Recherche fondamentale

Immunodéficientes puis greffées avec des cellules souches de sang de cordon humain, 480 souris femelles portent un système immunitaire humain reconstitué, ce qui les expose à une maladie du greffon contre l'hôte, à des pertes de poids et à des plaies cutanées. Toutes seront tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rasées sur le flanc, elles reçoivent une greffe de tumeur mammaire humaine sous la peau, deux injections dans l'abdomen par semaine et deux mesures de la tumeur au pied à coulisse, sans anesthésie. Le porteur écarte les analgésiques, susceptibles selon lui d'interférer avec les résultats, et prévoit la mise à mort 35 jours après la greffe, ou plus tôt si un point limite est atteint, pour analyses cellulaires et moléculaires.

Objectifs

Le cancer est la seconde cause de mortalité en France après les maladies cardio-vasculaires. Le cancer du sein est la première cause de décès par cancer chez la femme. Malgré d'importants progrès, il reste encore de nombreux traitements à tester, en particulier dans le champs des immunothérapies. Dans le cadre général de notre projet d'immunothérapie du cancer, nous cherchons à valider des anticorps thérapeutiques dans un modèle de cancer du sein implanté par la voie sous cutanée chez la souris humanisée. Les souris humanisées sont des souris immunodéficientes reconstituées avec un système immunitaire humain après transfert de cellules souches de sang de cordon ombilical. Avec ce protocole, les souris régénerent un système immunitaire humain complet et fonctionnel quelques semaines après la greffe. Les objectifs du projet sont donc d'évaluer l'effet thérapeutique de différents anticorps sur la croissance de la lignée tumorale en l'absence ou en présence d'un système immunitaire humain. Le choix de la lignée de souris utilisée dans chaque expérience dépend de la cible de la thérapie, ces lignées de souris présentant des caractéristiques de reconstitution immunitaire particulières. La comparaison de la croissance des tumeurs avec ou sans traitement dans des souris humanisées ou non va nous renseigner sur l'efficacité des anticorps à aider le système immunitaire à contrôler la croissance de la tumeur. Ces informations pourraient être importantes pour développer de nouveaux traitements pour le cancer du sein.

Bénéfices attendus

La comparaison des croissances tumorales dans différents groupes de souris traitées nous renseignera sur la qualité de la réponse immunitaire contre le cancer du sein dans un modèle proche de la physiologie humaine donc plus pertinent que les études in vitro ou des études dans des modèles purement murin. Nous testerons des combinaisons thérapeutiques originales de médicaments destinés à la clinique humaine, susceptibles d'être transposées chez l'homme. Les bénéfices potentiels du projet sont donc nombreux, justifiant le recours à l'expérimentation animale.

Procédures

Les animaux humanisés vigiles sont prélevés à la veine mandibulaire une semaine après leur arrivée pour mesurer la qualité de la reconstitution en cellules humaines. Ce geste dure deux minutes par souris. Les animaux vigiles sont rasés sur le flanc droit avec une tondeuse dédiée puis greffés avec une lignée tumorale humaine par injection sous cutané avec une aiguille adaptée. Ce geste dure cinq minutes par souris. Les animaux sont traités deux fois par semaine avec les médicaments à tester avec une injection dans le péritoine avec une aiguille adaptée et pesées simultanément, avec contention appropriée. La taille de la tumeur est mesurée deux fois par semaine avec un pied à coulisses, sans anesthésie, avec contention appropriée. Les animaux sont euthanasiés pour analyses complémentaires soit à la fin de l'expérience (35 jours après la greffe de la tumeur), soit si un point limite est atteint.

Impact sur les animaux

Les animaux vigiles sont injectés par la voie sous cutanée. La croissance des tumeurs sous la peau pourrait conduire à une gêne dans les déplacements, des infections des plaies pouvant conduire à des nécroses, ou encore des douleurs. L'immunodéficience des animaux pourraient conduire à leur infection par des agents opportunistes, conduisant à des atteintes oculaires ou pulmonaires. Le prélèvement sanguin pourrait conduire à une hémorragie incontrôlée. Les injections répétées des traitements par la voie intra péritonéale pourraient conduire à des douleurs locales ou à des infections opportunistes. L'humanisation des souris immunodéficientes pourraient induire une maladie du greffon contre l'hôte, entrainant une perte de poids et/ou des plaies cutanées et/ou une diarrhée.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure par une méthode réglementaire pour analyses cellulaires et moléculaires complémentaires, si ils ont atteint un des points limites définis ou si la durée de la croissance de la tumeur dépasse 35 jours.

Remplacement

Ce projet repose sur la mesure chez la souris des croissances tumorales d'une lignée de cancer du sein humain dans différentes conditions expérimentales et en présence d'un système immunitaire humain. Dans ce cas précis de recherches pré cliniques visant à évaluer l'efficacité de traitements expérimentaux, il n'est pas possible de remplacer l'expérimentation animale par des expériences in vitro, incapables de reproduire la complexité physiologique de la réponse immunitaire dirigée contre la tumeur. De plus, seul le modèle des souris humanisées permet de répondre aux questions du projet et d'obtenir des résultats potentiellement transposables à la clinique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans le projet (480) est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Le groupe contrôle recoit les véhicules des deux molécules testées en combinaison. La taille des effectifs a été fixée à 6 animaux / groupe pour détecter une différence de 20 pour cent dans la croissance tumorale avec une puissance de 80 pour cent. Du fait de la variabilité de croissance tumorale entre souris, nous répéterons l’expérience pour chaque condition testée. Les groupes expérimentaux tests et contrôles seront réalisés simultanément, réduisant le nombre d'animaux nécessaires. Chaque souris sera inclus dans un protocole d'analyse complet, allant de la mesure de la croissance tumorale aux analyses cellulaires et moléculaires subséquentes.

Raffinement

L’état général des animaux sera suivi quotidiennement par les membres de l'équipe et/ou par le personnel qualifié de l'animalerie. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en oeuvre (euthanasie ou arrêt du protocole). Il n'est pas prévu d'utiliser des analgésiques, ceux ci pouvant interférer avec les résultats de l'étude. Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Le milieu sera enrichi avec du papier et une maison pour permettre aux souris de faire un nid. Les animaux sont regroupés de façon à éviter les combats et permettre l'installation d'une hiérarchie stable et non conflictuelle. Les animaux reçoivent nourriture et eau en quantité non limité. Des points limites basés sur différents critères extérieurs (poids, comportement, aspect général,...) ont été établis.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes humanisées représentent le seul modèle d'une réponse immunitaire humaine contre une tumeur humaine in vivo. A ce titre, elles représentent le seul modèle vivant dans lequel des drogues à destination d'un usage clinique peuvent être testées. Il devient ainsi possible d'apprécier l'efficacité de telle ou telle drogue sur la réponse immunitaire contre la tumeur. Cette hypothèse est développé depuis de nombreuses années par l'équipe et le modèle nous a permis de proposer une nouvelle stratégie de traitement pour le cancer du sein. Le présent projet vise à utiliser les souris humanisées pour développer 5 nouveaux traitements contre le cancer du sein. Les souris humanisées sont livrées par le fournisseur entre 15 et 18 semaines d'âge. Ce temps est nécessaire pour le développement complet des lymphocytes T humains chez la souris à partir des progéniteurs humains greffés dans les souris à l'âge de 3 semaines environ. Les animaux non humanisés sont livrés à l'âge de 6 à 10 semaines. Seules des souris femelles sont utilisées dans ce projet.

Des souriceaux de 7 à 10 jours ont l'extrémité de la queue coupée sur moins de 2 mm, à vif, pour être génotypés. D'autres, nouveau-nés, sont endormis par hypothermie dans la glace avant un geste chirurgical sans réveil. 11 712 souris vont être utilisées au total, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour comprendre comment trois gènes provoquent les mouvements miroirs congénitaux, une maladie humaine rare sans traitement. Le porteur chiffre à dix le nombre d'animaux par génotype, sans préciser en quoi consiste le geste chirurgical pratiqué sur les nouveau-nés.

Objectifs

Le syndrome des mouvements miroirs congénitaux (MMC) induit chez le sujet un mouvement incontrôlé d'une main qui mime le mouvement volontaire réalisé par la main opposée. Les personnes présentant des mouvements miroirs ne sont pas capables d'effectuer des tâches motrices unimanuelles pures, comme écrire et ont des difficultés pour les tâches bimanuelles nécessitant un contrôle indépendant des deux mains, comme ouvrir un pot de confiture. Il s'agit d'une maladie génétique rare dans laquelle les mouvements miroirs sont la seule manifestation clinique. Trois gènes sont connus à ce jour pour être impliqués dans cette maladie mais leur rôle n'est pas clairement identifié. L’objectif de ce projet sera d'identifier le mécanisme par lequel ils influent sur l'apparition de cette pathologie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra des avancées importantes dans la compréhension des mécanismes de mise en place des axones des neurones impliqués dans le contrôle des mouvements volontaires et des fonctions dans le système nerveux central d’une protéine impliquée dans la réparation de l’ADN (constituant principal des chromosomes). A plus long terme et au-delà des connaissances fondamentales sur le développement du système permettant la réalisation des mouvements volontaires, nous espérons clarifier la pathogenèse des Mouvements en Miroir Congénitaux (MMC) et proposer de nouvelles hypothèses de travail pour la recherche clinique dans le champ des maladies du mouvement. En effet, l'étude de modèles animaux et cellulaires reproduisant les défauts génétiques impliqués dans les MMC clarifiera la pathogenèse de ce trouble. Cela est important car il n'existe actuellement aucun traitement, et certains patients ont une incapacité significative dans les activités de la vie quotidienne, des douleurs aux membres supérieurs, une inhibition psychosociale et une perte d'estime de soi en raison de la maladie. Enfin, l’étude des mutations détectées chez les patients atteints de MMC de la protéine connue pour son rôle dans la réparation de l’ADN pourrait également intéresser le domaine de la réparation de l'ADN et du cancer.

Procédures

Un prélèvement de moins de 2mm de l’extrémité de la queue sera réalisé sur animaux vigiles entre leur 7ème et leur 10ème jour de vie postnatale pour identification génique. Ce geste sera réalisé une seule fois et n’excèdera pas 2 minutes par animal. Certains animaux de ce projet présentent une ataxie (altération de la coordination des mouvements), ils seront euthanasiés dès l'apparition des signes. Les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire. Les nouveau-nés recevront un antalgique avant d’être profondément endormis par hypothermie dans la glace et d’être soumis à un geste chirurgical sans réveil (durée moins de 2 minutes). Ils ne seront pas en contact direct de la glace. Certains mâles seront isolés entre deux accouplements (4 mois maximum, isolement intermittent avec mise en accouplement 1 fois par semaine au moment de la génération des petits), cela pourra générer un stress.

Impact sur les animaux

Lors de la génération des animaux expérimentaux, l’isolement des mâles pour la réalisation des accouplements contrôlés pourra générer un stress. Le prélèvement de l’extrémité de la queue, pour connaitre le patrimoine génétique des animaux, peut générer une légère et brève douleur. Certains animaux de ce projet présentent une ataxie (altération de la coordination des mouvements). Ils ont ainsi des difficultés à maintenir leur posture et à se déplacer, ce qui peut générer un stress. Ils seront euthanasiés dès l’apparition des signes. L’anesthésie par le froid même sous analgésie pourra générer un stress. Toutes les contentions des animaux lors des manipulations engendreront un stress pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet soit parce que ce sont : i) des animaux non porteurs des génotypes d’intérêt pour notre étude, des reproducteurs qui atteindront un âge avancé (12 mois) et ne pourront donc plus être des reproducteurs, iii) des animaux expérimentaux pour l’analyse de leur cerveau.

Remplacement

Les neurones impliqués dans ce syndrome et qui contrôlent les mouvements volontaires ont leur corps cellulaire dans le cortex et leur axone va jusque dans la moelle épinière. Pendant le développement, ces axones traversent de nombreuses régions du cerveau. Il n’est pas possible d’étudier un faisceau qui traverse d’aussi nombreuses régions dans des modèles de culture cellulaire. Une fois les acteurs déterminés, nous étudierons les mécanismes moléculaires à l’aide de modèles de cultures cellulaires pour limiter le nombre d’animaux utilisés.

Réduction

Le nombre total d’animaux du projet sera de 11712. Pour le maintien de lignées et l’expérimentation, nous avons adapté les croisements en fonction de la complexité des lignées et des objectifs pour générer le moins d’animaux possible. Dès le nombre d’animaux reproducteurs ou expérimentaux atteint, nous arrêterons de générer de nouveaux animaux. Pour la partie expérimentale, des expériences préliminaires ont permis d’estimer à 10 le nombre d’animaux par génotype (calcul de puissance) pour obtenir des résultats statistiquement concluants. Nous optimisons ainsi la composition des groupes d'animaux en restreignant leur effectif tout en garantissant l'obtention de résultats statistiquement concluants. Par exemple dès que nous aurons obtenus le nombre de 10 petits par génotype et par âge, nous ne générerons plus d’animaux pour la partie expérimentale. Nous avons calculé un nombre théorique d’animaux pour le rafraîchissement en suivant les bonnes pratiques en élevage. Les souris d’une même lignée sont comme une grande famille avec des caractéristiques spécifiques héritées. Si une mutation génétique survient dans cette famille, elle peut devenir plus importante à cause des croisements entre membres de cette famille. Pour éviter cela, nous ajoutons de nouveaux membres à la famille avec un patrimoine génétique connu. Pour chaque croisement, le calcul du nombre de petits à générer a été optimisé.

Raffinement

Les animaux seront hébergés sous la surveillance de zootechniciens et du vétérinaire désigné. L’hébergement des animaux sera réalisé conformément à la directive européenne 2010/63/UE en termes d’espace et d’environnement, à savoir pas plus de 5 souris adultes par cage, la température et l’hygrométrie sont contrôlées journellement, les souris seront soumises à un cycle lumière- obscurité de 12h avec transitions progressives avec un accès libre à la nourriture et à l’eau. Pour l’enrichissement, du matériel pour réaliser un nid végétal sera placé dans la cage ainsi que du matériel à ronger (bâtonnet en bois). Pour les accouplements, une maisonnette est ajoutée. Les souris seront observées quotidiennement. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Dans le cadre des mâles isolés des maisonnettes voire du kraft seront ajoutés comme enrichissement complémentaire. Les 2 manipulations pour l’identification et le prélèvement de l’extrémité de la queue des animaux sont réalisées au même moment pour limiter le nombre de manipulations des souriceaux. Elles seront sont réalisés par des personnes compétentes dans un endroit calme et dédié. Les souriceaux des portées de la lignée présentant un phénotype dommageable seront surveillés plus spécifiquement au moment de la mise en place de la locomotion. En effet, certains petits de cette souche mutante peuvent présenter un problème de coordination de leur mouvement qui les empêchent de se déplacer correctement. Les petits présentant ce signe clinique seront systématiquement euthanasiés. Les souriceaux endormis par le froid ne seront pas en contact direct avec la glace, ils seront dans un gant nitrile et recevront au préalable une injection d’analgésique. Pour assurer la reproductibilité et la validité de nos études, nous rafraîchirons régulièrement le patrimoine génétique de nos lignées afin de les garder aussi génétiquement similaire que possible aux lignées contrôles.

Choix des espèces

Les souris sont des rongeurs, et comme les écureuils, elles utilisent leurs deux pattes avant pour effectuer des tâches complexes, comme manipuler de la nourriture. Les neurones qui contrôlent les mouvements volontaires fins chez les souris sont similaires à ceux que nous avons chez les humains. L’étude de ces neurones chez la souris représente un bon modèle pour mieux comprendre le syndrome des mouvements en miroir. Chez les souris, nous pouvons créer des modèles génétiques spéciaux qui nous permettent de comprendre comment certains gènes influencent certaines parties de leur cerveau. Ces modèles sont utiles car ils nous aident à éviter des mutations génétiques trop graves, tout en nous permettant d'analyser précisément comment un gène particulier fonctionne dans une région spécifique du cerveau. Dans cette étude, des souris femelles ou mâles seront étudiées à 3 stades. Pendant la période embryonnaire, moment où les premiers axones du faisceau que nous étudions traversent des régions importantes du cerveau pour leur développement. A la naissance l’âge où ces premiers axones traversent la ligne médiane et arrivent dans la moelle épinière. A l’âge adulte entre 3-4 mois. Les animaux reproducteurs auront entre 3 et 12 mois (maximum).

980 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de parasites du paludisme, puis un médicament dans l'eau de boisson ou par voie orale, et une goutte de sang prélevée à la queue tous les un à deux jours pendant sept à vingt-et-un jours. Un groupe est anesthésié puis exposé quarante-cinq minutes aux piqûres de moustiques, sans réveil. L'affaiblissement et l'anémie liés à l'infection figurent parmi les contraintes annoncées, et le porteur affirme qu'aucun système de culture continue de Plasmodium berghei ne permet de remplacer la souris pour les manipulations génétiques du parasite.

Objectifs

L'objectif du projet est de caractériser les mécanismes d'infection par Plasmodium, l'agent du paludisme, à l'aide d'un modèle murin d’infection par Plasmodium berghei. Ce parasite peut être étudié à tous les stades du cycle parasitaire, notamment après infection de moustiques Anopheles à partir de souris infectées. Le modèle d’infection de la souris par P. berghei reproduit de nombreux aspects de la biologie des espèces de Plasmodium infectant l'homme, et permet d’étudier le rôle de facteurs parasitaires au cours de l’infection, notamment à l’aide de parasites génétiquement modifiés. Le projet vise à caractériser la fonction de protéines candidates à différents stades du cycle parasitaire.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d'améliorer notre connaissance des mécanismes fondamentaux d'infection par Plasmodium, en identifiant des protéines essentielles à différents stades du cycle parasitaire. Les résultats pourraient permettre d'identifier de potentielles cibles pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le paludisme.

Procédures

Un premier groupe d’animaux sera soumis successivement à une injection intraveineuse de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), une administration de médicament dans l'eau de boisson (durée 7 à 10 jours, sur animaux vigiles), un prélèvement d'une goutte de sang à la queue ( tous les 1 à 2 jours pendant 7 à 10 jours, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), une anesthésie gazeuse (acte unique, durée 10 minutes) suivie d’un prélèvement de sang par ponction terminale (acte unique, durée 10 minutes, sur animaux anesthésiés). Un deuxième groupe d’animaux sera soumis successivement à une injection intrapéritonéale de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), une administration orale de médicament (prise unique, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), un prélèvement d'une goutte de sang à la queue ( tous les 1 à 2 jours pendant 7 à 21 jours, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles). Un troisième groupe d’animaux sera soumis successivement à une injection intrapéritonéale de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), un prélèvement d'une goutte de sang à la queue ( tous les 1 à 2 jours pendant 4 à 5 jours, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), une administration orale de médicament (prise unique, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), une injection intrapéritonéale d'anesthésiants (1 injection, durée 10 secondes) suivie de l’exposition d'animaux anesthésiés à des piqûres de moustiques (pendant 45 minutes, sans réveil a posteriori). Un quatrième groupe d’animaux sera soumis successivement à une injection intrapéritonéale de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), un prélèvement d'une goutte de sang à la queue ( tous les 1 à 2 jours pendant 5 à 8 jours, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), une anesthésie gazeuse (acte unique, durée 10 minutes) suivie d’un prélèvement de sang par ponction terminale (acte unique, durée 10 minutes, sur animaux anesthésiés).

Impact sur les animaux

Stress lié à la contention, douleur de courte durée lors des injections intrapéritonéales ou intraveineuses sur animaux vigiles, stress ou douleur de courte durée lors de l'administration orale de médicament sur animaux vigiles, douleur de courte durée lors des prélèvements sur animaux vigiles, risques associés à l'anesthésie (hypothermie, détresse respiratoire), contraintes liées à l'infection elle-même (affaiblissement, anémie).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures par des méthodes réglementaires, soit parce que des prélèvements sont nécessaires pour des analyses post-mortem, soit pour éviter d'atteindre des points limites chez les animaux infectés.

Remplacement

Le projet vise à caractériser dans un modèle murin la fonction de protéines du parasite Plasmodium, l'agent du paludisme, à l'aide d'approches génétiques. Il n'existe pas à l'heure actuelle de système de culture continue de Plasmodium berghei in vitro permettant le remplacement du modèle murin pour les manipulations génétiques du parasite et pour les études fonctionnelles (étude de la croissance parasitaire dans le sang et transmission aux moustiques). Par contre, nous utiliserons des systèmes de cultures cellulaires (lignées hépatocytaires) pour l'analyse de l'infection des cellules du foie par les parasites mutants (obtenus à partir de moustiques infectés).

Réduction

Au total ce projet utilisera 980 souris sur une durée de 5 ans. Ce nombre a été réduit au minimum pour permettre de réaliser les prélèvements nécessaires aux études fonctionnelles. La taille des effectifs a été établie à l'aide d'un calcul de puissance pour permettre de détecter un effet significatif par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Afin de contribuer au raffinement des procédures, les animaux sont hébergés avec leurs congénères dans un milieu enrichi (lanières de papier Kraft ou équivalent). Les conditions environnementales des locaux d’hébergement sont réglementaires. Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée avant le début des expérimentations. Une période d'habituation sera également respectée dans l'appareil de contention avant les injections intraveineuses sur animaux vigiles, afin de réduire le stress. Certaines procédures sont réalisées sous anesthésie et analgésie pour prévenir la douleur. La présence de points limites définis permettra d'éviter la souffrance liée aux complications de l'infection par Plasmodium berghei. Afin de faciliter l’alimentation et l'hydratation chez les animaux infectés par Plasmodium, la nourriture pourra être donnée sous forme de bouillie ou de gel directement dans la cage. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent, pour vérifier l’apparence et l’état clinique des animaux, la prise alimentaire et hydrique ainsi que leur comportement, afin de détecter toute modification suggérant une douleur, une souffrance ou une détresse.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal permettant des études fonctionnelles chez Plasmodium berghei, un parasite qui reproduit de multiples aspects de l'infection par les parasites infectant l'homme. Ce modèle est en particulier pertinent pour étudier la fonction de protéines essentielles du parasites lors de l'infection in vivo, dans le but d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans ce projet, nous utiliserons des souris adultes, âgées de 6 à 10 semaines au début des procédures, conformément aux protocoles classiques utilisés dans ce type d'étude.

95 brebis de sept à dix ans vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune passant de deux à quatre heures sous imagerie avant une heure d'opération. L'ovariectomie par laparotomie sur une dizaine de centimètres leur crée un état de ménopause, puis un stimulateur cardiaque implanté sous le muscle du cou pendant deux heures déclenche une fibrillation auriculaire, les procédures d'imagerie invasive et non invasive étant répétées chaque mois pendant six mois sous anesthésie générale. Le porteur signale une hernie possible après la laparotomie et des cicatrisations prolongées autour des implants, et affirme que la fibrillation reste asymptomatique, les brebis saines et celles en fibrillation étant selon lui indiscernables. Toutes sont tuées pour que le remodelage cardiaque soit caractérisé à l'échelle des tissus, des cellules et de la biochimie.

Objectifs

De plus en plus d’études montrent que la fibrillation auriculaire (FA) diffère entre les femmes et les hommes. Les femmes sont plus âgées au moment de l'apparition de la FA et la prise en charge est plus complexe et moins efficace. Parmi les rares études disponibles, nous observons qu’ un âge ménopausique plus jeune et un traitement hormonal limité ont été associés à un risque accru de FA et de maladies corrélées. Peu d'attention scientifique a été accordée aux différences entre les femmes et les hommes, d'où un manque de connaissances et de sensibilisation dans la communauté des chercheurs et dans le public. Par conséquent, afin d'améliorer le diagnostic et la thérapeutique de la maladie, nous devons mieux comprendre comment le rôle des hormones sexuelles influence le développement, la progression et le traitement de la FA. L'objectif de ce projet est la validation et caractérisation d’un modèle ovin de femelle ménopausée et son impact sur le remodelage atrial au cours de la fibrillation auriculaire

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de créer un modèle d’ovin pour mieux comprendre le rôle des hormones sexuelles dans la progression des maladies cardiaques, notamment de la FA. Les résultats de ce projet nous aideront à identifier les mécanismes spécifiques favorisants cette arythmie, et ils nous fourniront une base pour mieux prendre en charge les soins des patients atteints ou a risque de développer la FA à cause de leur sexe.

Procédures

Dans ce projet, 95 animaux seront traités. Ces animaux subiront des analyses d’imagerie (120-240 mins), suivies par une procédure chirurgicale pour l’induction de la ménopause par ovariectomie (60 mins). Ensuite, ils recevront un stimulateur cardiaque pour le déclanchement de la FA (120 mins). Au long de leur suivi de maximum 6 mois, nous répèterons, avec une cadence mensuelle, les procédures d’imagerie non-invasive et invasive. Des prélèvements de fluides biologiques auront lieu mensuellement afin d’étudier les changements hormonaux et le bila métabolique. Toutes ces procédures seront effectuées sous anesthésie générale et monitorage des paramètres vitaux.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables éventuels peuvent être liés aux anesthésies (hypothermie) réalisées aux différentes procédures, notamment lors du réveil de l'animal (désorientation, apathie). L’ovariectomie par laparotomie médiale sur la ligne blanche d’une dizaine de centimètres pourrait éventuellement provoquer une hernie. Pour éviter ce type de complications, des points séparés et rapprochés seront réalisés afin d’éviter les tensions. Des effets indésirables attendus sont liés à l’implantation des équipements électroniques localisés en sous-musculaire dans la zone du cou pour induire et enregistrer la progression de la FA mais ils sont maîtrisés et correspondent à des phases de cicatrisation prolongées. L’induction de la FA chez la brebis peut provoquer une fréquence ventriculaire cardiaque irrégulière mais à noter que l’installation de la FA est asymptomatique chez la brebis ainsi les brebis saines et en FA sont indiscernable au niveau du comportement et de l’aspect physique.

Devenir

Tous les animaux impliqués dans ce projet seront mis à mort afin de caractériser à l’échelle tissulaire, cellulaire et biochimique les effets du remodelage cardiaque obtenu par la ménopause et/ou l’induction de fa fibrillation atriale. Ces données sont fondamentales pour prouver si et comment les hormones sexuelles jouent un rôle de protection contre la fibrillation atriale, et finalement envisager des thérapies ciblées et appropriée aux spécificités de la population féminine des patients.

Remplacement

Pour répondre aux questions d’ordre clinique, des modèles animaux de pathologies humaines et des tissus animaux sont nécessaires. Le remplacement des animaux n’est actuellement pas possible pour cette étude. En effet, les mécanismes physiologiques sont complexes dans leur globalité et nécessitent d’avoir recours à un modèle animal. S’y ajoute, qu’il n'existe pas à ce jour de modèles numériques ou même cellulaires pour répondre aux objectifs.

Réduction

Pour la première phase, nous avons estime une taille de 20 animaux en total, divisée entre un groupe ménopause et groupe ménopause + remplacement hormonale. Cela nous permettra d’avoir un nombre de 10 par groupe suffisant pour les observations des changements des niveaux hormonaux et ceux de type anatomique et électrophysiologique plus évidents. Pour la deuxième phase, nous avons fixé un nombre de 75 animaux max au long des 5 ans. Il s’agit du nombre minimal d’animaux nécessaire en se basant sur notre expérience antérieure dans l’utilisation d’autres modèles au cours de divers projets menés jusqu’à présent. Pour les deux phases, une attention sera portée à la réduction du nombre de ces animaux en recalculant le nombre statistiquement relevant après les premiers 5 et 10 animaux par groupe. Dans cet objectif de réduction, nous ferons également en sorte que chaque animal soit son propre contrôle dès que cela sera possible. Cela nous aidera dans le but d’obtenir des résultats plus robustes en utilisant moins d’animaux.

Raffinement

Le raffinement du projet et le respect du bien-être animal reposent sur plusieurs mesures, d’une part lors de l’hébergement dans des locaux agréés, les animaux bénéficient de soins quotidiens dispensés par du personnel compétent et soucieux du bien-être animal. Les animaux sont habitués au personnel animalier afin de limiter tout stress. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux ce qui leur permet d’exprimer des comportements naturels et ils disposent d’enrichissements adaptés (i.e. foin, pierre à sel, etc.). Afin de minimiser les risques amenés par la chirurgie, nous les habituerons à porter des gilets médicaux. D’autre part, lors de l’intervention chirurgicale et implantation de dispositifs de stimulation, la procédure est réalisée sous anesthésie générale (mise en œuvre et surveillance par du personnel dédié) et une analgésie adaptée est mise en place. Des critères d’alerte précis et effets adverses seront évalués et surveillés. Si un point limite est atteint, des mesures adaptées seront mises en place dans le plus court délai (administration d’une thérapie analgésique ou bien augmentation des doses si déjà en cours). Parallèlement, le responsable du projet, le responsable du bien-être et le vétérinaire délégué seront contactés.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proches de l’homme (ovin, porc, chèvre, chien), l’ovin a été identifié comme le plus adéquate car : •Les équipes possèdent une très grande expérience sur la création des modèles dans cette espèce ; •Ce modèle animal est bien décrit et caractérisé, et constitue une référence dans la communauté scientifique ; •Le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie dans la gestion de cette espèce ; •Les moutons fournissent également les dimensions et les propriétés physiologiques comparables à celles de l'homme. Nous utilisons des Femelles matures de 7 à 10 ans d’âge pour reproduire la ménopause et la susceptibilité à la FA chez la femme.

552 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 504 femelles gestantes tuées pour que leurs embryons soient prélevés à treize jours et demi puis seize jours et demi de gestation, tandis que 24 mâles et 24 femelles reproducteurs sont gardés vivants et réutilisés jusqu'à la fin du projet. Le geste infligé aux mères tient en trente secondes, un gavage unique. Les souriceaux, eux, sont anesthésiés par le froid pendant dix minutes puis décapités. Le laboratoire développe en parallèle des organoïdes cardiaques humains en trois dimensions qui reproduisent déjà le début de la trabéculation, et le bénéfice annoncé pour les patients tient en une ligne, comprendre le mécanisme "permettra d'agir pharmacologiquement".

Objectifs

Le syndrome de non compaction cardiaque est une malformation congénitale d’origine diverse. La non compaction s’observe souvent dans les maladies métaboliques. Le cœur en développement forme à partir des parois ventriculaires et auriculaires des trabécules se projetant dans les chambres afin d’augmenter la surface d’échange entre les cardiomyocytes et le sang avant que le système coronaire ne soit mis en place. On parle alors de trabéculation Vers le stade embryonnaire E13.5 (milieu de la gestation) chez la souris, les trabécules régressent et les parois ventriculaires s’épaississent. On parle alors de compaction. Nous connaissons assez bien les mécanismes cellulaires de la trabéculation mais très mal l’origine incluant le signal de la compaction. Nous avons déjà des nombreuses données incluant des données d 'expression génique montrant que la régression des trabécules est due à une sénescence des cellules cardiaques bordant le trabécules puis par leur élimination par des macrophages. De plus, le changement du métabolisme cardiaque au mileu de la gestation semble impliqué dans le processus de sénéscence. Pour valider ces données, nous délèterons un gène essentiel pour la sortie des cellules du cycle prolifératif et un gène impliqué dans le changement métabolique preferentiellement dans les cardiomyocytes embryonnaires et étudierons le phenotype des cœurs à différentes étapes du développement cardiaque.

Bénéfices attendus

La non compaction impacte l’hémodynamique cardiaque et est à l’origine de défaillance cardiaque. Elle ne peut pas contrairement aux autres malformations cardiaques être réparée par chirurgie. Comprendre ce mécanisme permettra d’agir pharmacologiquement

Procédures

gavage 30 s une seule fois dans leur vie. Anesthésie par le froid pour les souriceaux (10 min) avant mise à mort par décapitation

Impact sur les animaux

Le gavage est une nuisance bien que courte lorsque pratiqué par un expérimentateur très habitué. Le processus ne prend que 30s . Il permet la diffusion de la molécule à chaque embryon et sera appliqué qu’une seule fois pour chaque souris.

Devenir

504 animaux femelles utilisés dans le projet seront mis à mort au moment de la collection d 'embryons à E13.5 et E16.5 . Les mâles (24) et les femelles (24) ayant donné naissance aux souriceaux seront conservés et pouront être réutiilisés juque la fin du projet .

Remplacement

Nous etablissons un modèle cellulaire d'organoides cardiaques en 3D in vitro. Nous utilisons en effet en parallele des cellules souches embryonnaires humaines differenciées en different types de cellules cardiovasculaires au sein de cardioides en 3D. Ce modèle humain montre des trabecules naissant mais requiert encore une optimisation pour mimer la trabéculation et la compaction.

Réduction

Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour mettre en évidence une apparition d un phénotype lié à l’utilisation de notre modèle avec une significativité statistique. il existe une variabilité inter-portée c'est pourquoi il nous faut 6 portées par condition expérimentale. Nous effectuerons un test statistique de comparaison de la variance à 2 facteurs pour comparaison inter groupes . Les données acquises sur le modèle cellulaire d'organoides cardiaques humains en 3D in vitro validant des données acquises chez les souris permettront de diminuer les effectifs de souris par groupe.

Raffinement

Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture et eau ad libitum , cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). Le laboratoire de stabulation est éclairé par cycle de 12H. Des points limites clairs et spécifiques seront définis et les animaux seront euthanasiés lorsqu’ils atteindront les critères d’interruption. L'enrichissement de cages sera multiple (papier kraft, dômes, petits batonnets). Les souris sont visitées chaque jour incluant le week end par l’expérimentateur et sont conditionnées à la contention avant le gavage.

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle de développement cardiaque reflétant les étapes du développement cardiaque humain y compris les phénomènes étudiés dans ce projet ( trabéculaton et compaction). Les stades de développement E13.5, E16.5 et nouveau-nés ont été choisis de part les phenomènes biologiques se déroulant à ces stades (trabéculation versus compaction et changement de métabolisme cardiaque, respiration de l 'O2...)

Quatre injections dans le péritoine, une injection dans la veine rétro-orbitale, une injection directement dans le foie, cinq anesthésies gazeuses suivies de séances d'imagerie et deux anesthésies générales profondes: 2 138 souris génétiquement immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes lymphoïdes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris reçoivent des cellules souches ou des progéniteurs sanguins humains, corrigés ou non, pour vérifier que ces cellules se développent dans un organisme vivant. Le porteur indique que cette étape est exigée par l'Agence nationale de sécurité du médicament avant toute demande d'essai clinique chez l'être humain. L'effectif de 2 138 animaux n'est adossé à aucun calcul de puissance statistique, il a été dimensionné "en fonction de notre expérience du modèle" et de la variabilité observée lors de projets antérieurs.

Objectifs

Le but de ce projet est de tester in vivo dans un modèle murin l’innocuité et l’efficacité de nouveaux protocoles thérapeutiques pour des déficits immunitaires sévères. Ces déficits sont des pathologies très graves qui touchent les cellules sanguines et immunitaires, indispensables à la lutte contre les agents infectieux. Ils sont dûs, soit à une mutation dans un gène indispensable au développement ou à la fonction des cellules sanguines, soit à des traitements contre le cancer du sang, dans le cas de leucémie par exemple. Pour toutes ces pathologies, la greffe de moelle osseuse provenant d’un donneur sain est une option thérapeutique largement utilisée, mais la survie après greffe est très hétérogène et peut être inférieure à 30%. De nouvelles approches thérapeutiques doivent donc être absolument développées pour augmenter la survie de patients greffés. Notre objectif est d’explorer l’efficacité de trois nouveaux traitements de thérapie cellulaire (injection de progéniteurs des cellules sanguines), et de thérapie génique (injection de progéniteurs des cellules sanguines ou cellules souches, génétiquement modifiés). L’efficacité de ces approches innovantes doit absolument être validée dans un modèle animal car cette étape est exigée par l’Agence Nationale de la Santé et du Médicament avant tout essai clinique chez l’homme. Il existe un modèle de souris génétiquement modifiée pour être atteinte de déficience immunitaire et qui peut recevoir des cellules sanguines humaines pour qu'elles se développent sans effet délétère. Selon l’âge des souris receveuses, les cellules humaines seront injectées en intraveineuse ou en intrahépatique et la reconstitution immunitaire sera suivie par des prélèvements d’organes lymphoïdes après la mise à mort.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de valider et de justifier la mise en place de nouvelles thérapies dans le cas de déficits immunitaires sévères. Plus spécifiquement, les différentes études sur les progéniteurs de cellules sanguines nous permettront de choisir le protocole de production le plus optimisé pour leur capacité à se développer dans le corps. Par ailleurs, les protocoles impliquant la modification génétique des progéniteurs ou cellules souches visent à évaluer l’efficacité de telles stratégies de remplacement de gènes défectueux et notamment en vérifiant la bonne évolution des cellules génétiquement corrigées chez la souris, et ce durant leur développement. A terme, l’ensemble de ce projet permettra la mise au point jusqu’au stade clinique de protocoles thérapeutiques personnalisés avec une survie améliorée pour tous les patients atteints de déficits immunitaires.

Procédures

Les animaux subiront selon leur utilisation, soit 1 ou 2 : Injection intrapéritonéale (4X), 10s par intervention. Injection intraveineuse rétro-orbitale (1X), 30s par intervention. Anesthésie générale profonde (2X), 2min par intervention. Injection intrapéritonéale (1X), 10s par intervention. Injection intrahépatique (1X), 10s par intervention. Anesthésie gazeuse (5X), 10min à 30min. Imagerie optique (5X), 10min à 30min par intervention. Anesthésie générale profonde (1X), 2min par intervention.

Impact sur les animaux

Les altérations génétiques des animaux provoquent une immunodéficience sévère qui les rend vulnérables aux infections microbiennes. A la dose utilisée, l'agent de conditionnement n'induit pas d'effet indésirable majeur mais une douleur transitoire durant les heures post-injectio. L’anesthésie légère gazeuse ou profonde générale par injection de produits anesthésiants peut provoquer une baisse de la température corporelle et un assèchement des yeux. Les cellules souches et progéniteurs lymphoïdes ne provoquent pas d'effets indésirables et sont très bien tolérés chez les animaux. Les injections intrapéritonéales et intraveineuses par voie caudale provoquent une douleur localisée légère. Les injections intraveineuses par voie rétro-orbitaire provoquent une douleur localisée légère et un stress transitoire.

Devenir

Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort à la fin de cette procédure car nous avons besoin de prélever leurs organes afin de réaliser plusieurs analyses moléculaires et biochimiques.

Remplacement

La mise en place d’essais précliniques sur modèles animaux, quand ceux-ci existent, est exigée par l’Agence Nationale de Sécurité du Médicament dans tout dossier préalable à la demande d’un essai clinique chez l’homme. Il est à noter que seuls les protocoles mis au point et validés sur les cellules seront testés chez l’animal. Notre protocole de production de progéniteurs de cellules sanguines est déjà une méthode de remplacement partiel, puisque nous partons de cellules souches pour produire et expandre des cellules qui normalement se différencient en plusieurs mois dans la moelle osseuse. Nous utilisons un système de culture cellulaire, en évitant la maturation des cellules humaines chez la souris sur plusieurs stades. De même, la modification génétique des cellules sera faite dans la culture puis validée (efficacité de l’incorporation du gène sain, expression protéique du gène sain…) avant l’injection chez les animaux. En outre, la capacité des progéniteurs ou cellules souches, corrigées ou non, à se développer correctement, notamment en certains sous-type de cellules sanguines, sera également évaluée dans une culture cellulaire grâce à des tests déjà validés dans la littérature. Ils serviront à statuer sur la fonctionnalité potentielle des cellules avant leur injection chez les souris. Les expériences chez l’animal interviendront au terme d’un long développement et d’une caractérisation des produits cellulaires qui seront utilisés afin de ne traiter les animaux qu’avec les cellules dont les résultats sur les cellules seront suffisamment satisfaisants pour poursuivre chez l’animal. Ces expérimentations s’inscrivent dans le cadre d’une validation de la capacité de ces cellules, dans un organisme complet, à se développer. En effet, les expériences sur les cellules ne permettent pas d’évaluer la biodisponibilité, la capacité à migrer et la persistance de nos cellules therapeutique.

Réduction

Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été réalisé en fonction de notre expérience du modèle en question, en prenant en compte la variabilité observée lors de précédents projets du laboratoire. De par la faible taille de nos groupes, nous nous attendons à ne pas pouvoir valider une distribution gaussienne de nos données et donc à privilégier des tests non paramétriques. Cependant, nous raisonnerons de manière méthodique en testant la possibilité d’une répartition en loi normale de nos jeux de données. Un premier test sera utilisé pour évaluer la répartition gaussienne de chaque groupe, suivi d'un test pour comparer les variances. Pour la comparaison entre deux groupes, si les données suivent une distribution gaussienne, nous aurons recours aux tests paramétriques. En cas de répartition non gaussienne, un test non paramétrique sera utilisé. Pour les comparaisons entre plus de 2 groupes, nous utiliserons soit un test d'analyse de la variance pour les données normales avec comparaisons multiples ou son équivalent non paramétrique en cas de répartition non gaussienne. Par ailleurs, afin de réduire au maximum la production de notre élevage de souris immunodéficientes, nous aurons recours à la synchronisation des trios en amont de chaque expérience de manière à utiliser au maximum les animaux de chaque portée.

Raffinement

Les animaux immunodéficients seront hébergés au sein d'un établissement dont le statut sanitaire apporte un niveau de stérilité permettant d’éviter toute souffrance dues à leur phénotype immunodéficient. Les souris seront hébergées à raison de 5 par cage sur portoir ventilé avec un accès à la nourriture et à la boisson à leur volonté, la nourriture et l’eau sont stériles. Chaque cage bénéficie d’un enrichissement matérialisé par un tunnels de polycarbonate rouge translucide (pour les activités journalières) destiné à diminuer le stress et stimuler leur activité, des carrés de cellulose afin de favoriser la nidification et un bâtonnet en bois pour répondre aux besoins naturels des rongeurs. Des gels riches en nutriments pourront être ajoutés dans la cage si le besoin s'en fait sentir (animal chétif ou faible). La souffrance des animaux sera surveillée régulièrement et la décision de leur mise à mort encadrée par une grille de score définissant des points limites spécifiques. Une surveillance quotidienne sera réalisée par le personnel compétent de l’animalerie ainsi qu’une surveillance hebdomadaire par les responsables du projet. Chaque procédure invasive sera précédée d’une anesthésie générale profonde accompagnée d’une analgésie. Lors des anesthésies gazeuses, les animaux seront placés sur un plateau thermostaté permettant de maintenir leur température corporelle. La mise à mort de l'animal sera faite sous anesthésie générale afin de réduire leur stress.

Choix des espèces

La souris immunodéficiente que nous avons choisie constitue le modèle de référence pour tester l’efficacité de nouvelles approches de thérapie cellulaire et génique des déficits immunitaires. En effet, ces souris immunodéficientes sont capables de soutenir le développement des différentes cellules sanguines humaines à partir de cellules souches. Nous utiliserons soit des souris femelles ou mâles de 4 à 8 semaines soit des souris nouveau-nés (moins de 4 jours). Les souris de 4 à 8 semaines supportent bien le traitement permettant de les “vider” de leur globules blanc les 2 jours précédant la greffe. Ce traitement à la dose choisie est sans toxicité majeure et permet d’une part de mimer la situation clinique de greffe, et d’autre part de « vider » la moelle des animaux afin de faire de la place pour les cellules humaines et faciliter leur différenciation dans toutes les lignées sanguines. La prise de greffe des cellules humaines est bonne chez les animaux âgés de 4 à 8 semaines. Les souris nouveau-nées (