutiques pour améliorer les troubles digestifs intestinaux liés au stress et à l’inflammation.

Procédures

Pesée quotidienne des animaux – 10 sec sur la balance – 6 au total Contention + injection intrapéritonéale – 30 sec – 5 au total

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent avoir une inflammation des intestins à l’issue du traitement et cela peut générer une perte de poids. Ils peuvent également avoir peur au moment des injections intrapéritonéales.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de prélever des tissus d’intérêt (tube digestif) pour analyser les échantillons ex vivo.

Remplacement

Les données préliminaires obtenues dans un modèle ex vivo ne sont malheureusement pas suffisantes pour extrapoler les résultats obtenus à un individu entier. Plusieurs acteurs comme le système immunitaire et la présence de facteurs circulants sont absents de nos modèles ex vivo. C’est pourquoi il n’est pas possible de remplacer ce modèle d’induction de colite aigüe par un modèle ex vivo ou in vitro.

Réduction

Nous avons calculé le nombre d’animaux minimum nous permettant d’obtenir des résultats statistiquement interprétables (n=9 pour une augmentation de 40 % de la production de corticostérone). Pour s’assurer de la réussite de ce projet, nous avons prévu un lot d’animaux « pilote » de 10 souris qui permettra de valider les expérimentations in vitro sur les échantillons issus de nos animaux. Comme une partie des animaux va recevoir une injection intrapéritonéale d’antagoniste et que ce type d’injection peut rater malgré un personnel compétent, nous avons prévu un lot supplémentaire (n=3 par groupe) qui sera réalisé seulement si certains animaux doivent être exclus. L’utilisation d’un tel nombre (58 au total) devrait nous éviter de devoir répéter l’expérience.

Raffinement

Les souris seront au maximum 5 par cages et de l’enrichissement (frisottis, tubes) sera placé dans les cages leur permettant de déchiqueter, de jouer et de se cacher. Elles seront également surveillées quotidiennement à l’animalerie avant et pendant la procédure expérimentale, y compris le week-end. Les souris seront habituées à la présence de l’utilisateur grâce à une manipulation régulière pour limiter le stress lors des expérimentations. Nous avons également défini des points limites à nos expérimentations pour évaluer le bien-être de nos animaux et prendre en charge la douleur si elle a lieu.

Choix des espèces

La colite expérimentale provoquée par le traitement chez les rongeurs est un modèle reconnu d’affections inflammatoires chroniques humaines. La souris représente un très bon modèle d’étude (plus petit) et est plus adapté à nos besoins qu’un modèle rat et nous permettra de faire un parallèle avec l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 à 10 semaines) puisque ce projet s’intéresse à la régulation de la production de glucocorticoïdes à l’âge adulte.

Les femelles sont privées de leurs ovaires par chirurgie, six semaines avant la suite du protocole, pour reproduire la forme d'insuffisance cardiaque qui touche surtout les femmes. 156 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une pompe implantée sous la peau qui diffuse des molécules provoquant hypertension et hypertrophie du cœur, puis trois échographies sous anesthésie et trois mesures de pression artérielle sur animal vigile, sur huit semaines. Le porteur écrit que l'ovariectomie n'induit pas d'effets indésirables, et décrit par ailleurs une dyspnée qui peut être sévère en phase terminale, moment où les souris sont tuées.

Objectifs

L'insuffisance cardiaque (IC) se caractérise par une incapacité du coeur à assurer sa fonction de pompe circulatoire et donc à remplir les besoins de l’organisme en perfusion de sang oxygéné. Ce projet porte sur une forme d’IC qui se caractérise par des défauts de relaxation du cœur. Cette forme d’IC touche un peu plus les femmes que les hommes, ; elle est fortement associée à l’âge et aux autre maladies cardiovasculaire (ex : hypertension) et touche près de 50 % des patients en IC. Ces patients souffrent d’une sévère perte de qualité de vie et d’hospitalisations répétées avec une mortalité importante. Actuellement, très peu de traitements efficaces ont été identifiés. Notre projet général d’équipe a pour but de tester de nouveaux médicaments pour ce syndrome sur un modèle murin. Nous testerons des molécules induisant l’hypertension artérielle et l’hypertrophie du cœur pour établir ce modèle au sein de notre laboratoire et comparer la réponse entre les mâles et les femelles. Le but de ce projet est donc de mettre en place ce modèle spécifique d’insuffisance cardiaque afin d’établir un protocole reproductible et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés dans nos investigations futures.

Bénéfices attendus

La capacité fonctionnelle et la qualité de vie chez les sujets souffrant de l’IC avec une fraction d’éjection systolique préservée sont gravement altérées. En effet, le cœur de ces patients n’arrive pas à éjecter suffisamment de sang vers les organes car il n’arrive pas à se relaxer suffisamment durant la phase de relaxation. Ce dysfonctionnement conduit à une intolérance à l’exercice physique et des effets néfastes sur d’autres organes comme les poumons (hypertension pulmonaire) et les muscles squelettiques. Les traitements développés depuis plusieurs décennies ne sont pas ou peu efficaces pour ces patients. L'IC est une maladie affectant plus d’ 1 million de personnes en France et environ la moitié de ces patients souffrent ICFEp ce qui représente un coût socio-économique et humain majeur pour le système de santé en France. Il est donc essentiel de poursuivre la recherche thérapeutique dans ce domaine. Le bénéfice principal attendu de projet pilote est l’établissement d’un modèle murin reproductible et bien caractérisé qui pourra ensuite être utilisé par différentes équipes au niveau de notre laboratoire et au niveau national.

Procédures

Souris mâle: durée de la procédure 8 semaines Les animaux auront une injection (environ 15 secondes) sous anesthésie locale (environ 1heure) 6 semaines avant l'implantation d'une mini pompe osmotique qui permettra l'administration des produits (durée 20 minutes) sous anesthésie générale (30 minutes). Au cours des 8 semaines: 3 échocardiographies sous anesthésie générale (durée environ 15 minutes) et 3 mesures de la pression artérielle sur animaux vigiles seront réalisées. Une habituation est réalisée pendant 4 jours précédents la première de pression artérielle,mesure qui a lieu le 5ème jour pour diminuer l’élévation de la pression artérielle par le stress associé à la procédure. Souris femelles: durée de la procédure 8 semaines Les ovariectomies seront réalisées 6 semaines avant l'implantation de la minipompe (deux chirurgies :durée 20 minutes chacunes sous anesthésie générale (environ 30 minutes)). Les injections (environ 15 seconde) sous anesthésie locale (environ 1h) débuteront le jour d'après l'ovariectomie. Au cours des 8 semaines: 3 échocardiographies sous anesthésie générale (durée environ 15 minutes) et 3 mesures de la pression artérielle sur animaux vigiles seront réalisées. Une habituation est réalisée pendant 4 jours précédents la première de pression artérielle,mesure qui a lieu le 5ème jour pour diminuer l’élévation de la pression artérielle par le stress associé à la procédure.

Impact sur les animaux

La procédure d'implantation de la micropompe osmotique au niveau sous-cutanée correspond à une chirurgie minimale, très souvent source d'un niveau de douleur très limitée et relativement bien tolérée par les animaux. Le seul risque (rare) observé lors de ces interventions correspond à une protrusion de la pompe. Dans ce cas, la pompe peut être réinstallée et la suture refaite. De plus du fait de l’opération les souris peuvent avoir une difficulté à l’accès à la nourriture ce qui pourrait entrainer une perte de poids. Au moment de l’échographie les yeux des souris peuvent subir un léger dessèchement. Le syndrome d’insuffisance cardiaque lui-même, induit une dyspnée qui peut être sévère et une incapacité à l’effort. Ces deux symptômes peuvent induire un stress psychique sur la souris en phase terminale. Cet effet n’est pas prolongé dans le temps puisque les animaux sont sacrifiés lorsqu’ils arrivent dans cette phase terminale. L’ovariectomie elle-même n’induit pas d’effets indésirables.

Devenir

Tous les animaux du projet sont euthanasiés en fin de procédure.

Remplacement

Le recours à des animaux se justifie par la nécessité d'étudier la fonction cardiaque dans un contexte physiopathologique complexe et multifactoriel impliquant une circulation sanguine avec pression artérielle, une régulation neurohormonale du rythme et de la contractilité cardiaque et une étude du retentissement sur différents organes majeurs impliqués dans l’évolution de l’IC tels que les poumons, les reins et les muscles squelettiques notamment. Les modèles cellulaires ne permettent pas d’étudier le fonctionnement physiologique intégré du cœur et l’effet de l’ICEFp sur d’autres organes. Une légère douleur peut être associée à l’ovariectomie correspondant à l'incision musculaire et cutanée, de plus l’absence d’ovaire n’est pas associée à une douleur.

Réduction

Une planification minutieuse basée sur un calcul de puissance et l’expertise de l’équipe ont permis l'estimation de la taille d'échantillon optimale. Ceci a permis de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en préservant la validité statistique de l’étude, et de conserver une puissance statistique suffisante pour observer un effet de 40% obtenu l’altération de la fonction diastolique (critère principal retenu dans cette étude). Les fonctions cardiovasculaires sont étudiées par des méthodes non invasives permettant de limiter le nombre d’animaux car on peut les mesurer à différents temps sur le même animal. Alors que les méthodes invasives sont des procédures terminales. De plus, afin de minimiser encore le nombre d’animaux utilisés, en fin d’expérimentation les tissus prélevés sont partagés entre les domaines explorés. Les analyses statistiques seront la comparaison de moyennes entre deux groupes, le groupe contrôle est implanté avec une pompe remplie de sérum physiologique et le groupe ICFEp est implanté avec une pompe diffusant la combinaison diluée dans le sérum physiologique. La variation séquentielle des doses est une procédure par étape qui permet de ne pas nécessairement réaliser l’étude de tous les groupes si une des doses convient. Cela limite potentiellement le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Après implantation de la minipompe osmotique, les souris seront observées tous les jours. Les cages sont changées 1 fois par semaine. Les animaux sont hébergés selon les conditions fixées par l'arrêté du 1er février 2013 fixant les conditions d'agrément, d'aménagement et de fonctionnement des établissements utilisateurs. Les opérations chirurgicales (pose de minipompe et ovariectomie) sont induites en respectant au maximum les procédures du bien-être animal et en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques et analgésiques. L’expérimentateur, le personnel de l’animalerie seront informés des critères d’observation des animaux qui seront : l’état général, l’état de la cicatrice, le comportement de prostration, la courbure de la colonne vertébrale, l’état du poil (manque d’hygiène), et un critère propre à l’étude de l’IC qui est la manifestation d’une dyspnée sévère. Le poids des animaux sera également relevé quotidiennement. Après l’échographie l’animal est placé dans une cage propre. Au moment de l’échographie les yeux des souris peuvent subir un léger dessèchement ainsi une pommade de protection sera appliqué. Après son réveil complet, l'animal il est remis dans sa cage. Pour les opérations chirurgicales, les animaux sont anesthésiés, pour les maintenir immobiles. Une fois anesthésiés et endormis, ils reçoivent une injection en sous-cutanée d'analgésique. Au réveil, chaque souris est isolée dans une cage pendant quelques heures, au calme et au chaud puis stabulé à 4 ou 5 souris /cage. En post opération, la cicatrisation cutanée de la zone opérée est surveillée régulièrement. Le seul risque (rare) observé lors de ces interventions correspond à une protusion de la pompe. Dans ce cas, la pompe peut être réinstallée et la suture refaire. Un traitement antalgique est alors donné en complément. Une habituation est réalisée pendant 4 jours précédents la première mesure de pression artérielle qui a lieu le 5ème jour pour diminuer l’élévation de la pression artérielle par le stress associé à la procédure.

Choix des espèces

La souris est un des modèles les plus utilisés en recherche biomédicale. La structure des tissus musculaires et cardiaques murins est très proches de celle de l’homme. De plus les souris se reproduisent rapidement et de nombreuses études en IC ont été réalisées chez la souris ce qui nous permettra plus tard de discuter nos résultats par rapport aux autres études publiées. Les souris seront utilisées à l’âge de 2 mois pour avoir la taille minimum pour procéder à implantation de mini pompe osmotique.

324 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale ou un gavage chaque jour pendant cinq jours, puis une injection de toxine ou de chlorure de baryum dans le muscle de la patte, qui le paralyse le temps que dure l'effet. Le projet cherche à comprendre comment un dysfonctionnement des mitochondries perturbe la régénération du muscle, avec en ligne de mire les dystrophies musculaires et la sarcopénie. Le porteur qualifie sa propre étude de "menée de manière éthique" et affirme utiliser "judicieusement des modèles animaux" avec des "stratégies d'intervention humaines".

Objectifs

L’ensemble du projet vise à apporter de nouvelles connaissances fondamentales sur la mise en place des muscles squelettiques au cours du développement, de la régénération musculaire et des pathologies. Nous souhaitons comprendre comment les mitochondries sont impliqués dans le développement de muscles des membres. Ces études sont essentielles pour comprendre l’origine des maladies qui touchent le muscle squelettique, appelées dystrophies musculaires, ainsi que la sarcopénie. Pour cette étude, il est essentiel de recourir à des modèles murins génétiquement modifiés qui i) nous permettent de marquer et suivre spécifiquement leur devenir ou éliminer des cellules d’intérêts pour comprendre leur origine et leur fonction et ii) nous permettent d’altérer les fonctions mitochondriales. Le deuxième aspect que nous étudions est le développement du muscle post-natal et sa capacité à régénérer après une blessure ou dans des cas de dystrophies musculaires. Ces processus font intervenir des cellules souches adultes. Les cellules souches ont la propriété de générer des cellules différenciées (les myofibres) qui assurent la fonction contractile du muscle, et de s’auto-renouveler afin d’assurer leur maintenance. La compréhension du fonctionnement normal des cellules souches est nécessaire pour définir l’origine de leur dysfonctionnement dans les pathologies musculaires ou le vieillissement. Notre étude vise à comprendre les propriétés des cellules souches musculaires, les myofibres et les populations interstitielles des muscles des membres. Pour cela, il est essentiel d’utiliser des modèles de souris génétiquement modifiées qui nous permettent d’identifier et d’isoler les cellules souches musculaires, les myofibres et les populations mutantes afin de les étudier aux niveaux cellulaires, moléculaires et fonctionnels. Si certaines expériences d’analyse peuvent être établies in vitro, d’autres doivent impérativement être réalisées in vivo car aucun système in vitro ne permet à ce jour de reproduire fidèlement les conditions naturelles et complexes d’un tissu.

Bénéfices attendus

Cette recherche s'efforce d'explorer la relation complexe entre la dysfonction mitochondriale, les cellules souches adultes et les fibres musculaires, en mettant particulièrement l'accent sur les implications pour la sarcopénie et la dysfonction musculaire. En comprenant les mécanismes moléculaires impliqués, cette étude vise à élucider comment les dommages mitochondriaux contribuent à la dégénérescence et à la régénération du muscle squelettique. La compréhension de ces processus complexes offre d'énormes perspectives pour faire progresser les stratégies thérapeutiques ciblant des conditions telles que la sarcopénie et les maladies musculaires génétiques, visant finalement à améliorer la qualité de vie des personnes concernées. Les avantages potentiels vont au-delà de l'amélioration des pathologies liées aux muscles, car les connaissances acquises grâce à cette recherche pourraient avoir des implications plus larges pour atténuer la fragilité liée à l'âge, réduire le risque de chutes et de fractures, et améliorer l'homéostasie générale du muscle squelettique. Menée de manière éthique, cette étude utilise judicieusement des modèles animaux, mettant en œuvre une surveillance rigoureuse, des statistiques prédictives et des stratégies d'intervention humaines, garantissant que les connaissances acquises contribuent de manière éthique et efficace à la compréhension plus large de la communauté scientifique de la dysfonction mitochondriale dans le contexte des cellules souches adultes et des fibres musculaires. L’ensemble de ces résultats nous permettra d’apporter des informations nouvelles sur les bases moléculaires qui contrôlent la prédisposition des muscles aux pathologies musculaires et de ce fait, des informations essentielles pour les thérapies à développer.

Procédures

- La procédure comporte essentiellement des injections intrapéritonéales ou intramusculaires. - La procédure comporte en général une injection intrapéritonéale (quelques secondes) ou un gavage (de l’ordre d’une minute) chaque jour, pendant 5 jours, avec optionnellement 4 injections intrapéritonéales supplémentaires avant mise à mort (1 injection/jour) et d’une injection intramusculaire (quelques secondes) sous anesthésie. - La procédure dure au maximum 1 mois

Impact sur les animaux

Nous veillerons dans nos expériences à impacter le moins possible le bien-être des souris. Les expériences consistent essentiellement en des injections intrapéritonéales ou intramusculaires sur quelques jours. La piqure d'aiguille pour injection de toxine ou chlorure de baryum entraine une douleur légère de courte durée. Les effets indésirables attendus est une boiterie transitoire de courte durée (

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, selon les critères énoncés pour la procédure, à la fin de des expériences, pour collecter les tissus nécessaires à nos travaux de recherche.

Remplacement

La formation et la régénération des muscles squelettiques impliquent une multitude de réponses et d’interactions cellulaires entre les progéniteurs/cellules souches musculaires et leur environnement au sein d’une ultrastructure tridimensionnelle complexe. L’environnement ou la niche, est composé de multiples facteurs comme une matrice extracellulaire tridimensionnelle et des types cellulaires interstitiels variés. Les cultures in vitro ne peuvent pas récapituler la complexité de ces interactions. Néanmoins, l’approche in vitro pour les stratégies d’analyses moléculaires sera mise en place toutes les fois où cela sera possible afin de limiter le recours à l’animal en utilisant des lignées cellulaires ou des cellules primaires amplifiées in vitro.

Réduction

Les effectifs des groupes expérimentaux ont été ajustés : - en tenant compte de notre expérience, - en fonction de la nature de l'expérience et des paramètres mesurés, - de la variabilité de ces paramètres, - de façon à produire des résultats interprétables, permettant d'atteindre une signification statistique, par des biostatisticiens.

Raffinement

Un suivi régulier des animaux inclus dans le projet selon leur état général de santé est prévu. L’effet local de l’injection de toxines peut être une paralysie transitoire du muscle tibial antérieur injecté et donc une incapacité pour l’animal de s’appuyer sur son membre inférieur durant le temps de paralysie. Au réveil de l’anesthésie, l’animal présente une boiterie transitoire (

Choix des espèces

L’utilisation de la souris est basée sur plusieurs critères : - Les souris sont des petits Mammifères. Ils partagent donc de nombreuses similarités avec l’homme notamment au niveau des mitochondries. - Leur temps de génération est court et les effectifs des portées élevés, ce qui permet d’avoir rapidement accès à un grand nombre d’animaux. - De nombreuses lignées existent (souris génétiquement modifiées) pour étudier les acteurs de la régénération notamment la souris transgénique étudiée qui permet d’isoler une population pure de cellules souches musculaires. Adulte. Les animaux sont considérés comme adulte après 6 semaines et âgés à partir de 20 mois. Au-delà de 6 mois, le nombre de cellules satellites décroit chez les souris. Pour ces raisons, nous utilisons essentiellement des souris de 6 à 12 semaines.