Recherche fondamentale

Sous anesthésie générale, 360 souris reçoivent une inflammation de la patte ou une opération témoin et 360 autres une lésion nerveuse, 100 recevant en plus quatre injections de tamoxifène. Au total, 900 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes anesthésiées puis tuées pour prélever leur moelle épinière. Le but est de comprendre comment le toucher devient douleur, en suivant l'activité des neurones de la corne dorsale chez des souris génétiquement modifiées porteuses d'un capteur calcique. Le porteur annonce deux jours de tests comportementaux avant l'induction du modèle puis trois semaines de tests après, sans préciser lesquels, et écrit qu'aucune procédure du projet n'entraîne d'effet indésirable majeur en dehors de la douleur qu'il provoque.

Objectifs

Les douleurs chroniques sont très fréquentes et les traitements disponibles souvent peu efficaces. Une des raisons à cet échec est qu’il n’y a pas une mais des douleurs chroniques. En effet, les douleurs chroniques se manifestent par plusieurs symptômes : douleurs spontanées, et douleurs provoquées par une stimulation normalement non douloureuse (allodynie) ou douloureuse (hyperalgésie). Chaque symptôme dépendant de mécanismes distincts, un médicament efficace sur l’un ne le sera donc pas nécessairement sur un autre : d’où la nécessité de traitements spécifiques pour chacun d’eux. Nous nous intéressons aux mécanismes de l’allodynie mécanique, un des symptômes les plus fréquents observés chez les patients douloureux chroniques. Comment le toucher devient-il douleur ? Normalement, ces sensations sont indépendantes. Les nerfs véhiculant les messages douloureux se terminent dans les couches superficielles de la moelle épinière et ceux véhiculant les messages tactiles dans les couches profondes. Cependant, suite à une lésion nerveuse ou une inflammation périphérique, les informations tactiles peuvent accéder aux neurones de la douleur des couches superficielles via un ‘court-circuit’ et provoquer ainsi une allodynie mécanique. Un petit nombre de neurones appartenant à ce circuit a été identifié, mais le manque d’informations concernant le réseau dans son ensemble et ses caractéristiques propres constituent une barrière majeure contre la mise en place d’une thérapeutique ciblée et efficace. Quels sont les autres neurones ? Comment l’information tactile se propage-t-elle à travers ce circuit ? En combinant des techniques de pointe – imagerie calcique en microscopie multiphotonique, enregistrements électrophysiologiques ciblés – chez des souris exprimant génétiquement un marqueur d’activité neuronale, nous visualiserons en temps réel la dynamique de l’activation de ce circuit et identifierons les neurones impliqués. Nous étudierons le rôle de neurotransmeteurs dans ces mécanismes de plasticité, notamment la sérotonine et l'ocytocine.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de comprendre le rôle des neuromodulateurs dans la plasticité des réseaux neuronaux spinaux en conditions physiologiques et pathologiques.

Procédures

Les animaux subiront entre 4 et 5 interventions au total (cf description annexe schématique du projet). Le groupe de souris CFA est composé de 180 Sham + 180 CFA = 360 animaux. Le groupe de souris neuropathiques est composé de 360 animaux. L'ensemble de ces animaux seront testés pendant 2 jours pour étudier leur comportement avant tout modèle de douleur, puis pendant 3 semaines une fois le modèle établi. L'induction des modèles de douleur se fera sous anesthésie générale

Impact sur les animaux

Aucune des pocédures décrites dans ce projet, en dehors de la douleur induite dans les modèles de douleur, n'induit d'effets indésirables majeures. Les données de la littérature indiquent néanmoins une comorbidité anxio-dépressive dans les modèles de douleurs utilisés dans ce projet, comme décrit par les patients atteints de douleurs persistentes.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin d'analyser l'excitabilité neuronale de la corne dorsale. L'objectif du projet est d'étudier l'activité neuronale de la moelle épinière et les contraintes techniques de cette approche nécessitent de réaliser l'étude ex vivo.

Remplacement

Pour ce projet, l'utilisation de souris transgéniques permettant la visualisation de l'activité neuronale de la moëlle épinière est nécessaire. Aucune méthode alternative n'existe pour prévenir l'utilisation d'animaux dans ce protocole : en effet, il est nécessaire de réaliser ces études chez l'animal car l’intégration du toucher et de la douleur implique de nombreux neurones organisés en réseaux complexes et méconnus du système nerveux central et périphérique.

Réduction

Le nombre de souris par groupe (n=20) est réduit au maximum tout en permettant de discriminer un effet significatif entre les traitements, et calculé par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux seront reproduits au sein de notre animalerie. Dans ce but, le laboratoire est titulaire d'un agrément d'utilisation d'organismes génétiquement modifiés en milieu confiné à des fins de recherche, de développement et d'enseignement, en accord avec le décret n° 2011-1177 du 23 septembre 2011 relatif à l'utilisation confinée d'organismes génétiquement modifiés. Les animaux sont stabulés dans des cages individuelles contenant au maximum 4 males ou 5 femelles et situés dans des portoirs ventilés, thermorégulés (22 ± 1 °C) avec hygrométrie contrôlée ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum ; changement de litière 1 fois toutes les 2 semaines. Nous utiliserons une pièce réservée pour la stabulation de souris transgéniques avec un cycle de lumière inversé (lumière de 19h à 7h). Les animaux seront hebergés en milieu enrichi (social et environemental) afin de respecter au mieux leur confort et leur niveau de stress. Les tests comportementaux à la douleur seront réduits au minimum (fréquence et intensité des tests) et réalisés selon des protocoles expérimentaux établis et acceptés par la communauté scientifique de la Recherche sur la douleur. Aucun des modèles de douleurs décrits dans ce projet n'induit de déficit locomoteur sévère pouvant influer sur les besoins physiologiques de l'animal. Les procédures expérimentales impliquant une anesthésie et une analgésie se feront à l'aide de mélanges de Kétamine et de Xylasine. Les animaux seront suivis quotidiennement par les membres utilisateurs du projet, et seront euthanasiés en cas de points limites atteints, après consultation de la SBEA et selon le fascicule « la douleur de l’animal au cours d’une expérimentation », élaborée par le service communication de l’école Vétérinaire de Lyon.

Choix des espèces

Les souris transgéniques GCamp sont les seules espéces animales dotées d'un senseur calcique exprimé au sein de leurs cellules neuronales. L'utilisation d'autres marqueurs calciques exogènes est toxique pour les neurones qui y sont exposés et est donc peu recommendé pour l'étude de réseaux neuronaux physiologiques et physiopathologiques. Par ailleurs, seules les souris permettent à l'heure actuelle de cibler l'expression du senseur calciques dans des populations spécifiques de neurones spinaux. Adultes (P21-35) pour comparaison avec les autres données de la littérature

Vingt-cinq souris dites "inconnues", utilisées comme partenaires sociales dans un test de sociabilité, sont gardées vivantes et remises en circulation dans l'animalerie. Les 264 autres sont tuées, dans un projet où 289 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Gavées trois fois par semaine de vésicules issues du microbiote intestinal de personnes autistes, elles passent trois jours de tests de locomotion, d'interactions sociales, de gestes répétés et d'anxiété, puis une sonde introduite dans le rectum mesure leur sensibilité colique. Le porteur affirme que le lien entre intestin et cerveau ne peut s'étudier aujourd'hui que sur un modèle animal, alors qu'il décrit par ailleurs des travaux préalables menés sur cultures de neurones intestinaux et sur intestins isolés.

Objectifs

L’autisme regroupe un ensemble de troubles neurodéveloppementaux caractérisés par des déficits dans les interactions sociales et des centres d’intérêts restreints et répétitifs. Outre ces symptômes comportementaux, une grande majorité de personnes autistes (environ 70%) souffrent de symptômes digestifs, diarrhée, constipation, ballonnement, douleur abdominale. La corrélation entre la sévérite des symptômes digestifs et des troubles comportementaux souligne l'importance de l'intestin dans l’autisme. Ceci suggère également des mécanismes communs dans les dysfonctions des neurones de l'intestin (système nerveux entérique) qui régulent les fonctions digestives et ceux du cerveau. Un cofacteur important dans l’autisme est le microbiote intestinal. En effet, des modifications de la composition du microbiote intestinal ont été décrites chez les patients autistes par rapport à des sujets témoins. Des études fonctionnelles visant à déterminer l’impact de ces modifications ont montré que le transfert de microbiote humain provenant de sujets autistes chez la souris induisait des symptômes digestifs et comportementaux de l’autisme. Cependant, les mécanismes sous-jacents à ces effets sont encore inconnus, mais pourraient impliquer des vésicules extracellulaires. Les vésicules extracellulaires sont produites et libérées par tous types cellulaires, incluant les bactéries, et transportent des molécules signalétiques pouvant agir à la fois sur l’intestin et le cerveau. L’hypothèse du projet est que les vésicules extracellulaires produites par le microbiote intestinal altéré des autistes contribuent aux dysfonctions digestives et cérébrales. Le premier objectif est donc d’étudier la capacité des vésicules extracellulaires produites par le microbiote à induire chez la souris des symptômes digestifs et comportementaux pertinents de l’autisme. Nos données préliminaires obtenues in vitro montrent que les vésicules extracellulaires isolées à partir de selles de patients autistes augmentent l'expression d’une enzyme neuronale responsable de la libération du nitric oxide, un neurotransmetteur clé du système nerveux entérique et du cerveau, dont les voies de signalisation sont perturbées dans l’autisme. Ainsi, le 2e objectif sera d'explorer la contribution de cette voie de signalisation dans les effets induits chez la souris par les vésicules extracellulaires. Ce projet apportera des éléments novateurs dans la compréhension des mécanismes physiopathologiques de l’autisme.

Bénéfices attendus

L’autisme touchent environ 1% de la population mondiale et est en constante augmentation. Un frein pour le développement d’approche thérapeutique résulte d’un manque de connaissances des mécanismes physiopathologiques impliqués dans les troubles digestifs dans l’autisme. Bien que plusieurs éléments récents indiquent que des altérations du microbiote intestinal représentent un facteur important pouvant contribuer à l’autisme, les médiateurs impliqués dans les interactions entre le microbiote intestinal et les organes cibles de l’autisme, l’intestin et le cerveau, sont encore largement inconnus. En ciblant les vésicules extracellulaires, ce projet vise à mieux comprendre dans l’autisme les mécanismes d’interaction entre le microbiote intestinal d’une part, et l’intestin et le cerveau d’autre part. De plus, ce projet permettra d’identifier la voie nitrergique (neurotransmetteur nitric oxide) de l’hôte comme une cible potentielle des vésicules extracellulaires dérivées du microbiote de patients autiste. La voie nitrergique ayant été précédemment identifiée comme altérée dans l’autisme, ce projet permettra de proposer un mécanisme reliant l’altération du microbiote intestinal de patients autiste avec les dysfonctions digestives et cérébrales. Cette étude présente un intérêt non seulement pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques impliqués dans l’autisme, mais également dans la perspective d’un traitement thérapeutique basé sur l’utilisation de vésicules extracellulaires comme postbiotiques.

Procédures

Pour chaque procédure, lors des études comportementales et fonctionnelles digestives, nous réaliserons : - Un gavage sera réalisé 3 fois par semaine (un jour sur deux) avec une solution de vésicules extracellulaires (2min). - Injection d'un traitement visant à inhiber la signalisation nitrergique, une fois par jours pendant 7 jours (2min). - Des tests comportementaux sur 3 jours seront effectués sur les souris : Jour 1: un test mesurant la locomotion des souris de 15min et un test mesurant les interactions sociales de 35min. Jour 2: un test mesurant les gestes répétés de 15min et un test mesurant l’anxiété de 15min. Jour 3: un prélèvement d’un échantillon de sang à la base de la queue - un prélèvement des selles tous les ¼ d’heure sur 2 heures. - un test permettant de mesurer la sensibilité colique par une petite sonde introduite dans le rectum (30min).

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendues sur les souris sont faibles. Cependant, du stress et de la douleur peuvent être générés par les différentes procédures expérimentales (gavage, prélèvements de sang ou tests comportementaux). Par ailleurs, l’administration de vésicules extracellulaires et de métabolites bactériens de patients avec troubles digestifs sont susceptibles d’induire chez la souris des douleurs abdominales et des troubles gastro-intestinaux. Tous ces signes seront observés quotidiennement au cours du traitement.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort, sauf les 25 souris dites « inconnues » utilisées pour le test des 3 chambres seront gardées en vie et réutilisées au sein de l'animalerie. Pour les souris mise à mort, les intestins et le cerveau seront prélevés et des mesures ex vivo de motricité colique et de perméabilité colique seront effectuées ainsi que des analyses supplémentaires de biochimie (protéines, tissus et ADN pour mesurer des marqueurs de neurones) et des marquages immunohistochimiques

Remplacement

L’étude du lien entre les systèmes nerveux central et entérique, dans un contexte de neurodéveloppement physiopathologique, nécessite une étude comportementale qui ne peut, à ce jour, se réaliser que sur un modèle animal. De plus, notre étude sur l’autisme mettant en jeu différents systèmes cellulaires (neurones de l’intestin, neurones du cerveau, microbiote intestinal...) dont la complexité d’interaction ne peut être modélisée seulement par une approche in vitro, justifie l’utilisation de modèles animaux afin de disséquer la complexité d’interaction des acteurs impliqués et d’identifier les mécanismes sous-jacents associés.

Réduction

Les travaux réalisés in vitro sur des cultures de neurones de l’intestin et ex vivo sur des intestins isolés nous ont permis de mettre en évidence que les vésicules extracellulaires provenant de selles humaines ont une bioactivité sur les neurones entériques et de réduire significativement le nombre d’animaux qu’il aurait fallu pour examiner les effets potentiellement sur le système nerveux entérique. Parallèlement, des expérimentations similaires menés chez des modèles animaux au cours de projets antérieurs nous ont permis de faire des calculs de puissance statistique et ainsi de sélectionner le nombre minimum d’animaux par groupe pour avoir une significativité avec une erreur de 0,05 et une puissance de 80%.

Raffinement

Le bien-être animal sera pris en compte tout au long de l’expérimentation. Nous recevrons les souriceaux une semaine avant le début du traitement. Les animaux seront hébergés collectivement (max 5) dans des cages avec frisottis et tunnels ou dômes plastiques transparents rouges. L’évaluation des animaux sera effectuée selon des critères définis (poids, apparence physique (pelage, posture), activité, comportement, fréquence respiratoire). Le poids et l’état d’hydratation seront surveillés 3 fois par semaine. Pour l’ensemble des procédures, des points limites sont mis en place

Choix des espèces

Une de nos études préliminaires a montré que l’administration du microbiote intestinal des patients autistes de cette même cohorte induisait des troubles gastro-intestinaux chez la souris. Le but ici est de déterminer si les effets observés impliquent les vésicules extracellulaires du microbiote intestinal dans ce même modèle. Les souris seront réceptionnées à l’animalerie juste après le sevrage (21/22 jours) et gardées une semaine en acclimatation avant le début des gavages. Ce stade correspond à un stage enfant/adolescent cohérant avec le fait que l’autisme est une pathologie du neurodéveloppement. Par ailleurs, le système nerveux entérique étant encore plastique pendant la période de l’enfance et adolescence, étudier l’impact des vésicules extracellulaires sur le remodelage du système nerveux entérique est plus pertinent à ce stade du développement.

Deux opérations sous anesthésie, de 45 à 90 minutes puis de 90 à 120 minutes, et la pose d'une prothèse sur la tête sous sédation : 80 souris d'une lignée génétiquement modifiée, étudiée pour les troubles de l'attention liés à l'autisme, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Hébergées seules pendant cinq semaines, avec des moments de contact, elles sont habituées par séances de 2 à 30 minutes à porter un appareil d'imagerie sur la tête. Elles passent ensuite, l'appareil en place, une tâche comportementale de 30 minutes, reprise 20 minutes le lendemain. Le porteur qualifie cette tâche de "légèrement désagréable et stressante", sans dire en quoi elle consiste ni ce que comportent les deux opérations. Toutes sont tuées à l'issue pour le prélèvement de leur cerveau.

Objectifs

Les difficultés d'attention sont fréquentes dans divers troubles neurodéveloppementaux tels que l'autisme, les troubles du déficit de l'attention et certaines maladies génétiques caractérisées par un retard de développement. Ces problèmes posent un défi important à l'intégration sociale, éducative et professionnelle des personnes concernées. Pour mieux comprendre les raisons biologiques de ces difficultés, nous proposons d'analyser l'activité des cellules nerveuses dans une région du cerveau impliquée dans ces troubles. Nous utilisons un modèle génétiquement modifié représentant l'autisme, qui manifeste des problèmes d'attention dans des conditions expérimentales. Ceci est complété par des tests de comportement et l'imagerie pour mettre en évidence ces déficits.

Bénéfices attendus

L'autisme est une condition complexe pour laquelle il n'existe actuellement aucun traitement médicamenteux spécifique. En raison de la diversité des origines et des manifestations de cette condition, il est peu probable qu'une seule molécule puisse traiter tous les symptômes. Face à cette complexité, une approche consiste à comprendre les modifications dans les circuits cérébraux liés à des symptômes spécifiques. Notre étude se concentre sur les problèmes d'attention, qui touchent environ 40% des personnes autistes et sont étroitement liés à d'autres symptômes comme les problèmes sensoriels. En s'appuyant sur des recherches antérieures, nos propres données préliminaires et notre programme de recherche, nous cherchons à identifier les changements dans l'activité de certaines populations de cellules nerveuses. Ces modifications pourraient servir de biomarqueurs tant sur le plan physiologique que comportemental, permettant d'évaluer l'impact de nouveaux traitements médicamenteux pour les problèmes d'attention liés à l'autisme. Nous pensons que notre travail pourrait éventuellement contribuer à orienter des essais cliniques chez l'homme. En outre, les avancées techniques réalisées dans le cadre de ce projet bénéficieront à d'autres projets de recherche de notre laboratoire, nous permettant d'améliorer nos méthodes techniques et scientifiques pour nos futurs travaux. Dans une perspective plus large, les connaissances que nous espérons tirer de notre étude pourraient également enrichir notre compréhension d'autres troubles neurodéveloppementaux impliquant des problèmes d'attention.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie : la première durera environ 45 à 90 minutes, et la deuxième durera de 90 à 120 minutes. En outre, ils subiront une intervention sous sédation (sans acte invasif) d'une durée d'environ 60 minutes pour la pose d'une prothèse sur la tête. Pour des raisons techniques liées à la présence d'une prothèse, il est nécessaire d'adapter les conditions d'hébergement. Les animaux seront hébergés individuellement pendant une période de 5 semaines, avec des périodes d'échange entre congénères. Les animaux seront progressivement habitués à accepter la pose d'un appareil d'imagerie sur leur tête au cours de séances d'entraînement, dont la durée augmentera progressivement de 2 à 30 minutes. Par la suite, les animaux effectueront une tâche comportementale légèrement désagréable d'environ 30 minutes en présence de l'appareil d'imagerie, qui sera positionné sur leur tête. Le lendemain, ils seront de nouveau exposés à la tâche comportementale, cette fois pendant environ 20 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie : le risque d'inconfort, de douleur, d'infection et/ou de perte de poids est inhérent à ces procédures. Ils seront à nouveau endormis, exposant ainsi un risque d'hypothermie ou de problèmes respiratoires temporaires. Ils seront soumis à une tâche comportementale légèrement désagréable et stressante pour l'animal. Ils seront entraînés à porter un appareil d'imagerie sur leur tête, ce qui représente une contrainte pour la posture de l'animal. La pose d'une prothèse implique également une contrainte pour l'animal, ce qui nous obligera à adapter les conditions d'hébergement.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées et leurs cerveaux seront prélevés pour des analyses post-hoc.

Remplacement

Le projet se concentre sur l'exploration des changements comportementaux et neurobiologiques chez un modèle de maladies neurodéveloppementale. Les expériences proposées nécessitent l’utilisation d’un modèle animal vivant et il ne peut pas être remplacé par les études in vitro ou in silico. Les études cliniques ne sont pas appropriées pour notre objectif expérimental, en raison de la fragilité de la population clinique concernée et de la nécessité d'approches invasives pour répondre à nos questions scientifiques. Les structures cérébrales sont généralement bien préservées chez différentes espèces de mammifères, ce qui suggère une similitude fonctionnelle entre les rongeurs et les humains. L'utilisation de modèles animaux avec une sensibilité neuronale plus faible (tels que les invertébrés ou les poissons) ne convient pas à notre projet, car ces organismes ne possèdent pas la structure cérébrale spécifique ciblée par notre étude.

Réduction

Nous avons réfléchi à notre projet de recherche de façon à réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés. La conception expérimentale soigneuse de notre projet permettra une stratégie de réduction à minima de nombre des animaux nécessaires à l’exploitation statistique des résultats. Afin d’estimer correctement le nombre d’animaux nécessaires, nous avons consulté deux experts dans le domaine. Nous avons également prévu une étude pilote, permettant l’étude de la faisabilité technique de certains aspects de notre projet. De plus, nous avons intégré une stratégie permettant une évaluation précoce de nos résultats au fur et à mesure et, si nécessaire, une réduction de nombre d’effectifs nécessaire à la réalisation de nos objectifs scientifiques.

Raffinement

i) Surveillance quotidienne. ii) Vérification de l'état de l'animal avant et après chaque expérience ou manipulation. iii) Perfectionnement des procédures chirurgicales pour réduire le risque de douleur ou de souffrance : utilisation d'une crème pour les yeux et d'un tapis chauffant pour maintenir la température de l'animal. Utilisation d'anesthésiques et d'analgésiques pour chaque intervention chirurgicale. Ajout d'un analgésique local à longue durée d'action et d'un anti-inflammatoire lors de la deuxième intervention chirurgicale. iv) Application de soins préventifs après la chirurgie v) Animaux manipulés quotidiennement avant les séances de comportement afin de réduire le niveau de stress. vi) Entraînement à la porte de l'appareil d'imagerie, vii) Utilisation des techniques de manipulation prévu pour réduire le stress de la manipulation viii) Habituation à la salle de comportement, ix) Définition de points limites spécifiques et de mesures conservatrices pour chaque phase de la procédure. x) Mécanismes d'intégration des nouvelles techniques de perfectionnement : formation régulière des expérimentateurs, consultation de sites éducatifs en bien être animal, consultation d'experts dans le domaine.

Choix des espèces

Choix de l'espèce : Les expériences proposées pour cette étude nécessitent des mesures comportementales et neurophysiologiques (impliquent des interventions invasives). Nous avons donc besoin d’un modèle animale complexe et intacte, adapté à la réalisation des tests cognitifs, possèdant la structure cérébrale ciblée par notre étude, pour lequel il existe déjà des tests comportementaux validés dans la littérature scientifique. De plus, il est essentiel que l'espèce soit susceptible d'accepter des modifications génétiques pour reproduire les conditions génétiques humaines. Idéalement, le modèle devrait être bien validé par des études antérieures en tant que représentation fiable et éprouvée pour l'étude de l'autisme. La souris répond à tous ces critères et offre la cohérence avec les recherches précédemment menées au sein de notre équipe. Les modèles animaux avec une sensibilité neurophysiologique moindre, tels que les invertébrés ou les poissons, ne sont pas appropriés pour notre projet, car les approches techniques que nous envisageons ne peuvent pas être appliquées à ces organismes. De plus, les tests comportementaux chez ces animaux sont souvent trop limités pour modéliser de manière adéquate des maladies complexes comme l'autisme. Stade de développement : 4 à 6 semaines au début des procédures (c.a.d. l'acte chirurgical) et 10 à 12 semaines (jeunes adultes) au moment du test comportemental. Justification : Ce stade de développement a été choisi pour être en cohérence avec les études antérieures effectuées au sein de notre équipe, utilisant le même modèle transgénique et la même tâche comportementale. En effet, cette étude s'inscrit dans la continuité de notre programme de recherche, et il est très important de maintenir les mêmes conditions expérimentales afin de garantir la reproductibilité et la fiabilité de nos expériences, tout en facilitant la comparabilité de nos données avec celles obtenues précédemment. L'âge de 10 à 12 semaines a été choisi car il correspond au moment de maturité des circuits neuronaux ciblés. Bien que la condition étudiée se manifeste à tous les stades de la vie, une intervention thérapeutique sera plus efficace si elle est effectuée de manière la plus précoce possible. C'est pour ces raisons que nous utilisons des jeunes adultes.

Endormis par le froid, injectés dans le cerveau pendant cinq minutes, réchauffés sur un tapis à 37 degrés puis rendus à leur mère, des souriceaux nouveau-nés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent en parallèle une opération sous anesthésie générale, jusqu'à une heure, pour introduire du matériel génétique dans le cerveau de leurs embryons. Le projet compte 504 souris, toutes tuées quelques jours après l'intervention, mères gestantes et embryons compris. Ces mises à mort permettent de filmer la migration des neurones sur tranches de cerveau vivant, le porteur indiquant que les analyses ne sont réalisables que post mortem.

Objectifs

La migration neuronale est une étape fondamentale du développement du système nerveux qui permet la mise en place de circuits neuronaux fonctionnels. Des défauts de migration neuronale conduisent à des malformations cérébrales et sont impliquées dans des maladies psychiatriques. Il est donc crucial de comprendre les mécanismes qui régulent la migration neuronale aussi bien d’un point de vue fondamental qu’appliqué. Nous avons découvert récemment un mécanisme entièrement nouveau de régulation de la migration neuronale. Nos objectifs sont à présent de disséquer dans son intégralité la voie de signalisation impliquée, son lien avec le cytosquelette des neurones migrants ainsi que son existence chez l’embryon. Nous nous intéressons également aux défauts de cette voie dans le cadre du Syndrome de l’X Fragile, 1ère cause héréditaire de déficit intellectuelle. Dans ce syndrome, l’absence de la protéine FMRP (Fragile X Messenger Ribonucleoprotein) entraine une série de défauts neurodéveloppementaux associées à des déficits de plasticité neurale adulte. Les défauts de migration neuronale dans cette pathologie restent peu connus jusqu’alors. Ces études mettront donc en évidence des mécanismes fondamentaux jusqu’alors inconnus de régulation de la migration neuronale, ce qui est essentiel pour comprendre le développement du cerveau en conditions physiologiques et pathologiques, y compris dans le cadre du syndrome de l’X Fragile.

Bénéfices attendus

Ces études mettront donc en évidence des mécanismes fondamentaux jusqu’alors inconnus de régulation de la migration neuronale, ce qui est essentiel pour comprendre le développement du cerveau en conditions physiologiques et pathologiques, y compris dans le cadre de l’X Fragile. Ce type d’analyse de la migration neuronale sur coupes de tissu vivant est extrêmement informatif, apportant des informations uniques qui reste inaccessibles par d’autres types de techniques.

Procédures

Des souris post-natales seront soumises à une procédure visant à l’introduction de matériel génétique dans leurs cerveaux. Pour ce faire, elles seront temporairement endormies par le froid, ce qui sera suivi de la procédure principale qui durera environ 5 minutes. Les souris reprendront conscience sur un tapis chauffant à 37°C avant de retourner dans leur cage auprès de leur mère. Ces souris seront euthanasiées quelques jours après pour pouvoir filmer la migration des cellules modifiées par différentes techniques comme le film sur tissu vivant ou le marquage de protéines sur tissu fixé. Parallèlement, des souris gestantes seront impliquées dans une procédure spécifique permettant l’introduction de matériel génétique dans le cerveau de leurs embryons. Pendant cette intervention, elles seront sous anesthésie générale induite par un gaz inodore et analgésie. Un maintien de la chaleur sera assuré tout au long de la procédure, qui ne devrait pas dépasser une heure. Ces souris se réveilleront rapidement après l'arrêt de l'anesthésie. Les embryons seront euthanasiés (en même temps que la mère gestante) quelques jours après afin d’analyser la migration de leurs neurones sur tissu vivant ou fixé. Les procédures d’euthanasie respecteront des normes éthiques rigoureuses.

Impact sur les animaux

Le projet peut impacter, de manière limitée, les 5 libertés fondamentales de l’animal, notamment induire des éléments de stress physique et thermique lors des expérimentations. La méthode d’introduction des mutations chez les nouveau-nés implique l’anesthésie par le froid. L’introduction de mutation chez l’animal postnatal et l’embryon impliquent une chirurgie. Les procédures de chirurgie peuvent provoquer une douleur pendant 24/48h malgré l’utilisation d’analgésiques. Néanmoins, elles sont indispensables à notre projet car seules cette technique permet d’introduire les multiples mutations dont nous avons besoin pour analyser notre système de migration.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés car les analyses expérimentales envisagées ne peuvent être réalisées que post-mortem.

Remplacement

Nous souhaitons explorer le déplacement des neurones dans le cerveau des souris à différents stades de leur vie, que ce soit après la naissance ou pendant la période embryonnaire. Notre objectif est de comprendre comment ces cellules se déplacent dans un environnement complexe, avec des influences provenant d'autres cellules du cerveau. Cette étude nécessite une approche spéciale d'imagerie sur tranche de cerveau pour préserver les conditions naturelles dans lesquelles ces cellules se déplacent. Bien que nous utilisions parfois des cultures d'explants dans du matrigel pour certaines expériences in vitro afin d'analyser le déplacement des cellules, il est important de noter que ces cultures ne peuvent pas reproduire la complexité totale de l'environnement naturel des cellules dans le cerveau. Dans le cadre de nos expériences, nous introduisons des modifications génétiques chez les animaux avant d'utiliser un système in vitro pour analyser leur migration. L'objectif ultime est de mieux comprendre le développement cérébral dans des conditions aussi proches que possible de la réalité.

Réduction

Le projet impliquera un total de 504 souris. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Par ailleurs, l'analyse statistique sera réalisée et nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de nid végétal. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive en respectant des points limites et des soins adaptés en terme d'anesthésie et d'analgésie.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix, reconnu comme tel sur la scène internationale, pour étudier la migration neuronale chez l’animal postnatal et chez l’embryon. De plus, les techniques de manipulation génétique que nous utilisons chez la souris sont robustes et reproductibles. Pour étudier la migration postnatale, nous utilisons des souris post-natales Pour étudier la migration embryonnaire, nous utilisons des souris embryonnaires. Ce sont des modes de migration qui se ressemblent mais qui peuvent présenter des différences qu'il est important de comprendre pour mieux comprendre le développement du cerveau dans des conditions physiologiques ou pathologiques.

Obtenir un foie gras sans gavage : 600 canards de trois génotypes vont être utilisés, tous abattus à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. De l'éclosion à dix-sept semaines, ils subissent six heures par jour à dix degrés sous leur optimum thermique, des variations d'éclairage, deux semaines de restriction alimentaire à -25 %, puis une remise à volonté destinée à les faire manger au-delà de leur besoin. Vingt canards par groupe et par semaine sont saignés au sinus occipital pour doser un marqueur d'engraissement du foie, avant l'abattage et le prélèvement des tissus. Le porteur situe la recherche dans "un contexte d'intensification du questionnement sociétal relatif au bien-être animal" et juge "nécessaire" de porter l'effort sur le canard, l'oie ne représentant que 2 % de la production française.

Objectifs

Aujourd’hui, la production de foie gras repose sur le gavage des animaux. Dans un contexte d’intensification du questionnement sociétal relatif au bien-être animal, des recherches ont été entreprises sur des méthodes alternatives à cette pratique pour la production de foie engraissé. Les premiers travaux concluants ont été réalisés sur l’oie mais celle-ci ne représente que 2 % de la production française de foie gras. Il est donc nécessaire à présent de concentrer les efforts de recherche sur le canard. L’objectif du présent projet est d’utiliser plusieurs leviers physiologiques et métaboliques susceptibles d’induire un engraissement hépatique en les mettant en œuvre de façon précoce, dès le développement embryonnaire, de façon à bénéficier des périodes où l’oiseau présente une grande plasticité d’adaptation métabolique et physiologique et de les tester chez trois génotypes de canards (Barbarie, mulard et Pékin) et les deux sexes. Le canard mulard résulte du croisement d’un mâle Barbarie avec une femelle Pékin. Ces trois génotypes de canard ne présentent pas la même sensibilité aux variations de la photopériode et de la température, la même vitesse de croissance, le même comportement alimentaire, ni la même aptitude à la production de foie gras lorsqu’ils sont gavés. Ce projet a pour objectif d’explorer la réponse de ces génotypes face à une combinaison de différentes modalités de stimulation du développement des organes digestifs, de l’hyperphagie (surconsommation spontanée d’aliment) et/ou de la capacité de synthèse et de stockage des lipides par le foie. En conditions standards d’élevage, la capacité d’engraissement corporel global des femelles est en général supérieure à celle des mâles d’où l’intérêt d’étudier la réponse des canards des deux sexes. Les leviers testés seront l’exposition à une baisse de température au cours de la dernière phase de développement embryonnaire et de la croissance, la composition (ratio énergie/protéines, teneurs en fibres et antioxydants) et les modalités de distribution de l’aliment (durée et fréquence des repas, restriction suivie d’un apport à volonté), la durée et l’intensité de l’éclairage.

Bénéfices attendus

Sur le plan scientifique, ce projet mettra à profit les connaissances récemment acquises sur la programmation thermique embryonnaire et post-éclosion des oiseaux (poulets, canards) et devrait permettre d’enrichir celles portant sur le métabolisme des lipides du canard en croissance et la régulation de son ingéré alimentaire sous l’effet conjugué de différents facteurs, la photopériode (durée et intensité d’éclairage), les modalités de distribution de l’aliment (durée et fréquence des repas, restriction, distribution à volonté) et la composition de l’aliment (ratio énergie/protéines, teneurs en fibres et antioxydants). Ce projet permettra aussi d’enrichir les connaissances sur le comportement alimentaire du canard. L’objectif de ce projet est de chercher une alternative à l’alimentation forcée représentée par l’acte de gavage pour l’obtention d’un foie engraissé. Si la combinaison des leviers précités permet d’atteindre cet objectif, il représentera un changement évident de pratique d’élevage. Il s’agira ensuite de la valider et de l’optimiser puis d’évaluer son impact sur les aspects environnementaux, économiques et sociétaux. Les résultats de ce projet permettront aussi d’ouvrir un large champ d’investigation pour décortiquer les mécanismes comportementaux, physiologiques et métaboliques mis en œuvre chez les animaux aux différents stades de leur croissance et de la phase d’engraissement du foie.

Procédures

A l’éclosion, les canetons seront sexés, pesés et leur aspect visuel et leur vivacité seront évalués. Au cours de la croissance, les canards seront pesés en semaines 1, 2, 4, 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17. Une prise de sang au sinus occipital sera réalisée sur 20 canards vigiles par groupe et par semaine d’abattage lors de la période d’alimentation à volonté de S13 à S17 soit un total de 600 canards. Cela nous permettra de déterminer la concentration plasmatique en chémerine, un marqueur de l’engraissement du foie et de vérifier que ce marqueur reste robuste même si l’engraissement du foie est éventuellement plus modéré que celui obtenu par gavage. Ces canards seront abattus pour évaluer leur composition corporelle et prélever des échantillons de différents tissus. De J1 à J70, les canards seront exposés à une diminution temporaire quotidienne (6h/24h) de la température ambiante de 10°C par rapport à leur optimum thermique, à des variations de l’intensité lumineuse (40-50 lux pendant les repas et 5-10 lux entre les repas) et de la durée d’éclairage (diminution de 24h à 16h d’éclairage de J1 à J21 puis de 16h à 8h de J70 à J78 et augmentation de 8h à 16h à J85) à une restriction alimentaire de -25% par rapport à l’ingéré à volonté de J70 à J84 suivie par une distribution à volonté de l’aliment de J85 à J119.

Impact sur les animaux

L’exposition à une baisse de la température de 10°C pendant 6 h/24 h pourra induire un inconfort thermique en particulier au cours de la première semaine d’élevage (exposition à 20°C au lieu de 30°C), mais dès l’éclosion, les canetons sont capables de maintenir leur température corporelle lorsque la température ambiante ne descend pas au dessous de 20°C. Ce seuil de température ambiante au-dessus duquel les canards sont capables de maintenir leur température corporelle diminue progressivement avec l’âge et la température dans le bâtiment d'élevage diminue également. Les canetons seront élevés en groupe et sur des copeaux de bois qui apportent un confort thermique lorsque les animaux sont couchés. La phase de restriction alimentaire pourra induire une frustration des animaux. L’apport de fibres dans l’aliment et la mise à disposition de grit (mélange de graviers et de coquilles broyées) et de bottes de pailles sur le sol ont pour objectif de ralentir le transit digestif et de favoriser le comportement exploratoire des canards et donc de réduire leur nervosité éventuelle. La diminution de l’intensité lumineuse favorisera aussi une ambiance calme dans le bâtiment. Le prélèvement de sang peut engendrer une réaction de stress lors de la contention et l’animal peut ressentir une douleur modérée lors de la piqûre. Le diamètre des aiguilles qui seront utilisées pour les prélèvements de sang sera adapté au gabarit de l’animal. Il n’y a pas en principe de saignement post-prélèvement et la cicatrisation est très rapide. La prise de sang est réalisée avec du matériel stérile dans un environnement propre pour limiter le risque d’infection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en respectant la règlementation en vigueur (abattage dans des abattoirs agréés) pour évaluer leur composition corporelle, l’engraissement du foie et prélever des échantillons de différents tissus.

Remplacement

Etant donné que cette étude porte sur les alternatives au gavage du canard en utilisant différents leviers physiologiques et métaboliques, l’utilisation de l’animal ne peut pas être remplacée par un modèle d’étude in vitro ou in silico.

Réduction

L’effectif total d’animaux mis en procédure dans cette étude est 600. La concentration du plasma en chémerine (une hormone marqueur de l’engraissement du foie) sera déterminée sur 20 canards par sexe et par génotype qui seront abattus chaque semaine au cours de la dernière période d’élevage (S13-S17) lors de l’alimentation à volonté. Les paramètres de composition corporelle et d’expression tissulaire de la chémerine seront mesurés sur 20 canards par sexe et par génotype. Ces effectifs sont suffisants pour mettre en évidence un effet significatif des conditions d’élevage au regard de l’expérience acquise sur des études précédentes concernant ces différents paramètres.

Raffinement

Les animaux seront élevés en groupe et au sol sur une litière de copeaux de bois dans un bâtiment d’élevage standard. Ils disposeront de mangeoires circulaires pour la première semaine afin de permettre un accès plus facile à l’aliment puis ensuite de mangeoires linéaires qui sont plus hautes pour éviter le gaspillage alimentaire. L’accès à l’eau sera effectué avec des abreuvoirs en cloche. En dehors des repas, l’intensité lumineuse sera réduite à 5-10 lux pour limiter la nervosité des animaux. Le milieu sera enrichi avec des bottes de paille permettant aux animaux d’exercer une activité exploratoire en particulier lors de la période de restriction alimentaire. Les effets des conditions d’élevage sur le comportement et l’activité des animaux seront évalués à 35 jours pour la phase de croissance, à 85 jours pour la phase de restriction alimentaire et à 105 jours pour la phase d’alimentation à volonté à l’aide d’une méthode d’évaluation du bien-être. Cette méthode comporte 3 étapes : un questionnaire regroupant tous les indicateurs de moyens, qui sont liés à l’environnement de l’animal, des mesures de comportement sur un échantillonnage d’animaux et des informations sanitaires. Le comportement des animaux sera suivi quotidiennement afin de détecter tout risque de souffrance ou de mal-être. Une grille d'évaluation (indicateurs physiologiques, comportementaux et d'état corporel) sera mise en place afin d'assurer un suivi quotidien et de détecter précocement toute altération du bien-être des animaux. Toute manifestation de symptômes comportementaux persistants définis par un point limite (animal blessé et/ou prostré plus de 24 h et ayant cessé de s’alimenter et de s’abreuver) entrainera le retrait de l’animal de l’expérimentation pour un placement en infirmerie ou une mise à mort selon l’état corporel de l’animal.

Choix des espèces

L’objectif de ce projet est de tester une combinaison de leviers physiologiques et métaboliques susceptibles d’induire un engraissement du foie chez le canard en croissance. Il n’existe pas de modèle mathématique ni de test in vitro permettant d’atteindre cet objectif. La possibilité d’expérimenter chez l’animal cible du projet (canard) est la plus adaptée. Le canard mulard résulte du croisement d’un mâle Barbarie avec une femelle Pékin. Ces trois génotypes de canard ne présentent pas la même sensibilité aux variations de la photopériode et de la température, la même vitesse de croissance, le même comportement alimentaire, ni la même aptitude à la production de foie gras lorsqu’ils sont gavés. Ce projet a pour objectif d’explorer la réponse de ces génotypes face à une combinaison de différentes modalités de stimulation du développement des organes digestifs, de l’hyperphagie (surconsommation spontanée d’aliment) et de la capacité de synthèse et de stockage des lipides par le foie. Nous élèverons les canards de l’éclosion jusqu’à l’âge de 13 à 17 semaines correspondant à la période de distribution à volonté de l’aliment afin de suivre l'évolution hebdomadaire de l’engraissement du foie. Pour stimuler la surconsommation d’aliment et donc la synthèse de lipides par le foie, les canards vont être soumis au préalable à une période de restriction alimentaire pendant les semaines 11 et 12. Cette restriction alimentaire ne peut pas intervenir trop tôt dans la croissance des animaux afin d’éviter un impact à long terme sur leur développement corporel.

Deux heures de chirurgie pour fixer un support sur le crâne, jusqu'à quarante séances d'IRM en contention sur six à huit mois, une prise de sang par semaine pendant deux mois : 64 souris et 64 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certains reçoivent en plus une injection de virus fluorescent dans le cerveau pendant l'opération. Le projet est présenté comme une amélioration du bien-être des animaux non-humains, puisqu'il vise un berceau d'IRM plus confortable que les barres d'oreilles habituelles, et les prises de sang hebdomadaires dosent l'hormone du stress. Tous les rongeurs sont tués à la fin pour chercher dans leur cerveau les marqueurs moléculaires de ce même stress.

Objectifs

L'imagerie par résonance magnétique (IRM) est une technologie très courante. Une de ces applications, appelée IRM fonctionnelle (IRMf), permet d’obtenir des évaluations non invasives de l’activation cérébrale rendant ainsi possible un suivi à long-terme. Le développement de cette technique chez le rongeur, avec le but d’établir une cartographie fonctionnelle de leurs fonctions cognitives, permettra d’établir un lien avec la recherche humaine. Pour cela, il est nécessaire d’effectuer les mêmes modalités d’imagerie et dans les mêmes conditions physiologiques chez les rongeurs et dans l’espèce humaine. Jusqu’à présent, les contraintes liées à l’IRMf notamment en terme d’immobilité, ont conduit essentiellement à la réalisation de protocoles sur rongeurs anesthésiés. Cependant, l'utilisation d'anesthésiques pendant l'IRMf empêche toute investigation sur les modalités de traitement des informations par le cerveau de façon consciente . La réalisation d'études chez des animaux non anesthésiés présente donc un intérêt majeur. Nous souhaitons construire un tout nouveau berceau IRM qui sera utilisé dans un protocole d’habituation pour l'adaptation des rongeurs à l'environnement du scanner, améliorant ainsi le bien-être animal et permettant d’obtenir des résultats non biaisés par un état de stress et limitant le nombre de rongeurs nécessaires par étude car induisant une diminution des variabilités inter individus. Ce nouveau berceau sera jugé sur l’amélioration du confort des animaux lors des acquisitions IRMf et la diminution de leur niveau de stress. Les animaux seront maintenus à l’intérieur du berceau à l’aide d’un système de fixation implanté sur le dessus du crâne et évitant donc l’utilisation de la contention par des barres d’oreilles. De plus, l’innovation majeure de notre berceau sera la présence d’un tapis roulant placé dans le berceau qui permettra aux rongeurs de marcher à l’intérieur de l’IRM lors des sessions, ce qui aura pour effet de limiter leur niveau de stress. Une fois l’animal mis en confiance avec son environnement, il augmentera alors ses périodes d’inactivité pendant lesquelles les acquisitions IRM pourront avoir lieu.

Bénéfices attendus

L'imagerie par résonance magnétique (IRM) est une technologie d’imagerie médicale aujourd’hui très développée et répandue. Une de ces applications, appelée IRM fonctionnelle (IRMf), permet de visualiser, de manière indirecte, l’activité cérébrale. L’IRMf est un outil performant pouvant être utilisée sur un grand nombre d’animaux, ce qui en fait un pont majeur vers la recherche humaine. Le développement de cette technique chez le rongeur afin de pouvoir dresser une cartographie fonctionnelle des fonctions cognitives complexes et donc essentiel pour ensuite établir un lien translationnel entre la recherche animal et humaine. Cela nécessite que les acquisitions se déroulent dans les mêmes conditions à la fois chez l’homme et chez l’animal pour qu’une comparaison puisse se faire. Les acquisitions IRMf chez l’homme se font chez des patients éveillés c’est pourquoi la réalisation d'études chez des animaux non anesthésiés présente un intérêt majeur. De plus, les quelques exemples d’IRMf de rongeurs éveillés sont réalisés dans des conditions stressantes pour l’animal (fixés par des barres d’oreilles, maintenus immobiles…). L’intérêt de notre projet est donc de pouvoir réaliser des enregistrements en IRMf tout en améliorant le bien-être animal afin de réaliser des expériences plus fiables.

Procédures

Ce projet consiste à développer une technique fiable et appropriée d’IRM fonctionnelle chez le rongeur éveillé à l’aide d’un berceau innovant et d’un protocole d’habituation adapté. Pour pallier aux contraintes liées à l’IRMf en terme d’immobilité, les rongeurs devront être soumis à une procédure chirurgicale de courte durée (2h) afin de positionner un système de fixation. Lors de cette intervention, certains animaux recevront une injection (5min) de virus fluorescent au niveau des structures cérébrales. Cela permettra de mesurer lors des acquisitions IRM l’activité neuronale au niveau des structures ciblées. Ces acquisitions IRM auront une durée maximum de 2h en fonction du comportement de l’animal, avec un maximum de 2 séances par semaine (une période d’une semaine entière sera laissée à l’animal pour récupérer entre deux séances consécutives). L’objectif sera de pouvoir acquérir des données sur une période de 6 à 8 mois avec un maximum de 40 sessions sur cette période. En début de procédure, pendant une période de 2 mois, en plus des phases d’étude IRMf, les animaux auront des prélèvements sanguins réguliers (5min, 1 fois par semaine) afin de contrôler leur taux de corticostérone dans le sang (également appelée l’hormone du stress), et des tests de comportements visant à évaluer l’anxiété et la socialisation des animaux seront également réalisés chaque semaine (2 tests de 10min) pour compléter les résultats obtenus avec l’ensemble des données physiologiques.

Impact sur les animaux

Les chirurgies de mise en place des systèmes de fixation et d’injection de virus pourront entraîner des douleurs et/ou une perte de poids dans les jours suivants l’expérimentation. La présence d’un dispositif chirurgical intracérébrale pérenne pourra induire une gêne chez l’animal. Les premières sessions d’habituation pourront stresser les animaux induisant une modification du comportement. L’immobilisation par contention des animaux pourra induire un stress chez les animaux. Les prélèvements sanguins effectués chaque semaine pourront induire un stress chez les animaux.

Devenir

La suite du projet prévoit des analyses histologiques du cerveau afin d’étudier certains marqueurs moléculaires pouvant être lié à l’état de stress des animaux. Les animaux seront donc euthanasiés afin de conserver le cerveau dans un état le plus proche possible de son état physiologique.

Remplacement

L'imagerie par résonance magnétique (IRM) est une technologie d’imagerie médicale aujourd’hui très développée et répandue. Une de ces applications, appelée IRM fonctionnelle (IRMf), permet de visualiser, de manière indirecte, l’activité cérébrale. L’IRMf est un outil performant pouvant être utilisée sur un grand nombre d’animaux, ce qui en fait un pont majeur vers la recherche humaine. Le développement de cette technique chez le rongeur afin de pouvoir dresser une cartographie des fonctions cognitives complexes est donc essentiel pour ensuite établir un lien direct entre la recherche animale et humaine. Cela nécessite que les acquisitions se déroulent dans les mêmes conditions à la fois chez l’homme et chez l’animal pour qu’une comparaison puisse se faire. Les acquisitions IRMf chez l’homme se font chez des patients éveillés, et c’est pourquoi la réalisation d'études chez des animaux non anesthésiés présente un intérêt majeur pour la comparaison des données. De plus, les quelques exemples d’IRMf de rongeurs éveillés sont réalisés dans des conditions très stressantes pour l’animal (fixés par des barres d’oreilles, maintenus immobiles…), l’intérêt de notre projet est donc d’accéder à ces données tout en améliorant le bien-être animal afin d’obtenir des expériences fiables.

Réduction

Nous avons calculé le nombre de rongeurs à utiliser dans chaque groupe avec un logiciel de statistique et en s’appuyant sur des expériences antérieures similaires d’évaluation du niveau de stress lors d’acquisitions IRM sur rongeurs éveillés. Nous arrivons à 49 rongeurs par groupe. D’après notre expérience, nous savons que chaque rongeur a besoin d’un calendrier différent pour l’entraînement et que certains ne seront jamais en mesure de réaliser des acquisitions IRM éveillés dans de bonne condition, sans stress. Cette proportion d’animaux non entraînables est estimée à 30%. Nous souhaitons pouvoir mettre au point ce protocole à la fois chez la souris et chez le rat. De plus, le but étant de développer un protocole général qui sera utilisé par tout projet ultérieur, il va donc être nécessaire de faire des tests avec les deux sexes. Nous arrivons donc à un total de 128 animaux pour ce projet. Ce nombre pourra être diminué en analysant en continu les données enregistrées. Chaque rongeur étant acheté au fur et à mesure, il n’y aura donc pas d’animaux inutilisés.

Raffinement

Les critères qui seront les plus importants pour cette étude seront l’amélioration du confort des animaux lors des acquisitions IRMf et la diminution de leur niveau de stress. Tous les animaux seront surveillés tout au long de la procédure. Pendant les interventions chirurgicales les animaux sont anesthésiés et recevront un analgésique ainsi que des injections d’anesthétique locales afin d’éviter toutes douleurs. Pour le suivi post chirurgie d’implantation des posts de fixation, nous utiliserons une grille de score dans laquelle des points limites sont déterminés afin de s’assurer que l’état de santé des animaux ne se dégrade pas. Si une souffrance est observée, l'animal sera pris en charge, et des soins adaptés seront mis en place en fonction de son état avec administration d’analgésique pour pallier à cette souffrance. Si un des points limites est atteint alors l’animal sera sortie d'expérimentation.

Choix des espèces

Les résultats précliniques de l'IRMf sur les rongeurs (que ce soit les souris ou les rats) ont été vérifiés à plusieurs reprises chez l'homme, ce qui en fait un bon modèle pour tester des médicaments ou étudier des hypothèses sur le fonctionnement du cerveau. En outre, les scanners IRM précliniques ont de petites cavités, ce qui permet d'utiliser uniquement de petits animaux, et conviennent à l'IRMf sur les rongeurs. Enfin, nous utiliserons des rongeurs adultes mâles et femelles, car l'étude que nous voulons réaliser ne nécessite pas de rongeurs jeunes ou très jeunes. Nous n'utiliserons donc, que des rongeurs entre 2 mois et un an et demi.