Recherche fondamentale

45 rates adolescentes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Isolées et pesées chaque jour, trente d'entre elles subissent trois semaines de restriction alimentaire pour reproduire une anorexie mentale, toutes passent deux examens d'imagerie de soixante minutes sous anesthésie après injection d'un produit radioactif, et quinze reçoivent en plus une injection dans l'abdomen chaque jour pendant trois semaines. Le porteur reconnaît que la restriction peut provoquer une constipation et que l'isolement peut stresser les rates, et fixe la sortie de l'étude à une perte de poids supérieure à 25 %. L'avancée espérée sur un sous-type de récepteur à la sérotonine "pourrait ouvrir la porte" à de nouveaux traitements, et le porteur affirme qu'un modèle animal est "nécessaire" parce qu'il veut suivre l'installation d'une maladie chronique.

Objectifs

L’anorexie mentale fait partie des troubles alimentaires dont l'origine est multifactorielle. Ce trouble se caractérise par une restriction des apports alimentaires durant plusieurs mois, voire plusieurs années, conduisant à une perte importante de poids associée à un certain "plaisir de maigrir" et une peur intense de prendre du poids. La prise en charge de cette pathologie passe par différentes stratégies (soutien psychologique, renutrition, traitement antidépresseur) mais il n’existe pour le moment pas de traitement médicamenteux spécifique de l’anorexie mentale. Une étude a montré l’implication de la sérotonine (un neurotransmetteur impliqué dans de nombreuses fonctions physiologiques) à diminuer la prise alimentaire chez le rat entraînant une perte de poids significative. Ces résultats préliminaires laissent entrevoir un potentiel rôle du récepteur à la sérotonine dans la prise alimentaire et plus largement dans l’anorexie mentale. Nous proposons donc d’explorer l’évolution de la densité d’un sous type de récepteurs à la sérotonine chez des rats dont l’anorexie mentale aura été induite par un régime alimentaire et une activité physique adaptés à l’aide de la Tomographie par Emission de Positons (TEP).

Bénéfices attendus

L'anorexie mentale a été longtemps considérée comme un trouble principalement influencé par des facteurs socioculturels ; cependant, des études ont montré qu’elle est plus fréquente dans certaines familles ce qui suggère une influence génétique dans ce trouble. Le rôle de la sérotonine dans l'anorexie mentale découle en grande partie des données pharmacologiques établissant un lien entre le système sérotoninergique et la régulation de l'appétit. Le système sérotoninergique peut en effet médier la sensation de satiété et la motivation de la consommation de nourriture. L’avancée des connaissances sur les récepteurs impliqués dans l’anorexie mentale pourrait alors ouvrir la porte à la conception de nouveaux traitements.

Procédures

Tous les rats (n=45) seront isolés et pesé quotidiennement. Deux groupes (n=30) seront soumis à un régime alimentaire restreint pendant trois semaines. Deux examens TEP sous anesthésie générale de 60 minutes, par injection intraveineuse, d’un radiopharmaceutique seront réalisés au début et en fin de procédure pour tous les rats (n=45). Un groupe (n=15) sera traité pendant trois semaines par injection intra péritonéale quotidienne d’un médicament.

Impact sur les animaux

Le régime hypocalorique pourrait induire une modification du transit intestinale avec apparition de constipation chez les rats. L'isolement des rats envers ses congénères pendant la période de l’étude pourrait provoquer des symptômes de stress chez les rats.

Devenir

Les rats seront mis à mort par utilisation d’un agent euthanasiant. En cas d’atteinte des points limites, la mise à mort d’un sujet sera envisagée. Les cerveaux pourront être extraits pour des analyses sur tissu frais congelé. D’autres organes pourront être prélevés si l’étude le nécessite.

Remplacement

Un modèle animal est nécessaire car nous souhaitons explorer l’évolution de certains récepteurs suite à l’apparition d’une maladie chronique. Une fois la preuve de concept obtenue chez l’animal, ce projet d’imagerie sera rapidement transférable chez l’Homme en utilisant le même radiotraceur.

Réduction

Le nombre d’animaux choisi correspond au minimum acceptable afin d’analyser les données de façon pertinente d’un point de vue statistique. Ce nombre est fonction du nombre d’examens techniquement réalisables par notre équipe. Le suivi longitudinal des rats en imagerie permet de diminuer le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Le choix de rats comme modèle repose sur le fait qu’ils sont un modèle robuste et connu pour la maladie étudiée. Un monitorage rapproché sera appliqué chez les rats du groupe ABA chronique. Les points limites justifiant la sortie d’un sujet de l’étude seront l’observation d’un comportement de souffrance (selon l’apparence, les comportements naturel et provoqué, l’hydratation et les selles) et une perte de poids supérieure à 25%. Lors des examens d'imagerie, les animaux seront sous anesthésie générale profonde permettant à l’animal de ne ressentir aucune douleur.

Choix des espèces

Dans cette étude potentiellement translationnelle chez l’Homme, le rat apparaît comme étant le plus adapté en termes de faisabilité, modélisation et translation. L’anorexie induite chez le rat est physiologiquement proche de celle retrouvée chez l’Homme : hyperactivité malgré la baisse de prise alimentaire, perturbation du cycle oestral. Le choix du rat est préféré à la souris pour la plus grande taille du cerveau, au regard de la résolution limitée de la TEP. Selon le modèle d’anorexie mentale chronique, des rats femelles de 8 semaines seront utilisées. Ainsi, nous pourrons suivre l’impact de la nourriture sur leur développement et influencer leur perte de poids permettant de créer un modèle d’anorexie mentale chronique se rapprochant de ce qui est observé chez l’humain. Le choix de rates adolescentes est motivé par le fait que l’anorexie mentale est fréquemment observée chez la femme entre 15 et 17 ans.

Rendues malades par un agent chimique qui enflamme leur côlon pendant sept jours, 32 souris de dix semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. L'inflammation peut provoquer des selles molles ou des diarrhées et une perte de poids. Après un gavage unique destiné à mesurer la perméabilité de leur intestin, elles sont anesthésiées, saignées, puis mises à mort quatre heures plus tard. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de prélever leur côlon et le contenu de leur cæcum, pour vérifier si une supplémentation en tryptophane et en butyrate atténue l'inflammation intestinale.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), principalement la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, sont des maladies chroniques très invalidantes dont l’origine implique des facteurs environnementaux, en particulier le microbiote intestinal et l’alimentation. Certains produits du microbiote connus pour leur rôle bénéfique dans la santé de la muqueuse intestinale, sont diminués chez les patients atteints de MICI. Plusieurs études ont démontré les propriétés anti-inflammatoires de ces produits du microbiote et confortent l’intérêt de rechercher les effets d’une supplémentation nutritionnelle en produits bactériens bénéfiques pour la muqueuse intestinale dans les MICI. L’objectif du projet de recherche est d’évaluer l’efficacité d’une supplémentation nutritionnelle en produits du microbiote sur l’inflammation intestinale et la cicatrisation de la muqueuse intestinale chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de confirmer ou d’infirmer l'effet bénéfique d'une supplémentation nutritionnelle en produits du microbiote sur l’inflammation et la réparation de la muqueuse intestinale et d’apporter des éléments sur le mécanisme d’action. Le projet devrait ainsi fournir des bases rationnelles à des essais cliniques de supplémentation nutritionnelle pour la prévention ou le traitement des patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin.

Procédures

Tous les animaux du projet seront soumis à des manipulations lors de la constitution des groupes et des pesées. Un gavage oral unique d’une durée de 5 secondes, avec une solution permettant d’évaluer la perméabilité intestinale, se fera sur tous les animaux à l’état vigil. Quatre heures après ce gavage, les animaux auront une anesthésie générale pour un prélèvement sanguin (d’une durée d’environ 10-15 secondes), puis seront immédiatement mis à mort.

Impact sur les animaux

Les animaux auront une inflammation modérée du côlon distal qui durera 7 jours. Cette inflammation peut être associée à des selles molles ou des diarrhées et une perte modérée de poids. L’arrêt du traitement inflammatoire au bout des 7 jours entraine l’arrêt progressif de ces symptômes et une récupération de l’état physiologique normal au bout de 4 jours. Le gavage unique des souris avec une solution pour évaluer la perméabilité intestinale est une procédure de classe légère qui devrait se limiter à un stress au moment du gavage, les animaux étant mis à mort 4 heures après.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour rechercher des différences statistiques de l’impact des différents régimes sur l’inflammation intestinale et sur le microbiote intestinal sur des critères histologiques et moléculaires. Il est indispensable de prélever des tissus coliques pour des analyses histologiques et de marqueurs moléculaires à partir d’ARN et de protéines extraits de ces tissus. L’analyse de la composition et de l’activité métabolique du microbiote intestinale nécessite de recueillir le contenu luminal au niveau du cæcum.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est indispensable dans les études évaluant l’impact de la nutrition sur un écosystème physiologique aussi complexe que le microbiote intestinal et la muqueuse intestinale, impliquant des interactions très complexes. Il n’existe pas de modèles cellulaires in vitro pouvant reproduire la complexité de ces interactions.

Réduction

Le nombre de souris par groupe est de N=8, ce qui représente un minimum nécessaire pour évaluer statistiquement l'effet des régimes alimentaires sur l’inflammation intestinale et la cicatrisation de la muqueuse intestinale. Ce nombre est basé sur des études similaires issues de notre laboratoire ou de la littérature et tient compte d'une variabilité interindividuelle importante dans la sensibilité à l'inflammation des animaux qui impacte les analyses effectuées.

Raffinement

L’environnement des souris sera enrichi (tunnel, bâton à ronger, frisottis) tout au long de la procédure. Les souris seront hébergées à 4 par cage dès leur arrivée jusqu’à l’induction d’une inflammation intestinale. Les animaux seront suivis par un personnel animalier compétent et observés quotidiennement pour détecter d’éventuels signes de souffrance. L’évaluation de l’état des animaux sera effectuée selon des critères définis (poids, apparence physique (pelage, posture), activité, comportement, fréquence respiratoire). Leur prise alimentaire et leur prise de poids seront mesurées 3 fois par semaine, puis quotidiennement durant la période de 7 jours d'inflammation afin de détecter une éventuelle sous-alimentation ou perte de poids anormale. Si une douleur était constatée chez un animal durant cette période, un analgésique sera administré. Les points limites définis conduiront, s’ils sont observés, à la mise à mort des animaux le cas échéant.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé dans les études nutritionnelles, mais également dans les études sur l’inflammation intestinale. Les souris commandées auprès de l’établissement éleveur seront âgées de 10 semaines. Après une phase d’acclimatation de 10 jours et une période expérimentale de 18 jours, les souris seront âgées de 14 semaines à la fin l’expérimentation (soit 3,5 mois) ce qui correspond à un stade de jeune adulte fréquemment observé chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin.

80 souris transgéniques vont être utilisées, chacune portant un mélanome injecté sous la peau qui peut atteindre 1 000 mm3, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'injection dure cinq secondes sous anesthésie à l'isoflurane, et toutes sont tuées ensuite pour prélever les tumeurs et les organes lymphoïdes. Le porteur affirme que ces tumeurs ne provoquent ni nécrose, ni métastase, ni gêne à la mobilité, et ramène les nuisances au stress de la manipulation et de la contention. Le bénéfice annoncé tient en une phrase : montrer qu'une protéine détectrice de danger pourrait servir de cible thérapeutique en cancérologie.

Objectifs

Nos résultats précédents ont montré in vitro et in vivo qu’une protéine détectrice de danger donnait des fonctions pro tumorales à certaines cellules immunitaires. Pour mieux comprendre ces observations et, pourquoi pas, à terme développer une stratégie thérapeutique, nous avons mis en place une collaboration avec une équipe ayant développé des souris transgéniques portant des mutations sur cette protéine. Une des mutations induit un profile antitumorale de nos cellules d’intérêt in vitro. Toujours in vitro, notre collaborateur a pu identifier une molécule agissant sur cette mutation. Pour valider que ces observations sont bien associées à un ralentissement de la croissance des tumeurs, nous utiliserons des souris transgéniques et évaluerons la croissance du mélanome dans ces souris. A la fin de l’expérience, les tumeurs et organes lymphoïdes secondaires des souris seront prélevés pour analyse

Bénéfices attendus

Grâce à cette étude nous pensons pouvoir montrer que la protéine détectrice de danger peut servir de cible thérapeutique en cancérologie.

Procédures

Dans le cas des tumeurs sous cutanées les souris recevront une injection de cellules tumorales (durée de l’injection +/- 5 sec). Les tumeurs sous cutanées seront injectées sous anesthésie à l’isoflurane.

Impact sur les animaux

Les tumeurs sous cutanées seront injectées sous anesthésie. Sur la durée de l’expérience (les plus grosses tumeurs atteignant un volume de 1000mm3), ces modèles de tumeurs ne provoquent pas de nécrose, pas de métastase et pas d’impact sur la mobilité des souris. Les souris subiront le stress de la manipulation et de la contention.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les tumeurs

Remplacement

Une grande partie de nos démonstrations a été réalisées in vitro. La réponse immunitaire anti-tumorale étant un phénomène complexe faisant intervenir beaucoup de cellules, de molécules et leurs interactions, il est impossible d’en modéliser l’entièreté en dehors d’un organisme vivant.

Réduction

Dans un souci de réduction, les expériences ne seront répétées que deux fois et les rates et les tumeurs seront analysées sur les mêmes animaux ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. De plus, nous avons fait appel à une méthodologiste afin de déterminer au mieux le nombre minimal de souris requis pour que nos tests statistiques soient suffisamment puissants.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Chaque animal sera examiné quotidiennement tout au long de l’expérimentation. En cas de signes de douleur ou de souffrance les souris seront mises à mort.

Choix des espèces

Les animaux seront utilisés à l’âge adulte à partir de 8 semaines, c’est-à-dire possédant un système immunitaire mature. Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales disponibles pour sous forme génétiquement modifiée.

Greffées de cellules d'adénocarcinome colorectal humain sous anesthésie, 80 souris mâles portent une tumeur pendant deux à trois semaines, traitées tous les trois jours et passées deux à trois fois en microtomographie à rayons X. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse des tumeurs. Le porteur écrit qu'aucune nuisance ni douleur n'est prévisible puisque les animaux sont anesthésiés pendant les manipulations puis tués en fin de protocole, tout en listant la perte de poids, le stress et la perte de mobilité parmi les effets à surveiller. Le projet transpose au cancer colorectal des peptides déjà testés sur un modèle de mélanome, jugé moins utile parce que ce cancer est plus rare et de meilleur pronostic.

Objectifs

Avec plus de 43000 personnes touchées par an en France, le cancer colorectal se situe au troisième rang des cancers les plus fréquents chez l’homme et au deuxième rang chez la femme. Il constitue la deuxième cause de décès par cancer et représente près de 12 % de l’ensemble des décès par cancer, en particulier chez les 65 ans et plus. Le choix du traitement du cancer colorectal dépend du stade, de sa localisation et de l'état général du patient. Bien que la  chirurgie  soit utilisée en première ligne, la chimiothérapie peut être prescrite à tous les stades de la maladie, et plus récemment, des thérapies ciblées sont utilisées en association avec la chimiothérapie . Malheureusement tous les patients ne répondent pas à ces thérapies et des phénomènes de résistance se développent très souvent. La recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à limiter la progression du cancer colorectal demeure donc un défi majeur.

Bénéfices attendus

Historiquement, nos premiers résultats sur les effets anti-cancéreux de nos peptides ont été obtenus sur un modèle de mélanome, en association avec un laboratoire de dermatologie. Toutefois, en France, le mélanome cutané se situe au 9ème rang des cancers tous sexes confondus et ne représente que 2 à 3 % de l’ensemble des cancers. C’est également un cancer de bon pronostic avec une survie à 5 ans supérieure à 80% dans le cas du mélanome de stade I, représentant lui-même 84% des cancers diagnostiqués. A l’heure actuelle, les traitements sont souvent efficaces depuis les progrès de l’immunothérapie. Le cancer colorectal est, quant à lui, le troisième cancer le plus fréquent, tous sexes confondus, en France où il représente la deuxième cause de décès par cancer. Les traitements peuvent être très lourds avec de nombreux effets secondaires. Il apparaît donc important de cibler de nouvelles approches thérapeutiques, c’est pourquoi nous souhaitons vérifier que l’activité anti-tumorale de notre molécule et de ses analogues, observée in vivo dans un modèle de mélanome murin, est transposable au cancer colorectal. En effet, les résultats préliminaires obtenus dans un modèle in vitro de tumeur 3D sont très prometteurs.

Procédures

Pour nos expériences, les animaux seront sous anesthésie générale (quelques minutes) pour l'injection des cellules de cancer colorectal. 7 jours après, les animaux seront traités tous les 3 jours (quelques secondes par animal) pendant 2 à 3 semaines. Le suivi longitudinal (imagerie 3D par microtomographie rayons X) des animaux se fera sous anesthésie (10 à 15 minutes) à raison de 2 à 3 fois au cours des 2 dernières semaines du projet.

Impact sur les animaux

Pas de nuisances ou critère prévisible de douleur dans la mesure ou les animaux seront sous anesthésie générale durant les manipulations puis euthanasiés en fin de protocole. Douleur potentielle modérée et passagère (piqure) à l'injection des molécules. Une surveillance quotidienne du développement des tumeurs permettra de s'assurer du bien-être des animaux (absence de gêne à la locomotion ou de signes visibles de souffrance). Les effets indésirables surveillés pourraient être : perte de poids, stress, perte mobilité.

Devenir

Pour chaque procédure, l’ensemble des animaux seront euthanasiés à la fin des expérimentations, afin de prélever et d'analyser les tumeurs.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans la continuité d’études réalisées in silico, in vitro et ex vivo. Les peptides testés ont fait l’objet d’une étude in silico afin de sélectionner les meilleurs candidats potentiels. Ces candidats ont ensuite été validés par des études in vitro (migration et invasion cellulaire, modèles 3D multicellulaires) et ex vivo (anneaux aortiques) et nous testerons dans ce projet les peptides ayant donnés les meilleures réponses. Ce projet vise donc à valider in vivo les effets observés. Aucune méthode de substitution n’existe actuellement pour mesurer les effets sur la croissance tumorale.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les peptides candidats ont été sélectionnés sur des modèles de sphéroïdes 3D. Ainsi seuls les peptides à fort potentiel seront testés. Ainsi l’étude considérée dans sa globalité est susceptible de concerner un nombre maximal de 80 souris mâles, réparties en 4 groupes et 2 procédures : 1 groupe contrôle, 3 groupes de test. Afin d’obtenir des résultats significativement robustes, un nombre maximal de 10 souris par groupe sera utilisé. L’analyse statistique se fera avec le test U de Mann-Whitney bidirectionnel.

Raffinement

Préalablement à la mise en place des expérimentations, les animaux seront hébergés dans des cages. L'eau et la nourriture seront mis à disposition ad libitum et la litière changée régulièrement. Afin de limiter le stress des animaux, les cages seront enrichies de divers équipements d'activité (tubes de jeu, niche, papier...). À leur arrivée dans l’animalerie et avant toute manipulation, les souris subiront une phase d’acclimatation aux conditions d’hébergement du laboratoire durant une période de 7 jours. Le suivi du protocole et de sa réalisation sera effectué par les responsables du projet en concertation avec la structure en charge du Bien-être animal et les animaux seront anesthésiés lors des procédures pouvant apporter un stress (jusqu'à l'euthanasie), de manière à n'induire aucune souffrance. Durant la phase d’anesthésie, si une détérioration irréversible de l'état de l'animal est observée (accélération anormale du rythme cardiaque ou suffocation ou hypothermie importante), alors l'animal sera immédiatement euthanasié.

Choix des espèces

Le modèle choisi est la souris. Il s’agit du modèle de référence pour l’étude de la croissance tumorale.

Douze semaines de régime enrichi en graisse jusqu'à l'obésité, puis six semaines de restriction calorique avec un gavage cinq fois par semaine : 168 souris suivent ce protocole de 18 semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont placées trois fois dans un tube de mesure de la composition corporelle, et mises à jeun six heures avant chacun des deux tests de tolérance au glucose, avec six gouttes de sang prélevées à la queue sur trois heures, à vif. Le porteur annonce une dyslipidémie, une hyperglycémie chronique et une intolérance au glucose comme effets attendus du régime, et un risque d'irritation de l'œsophage lié au gavage. À la dix-huitième semaine, toutes sont tuées pour prélever le tissu adipeux, le foie et le muscle.

Objectifs

L'obésité est un facteur de risque majeur pour le développement des maladies cardiovasculaires et du diabète. Différentes stratégies existent pour réduire le poids corporel (restriction calorique, chirurgie bariatrique ou traitements pharmacologiques) qui induisent à court terme une amélioration, mais qui ne perdurent généralement pas dans le temps, avec fréquemment un rebond pondéral avec retour des anomalies métaboliques, en particulier la dysfonction du tissu graisseux. Par exemple, les anomalies fonctionnelles du tissu adipeux comme la fibrose (définie par l'accumulation excessive de matrice de collagène dans le tissu gras), présente chez de nombreux patients en situation d'obésité ne sont pas résolues au cours de la perte de poids, et constituent un facteur important d'échec des interventions thérapeutiques de réduction pondérale. Cette situation peut être reproduite chez la souris rendue obèse par un régime riche en graisse, qui développe une fibrose du tissu adipeux comme les patients. Ce sont les cellules souches du tissu adipeux qui produisent l'excès de matrice extracellulaire. Notre objectif est de tester l'efficacité de stratégies visant ces cellules souches pour éviter leur transformation. Nous avons identifié deux traitements potentiels a administrer pendant la période de réduction pondérale, que nous souhaitons valider in vivo dans le modèle souris. Ces traitements se basent sur l'administration de 2 molécules déjà administrées chez l'homme dans d'autres contextes. Nous testerons si elles peuvent améliorer la réponse a la perte de poids lorsqu'elles sont administrées en combinaison à la restriction calorique chez des souris préalablement rendues obese par régime gras.

Bénéfices attendus

Ce protocole doit constituer une preuve de concept chez la souris de l'efficacité des traitements combinés avec la restriction calorique pour restaurer la santé métabolique, en utilisant des approches ciblant la fibrose du tissu graisseux. A terme ces experiences constitueront une indication de ces traitements vers une application en clinique humaine.

Procédures

Pendant 18 semaines, des changements de régime alimentaire seront effectués, avec mise sous régime enrichi en graisse (12 semaines) puis retour à un régime standard (pendant 6 semaines). La stabulation sera effectuée a thermoneutralité (30degrés Celsius) dans une enceinte a climat constant afin de limiter la dépense d'énergie liée au maintien de la température corporelle. Pendant 6 semaines a partir de la semaine 12 les animaux recevront un gavage avec les composes A ou B ou véhicule. Le gavage est réalisé sur animal vigile par simple contention a raison de 5 fois /semaine, et dure moins de 30 secondes. La nuisance est liée au risque d'inflammation de l'oesophage. Ni A ni B n'entrainent d'effet toxiques, ces composés sont approuvés et utilisés chez l'homme dans d'autres contextes. Le suivi métabolique longitudinal comprend des pesées hebdomadaires. Nous réaliserons des mesures non invasives de la composition corporelle à 3 temps : avant la mise sous régime, à la fin du régime gras, et à la fin de la période de traitement. Cette mesure implique de placer les animaux dans un petit tube et de placer l’animal dans l’appareil de mesure durant 2 minutes. Le test de tolérance au glucose est réalisé 2 fois a 12 et 18 semaines, comportant la mise a jeun pendant 6h suivie de prélèvements séquentiels de gouttes de sang a la queue (1 goutte x 6 pendant 180 minutes) sur animaux vigiles. Apres 18 semaines : prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse suivie immédiatement d'euthanasie pour prélèvement d'organes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus du projet sont ceux liés à l’induction de l’obésité et aux altérations métaboliques associées. En effet, la consommation d’un régime enrichi en lipides tel que celui utilisé ici, peut mener à une dyslipidémie, des altérations de la glycémie avec notamment une hyperglycémie chronique, une intolérance au glucose et une altération de la sensibilité à l’insuline, facteurs de risque cardiovasculaires chez la souris comme chez l'homme. Une fois l'obésité constituée nous initierons une période de restriction calorique pour induire une perte de poids, ce qui permet de reverser partiellement les troubles métaboliques. Cependant le gavage avec les composés a tester nessecite des manipulations de contention, et peut aussi induire des effets indesirables par irritation de l'oesophage. Pour l’évaluation métabolique des animaux, nous privilegions les procedures non invasives pour limiter le stress/douleur. Il est cependant necessaire de proceder au prélèvement de gouttes de sang a la queue pour le test de tolérance au glucose et les mesures de glycémie et de cétonémie, qui doivent etre réalisées sur animaux vigiles pour l'obtention de résultats valides. Les prélèvements sanguins peuvent générer un stress/douleur de courte durée.

Devenir

A la fin du protocole, tous les animaux sont euthanasiés en vue de prelever et d'etudier differents organes (tissu adipeux, foie, muscle etc). Les différents prélèvements sont nécessaires pour des analyses post-mortem et que cela implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux

Remplacement

Le tissu adipeux excerce une fonction de stockage de l'energie en exces et de production de molecules signalisatrices qui va être déterminée par le microenvironnement tissulaire complexe. Ainsi, il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle cellulaire in vitro qui puisse reproduire les fonctions de ce tissu in situ, en particulier sa flexibilité et les changenement ponderaux. L’évaluation de l’activité du tissu adipeux en réponse à des changements d'environnement métabolique et nutritionnels sont des processus biologiques et physiopathologiques complexes qui ne peuvent être explorés que par des approches expérimentales in vivo.

Réduction

Chaque animal (au total 168) sera exploité afin d’apporter le maximum d’information. Si possible, nous utiliserons les données de manière transversale entre les protocoles afin de réduire le nombre d’animaux. La taille des groupes expérimentaux a également été optimisée afin de répondre aux besoins de mettre en évidence des différences statistiques et pour prendre en compte les variations liées à la diversité de la réponse biologique. Lorsque cela est possible techniquement, sans affecter la qualité des données recueillies, les souris partageant un même groupe contrôle seront étudiés en même temps afin de réduire le nombre d’animaux. La taille des groupes expérimentaux a également été optimisée afin de répondre aux besoins de mettre en évidence des différences statistiques et pour prendre en compte les variations liées à la diversité de la réponse biologique. Le calcul de puissance indique que 12 souris par groupe est le nombre minimal permettant d’obtenir des résultats statistiquement fiables compte tenu de la variabilité interindividuelle des paramètres mesurés (poids,tolérance au glucose, tailles des adipocytes, contenu en collagène, analyse de cytométrie en flux).

Raffinement

Un suivi du poids des animaux sera effectué avant mise sous régime puis de manière hebdomadaire pendant les 12 semaines de régime riche en graisse. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (regroupés à 4 animaux par cage) et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. Les animaux seront maintenus à une temperature de 30 degrés Celsius qui correspond a la thermoneutralité pour les petits rongeurs (absence totale de stress thermique, réduction de la thermogénese). Nous utilisons une enceinte climatique homologuée permettant de contrôler la température, l'humidité et le niveau d'éclairage. De plus, le personnel expérimenté de l'animalerie veille au bien-être des animaux et l'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement pour vérifier le respect des points limites définis pour ce projet. De plus, un suivi hebdomadaire de prise alimentaire et du poids sera réalisé, ce qui permet, en plus des données expérimentales, de s’assurer du bon état de santé des animaux et de les habituer aux manipulations afin de reduire le stress potentiel lors des procédures ultérieures (tests de tolérance au glucose). Nous prendrons soin de faire exécuter toutes les manipulations des animaux (pesées, gavages) par des personnes expérimentées afin de réduire le stress au maximum. Nous avons également choisi un matériel et des procédures adéquats pour limiter la douleur, avec en particulier l’utilisation des sondes de gavage en plastique fines et souples. Un laps de temps de minimum 1 semaine entre les actes sera respecté afin de laisser un temps de récupération aux animaux.

Choix des espèces

La souris est un modèle pertinent car les mécanismes de régulation de la balance énergétique sont très proches de ceux a l'œuvre chez l'homme. En cas de surnutrition, les souris développent une obésité (accumulation de tissu adipeux) qui ressemble à la situation chez l'homme avec des troubles du métabolisme glucidique (diabète) et d’autres perturbations métaboliques. Il est à noter que les modèles murins ont généré des apports conceptuels dans le domaine de la régulation du poids corporel, avec la découverte de la leptine, hormone d'origine adipocytaire qui contrôle la prise alimentaire. Cette hormone a été découverte grâce a des mutations naturelles chez la souris (mutation ob). De plus en rapport avec le projet, les souris répondent a des restrictions caloriques par perte de poids, elles peuvent aussi, comme les patients atteints d'obésité, développer une fibrose du tissu adipeux, avec des conséquences deletaires sur leur santé. Nos études requièrent que les animaux soient sexuellement matures avec un métabolisme adulte. Les souris seront donc mises sous régime à partir de l’âge de 6-8 semaines, pour une étude de durée totale de 18 semaines.

L'atteinte d'un point limite déclenche les mesures inscrites sur une fiche d'observation, jusqu'à la mise à mort. 1 000 souris et 600 rats vont être utilisés, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des candidats médicaments par l'abdomen, la bouche, la peau, la veine ou le muscle, subissent des prélèvements de sang parfois sans anesthésie, puis une perfusion intracardiaque avant que leur cerveau soit prélevé pour enregistrer l'activité électrique de coupes cérébrales. Le porteur présente ces essais comme un moyen d'accélérer le développement de médicaments contre les maladies du cerveau, sans nommer les composés testés ni les pathologies visées, et prévoit d'utiliser des animaux de 3 à 95 semaines.

Objectifs

Les maladies du cerveau sont un fléau dans notre société. Le développement de nouveaux médicaments est un processus long et coûteux. Afin d’accélérer le développement de nouveaux médicaments, il est crucial de déterminer l’efficacité et la toxicité des candidats médicaments le plus tôt et le plus rapidement possible. Dans ce cadre, l’objectif de ce projet est de tester l'efficacité de candidats médicaments en développement sur l’activité électrique neuronale. Pour ce faire, des candidats médicaments seront administrés à des rongeurs (souris et rats) et leur effet sur l’activité électrique des cellules neuronales sera évalué par la technique d’électrophysiologie, sur coupes cérébrales.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l’effet de candidats médicaments sur la physiologie des cellules neuronales, dans le but de développer de nouvelles approches thérapeutiques chez l’Homme afin de traiter les pathologies cérébrales.

Procédures

Administrations : intrapéritonéale : 5 secondes, orale : 5 secondes, sous cutanée : 5 secondes, intraveineuse : 10 secondes, intramusculaire : 5 secondes Prélèvements sanguins : avec anesthésie légère par administration du mélange d’anesthésiques/analgésiques (10 secondes), anesthésie par inhalation (induction maximum 3 minutes) ou sans anesthésie, 5 secondes. Euthanasie : Administration du mélange d’anesthésiques/analgésiques (10 secondes), anesthésie par inhalation (induction maximum 3 minutes), perfusion intracardiaque d’un liquide physiologique (30 secondes), euthanasie pour prélévement du cerveau (3 secondes).

Impact sur les animaux

Les administrations et prélèvements peuvent induire un certain niveau de stress, et potentiellement une douleur modérée, qui seront limités par la maitrise des gestes techniques. Suite à l’administration des composés à tester, il se peut que des signes légers d’inconfort ou d’intolérance se manifestent (rougeur, gonflement...).

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés afin de réaliser les coupes cérébrales et procéder aux enregistrements de l’activité cérébrale sur ces coupes.

Remplacement

Les neurones et leur modulation peuvent être étudiés sur des coupes cérébrales de rongeurs par électrophysiologie. Ces approches expérimentales ne peuvent pas être remplacées par des méthodes substitutives type approche in sillico / in vitro ou culture cellulaire. L'étude de l'effet de composés en développement et une meilleure compréhension des pathologies du système nerveux central nécessitent donc l'administration de composés sur un organisme entier.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un programme adapté, (10 animaux par groupe / entre 2 et 10 groupes par étude et par espèce). Les résultats seront analysés par des tests statistiques. Nous adapterons les tests statistiques en fonction des observations.

Raffinement

Les animaux plus âgés pourront être placés individuellement pour éviter le risque de bagarre dès leur arrivée, suite à un retour d’expérience et conformément aux recommandations de l’éleveur. Ils resteront toujours en contact visuel et olfactif. Avant toute administration, une période d’acclimatation des animaux d’au moins 5 jours sera respectée. Un suivi quotidien des animaux sera effectué sans exception (Week-ends & jours fériés), les animaux seront pesés une fois par semaine dès la fin de la période d’acclimatation par les expérimentateurs pour suivre l’état de santé général. En particulier, ils seront observés après chaque geste technique (administration, prélèvement), afin de s’assurer de l’absence d’effet indésirable inattendu. En cas d’altération de l’état de l’animal, la surveillance sera rapprochée et il sera soigné selon les recommandations du vétérinaire et en accord avec le directeur d’étude. Ce suivi nous permettra de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. Les animaux seront évalués grâce à la fiche d’observation /points limites et l’atteinte d’un point limite entrainera les actions documentées dans cette fiche. Lors des prélèvements sanguins réalisés par du personnel compétent et qualifié, les animaux pourront être sous anesthésie générale. Une alternance ou rotation des sites d’injection peut être mise en place si les traitements sont sur plusieurs jours pour les différentes voies d’administrations. Afin de respecter le cycle adopté chez le fournisseur et pour des raisons d’études scientifiques, certaines études seront réalisées en cycle inversé jour / nuit pour que le rythme de l’animal soit le moins perturbé possible.

Choix des espèces

Nos expérimentations sont réalisées chez la souris et le rat, dont l’étude est extrêmement répandue au sein des laboratoires de recherche en Neurosciences, rendant les résultats pertinents pour la communauté scientifique nationale et internationale. Ces rongeurs, de petite taille et d’élevage facile, possèdent un système nerveux dont le développement est extrêmement proche de celui du système nerveux humain, et dont l’organisation, certes simplifiée, est suffisamment complexe. Ils constituent des modèles de choix pour l’étude des mécanismes du fonctionnement cérébral. Ils constituent des modèles de choix pour l’étude des mécanismes du fonctionnement cérébral. Les animaux seront utilisés de l'âge de 3 semaines à 95 semaines, afin de couvrir tous les âges, du jeune à l'adulte âgé.

Quinze minutes : une injection d'anesthésique dans l'abdomen, puis une chirurgie qui ne se termine pas par un réveil. 800 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées pour que leur cerveau soit prélevé, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet cartographie l'innervation de l'hypothalamus, centre de régulation du comportement alimentaire et social, en comparant des souris sans flore intestinale et des souris de souche classique à 14, 21 et 56 jours de vie. Le porteur annonce des lots de 10 souris par condition, ce qui laisse l'essentiel des 800 animaux sans justification chiffrée, et écrit par ailleurs que la procédure "n'induit pas de nuisances sur les animaux".

Objectifs

Le cerveau est divisé en différentes régions, noyaux et sous-noyaux produisant de nombreux neuropeptides avec son rôle propre dans le comportement de l’hôte. L’hypothalamus est le centre de régulation du comportement motivationnel : alimentaire, social. Il produit des neuropeptides et des récepteurs qui vont influencer le comportement motivationnel de l'hôte. Des mutations des gènes produisant ces neuropeptides ou récepteurs peuvent influencer ces comportements. L'objectif du projet est d'étudier l'innervation de l'hypothalamus par différentes populations neuronales impliquées dans le comportement motivationnel (comportement alimentaire, comportement social notamment), en conditions normale et pathologiques.

Bénéfices attendus

Une meilleure visualisation et l’établissement d’une cartographie des cellules nerveuses exprimant ces différents peptides et récepteurs permettra de mieux appréhender les mécanismes de communication neuronale, et ce chez différentes espèces ayant des métabolismes et comportements différents (sociaux, alimentaires). Une quantification des neurones positifs peut être faite pour comparer l’expression entre les souches. Une quantification de l’expression des peptides et récepteurs permettra de compléter ces datas et de comparer entre les souches l’expression des ARN messagers.

Procédures

Les animaux soumis à la procédure 1 recevront une injection intra-péritonéale d'anesthésique/analgésique, suivie d'une chirirgie terminale sous anesthésie générale. La procédure complète dure 15 minutes à compter de l'injection. cette procédure n'induit pas de nuisances sur les animaux.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à une douleur au niveau du site d'injection et a un éventuel stress dû à la contention nécessaire à la réalisation des injections. Cependant, les gestes étant réalisés par des personnes habilités et habitués à ces procédures, la durée et l'intensité de ces effets sera minime, 2 minutes maximum.

Devenir

Mise à mort pour prélèvements d'organes pour des études histologies

Remplacement

Les techniques de prélèvement du cerveau pour des etudes d'histologie et d'imagerie sont à ce jour irremplaçables pour observer les projections neuronales entre les différentes régions cérébrales. Ce sont des techniques classiques utilisées en neurosciences, tant pour observer l’expression génique que l’expression protéique. Des méthodes in vitro existent pour étudier la structure et le fonctionnement d'un organe en condition physiologique et pathologique. Nous pouvons notamment citer les techniques d'organes sur puce (organ on chip), qui sont tout à fait pertinentes pour étudier les effets de molécules / médicaments sur l'organe ainsi que réaliser des tests de toxicité sur le tissu. Cependant, dans le cadre de ce projet, nous souhaitons observer les différentes structures anatomiques (noyaux neuronaux) et l'architecture mise en place dans le cerveau pour relier les différents noyaux (fibres), ce qui n'est pas reproductible in vitro. De plus, nous souhaitons également voir l'impact du microbiote intestinal sur le développement du cerveau (souris axéniques vs souris C57Bl6), impliquant 2 organes, ce qui est actuellement pas reproductible in vitro.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux, des marquages multiples seront réalisés sur un même tissu. De plus, l’utilisation de ce type de modèles animaux permet de réduire le nombre de souris utilisées puisque le génotype est plus garanti que via des mutations spontanées. De mêle pour les études d'expression génique, plusieurs marqueurs peuvent être ciblés par tissu. Pour limiter le nombre d'animaux utilisés, les marquages seront analysés sur des lots de 10 souris par condition. Ces effectifs nous assureront d’obtenir des données statistiquement comparables. Nous allons quantifier le nombre de cellules positives par région, et comparer les différences entre les conditions (age et sexe). Nous évaluerons aussi la densité des fibres nerveuses positives, chaque noyau possédant plusieurs projections neuronales. Les 30 animaux par sexe correspondent donc à 10 souris à P14, 10 à P21 et 10 à P56.

Raffinement

Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. Les animaux seront maintenus à trois à cinq par cage pour éviter tout isolement social et leur environnement sera enrichi (présence de matériel pour construire un nid). Pendant toute la durée du séjour, les animaux seront suivis quotidiennement pour déceler tout signe de souffrance. Parmi ces signes, seront notamment relevés : perte de poids importante (20% du poids initial), posture « dos voûté », prostration, plaies, poil terne, vocalisations anormales, agressivité. Si l’un de ces signes ou combinaison de signes apparaît, le suivi de l’animal sera renforcé. Si l’état de l’animal s’aggrave dans les heures qui suivent ou ne s’améliore pas dans les 24h, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et une mise à mort sera réalisée. L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale). Bien que la mise au point de ces modèles animaux soit couteuse, cela permet d’éviter la souffrance des animaux induite par l’administration des toxines.

Choix des espèces

Seule l’utilisation d’un modèle mammifère entier, donc in vivo chez l’animal, peut nous permettre de comprendre de façon globale l’organisation des neuropeptides dans un tissu entier. La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coûts d’entretien réduits, fortes performances reproductives. De plus, la souris est un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques liées à la prise alimentaire, le comportement social, permettant ainsi une comparaison aisée de nos données avec celles d’autres équipes. Nous étudierons les animaux avant le sevrage (P14) ainsi qu’au sevrage à P21 et à l'age adule P56, afin d’observer le processus de développement chez les jeunes animaux et comparer les circuits hypothalamiques qui se développement principalement après le sevrage.

Pour mesurer l'hypersensibilité viscérale liée au stress et chercher des cibles contre les douleurs de l'intestin irritable, 1 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit trois distensions colorectales d'une heure dix étalées sur une semaine, des administrations de molécules ou de bactéries par l'abdomen, le colon ou la bouche, et un prélèvement de sang hebdomadaire à la joue. Le porteur décrit une possible perforation du colon, repérée à la présence de sang sur le ballonnet ou à l'anus. Les souris atteignant un point limite sont mises à mort, et le recours à l'animal est justifié par une douleur induite par le stress présentée comme une réaction de l'"organisme entier" impossible à reproduire in vitro.

Objectifs

La douleur viscérale chronique atteignant le tractus intestinal est communément retrouvée chez les patients atteints de syndrome de l’intestin irritable. Comprendre les mécanismes de régulation de la nociception (douleur) est indispensable au développement de nouvelles cibles thérapeutiques pour soulager la douleur nociceptive. A ce jour, il a été mis en évidence le rôle de médiateurs présents au niveau du tissu intestinal modulant l’hyperexcitabilité des entéro-neurones et responsables de douleur nociceptive. Comprendre comment ces médiateurs sont modulés au niveau de la barrière intestinale est essentiel pour palier l’hypersensibilité viscérale. Le stress est un facteur important prédisposant à une hypersensibilité viscérale, incluant chez les patients atteints de syndrome de l’intestin irritable. Notre projet vise (1) à évaluer l’effet du stress sur la production et l’activation de médiateurs d'intérêt au niveau de l’intestin et de leur contribution au développement d’une hypersensibilité viscérale ; et (2) à moduler leur activité par l’utilisation de molécules pharmacologiques ainsi que de l’utilisation de modèles murins génétiquement modifiés afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour la douleur viscérale.

Bénéfices attendus

Les méthodes alternatives permettant l’évaluation de la sensibilité viscérale de l'animal sont peu représentatives de la pathologie humaine. De plus, l'implication du stress entrainant une augmentation de la douleur est une réaction intégrée de l'organisme entier impossible a reproduire in vitro en intégralité. De plus, ce projet permettra de mieux comprendre la régulation de l’équilibre protéolytique intestinal et de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour les douleurs viscérales.

Procédures

- distension colorectale 3 fois par souris étalée sur 1 semaine (la distension colorectale dure 1h10) - Administration intrapéritonéale (i.p), intracolique (i.c) ou per os (p.o) de molécules d’intérêts ou bactéries -prélèvement de sang à la veine mandibulaire 1 fois par semaine sous anesthésie gazeuse

Impact sur les animaux

Le modèle de stress n'induit pas de douleur spontanée mais une hypersensibilité viscérale lors de la distension colorectale. La motilité et la perméabilité intestinales peuvent être modifiées dès 15 min après un stress aigu par administration d’hormone, mais elles sont toutes deux restaurées entre 1h à 2h suivant l’injection. La distension colorectale ne cause pas de dommages tissulaires et donc peut être reproduite sur les animaux au cours du temps. Cependant, un effet indésirable suite à la distension peut être une perforation du colon mis en évidence par la présence de sang sur le ballonnet et/ou au niveau anal. Si une présence de sang est décelée en fin de distension, les animaux sont surveillés dans les heures qui suivent ainsi que le lendemain pour vérifier une éventuelle perforation du colon.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de chaque procédure car des prélèvements de tissus et d'organes doivent être réalisés

Remplacement

Les méthodes alternatives, permettant une évaluation du statut douloureux de l'animal sont peu représentatives de la pathologie humaine. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour les douleurs viscérales. De plus, la douleur induite par le stress est une des réaction intégrée de l'organisme entier impossibles à reproduire in vitro dans son intégralité.

Réduction

Tout au long du projet, les animaux seront suivis régulièrement au cours du temps (au minimum 1 fois par semaine) par des techniques non invasives comme le suivi du poids, la consistance des fèces et la présence de sang dans les fèces évaluée par le test Hémoccult II® et de de façon plus spécifique par l'observation grâce à un endoscope pour la tumorigenèse. L’utilisation de ces techniques non-invasives permet d’observer au cours du temps un seul animal, là où l’information devait être obtenue par euthanasie et autopsie de multiples individus à chaque stade d’une seule étude, permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux.

Raffinement

Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, un enrichissement sera rajouté aux animaux. A savoir, dans un premier temps, des carrés de coton pur ou du papier absorbant permettant aux animaux de faire une nidation. Selon la durée de l’étude, un deuxième enrichissement pourra être introduit dans l’environnement, tel que des aspen Brick, des tunnels en polycarbonate ou des igloos. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé quotidiennement. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. De plus, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et de l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. L’apprentissage et la maitrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences des personnes concernées.

Choix des espèces

La souris présente des caractéristiques physiopathologiques proches de l'espèce humaine. Nous disposons également de souris déficientes pour l'expression de certains gènes cibles que nous utiliserons dans ce projet. Les souris seront âgées d'au moins 8 semaines car nous souhaitons utiliser des animaux adultes et matures et pesant minimum 20g.