Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
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Impact des filtres UV issus de crèmes solaires sur le développement larvaire du poisson clown Amphiprion ocellaris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
Toutes anesthésiées, photographiées sous loupe puis tuées au bout de quinze jours, 1 350 larves de poissons clowns vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Réparties par quinze dans des aquariums, elles subissent l'exposition aux résidus de cinq crèmes solaires à quatre concentrations, pour tester si les filtres UV perturbent leur métamorphose. Le porteur attend des malformations, un changement de comportement alimentaire et une gêne des échanges respiratoires liée à l'accumulation de filtres minéraux sur les branchies et la peau. Il retient cette espèce parce que son cycle de vie est entièrement maîtrisé au laboratoire, ce qui permet d'exposer les larves dès l'éclosion.
Objectifs
Les zones littorales connaissent une profonde érosion de la biodiversité marine et une altération des fonctions écologiques des écosystèmes en raison de pressions anthropiques accrues. Or, les écosystèmes marins côtiers jouent un rôle clé de nourriceries pour de nombreuses espèces d’organismes marins, notamment pour des poissons téléostéens. En effet, le cycle de vie de la majorité des espèces de poissons marins est composé de deux phases : une phase larvaire pélagique, suivie de phases juvénile et adulte durant lesquelles les individus intègrent leur habitat côtier définitif. Ainsi, dès leur plus jeune stade de vie, le risque d’exposition à divers stress environnementaux est important, pouvant perturber la transition entre les phases larvaire et juvénile, caractérisée par le processus physiologique sensible de la métamorphose, contrôlée par les hormones thyroïdiennes. Dans ce contexte, notre objectif est d'évaluer la toxicité des filtres UltraViolet (UV) relargués dans les résidus de 5 crèmes solaires différentes sur une espèce de poisson téléostéen marin, le poisson clown Amphiprion ocellaris dont le cycle de vie est maitrisé dans notre laboratoire. D’éventuelles perturbations endocriniennes sur la phase de métamorphose seront recherchées au cours du développement larvaire, par une approche intégrative s’appuyant sur des biomarqueurs de la métamorphose i) anatomiques (croissance, pigmentation), ii) physiologiques (activation de la transcription de gènes de l’axe endocrine hypothalamo-pituitaire thyroïdien, dosages des hormones thyroïdiennes T3 & T4).
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif d’évaluer le rôle des FUV contenus dans les crèmes solaires en tant que perturbateur endocrinien, en observant leur impact sur le développement larvaire d'une espèce tropicale de poisson télostéen. Comprendre quelles sont les répercussions des FUV sur le développement larvaire permet de jauger l'incidence qu'ils peuvent avoir durant la phase cruciale de recrutement larvaire ce qui, à terme pourrait impacter le stock des adultes en milieu récifal.
Procédures
Après éclosion des oeufs les larves seront réparties par 15 dans des aquariums afin d'être exposées aux différentes conditions expérimentales (contrôle ou exposition aux polluants). Après les 15 jours d'élevage, les larves seront individuellement anesthésiées puis photographiées sous loupe binoculaire avant d’être euthanasiées.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux résultent du stress lié à l'exposition des larves d'A. ocellaris aux FUV, un changement de comportement alimentaire, une perturbation du développement larvaire avec l'apparition éventuelle de malformations, ainsi qu’un déréglement des échanges ioniques et/ou de la diffusion de l'oxygène lié à l'accumulation des filtres UV minéraux sur les branchies et/ou la peau des larves.
Devenir
L'ensemble des animaux sera euthanasié à la fin de l’élevage afin de procéder aux différentes analyses.
Remplacement
L'étude écotoxicologique comprend i) une exposition aux polluants en milieu contrôlé ii) puis le dosage hormonal des larves, iii) et l'analyse de l'expression de gènes cibles. Il s’agit donc de mécanismes non modélisables car s'appliquant à des organismes vivants dans l’intégrité et la complexité qui leur sont propres. Ainsi, aucune expérience in silico ou in vitro ne permet d'accéder à ce type de données. Par conséquent, il n'existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet et l'utilisation du modèle animal est incontournable.
Réduction
La planification du design expérimental a été faite afin de réduire le nombre d’individus échantillonné pour l’ensemble des conditions testées permettant une analyse statistique pertinente, c’est-à-dire en triplicat pour chacune des concentrations de crèmes testées à savoir 5 crèmes FUV * 4 concentrations * 3 (triplicat) = 60 concentrations de FUV. A cela s'ajoute les 2 conditions contrôles (eau de mer et eau de mer avec une crème sans filtre) qui doivent être faite pour chaque ponte élevée. De ce fait, en fonction de la quantité d’œufs par ponte, nous optimiserons l’utilisation de chaque ponte afin de minimiser le nombre de condition contrôle et donc le nombre total d'individu nécessaire à notre projet. De plus, les larves retrouvées mortes durant la période d'élevage ne seront pas remplacées. Nous avons pu réduire notre échantillonnage en adaptant le protocole afin de combiner les mesures morphologiques (patron de pigmentation) et les analyses de biologie moléculaire sur les mêmes individus, au lieu d'utiliser 2 lots d'individus différents pour ces deux types de mesure ce qui aurait doublé le nombre total d'individu utilisé.
Raffinement
Les individus seront élevés selon le protocole développé et maîtrisé au sein de notre service d’aquariologie. Ce protocole a été développé pour que le bien-être des larves soit optimal, permettant une bonne croissance et une bonne survie. Notamment, une attention particulière et quotidienne sera portée tout au long de ce projet sur la température et la salinité de l'eau, deux facteurs importants de source de stress. Par ailleurs, le bien-être des individus sera assuré par un personnel compétent 7J/7J pour l’observation et le soin des animaux. Si toutefois un individu cumul différents points limites tels que le rejet de nourriture, l'hyperactivité ou l'hypoactivité, des comportements inhabituels se traduisant par une perte d'équilibre, alors l'individu concerné sera exclu de la phase expérimentale et sera euthanasié par surdosage d'anesthésique (MS222 tamponné, 200 mg/L).
Choix des espèces
Le poisson clown Amphiprion ocellaris a été choisi comme un modèle adapté pour mener à bien ce projet. En effet, il s'agit d'un modèle pertinent écologiquement pour l'étude du développement larvaire d'un poisson téléostéen tropical caractéristique de milieux pouvant être sujet à la toxicité des filtres UV issus des crèmes solaires. Par ailleurs, le cycle de vie de cette espèce est entièrement maîtrisé au sein de notre laboratoire et permet donc d'exposer les larves aux FUV à des stades précoces de développement. Les larves seront exposées aux FUV de l’éclosion jusqu’à 15 jours post-éclosion. Ce temps d’exposition aux FUV a été défini afin d’évaluer leur impact sur le développement larvaire et plus particulièrement pour réaliser des analyses en encadrant la période de pic de la métamorphose d’A. ocellaris.
DEVOFIL -Développement des filaires et de leurs symbiontes associés chez les rongeurs
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
1 015 mérions vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun recevant dans l'abdomen 80 filaires parasites dont une trentaine survit et douze femelles seront analysées. Un groupe reçoit un antibiotique deux fois par jour pendant quatorze jours à partir du quarantième jour d'infection, un autre un antihelminthique deux fois par jour pendant cinq jours, et tous subissent un prélèvement de sang sous anesthésie locale à 70 puis à 90 jours. La mise à mort sert à récupérer les filaires logées dans les espaces péritonéal et pleural. L'effectif est calculé à l'envers, à partir des 12 180 filaires femelles voulues, ce qui donne le nombre de mérions à infester.
Objectifs
Les parasitoses comme les filarioses affectent des millions de personnes dans les zones tropicales. Les filaires sont des nématodes parasites de l’homme et de nombreux vertébrés terrestres et sont toujours transmis par des arthropodes hématophages, comme des acariens. Le développement de résistance aux traitements actuels et l’absence de vaccin justifient la demande pour de nouvelles études en particulier sur des modèles animaux de références pour analyser le développement parasitaire, les réponses immunitaires, et les pathologies. Nous utilisons un modèle de filariose chez les rongeurs avec la filaire Litomosoides sigmodontis, laquelle présente de nombreuses caractéristiques proches de celles des filaires de l’homme. Les bactéries Wolbachia vivent dans une interaction mutuellement bénéfique dans certains compartiments spécifiques des filaires. Elles sont essentielles pour la survie et la fertilité des filaires et l’élimination de la bactérie par des traitements antibiotiques conduit à des retards de développement, une réduction de la longévité des filaires adultes et à la stérilité des femelles. Pour se déplacer dans les filaires, les bactéries utilisent un réseau composé de microtubules, des assemblages de protéines tubulines. De ce fait tout traitement déstabilisant le réseau de microtubules aura un effet sur les Wolbachia et donc sur la santé des filaires. Le projet a pour objectifs : 1/ d’étudier le réseau de microtubules dans les filaires au cours du développement chez le rongeur ; 2/ d’analyser la localisation et la quantité de Wolbachia dans les filaires au cours du développement de la filaire chez le vertébré ; 3/ d’estimer l’impact sur le développement bactérien et filarien de traitements antibiotiques ou antihelminthiques visant le réseau de microtubules.
Bénéfices attendus
Une meilleure connaissance du développement filarien et de la répartition de ses bactéries endosymbiotiques Wolbachia devrait permettre de mieux connaitre le mode d'action de traitements anti-filarien et anti-Wolbachia.
Procédures
Tous les animaux auront une injection intrapéritonéale de parasites (filaires) au temps 0. Un groupe recevra un traitement antibiotique par voie orale qui débute au 40ème jour de l'infection et qui est administré deux fois par jour pendant 14 jours, un autre groupe recevra un traitement antihelminthique( visant donc les nématodes donc les filaires) benzimidazole par voie orale qui débute au 35ème jour de l'infection et qui est administré deux fois par jour pendant 5 jours. Un troisième groupe contrôle n’est pas traité. Un prélèvement sanguin de 10µl sous anesthésie locale (lidocaine) pour établir la microfilarémie (nombre de stades sanguins des filaires) des mérions à 70 jours et 90 jours post infection sera effectué.
Impact sur les animaux
Les nuisances sont liées à l'infection filarienne. Elle est peu symptomatique et on n’observe pas de mortalité augmentée due à l’infection. Une surveillance journalière est opérée pour identifier d'éventuels effets indésirables, comme une perte de poids, une modification de l’aspect physique ou du comportement sur les animaux
Devenir
Euthanasie pour accéder aux filaires qui résident dans l'espace péritonéal et l'espace pleural du mérion
Remplacement
Le recours aux animaux se justifie dans la mesure où il n'existe actuellement aucun modèle alternatif permettant d’étudier les filarioses à tous les stades de développement de la filaire. Le cycle de vie est complexe et les filaires muent difficilement en culture et ne se reproduisent pas dans ces conditions.
Réduction
Le nombre de mérions est estimé au plus près des nombres de filaires femelles attendus et nécessaires pour réaliser toutes les analyses. Pour éviter les problèmes de compétitions en parasitologie (trop de parasites) qui ont un impact négatif sur le développement du parasite, les mérions sont infestés avec 80 filaires; cependant comme pour toutes les filarioses seules une partie des filaires survivent à la réponse immunitaire de l'hôte vertébré; dans le couple mérion-filaire Litomosoides sigmodontis, 30% des filaires inoculées survivent soit 24 filaires par mérion; le sex-ratio est de 50/50 et les études impliquant une caractérisation de l'embryogénèse/l'ovogénèse, seules les filaires femelles seront analysées ce qui représente 12 femelles par mérion. La totalité des analyses nécessite 4860 filaires femelles issues de 405 mérions non traités, 4860 filaires femelles issues de 405 mérions traités par un benzimidazole, 2460 filaires femelles issues de 205 mérions traités par antibiotique. Ces nombres de filaires sont déterminés de façon à avoir suffisamment de matériel en protéine ou en acides nucléiques et une puissance statistique suffisante pour valider le résultat observé
Raffinement
Les mérions sont dans un environnement adapté à leurs besoins (dimensions de la cage, nourriture, enrichissement, température et cycle jour/nuit). Entre autre, ils seront hébergés dans un environnement enrichi, avec un substrat pour faire leur nid et des objets à ronger. Une surveillance journalière des animaux est réalisée par un personnel compétent qui connait bien cette espèce.
Choix des espèces
Le mérion est l'animal le plus proche de l'hôte naturel de la filaire Litomosoides sigmodontis (même durée de l'infection filarienne, charge microfilarienne comparable...) ce qui permet d'étudier le développement de la filaire dans les conditions les plus proches de son environnement vertébré normal. Les animaux sont utilisés au stade adulte.
Etude intégrative de l’influence du paysage chimique sur les larves de poissons clowns (Amphiprion ocellaris)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Pour mesurer si des larves de poissons clowns préfèrent une eau marquée par des congénères ou par des anémones, 300 larves vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque larve est déplacée au bécher dans un aquarium à deux compartiments, dix minutes d'acclimatation puis vingt minutes de test filmé, avant d'être tuée par surdosage d'anesthésique et congelée pour analyser l'expression de ses gènes. Le porteur affirme qu'aucune expérience in silico ou in vitro ne donne accès à ce type de données et que le recours à l'animal est "incontournable". Une larve qui rejette la nourriture, s'agite, s'immobilise ou perd l'équilibre est retirée de l'expérience, puis tuée si son état se dégrade.
Objectifs
La majorité des poissons des récifs coralliens possède un cycle de vie biphasique comprenant une phase larvaire pélagique suivie d’une phase juvénile et adulte en milieu récifal. Le passage entre la phase pélagique et récifale, appelée recrutement larvaire, constitue une étape clé dans la vie de ces jeunes poissons. Durant cette période cruciale les larves subissent une métamorphose régie par les hormones thyroïdiennes impliquant des changements comportementaux, morphologiques et physiologiques. Ce remodelage intégratif comprend notamment le développement des capacités sensorielles, pouvant contribuer à l’orientation des larves vers leur habitat côtier définitif. Les environnements pélagique et récifal diffèrent notamment par leur paysage chimique, c’est-à-dire un ensemble de molécules chimiques qui émanent des organismes qui les peuplent. Cette différence est notamment le résultat d’une biodiversité riche dans les récifs, avec la présence abondante de différentes espèces de poissons, de coraux, d’anémones dans un espace plus restreint qu'en milieu océanique. L’objectif de ce projet est d’étudier l’influence du paysage chimique au moment de la période de recrutement (15 à 20 jours après l’éclosion des œufs) sur le comportement et la physiologie des larves du poisson clown Amphiprion ocellaris. De cette façon, des eaux caractérisées par différentes signatures chimiques (eau de mer contrôle, congénères ou anémones) seront proposées aux larves afin d'évaluer leur préférence chimique. A la suite de ces tests, nous allons faire des analyses d'expression génique sur ces larves afin d'évaluer l'influence de la présentation de ces signaux chimiques au sein du système nerveux.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permet de comprendre l'implication du paysage olfactif lors du processus de recrutement des larves d'A. ocellaris et de cerner les signaux spécifiques impliqués dans l’orientation des larves pour rejoindre leur habitat définitif. Comprendre le processus initial de recrutement des larves est nécessaire pour préserver les populations de poissons de récif coralliens notamment pour, par la suite, évaluer comment un stress d'origine anthropique entraînant une dégradation des récifs coralliens peut altérer cette phase cruciale.
Procédures
Après l'élevage, les larves seront récupérées délicatement à l'aide d'un bécher, afin d'être déposées dans l'aquarium de choix pour une durée de 30 minutes. Le test se déroule en deux partie, une première phase de 10 minutes d’acclimatation des larves dans le compartiment de dépôt, suivi de 20 minutes de test où la cloison qui sépare les 2 compartiments est retirée et les larves sont libres de se déplacer d’un compartiment à l’autre. Les 20 minutes de test sont filmés et serviront à l'analyse comportementale. A la suite du test, les individus seront euthanasiés dans un récipient comprenant une solution d’anesthésique en surdosage (MS-222 tamponné, 250mg/L), puis stockés au -20°C jusqu’aux analyses de biologie moléculaire.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux résultent du stress lié au déplacement des larves d'A. ocellaris dans un nouvel environnement. En effet, bien que minime, le stress perçu pourrait provenir de la manipulation des larves et de la découverte d'un nouvel environnement avec moins d'espace pour se mouvoir et également moins de congénères que dans le bac d’élevage.
Devenir
L'ensemble des animaux sera euthanasié à la fin de la phase comportementale afin de procéder aux différentes analyses d'expressions géniques de l'axe hypothalamo-hypophyso-thyroïdien (HPT).
Remplacement
L’étude comportementale ainsi que l’analyse d’expression génique sont des mécanismes non modélisables car s’appliquant à des organismes vivants dans l’intégrité et la complexité qui leur sont propres. Ainsi, aucune expérience in silico ou in vitro ne permet d’accéder à ce type de données. Par conséquent, il n’existe aucune méthode alternative à la réalisation de ce projet et l’utilisation du modèle animal est incontournable.
Réduction
L’ensemble de la planification expérimentale, a été fait dans l’optique de réduire le nombre d’individus permettant une analyse statistique pertinente. Compte tenu de la multiplicité des réponses qui semblent possible au cours des 20 minutes de test (aller-retour multiples) nous avons choisi de faire passer 12 tests par condition. Afin de réduire le nombre d’individus utilisés et optimiser leur utilisation, chacun des individus permettra 3 analyses différentes (comportementale, quantification et localisation de l’expression génique).
Raffinement
Dans le cadre du protocole d'élevage larvaire développé dans notre laboratoire nous élevons les larves dans la pénombre et dans un milieu comprenant une algue verte, ce qui rend l'eau turbide et permet aux larves de se cacher. Une attention particulière et quotidienne sera portée sur la température et la salinité de l'eau, deux facteurs importants de source de stress. Pour améliorer la communication 7J/7J, un cahier de suivi des élevages sera mis en place afin de noter les comportements anormaux des individus au fil de l’expérience. Si un individu cumule différents points limites (rejet de nourriture, hyperactivité, hypoactivité, déplacements inhabituels se traduisant par une perte d'équilibre) il sera exclu de la phase expérimentale afin d’être surveillé dans un aquarium contrôle. Si nous remarquons que l'état de l'individu se dégrade, nous prendrons la décision de l'euthanasier par surdosage d'anesthésique (MS222 tamponné, 250 mg/L).
Choix des espèces
Le poisson clown Amphiprion ocellaris a été choisi comme un modèle adapté pour mener à bien ce projet. Il s'agit d'un modèle pertinent pour les études écologiques du recrutement larvaire. La structure sociale et la relation de symbiose établie entre le poisson clown et son anémone hôte apparaissent comme des ressources clés lors de la phase de recrutement larvaire. Par ailleurs, le cycle de vie de cette espèce est entièrement maîtrisé au sein de notre laboratoire. Nous avons choisi de travailler sur des larves en cours de métamorphose âgées de 15 à 20 jours après éclosion des oeufs. Ces stades ont été privilégiés car ils correspondent à la période de recrutement en milieu naturel (passage du milieu océanique au milieu récifal).
Conséquences de l’invalidation simultanée de facteurs circulants hépatiques impliqués dans l’angiogenèse sur le système vasculaire de la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Des souris génétiquement modifiées, privées dès la naissance de deux facteurs produits par le foie, BMP9 et BMP10, sont élevées pour tenter de reproduire la maladie de Rendu-Osler, qui fragilise les vaisseaux sanguins. 340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou menées sous anesthésie sans réveil. Selon le porteur, beaucoup de nouveau-nés de cette lignée semblent ne pas survivre à la mise-bas, sans que l'équipe sache encore quand ni pourquoi, et des femelles gestantes sont tuées pour le découvrir. Chez les adultes, gardés jusqu'à huit mois, l'équipe attend un élargissement des vaisseaux et des connexions anormales entre artères et veines. En fin de procédure, ou plus tôt si des signes de souffrance apparaissent, ils reçoivent un analgésique, une anesthésie, puis une perfusion de fixateur ou jusqu'à trois injections, et sont tués sans réveil pour le prélèvement de leurs organes.
Objectifs
La maladie de Rendu-Osler est une maladie génétique héréditaire qui fragilise les vaisseaux sanguins et qui se manifeste par des hémorragies, par l’élargissement des vaisseaux sanguins au niveau de la peau et des muqueuses ainsi que des malformations entre les artères et les veines. Cette maladie peut conduire à des complications sévères touchant différents organes : atteinte du foie pouvant nécessiter une greffe, rupture de vaisseaux au niveau du foie, des poumons et dans des cas très rares dans le cerveau. Le diagnostic est souvent tardif car les symptômes se manifestent autour de 40 ans avec une grande variété de symptômes. Il s’agit d’une maladie génétique rare (1 cas sur 6000 naissances) dont la prise en charge et le contrôle des symptômes est difficile. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la maladie pour développer de nouvelles approches thérapeutiques. Parmi les acteurs impliqués dans le développement de la maladie de Rendu-Osler, se trouvent des facteurs circulants dont l’origine peut être cardiaque ou hépatique. Les rôles spécifiques de chacun de ces facteurs ne sont pas identifiés. Nous générons des modèles de souris ayant perdu l’un des facteurs, cardiaque, ou hépatique. L’objectif de ce projet est de prouver que le facteur essentiel permettant de protéger les souris du développement de la maladie de Rendu-Osler proviendrait du foie et non du cœur, hypothèse de travail à valider auprès de la communauté scientifique. Nous étudierons les vaisseaux de différents organes, et notamment ceux touchés dans la maladie de Rendu-Osler (poumons, foie) afin de déterminer si la perte de ces facteurs permet de reproduire la maladie. Ces étapes sont essentielles à la compréhension du mécanisme de développement de la maladie et sont nécessaires à l’identification de nouvelles pistes de traitement des patients atteints de Rendu-Osler.
Bénéfices attendus
Notre étude vise à identifier les conséquences de la perte d’expression simultanée de facteurs circulants impliqués dans la formation des vaisseaux sanguins et produits dans le foie. Ces facteurs, nommés BMP9 et BMP10 sont nécessaires pour protéger d’une maladie vasculaire, la maladie de Rendu-Osler. On peut anticiper que les défauts vasculaires que l’on va observer s’apparenteront à ceux de la pathologie humaine (mauvaises connexions entre les artères et les veines, hémorragies). Il est attendu que ces phénotypes apparaissent sur les animaux adultes comme c’est le cas dans la pathologie humaine. Ces résultats apportent des connaissances fondamentales sur une meilleure compréhension du développement de la maladie. Actuellement, seuls des traitements pour limiter les symptômes ou leurs effets existent l (traitement contre les saignements de nez, transfusion sanguine pour limiter les effets des hémorragies…) mais il n’y a pas de traitement curatif de la maladie. A court terme, des connaissances apportées par des publications scientifiques sont attendues visant à élaborer de nouvelles stratégies thérapeutiques (à moyen-long terme). C’est la première fois que des souris n’exprimant plus ces deux ligands, BMP9 et BMP10 hépatiques, et ce depuis la naissance, sont générées et nous espérons obtenir un nouveau modèle murin reproduisant les symptômes de la pathologie.
Procédures
Les animaux adultes recevront un analgésique 30 minutes avant l’anesthésie puis ils seront anesthésiés avant toute intervention (5 à 10 minutes avant tout geste invasif). Les gestes invasifs peuvent être une perfusion PFA pendant 15 minutes ou une injection d’un produit qui diffuse dans l’organisme pendant 10 à 15 minutes soir au total un maximum de 3 injections /animal. Les animaux ne sont pas réveillés à l’issue des procédures.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus concernent essentiellement les nouveau-nés, ou les fœtus en fin de gestation. Une précédente étude a montré que lors de la mise en place de l’élevage, le nombre de nouveau-nés n’exprimant pas les deux ligands était réduit par rapport à celui de nouveau-nés d’un élevage classique. Dans l’état actuel du projet, on ne sait pas encore quand et pourquoi les animaux génétiquement modifiés sont en nombre plus faibles le lendemain de la mise-bas: Une perte de fœtus est possible pendant la gestation ou au moment de la mise-bas. Nous attendons par contre des effets indésirables modérés chez l’adulte qui reproduisent certains symptômes de la maladie de Rendu-Osler (élargissement des vaisseaux, mauvaises connexions entre les artères et les veines). Il s’agit d’une maladie évolutive avec l’âge, les symptômes s’aggravant après 40 ans chez l’homme.
Devenir
Les protocoles nécessitent qu’à la fin de chaque procédure, tous les animaux soient euthanasiés, afin de récupérer les organes.
Remplacement
In vitro, les molécules que nous étudions sont deux molécules aux fonctions très similaires : L’une provient du foie, l’autre du cœur mais seule leur origine tissulaire, du foie ou du cœur permet de comprendre l’importance de chacune des molécules, dans le contexte d’un organisme vivant. Une de ces molécules contrôlent le développement des vaisseaux sanguins et on ne peut donc pas remplacer nos modèles animaux, ayant perdu l’expression des molécules spécifiquement dans un seul organe (en l’occurrence le foie) par des modèles in vitro pour démontrer l’importance de la source de production hépatique. La source principale de production est le coeur, et nos résultats indiquent pour la première fois un rôle essentiel de l’origine hépatique qui n’est pas du tout connu par la communauté scientifique et qui sera un élément déterminant pour comprendre comment la maladie de Rendu-Osler se développe avec l’âge.
Réduction
Nous avons effectué une analyse précise permettant de déterminer la taille des groupes nécessaires. Dix souris par groupe seront nécessaires. Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, les animaux reproduisant les symptômes de la maladie de Rendu-Osler sont générés uniquement pour rentrer dans une procédure mais ne sont pas utilisés pour la reproduction.
Raffinement
Les animaux sont surveillés quotidiennement par les zootechniciens (personnel assurant au sein de l’établissement des activités d'élevage ou de maintenance des d'animaux selon des protocoles établis). Les changements de litière, de biberon et l’apport d’alimentation sont pris en charge par les zootechniciens de façon quotidienne, y compris les week-end. Les cages contiennent des petites maisons et du matériel de nidification changé régulièrement comme dispositif d’enrichissement. Les femelles gestantes seront surveillées étroitement pendant la fin de la gestation et les nouveau-nés seront observés tous les jours dès la mise-bas. Chez les souris adultes, une mise en place de point limite permettra de s’assurer du bien-être des animaux. les animaux rentrent en dans une procédure expérimentale immédiatement si des signes de souffrance apparaissent. L’ensemble des interventions sera effectué sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Les souris utilisées dans ce projet seront des souris génétiquement modifiées pour deux molécules jouant un rôle clé dans la maladie de Rendu-Osler , l’une d’origine cardiaque, l’autre d’origine hépatique. Ce modèle de souris est le seul existant actuellement permettant d’évaluer l’importance de la molécule hépatique, alors que toutes les recherches se sont jusqu’à présent consacrées au rôle global de la molécule, sans chercher à discriminer si l’origine tissulaire avait une importance. Pourtant il semble que les défauts de développement vasculaire sanguin de la pathologie de Rendu-Osler soit liés uniquement à la molécule hépatique. Pour évaluer le rôle de la molécule hépatique, les animaux seront utilisés à plusieurs stades : de la fin de la gestation et jusqu’à 8 mois maximum pour éviter l’aggravation des symptômes pouvant évoluer avec l’âge. Il semble que beaucoup de nouveau-nés génétiquement modifiés ne survivent pas à la mise-bas. Nous devons donc évaluer si les souris ont un problème de développement in utero, ou à la mise-bas. Pour répondre à cette question, des souris gestantes seront euthanasiées. Une étude sur des animaux jeunes (jour 6 ou 7 après la naissance) permettra également d’étudier le développement des vaisseaux sanguins juste après la naissance dans un modèle très couramment dans les laboratoires de recherche sur le système vasculaire. Enfin ces animaux seront suivis tout au long de leur vie, et les expériences seront réalisées sur des animaux adultes entre 3 mois et 8 mois pour déterminer les défauts vasculaires similaires à la pathologie de Rendu-Osler.
Rôle de la protéine POBE1 dans le choc endotoxiques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Injectées dans l'abdomen avec du LPS bactérien pour déclencher un choc endotoxique, 44 souris seront toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. L'injection peut provoquer une perte de plus de 20 % du poids, des poils hérissés, une prostration et une chute de la température corporelle, une partie des souris recevant en plus un transpondeur sous-cutané et un prélèvement de sang. Le porteur indique avoir déjà montré sur cellules le rôle de la protéine étudiée dans la détection du LPS, et conclut que le modèle souris reste "indispensable". Il annonce des points limites "précoces et prédictifs" sans dire lesquels, et justifie l'effectif par des outils statistiques qu'il ne nomme pas.
Objectifs
Ce projet a pour but d’étudier la réponse immune au choc endotoxique déclenché par la détection de produits bactériens, une réponse d’importance médicale chez l’humain. Le choc endotoxique correspond à la sur-activation du système immunitaire lors d'une infection bactérienne, qui peut entraîner une défaillance des organes et la mort. Lors de l’infection par une bactérie, des cellules du système immunitaire nommées macrophages détectent le pathogène et déclenchent une réponse immune en produisant de petites molécules « alarmes » nommées cytokines inflammatoires. Ce sont ces cytokines qui permettent la mise en place d’une réponse antibactérienne efficace. Ce projet apportera une réponse quant à l’importance de POBE1 dans la réponse antibactérienne. POBE1 est aussi exprimée par les cellules humaines, et nos données indiquent que i) POBE1 participe à l’immunité antibactérienne dans des cellules humaines en culture et ii) l’histoire évolutive de POBE1 dans la population humaine est compatible avec son rôle comme acteur de l’immunité. Ce projet est donc un premier pas dans l’étude de l’importance de POBE1 chez les patients. La démonstration éventuelle du rôle pivot de POBE1 dans le déclenchement du choc endotoxique ouvre la voie à la création de molécules thérapeutiques inhibitrices de POBE1 ayant pour but de limiter le choc endotoxique chez les patients.
Bénéfices attendus
La réponse immune antibactérienne n’est pas totalement comprise. Nous avons récemment découvert une protéine nécessaire à l’activation du système immunitaire au cours d’une infection bactérienne. Ce projet propose d’analyser son rôle in vivo. À long terme, ce projet pourrait apporter la preuve que notre protéine d’intérêt joue un rôle in vivo dans la protection antibactérienne, ouvrant la voie à l’étude de cette protéine chez les patients. Nous explorons notamment des stratégies thérapeutiques utilisant des molécules inhibitrices de POBE1 pour limiter le choc endotoxique.
Procédures
Les animaux vigiles recevront une injection de produit directement dans l’abdomen (durée du geste inf à 5 sec). Un transpondeur sous-cutané sera ensuite posé sur une partie de ces animaux (durée du geste inf à 5 sec) puis un prélèvement sanguin sera réalisé sur ces animaux (durée du geste inf à 1min)
Impact sur les animaux
L’injection de LPS en intra-péritonéal au moyen d’une aiguille entraîne une douleur transitoire due à la piqure. L'injection de LPS intra-péritonéale peut entraîner, en fonction de la dose : - Une cachexie (perte de poids >20% du poids initial) - Poils hérissés et prostration - Une altération de l’état général - Une baisse de température corporelle
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort en fin de procédure pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Les premières étapes d’analyse et de validation in vitro ont démontré que POBE1 participe à la détection du LPS bactérien. Des cellules déficiente en POBE1 ne produisent plus de cytokines inflammatoires en présence de LPS, et contrôlent moins efficacement l’infection par Salmonella. Le projet a pour but maintenant d’étudier le rôle dans la réponse inflammatoire antibactérienne de notre protéine d’intérêt chez la souris, organisme vivant intégré et autonome. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours (culture cellulaire), l’utilisation du modèle Souris reste indispensable pour le présent projet.
Réduction
Le nombre de souris par groupe a été défini à minima. Pour ce faire, nous allons effectuer une étude préliminaire avec un nombre de souris réduit. Le nombre d'animaux a utiliser dans les groupes dans les groupes a été déterminé à l'aide d'outils statistiques.
Raffinement
Les souris sont manipulées sans stress par des personnels compétents. Le bien être des souris sera suivi quotidiennement. Les points limites conduisant à la mise à mort des souris seront précoces et prédictifs. Une grille de score permettra d’évaluer de façon objective l’état des animaux.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche antibactérienne : souches murines parfaitement définies et modèles génétiquement modifiés, avec de grandes similarités entre les systèmes immunitaires humains et murins qui permet de transposer nos découvertes dans le modèle murin chez l’humain. De plus, nous avons documenté de manière robuste l’existence de notre protéine d’intérêt chez la souris. Souris adultes ( sup 6 semaines) dans lesquelles la réponse immune antibactérienne est active
Etude de l’effet de l’invalidation du récepteur Sodium-glucose transporter 3 (SGLT3) sur la détection du glucose chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Pesées deux fois par semaine pendant huit semaines, dont la moitié sous régime hypercalorique jusqu'à peser près de 50 grammes et devenir prédiabétiques, 144 souris reçoivent ensuite un gavage de glucose ou une injection d'insuline, puis six prélèvements de sang à la queue en deux heures. Quarante-huit autres passent seize heures à jeun avant deux prélèvements, et vingt-quatre subissent une contention de trente minutes, un stress que le porteur présente comme "nécessaire" à l'activation de l'axe nerveux étudié. Au total 216 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue, pour analyser leur métabolisme du glucose et leur régulation du stress.
Objectifs
L’obésité et le diabète de type 2 connaissent une croissance alarmante. La dérégulation de l’équilibre de la glycémie (concentration de sucre (ou glucose) dans le sang), notamment chez des personnes diabétiques ou obèses, est un problème majeur de santé publique nécessitant une recherche constante quant aux thérapies proposées. Dans cet optique, le récepteur de glucose SGLT3 (pour sodium-glucose transporter 3) est une cible de choix. En effet, l’expression ce récepteur, présent dans les neurones de l'intestin grêle et dans les régions du cerveau qui contrôle la faim– est diminuée chez des souris obèses et varie également après une chirurgie gastrique, un traitement très efficace de l'obésité sévère, en particulier chez les patients diabétiques. Néanmoins, ces différentes études anatomiques et fonctionnelles restent aujourd’hui incomplètes pour définir le rôle de SGLT3 dans la détection du glucose et l’équilibre de la glycémie. Ce projet vise à déterminer si la détection du glucose par le récepteur SGLT3 est important dans le contrôle de la glycémie et du poids et, à plus long terme, de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques dans le cadre de l’obésité et du diabète. Pour cela, nous étudierons une lignée de souris transgéniques qui n’expriment pas le récepteur de glucose SGLT3.
Bénéfices attendus
Les résultats issus de ce projet nous permettrons de compléter les travaux sur les mécanismes de détection du sucre-glucose et de transmission des informations de l’alimentation envoyées par l’intestin. En effet, plusieurs études ont suggéré que SGLT3 est impliqué dans le métabolisme du sucre, notamment dans des situations pathologiques telles que l’obésité. Néanmoins ces travaux n’ont pas encore permis de montrer précisément le rôle de SGLT3. Ce projet nous permettra peut-être d’identifier une nouvelle cible de choix dans la lutte contre l’obésité et ses complications.
Procédures
-144 souris (72 nourries avec un régime standard et 72 nourries avec un régime hypercalorique) seront pesées et leur prise alimentaire sera mesurée deux fois par semaine pendant 8 semaines. Ces souris recevront ensuite soit un unique gavage avec une solution de glucose, soit une unique injection d’insuline (d’une durée d’environ 45 secondes par souris pour chaque geste). Des mesures de glycémie par prélèvement d’une goutte de sang (d’une durée d’une dizaine de secondes) au bout de la queue seront réalisées 0,15,30,60,90 et 120 minutes après le gavage ou l’injection. - 48 souris seront mises à jeun pendant 16h et subiront 2 prélèvements d’une goutte de sang (d’une durée d’une dizaine de secondes) au bout de la queue. - 24 souris subiront un test de contention d’une durée de 30 minutes ainsi que 3 prélèvements d’une goutte de sang (d’une durée d’une dizaine de secondes) au bout de la queue.
Impact sur les animaux
- Des hypoglycémies peuvent survenir lors du test de tolérance à l’insuline. Le contrôle régulier de la glycémie permettra d’anticiper une baisse de la glycémie trop importante. - Le jeûne de 16h ainsi que le test de contention vont entrainer un stress de l’animal, nécessaire à l’activation de l’axe nerveux que nous étudions ici. - Le régime hypercalorique favorise la prise de poids et l’induction du diabète. Après 8 semaines de régime, les souris WT sont prédiabétiques et en surpoids (environ 50g) mais sans impact sur leur mobilité. - Les souris recevant un gavage de glucose oral pourront présenter une légère irritation de l’œsophage.
Devenir
A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort afin d’étudier différents paramètres de leur métabolisme glucidique ainsi que de leur régulation du stress.
Remplacement
Cette étude ne peut pas être réalisée sur cellules ou organoïdes car la détection du glucose a des impacts sur l’ensemble du corps et implique des dialogues entre organes. En effet, le glucose produit par l’intestin est détecté dans les vaisseaux et active un signal nerveux vers le cerveau. En réponse, le cerveau va émettre des signaux nerveux en périphérie qui ont des effets bénéfiques anti-obésité et anti-diabète. Pour comprendre comment la production intestinale de glucose exerce ses effets bénéfiques, il est donc nécessaire de l’étudier dans l’organisme entier.
Réduction
Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances des modèles animaux et du métabolisme glucidique, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider la preuve de concept, soit 6, 9 ou 18 souris par groupe. Ce nombre a été établi sur différents paramètres prenant en compte les seuils de détection des techniques utilisées, l’analyse statistique et la variabilité entre individus. La mesure de prise alimentaire se fait par la pesée des croquettes dans la mangeoire. Toutes les souris étant hébergées 3 par cage, il est nécessaire de se baser sur le nombre de cage et non sur le nombre d’animaux, pour calculer la taille nécessaire d’échantillon. Ainsi, avec 18 souris par groupe, nous fixons une taille d’échantillon de 6 par groupe. Si aucune différence n’est observée entre les individus mâles et femelles, les données seront regroupées pour augmenter le nombre d’échantillons. Enfin, la réalisation de la procédure 3 est conditionnée aux résultats obtenus au cours de la procédure 2. Si nous n’observons pas de différences dans la contre-régulation induite par le jeûne de 16h, nous ne réaliserons pas cette dernière procédure. Au total, ce projet nécessitera au maximum 216 souris.
Raffinement
Les souris contrôles seront commandées à l’âge de 4 semaines et auront ainsi une longue période d’acclimatation avant le début des tests à l’âge de 14 semaines. Pendant cette phase d’acclimatation, les animaux seront observés et pesés régulièrement. Des signes de maladie, de perte de poids, de souffrance, de lésions ou de détérioration de l’état de santé général constituent des points limites au-delà desquels, si aucun moyen de prévention/correction de la douleur n’a été efficace, les souris sont mises à mort. Pour les différentes procédures, les animaux seront en groupe et manipulés dans le calme pour éviter tout stress superflu. Pour prévenir la douleur due à l’incision de la queue, de la crème anesthésiante à base de lidocaïne (anesderm) est appliquée localement sur la queue des souris, 30min avant l’incision. Pour limiter le stress des animaux, les animaux seront manipulés régulièrement par les personnes en charge des procédures expérimentales. Pour minimiser le stress lié à l'éclairage, nous utiliserons un éclairage diffus et faible (
Choix des espèces
Le rôle du récepteur SGLT3 dans le métabolisme glucidique et énergétique a été étudié chez les rongeurs. Les études réalisées sur des vertébrés inférieurs, tels que le poisson, montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que les mammifères. Nos études sont réalisées afin de fournir des bases fondamentales à la recherche clinique humaine. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils d’analyse disponibles. Les animaux provenant d’un éleveur agréé seront commandés à 4 semaines afin qu’ils soient hébergés dans les mêmes conditions que les animaux transgéniques (sevrés à 4 semaines). Les animaux seront tous utilisés à l’âge adulte (à partir de 14 semaines). Les résultats décrit dans la littérature ne proviennent que de souris mâles. Notre objectif est d’approfondir ces résultats mais également d’étudier si nous observons les mêmes résultats chez les femelles. Nous utiliserons donc à la fois des souris mâles et femelles.
Rôle central des récepteurs de l’hormone parathyroïdienne dans la régulation du métabolisme énergétique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 190 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie subit une chirurgie cérébrale d'environ une heure, porte des fibres optiques sur la tête pendant les enregistrements et passe une semaine seule en cage calorimétrique, cinq jours d'adaptation puis deux jours de mesure. Les autres reçoivent des injections intrapéritonéales, des tests de métabolisme du glucose de quatre heures et des prélèvements de sang sur animal vigile, avec une biopsie de la queue pour les lignées transgéniques. Les retombées annoncées contre l'obésité restent au conditionnel et à long terme, alors que la mise à mort de toutes les souris pour prélever des tissus est déjà programmée.
Objectifs
Le contrôle de la balance énergétique par l'hypothalamus est la résultante d'un équilibre entre l'apport et la dépense énergétique. Cette régulation repose sur la capacité du cerveau à intégrer les signaux provenant des organes périphériques, indiquant les états nutritionnels et énergétiques de l'organisme et à établir des réponses appropriées. Cependant, l'altération de cet équilibre, due à notre environnement alimentaire moderne, peut conduire au développement de troubles métaboliques associés au surpoids et à l'obésité. Malgré les avancées et les progrès accomplis, nous continuons à rechercher des stratégies innovantes et plus efficaces pour lutter contre cette pathologie. Les hormones jouent un rôle majeur dans le maintien de nos fonctions biologiques et régulent de manière critique le développement du cerveau. Cependant, malgré l’importance grandissante donnée aux hormones dans la régulation des fonctions du cerveau, leur mode d’action reste encore largement inconnu. De plus, de nombreuses hormones n’ont pour le moment pas encore été étudiés pour leur effet sur le cerveau. C’est en particulier le cas d’une hormone produite par les glandes parathyroïdiennes : la parathormone ou l’hormone parathyroïdienne. L’hormone parathyroïdienne, sécrétée par la glande parathyroïde est connue pour être impliquée de façon majeure dans l’intégrité des os. Cependant, son rôle dans le contrôle du métabolisme et de la prise alimentaire est très peu connu. Notre projet s’inscrit donc plus précisément dans l’identification et la caractérisation du mode d’action de cette hormone et l’implication de cette dernière dans le contrôle du comportement alimentaire à travers des études réalisées sur des modèles animaux. La règle des trois R sera respectée, le nombre d’animaux sera réduit au minimum en optimisant au maximum les groupes expérimentaux (réutilisation des animaux dans différentes procédures n'entrainant pas de douleur ou de stress) et en raffinant les procédures pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l'angoisse des animaux.
Bénéfices attendus
Les dernières estimations de l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) révèlent qu'en Europe, plus de la moitié des hommes et des femmes sont en surpoids, et environ un tiers sont obèses. Cela constitue, de ce fait, un fardeau social, économique et sanitaire. Bien que certains traits génétiques (causes monogéniques) aient été identifiés, il est largement reconnu que le syndrome métabolique est par essence un trouble multifactoriel et multidimensionnel qui englobe des réseaux complexes d'inadaptations physiopathologiques en aval. Cependant, et malgré les progrès et les efforts récents, nous sommes toujours confrontés à un besoin de stratégies innovantes et plus efficaces contre les troubles métaboliques. Ce projet vise ainsi à établir un nouveau cadre conceptuel impliquant le rôle du système PTH/PTH1R dans la régulation des processus métaboliques induits par les neurones AgRP. Cette nouvelle régulation de l'équilibre énergétique par le cerveau offre un cadre idéal pour le développement de nouvelles cibles thérapeutiques qui peuvent prévenir les défauts de répartition des nutriments induits par l'obésité. Ce projet nous permettra d'identifier des rôles encore insoupçonnés du PTH1R hypothalamique et de son ligand PTH dans la régulation intégrée du métabolisme du corps entier. En outre, à long terme, les stratégies virales utilisées par ce projet pourraient être plus facilement adaptées et transposées aux troubles humains que les procédures chirurgicales invasives actuellement utilisées en thérapie (sleeve gastrectomie, bypass gastrique).
Procédures
Pour 5 lots à une chirurgie (environ 1h) (classe modérée), puis après une période de repos, les animaux seront soumis à des tests de comportements et/ou de métabolisme du glucose (environ 4h pour chaque test) (classe légère). Pour les études calorimétriques réalisées sur 2 lots d'animaux, environ 1 semaine de procédure est envisagée (environ 5 jours pour permettre aux animaux de s'adapter à l'individualisation et environ 2 jours pour l'enregistrement) (classe légère). Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles seront fait sur deux de ces lots (classe légère). -pour 4 lots, les animaux seront soumis à des injections de différents modulateurs par voie intrapéritonéale et à des tests de comportement et/ou de métabolisme du glucose (environ 4h pour chaque test) (classe légère). Pour les études calorimétriques réalisées sur 1 lot d'animaux, environ 1 semaine de procédure est envisagée (environ 5 jours pour permettre aux animaux de s'adapter à l'individualisation et environ 2 jours pour l'enregistrement) (classe légère). Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles seront fait sur un lot (classe légère). Pour 1 lot de souris à une chirurgie (classe modérée), les souris vont porter des fibres optiques sur la tête pendant les enregistrements ce qui peut initialement induire un stress. Cela peut entraîner une immobilité ou une mobilité réduite, ce qui constitue un comportement initialement indésirable cependant les fibres étant légères, les animaux s'habituent très rapidement. De plus avant d'imager l'activité neuronale, l'animal sera soumis à plusieurs séances d'habituation d'une durée de 30 min pendant 2 à 3 jours, ce qui lui permettra de s'habituer aux procédures d'enregistrement (classe modérée). Pour les souris transgéniques, une biopsie à la queue sera réalisée vers 6 jours (douleur légère de courte durée).
Impact sur les animaux
Le fait de porter des fibres optiques sur la tête de l'animal pendant les enregistrements peut initialement induire un stress. Cela peut entraîner une immobilité ou une mobilité réduite, ce qui constitue un comportement initialement indésirable cependant les fibres étant légères, les animaux s'habituent très rapidement. De plus avant d'imager l'activité neuronale, l'animal sera soumis à plusieurs séances d'habituation d'une durée de 30 min pendant 2 à 3 jours, ce qui lui permettra de s'habituer aux procédures d'enregistrement.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements de tissus.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet, nous devons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée. De plus, les invertébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et du comportement.
Réduction
Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus. Afin d'optimiser nos cohortes et réduire le nombre d'animaux transgéniques générés par croisements, nous utiliserons l'ensemble des portées (mâles et femelles).
Raffinement
Les soins apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures invasives en particulier. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement et du régime alimentaire. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton, bâtons de bois ou tunnels en carton. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé : notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à assurer des soins pré-, per- et postopératoires adéquats, à recourir à l'anesthésie et à l'analgésie, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.
Choix des espèces
Notre étude repose entièrement sur la physiopathologie intégrée et nécessite du modèle rongeur, notamment la souris car celle-ci permet l’utilisation de stratégies transgéniques et virale. Toutes les souris seront utilisées à l’age adulte (au moins 2 mois) afin que les réseaux neuronaux soient stables.
Greffe de cellules souches et nanotechnologies comme stratégie thérapeutique innovante dans un modèle rat d’AVC. Suivi de l’évolution du tissu cérébral par IRM et histologie EU 2/2.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un score clinique décide du sort de chaque rat opéré, entre prise en charge de la douleur, exclusion de l'étude ou mise à mort. 140 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacun subit deux chirurgies cérébrales d'une heure, une lésion du cortex moteur puis la pose d'un implant, trois séances d'IRM sous anesthésie et des tests répétés de force d'agrippement et de statut neurologique, jusqu'à trois fois par semaine pendant un mois. Le porteur indique avoir déjà obtenu cette preuve de concept chez le rat avec des biomatériaux non biodégradables et vouloir la répliquer avec des biomatériaux dégradables.
Objectifs
L’objectif scientifique du projet est de développer un traitement pour améliorer la reconnexion des fibres nerveuses après une atteinte du cortex moteur. Les effets du traitement sur l’architecture du tissu cérébral seront évalués par IRM in vivo, par une mesure des capacités motrice et enfin par histologie ex vivo. Le projet se déroulera sur trois mois dans deux établissements utilisateurs, un pour l'imagerie, l'autre prenant en charge toutes les autres techniques expérimentales et l'hébergement.
Bénéfices attendus
Amélioration de la récupération fonctionnelle du cerveau aprés un acccident vasculaire cérébral.
Procédures
Chaque animal sera soumis à 2 chriurgies sous anesthésie (réalisation de lésion (durée 1h) puis pose de l'implant (durée 1h)) au niveau cérébral (EU 1/2). Une IRM cérébrale sous anesthésie (durée 1h) sera réalisée 3 fois aprés la lésion puis 1mois et à 3 mois (EU 2/2). Des tests comportementaux et sensorimoteurs avant les chirurgies seront réalisés pour habituation et détermination des valeurs de références 3 à 4 jours par semaine durant 2 semaines avant les chirurgies puis après la pose de l'implant 3 fois par semaine pendant le premier mois et trois fois la première semaine des 2 mois suivant (EU 1/2). La mise à mort sera réalisée pour la récupération des tissus cérébraux (EU 1/2).
Impact sur les animaux
La chirurgie partiquée induit une lésion cérébrale de la région motrice antérieure (les conséquences de la chirurgie et la douleur est limitée par une prise en charge médicamenteuse). La génération de cette lésion cérébrale ciblée dans la zone contrôlant la motricité d'un membre antérieur provoque une diminution des capacités motrices de l'animal (EU 1/2). Les nuisances et effets indésirables sont dus aux chirurgies. Elles peuvent se traduire par une altération de l’état général de l’animal : douleur modérée, isolement, diminution du comportement exploratoire, perte de poids. Ces effets peuvent durer jusqu’à 48h (nuisances sévères). Le passage à l'IRM est réalisé sous anesthésie, la nuisance est modérée (EU 2/2). Les tests comportementaux pourraient engendrer un stress léger dû au fait que les animaux sont enlevés de leur environnement habituel, leur nuisance est légère (EU 1/2).
Devenir
La procédure se termine par une mise à mort des animaux pour effectuer l'analyse histologique.
Remplacement
L'accident vasculaire cérébral est une maladie grave entrainant un déficit neurologique lié à des lésions vasculaires. L'accident vasculaire cérébral est le résultat de l'obstruction d'un vaisseau sanguin (ischémique) ou de la rupture d'un vaisseau (hémorragique). Si les progrès actuels dans le domaine des organoides cérébraux ou de l'impression 3D de tissu cérébral in vitro sont remarquables, ils ne permettent toujours pas de recréer l'ensemble fonctionnel d'un cerveau. En particulier, les aspects vasculaires et les intéractions sytémiques ne sont pas encore accessibles avec ces méthodes alternatives à l'utilisation d'animaux. En effet, l'accident vascilaure cérébral conduit à des mécanismes comme l'inflammation, la migration cellulaire de cellules souches, la formation d'une cicatrice , la dégénérence des fibres nerveauses, et des processus de reconnexion dont la complexité et les interactions ne peuvent pas actuellement être simulées sur plusieurs mois par des approches in vitro ou ex vivo. Ainsi l'objectif de notre projet nécessite l'utilisation d'un modèle animal d'accident vasculaire cérébral. Le bénéfice de notre stratégie thérapeutique par greffe de biomatériaux (avec ou sans cellules) sur la récupération fonctionnelle de la motricité doit être évaluée sur des animaux vivants. La force d’agrippement, et le statut neurologique des animaux seront testés sur le long terme. Les effets des atteintes cérébrales et de la greffe sur l’architecture tissulaire du cerveau seront évaluée sur plusieurs mois par Imagerie par Résonance Magnétique. Nous avons déjà fait la preuve de concept de l'efficacité de notre stratégie thérapeutique sur le rat en utilisant des biomatériaux non biodégradables et projetons de la répliquer avec des biomatériaux biodégradables pour nous rapprocher de la situation physiologique.
Réduction
L'utilisation de méthodes non invasive comme l'IRM et l'évaluation motrice permettent le suivi longitudinal sur un même groupe d'animaux. Ainsi, les données peuvent être appariées, ce qui augmente la puissance statistique et limite le nombre d'animaux nécessaires dans l'étude. Des tests statistiques non paramétriques et de corrélation seront utilisés pour évaluer notre approche thérapeutique innovante de l'accident vasculaire cérébral. Nous réutiliserons les données d’animaux contrôles d’un protocole antérieur si possible.
Raffinement
Le principe fondamental des 5 libertés est respecté sur toute la durée de l’étude. Les rats sont hébergés dans des cages ventilées, en groupes de 2 (étant des animaux grégaires), dans une salle spécialement réservée aux rats. L'alimentation est disponible en permanence (ad libitum), y compris pendant les phases d'entraînement et d'évaluation motrice, sans jeûne ni restriction alimentaire. Le suivi de l'état de santé général des animaux est assuré par le personnel de zootechnie, qui les pèse chaque semaine et effectue des contrôles vétérinaires réguliers. Une attention particulière est portée aux animaux opérés, qui font l'objet d'une surveillance quotidienne par le personnel compétent. Cette surveillance inclut l'observation de l'appétit, du poids corporel, de la mobilité, de l'état du pelage et du comportement des animaux et fait l'objet d'un scoring clinique. La valeur du score détermine l'action à réaliser sur l'animal pour une prise en charge de la douleur, une notification de surveillance accrue, une exclusion de l'étude ou une mise à mort. La prise en charge de la douleur est mise en place avec des protocoles stricts validés, prenant en compte le principe de nociception et son impact sur les animaux et les résultats de l'étude. Un enrichissement environnemental est intégré au protocole, comprenant divers éléments pour stimuler cognitivement les rats (tunnels, boule de fouille, boule traversante, odeur naturelles variées, ..), ainsi qu'une composante sociale (arène de rencontre intercage). Les animaux sont conditionnés pour la réalisation de tâches motrices, renforcés positivement. Le procédé est très peu anxiogènes.
Choix des espèces
Les rats sont un modèle animal privilégié pour l'étude de la récupération fonctionnelle de la motricité du membre supérieur après lésion et greffe de bioimplants. Animaux adultes âgés de 3 mois, afin de se rapprocher de la démographie humaine pour l'apparition des accidents vasculaires ischémiques (à partir de 40 ans). La mobilité et la force du membre supérieur est un élément clé des fonctions motrices permettant aux patients cérébrolésés de récupérer une autonomie dans la vie de tous les jours. Nous disposons de tests adaptés pour évaluer ces paramètres sur le rat : l’amplitude de mouvement, la force et la sensibilité des membres supérieurs. Les examens d'imagerie, non-invasifs et indolores, se font sur le rat adulte anesthésié.
Etudes de gènes impliqués dans l’hétérotopie chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Pour comprendre le rôle de gènes responsables chez l'humain d'une malformation cérébrale appelée hétérotopie, 4 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 2 171 d'entre elles et modéré pour 1 981. Des femelles gestantes sont opérées quarante-cinq minutes sous anesthésie pour une électroporation in utero, des juvéniles et des adultes subissent une chirurgie de dix minutes sans jamais se réveiller, et des femelles gestantes éveillées reçoivent des injections intrapéritonéales. Le porteur présente l'électroporation comme un moyen de réduire le nombre d'animaux par rapport à la création de lignées transgéniques, tout en portant l'effectif du projet à 4 152 individus. Aucune de ces souris ne peut entrer dans un autre protocole après les injections reçues, et toutes sont tuées pour les analyses histologiques.
Objectifs
Le développement du système nerveux comprend des phases de prolifération et de migration cellulaires et des phases de différenciation au cours desquelles les neurones établissent des connexions entre eux. Il est important d'identifier les mécanismes moléculaires et cellulaires qui contrôlent ces processus pour améliorer notre compréhension du développement normal et physiopathologique du cerveau. L’objectif principal de ce projet est de mieux comprendre les rôles de gènes dont les mutations sont responsables chez l’homme de malformation d’une région du cerveau appelée « hétérotopie ». Notre stratégie repose sur l’étude de souris génétiquement modifiées. Nous avons d’abord étudié une lignée porteuse d’une mutation spontanée responsable d’hétérotopie comme celle observée chez l’homme. Nous avons plus récemment créé d'autres lignées permettant de contrôler l’inactivation du gène spécifiquement dans le temps et l’espace. Ainsi, nous pouvons générer des souris dont la mutation n’est exprimée que pendant la phase de prolifération, alors que chez d’autres souris, la mutation ne sera exprimée que pendant la phase de différenciation des neurones excitateurs. Ces inactivations spécifiques vont nous permettre de décortiquer les mécanismes responsables de l’hétérotopie. En analysant les capacités de prolifération et de différenciation de neurones par des études d'injection de produits et d’immunohistochimie, nous identifierons le défaut primaire lié à une perturbation de ces gènes. L’utilisation de protéines fluorescentes spécifiques de certaines structures subcellulaires nous permettra de préciser et de localiser les anomalies par des techniques dynamiques de videomicroscopie. Nous testerons l’action d’agents pharmacologiques pour pallier les défauts de prolifération, de différentiation et de migration observés aux stades embryonnaires. Nous ferons ensuite des essais de thérapie génique par une approche de chirurgie par électroporation in utero visant à traiter les souris mutantes et donc à mieux comprendre les fonctions des gènes électroporés pendant le développement cortical.
Bénéfices attendus
Les malformations corticales sont des maladies rares (incidence 1: 100000) pour lesquelles les mécanismes pathogéniques et physiopathologiques sont peu étudiés. Elles sont associées à des retards de développement et des déficits intellectuels sévères. S’agissant d’anomalies de neurodéveloppement, les anomalies apparaissent in utéro. L’étude de malformations induites par des mutations génétiques permet de comprendre les mécanismes cellulaires mis en jeu pendant le développement lors de la prolifération, la migration et la différenciation des cellules du système nerveux central. Les mutations génétiques sont très informatives car elles peuvent être modélisées chez l’animal, permettant une vision du développement physiologique in vivo. Les processus sont pour la plupart conservés entre l’Homme et les rongeurs. Les résultats de notre projet pourraient permettre, en inactivant l’expression d’un gène impliqué dans les cellules en division et les neurones de souris, d’identifier des mécanismes cellulaires, subcellulaires et moléculaires clés qui sont pertinents pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Femelles gestantes vigiles : une injection d’agents pharmacologiques par voie intrapéritonéale (1 minute). Juvéniles et adultes : chirurgie sous anesthésie et analgésie, sans réveil (durée : 10 minutes). Femelles gestantes: chirurgie sous anesthésie générale (45 minutes) avec utilisation d’une analgésie (anti-douleur) pré et post opératoire.
Impact sur les animaux
L’injection intrapéritonéale implique une douleur légère au point de piqûre ainsi qu’une contention et donc un stress momentané. Un risque mineur de péritonite est possible. Dans le cadre de la chirurgie, des douleurs sont possibles en période post-opératoire, correspondant à la cicatrisation. Le niveau de douleur sera estimé par rapport à une échelle de grimace et l’observation des difficultés de mouvements. L’anesthésie utilisée peut induire dans de rare cas une hypothermie, une détresse respiratoire, voire un arrêt cardiorespiratoire.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de réaliser des analyses histologiques (prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem). Ces souris ne peuvent entrer dans de nouveaux protocoles d’expériences puisqu’elles ont reçu des injections dans le cadre du projet.
Remplacement
Une partie de notre projet est réalisé in vitro (biochimie et biologie cellulaire). Nous utilisons également la culture cellulaire : transfections de lignées cellulaires, afin de limiter le nombre d’animaux. Mais pour des raisons scientifiques (difficulté d’étudier le cerveau en culture) nous devons caractériser ces maladies sur le modèle murin. L’étude d’un système intégré, requis pour la modélisation des altérations du cerveau associées à une pathologie impliquant des réseaux de neurones à différentes échelles, nécessite d’avoir recours à des animaux. De plus, nous avons accès à un modèle animal qui mime la pathologie humaine, qui est une opportunité pour étudier les causes de la maladie. La plupart des gènes que nous étudions sont spécifiquement exprimés dans le système nerveux central et ne sont pas exprimés dans les lignées cellulaires, d’où la nécessité d'étudier in situ les cellules neuronales dans les cerveaux des modèles murins. En effet, les modèles murins que nous étudions sont à ce jour les seuls modèles disponibles. Ils présentent l’avantage de mimer assez bien le phénotype humain. Le développement du cerveau est en effet bien conservé chez la souris, surtout pour les étapes de développement qui nous intéressent, favorisant l’identification de phénotypes robustes.
Réduction
Nous réduisons le nombre d’animaux en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée. De plus, chez la souris, la période de gestation est courte et le nombre d’embryons important, ce qui nous permet de générer un nombre d’animaux suffisant pour plusieurs expériences à partir de relativement peu de fondateurs. Nous comparerons également des souris de type sauvage et mutantes issues de la même portée, avec une répartition mendélienne. De même, tous les animaux générés (femelles et mâles) sont étudiés. Nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque expérience, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les lignées de souris mutantes représentent des modèles de déficits intellectuels, pour lesquels il est important de continuer la caractérisation afin d’éclaircir la physiopathologie. Pour cela, nous analyserons l’anatomie et la morphologie du système nerveux centrale de ces souris, par des méthodes d’histologie, d’immunohistochimie et de microscopie. L’objectif est d’identifier et d’étudier les anomalies associées aux inactivations de gènes d’intérêt. Des travaux précédents nous ont permis de valider l’analyse des régions cérébrales considérées avec une excellente reproductibilité et donc de réduire le nombre d’animaux requis. L’inactivation de gènes ou l'expression de protéines (par exemple, protéines fluorescentes rapportrices) de manière locale et aigüe chez la souris, in utero ou dans le cerveau postnatal, a l’avantage d’être rapide et de réduire le nombre de souris nécessaire par comparaison aux méthodes classiques de génération de lignées de souris transgéniques. Cette approche est donc la méthode de choix quand nous testons la fonction de nouveaux gènes de pathologies humaines. Grâce à cette méthode nous éclaircirons les voies biochimiques et les mécanismes subcellulaires essentielles pour le développement cortical. L’étude des mécanismes physiopathologiques liés aux déficits des différents gènes d'intérêt, et réalisée par les approches ci-dessus, est nécessaire à la recherche de nouvelles pistes thérapeutiques. Des approches par chirurgie seront aussi réalisées afin de réduire le nombre d'animaux nécessaire à l'étude. Le projet impliquera l'utilisation de 4152 animaux.
Raffinement
Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être des animaux, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les souris sont stabulées en portoir ventilés dans des hébergements standards dans lesquels il y a un contrôle de la température, de l’hygrométrie et des pressions, un cycle nycthéméral de 12 :12 et un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau, un autoclave et un sas chimique comme barrière, comme défini dans l'agrément de notre établissement. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification et d'une maison. Des observations du bien-être sont réalisées 1 fois/jour. Les souriceaux et jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. Les souris sont placées dans les cages avec la litière chirurgicale entre 1 et 2 jours avant la chirurgie afin d’avoir le temps de s’y habituer. L’utilisation de cette litière est particulièrement importante afin d’éviter l’infection de la suture des souris qui se situe au niveau de l’abdomen. Lors des actes chirurgicaux, les souris sont placées sur une plaque chauffante, avec une anesthésie générale par ventilation et reçoivent des injections sous-cutanées d'analgésiques en pré et post-opératoire, ainsi qu’une analgésie locale sur le site. Un gel ophtalmique est également utilisé afin d’éviter le dessèchement des yeux. Les animaux font l’objet d’une attention post-chirurgicale particulière (surveillance et traitement des plaies). En cas de comportements anormaux (manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture...), l’état des animaux est surveillé plusieurs fois par jour. Mise à disposition d’un aliment enrichi et d’eau directement dans la cage pour animaux apathiques. Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés par des méthodes adaptées, conformément aux bonnes pratiques vétérinaires.
Choix des espèces
Nous comparerons des souris contrôles et mutantes issues de la même portée. Le développement du cerveau murin est bien caractérisé, ce qui rend les études plus aisées et favorise l’identification de phénotypes robustes. Le développement embryonnaire du système nerveux centrale de la souris est extrêmement proche de celui de l’homme, ce qui en fait un parfait modèle d’étude. L’utilisation de lignées de souris, avec des croisements en retour réguliers permet d’éviter la dérive génétique, une meilleure reproductibilité des résultats et réduit le nombre d’animaux utilisés. La technique d’électroporation in utero dans le cerveau a été mise au point chez le rat et la souris, c’est une méthode de choix efficace pour analyser le rôle des gènes pendant le développement. Cette procédure est simple et rapide, donne un bon rendement, avec une cytotoxicité faible et implique beaucoup moins d’animaux adultes qu’une lignée transgénique. Pour chaque procédure, des souris adultes sont utilisées pour l’élevage et le maintien des lignées. Plusieurs stades seront ensuite analysés : nous nous intéressons au développement cortical, comprenant les étapes de la prolifération et migration (stades embryonnaires de 12,5 à 18,5 jours post-fécondation), ainsi qu'à l'organisation des couches corticales (stades juvéniles 1 et 10 jours post-natal et adulte à 90 jours post-natal). Ces stades seront nécessaires afin d'apprécier l'impact des mutations sur le développement cortical et la permanence du phénotype.
Impact du développement du cerveau sur l’évolution des maladies neurodégénératives chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
5 760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 2 520 d'entre elles et modéré pour 3 240. Des femelles gestantes subissent une chirurgie de trente à quarante-cinq minutes sous anesthésie générale, le temps d'injecter un produit dans le cerveau de chaque embryon, et les souriceaux sont génotypés par prélèvement de queue à dix jours. Le porteur annonce l'identification de cibles thérapeutiques pour les maladies neurodégénératives, sans que le RNT précise laquelle il étudie. Les reproductrices sont tuées à six mois et les reproducteurs à huit, lorsque le porteur observe une baisse de leur reproduction.
Objectifs
Ce projet vise à étudier le développement cérébral dans la maladie neurodégénératives. Nous évaluerons les conséquences de cette maladie sur la génération des différents types cellulaires du cortex en développement, ainsi que les stratégies de compensations qui pourraient se mettre en place dans ces modèles pathologiques pour pallier ces effets. Cette étude permettra la découverte de marqueurs permettant de suivre l’évolution de la maladie à des stades très précoces. Cette étude permettra également d’identifier des cibles thérapeutiques pour retarder ou atténuer les symptômes associés à la neurodégénérescence .
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus qui découlent de ce projet sont les découvertes de mécanismes clés dans les maladies neurodégénérative, notamment l’identification de cibles thérapeutiques possibles pour la prévention et le traitement précoce de la pathologie.
Procédures
Lors de la procédure d’élevage, un prélèvement inférieur à 1mm de l’extrémité de la queue sera réalisé sur les petits âgés de 10 jours. Cet acte se fera une seule fois sur animal vigile et durera moins de 1 minute par animal. Des femelles gestantes seront soumises à une chirurgie sous anesthésie générale (30-45minutes) et anti-douleurs afin de réaliser une injection intracérébrale dans le cerveau de chaque embryon. Tous les animaux (femelles adultes, embryons, souriceaux) seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin des procédures pour collecter des échantillons pour réaliser nos analyses.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de 1 mmm de l’extrémité de la queue pour génotypage peut générer une légère et brève douleur chez l’animal. Des femelles gestantes seront soumises à une chirurgie sous anesthésie et analgésie avec les risques inhérents à ce type de geste (dépression cardio-respiratoire, hypothermie, hémorragies, infections, cicatrisation) qui seront maitrisés au maximum par les moyens et le suivi mis en place. La mutation de l’animal peut générer des souffrances à partir de 16 mois : difficultés locomotrices, prostrations et pertes de poids, nous ne maintiendrons pas les animaux à des stades aussi avancés.
Devenir
Tous les animaux reproducteurs ayant permis les générations des animaux seront euthanasiés à 6 mois pour le femelle et 8 mois pour les mâles, lorsqu'une diminution significative de la reproduction est observée. Les femelles gestantes seront euthanasiées car elles ne pourront pas être réutilisées suite à leur chirurgie. Tous les embryons ayant reçu l’injection intracérébrale seront euthanasiés à différents stades pour les études histologiques.
Remplacement
L’étude du cerveau en développement nécessite le recours au modèle souris car il permet de préserver l’environnement du développement utérin (impliquant différents types cellulaires qui interagissent entre eux, ce qui ne peut être reproduit en culture cellulaire). L’influence d’un développement cérébral anormal sur le cerveau adulte ne peut se faire qu’avec des modèles de souris. Nous utiliserons des cultures cellulaires afin de valider les outils moléculaires qui seront ensuite injectés chez l’animal. Ces éléments rendent l’utilisation de l’animal indispensable pour notre étude
Réduction
Le nombre total d’animaux est de 5760. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum pour pouvoir atteindre l’objectif scientifique fixé. Il a été déterminé en prenant en compte les lignées murines génétiquement modifiées nécessaires à l'étude et en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en obtenant des résultats significativement exploitables. Pour cela nous utiliserons des tests statistiques adaptés en fonction du type d’analyses réalisées. Afin d’extraire le plus de données possibles sur un nombre minimum d’animaux, le matériel biologique récupéré sera utilisé au maximum et différentes expériences seront combinées. Si les résultats sont concluants avant l’utilisation de tous les animaux alors ils ne seront pas tous utilisés.
Raffinement
Les cages sont maintenues en portoirs ventilées avec un accès ad libitum à l’eau et à la nourriture. La température et d’hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour et se met en place progressivement. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères et l’isolement est évité au maximum. Les cages sont enrichies d’un nid et de bâtons en bois. Pré et post chirurgie seront enrichies d’une maison et d’un nid en coton afin d’améliorer le bien-être de la mère. Les souris seront observées quotidiennement par le personnel qualifié des animaleries. Un suivi renforcé sera mis en place à la suite de la chirurgie et jusqu’à la mise bas. Les procédures chirurgicales seront raffinées grâce à un protocole d’anesthésie et d’analgésie approprié à une laparotomie sur une femelle gestante. Le matériel et la préparation du site chirurgical doivent limiter le risque d’infection, le risque hypothermique est limité par l’utilisation de tapis chauffant thermorégulé, d’une cage de réveil thermostatée. Le risque hémorragique sera contrôlé par le choix de la voie d’abord, une manipulation douce des organes et un contrôle de l’hémostase au cours de la chirurgie. Les animaux seront réhydratés et les organes exposés irrigués régulièrement le temps de la chirurgie. La profondeur de l’anesthésie sera vérifiée et adaptée aux gestes à réaliser, la respiration et les réflexes seront appréciés régulièrement. De l’eau sous forme d’hydrogel ainsi que de la nourriture facile d’accès dans la cage seront également fournis à l’animal. Les chirurgies seront réalisées le matin afin de pouvoir observer les animaux le soir et administrer les médicaments nécessaires (analgésie). Après les chirurgies les animaux seront ensuite examinés une fois par jours pendant deux jours. Une attention particulière sera donnée à la surveillance d’éventuelles infections ou à une mauvaise cicatrisation de la laparotomie. Le points limites définis avant la chirurgie seront surveillés : une échelle d’évaluation de la douleur sera utilisée, seront également surveillés l’amaigrissement et des signes de prostration ou d’agitation anormales Les animaux seront observés et toute anomalie sera rapidement prise en charge et confrontée aux points limites définis pour les respecter et éviter toute souffrance. Le génotypage, réalisé par des personnes compétentes dans un endroit calme et dédié, est réalisé au même moment que l’identification pour limiter le nombre de manipulations.
Choix des espèces
Il n’existe pas de méthodes expérimentales in vitro pour étudier le développement et la complexité du cortex. Ces analyses nécessitent l'utilisation de souris pour trois raisons : le comportement des neurones corticaux diffère selon leur environnement ; ils migrent et se différencient différemment in vitro et in vivo ; la mise en place de l'organisation laminaire du cortex, ainsi que les connexions neuronales formées, ne peuvent être reproduites en culture cellulaire ; la complexité des interactions entre les différents types cellulaires du cortex au long de la vie ne peut être étudiée qu’in vivo. Ainsi les modèles in vitro sont insuffisants voire inexistants pour étudier la complexité et la mise en place des réseaux neuronaux dans le cortex. Sachant que le but de ce projet est de suivre le développement de ces animaux, nous allons nous focaliser sur les âges suivants : entre le jour de la naissance et une semaine, ( phase de croissance, maturation en cours) puis au stade de 21 jours, lorsque le cortex est mature.
Impact du neurodéveloppement dans l’évolution des ataxies spinocérébelleuses de type 7 sur un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 210 souris pour un protocole qui, sur chaque animal, tient en une biopsie de queue de moins d'une minute et un tatouage de deux doigts. Toutes sont tuées à différents âges pour prélever des tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le projet suit le développement du cortex chez des souris porteuses de la mutation de l'ataxie spinocérébelleuse de type 7, du stade embryonnaire à trois mois. Le porteur fixe la mise à mort avant six mois pour devancer les difficultés locomotrices, la prostration et la perte de poids que la mutation provoque ensuite.
Objectifs
Ce projet vise à étudier le développement cérébral dans un trouble moteur appelé l’ataxie cérébelleuse de type 7. Cette maladie est causée par une mutation génétique, avec un risque de transmission de 50 pour cent pour un parent porteur d’une version de cette mutation. Cette mutation provoque une neurodégénérescence progressive qui a de lourdes conséquences sur la qualité de vie des patients, car elle affecte non seulement la coordination motrice, mais aussi la vision et peut entraîner une cécité totale. Dans cette étude, nous évaluerons les conséquences de cette mutation sur la génération des différents types cellulaires du cortex cérébral depuis le développement embryonnaire jusqu’au cortex mature adulte. Nous étudierons également les stratégies de compensations qui pourraient se mettre en place pour pallier à l’impact de la mutation jusqu’au début des symptômes. Cette étude permettra la découverte de marqueurs permettant de suivre l’évolution de la maladie à des stades très précoces et d’identifier des cibles thérapeutiques pour corriger les symptômes associés à cette maladie.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre l’effet de cette mutation sur le développement du cerveau et les potentiels mécanismes compensatoires. Cela permettra de mettre en évidence des marqueurs spécifiques, permettant de suivre l’évolution de la maladie à des stades précoces. De plus, elle vise à long terme à identifier des cibles thérapeutiques afin de corriger les symptômes associés à la maladie.
Procédures
Un prélèvement de l’extrémité de la queue sera réalisé pour déterminer la présence de la mutation (génotypage) et un tatouage (sur la pulpe digitale sur 2 doigts maximum) sera réalisé sur animaux vigiles. Ces deux actes seront réalisés rapidement (moins d'une minute) et une seule fois sur chaque animal. Afin de récupérer des tissus à des stades très précis nous aurons besoin de réaliser des accouplements contrôlés d’une nuit. Les souris mâles et femelles sont mises ensemble une seule nuit pour accouplement. Dans ce cadre il peut arriver qu’un mâle soit en hébergement individuel le temps d’une nuit avant d’être remis avec un de ses frères dans une cage.
Impact sur les animaux
Le prélèvement pour génotypage peut générer une légère douleur chez l’animal. Une biopsie de queue sera réalisé, la procédure est rapide et dure moins d'une minute. Les souris étant des animaux grégaires, l’hébergement individuel de certains mâles pourra générer un stress.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à différents âges afin de récupérer des tissus post-mortem pour analyses histologiques et biochimiques. Les animaux seront euthanasiés avant 6 mois pour éviter les nuisances du au phénotype dommageable.
Remplacement
L’étude du développement du cerveau nécessite le recours au modèle murin car il permet de préserver l’environnement du développement du cortex qui implique l’interaction de différents types cellulaires entre eux, ce qui ne peut pas être reproduit en culture cellulaire. L’influence d’un développement cérébral anormal sur le cerveau adulte ne peut se faire qu’avec des modèles murins. Il n’existe pas d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas d’animaux et permettant d'étudier le développement et la complexité du cortex. Ces analyses nécessitent l'utilisation d’animaux pour trois raisons majeures : le comportement des neurones corticaux diffère selon leur environnement puisqu'ils adoptent un comportement migratoire dans le cerveau et un comportement de croissance une fois mis en culture ; la mise en place des couches du cortex, ainsi que les connexions neuronales qui y sont formées, ne peuvent être reproduits en culture cellulaire. Ainsi les modèles de culture cellulaire ne permettent pas d’étudier la complexité et la mise en place des réseaux neuronaux dans le cortex.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au minimum pour pouvoir atteindre l’objectif scientifique fixé. Il a été déterminé en réduisant au plus petit nombre le nombre d’animaux tout en obtenant des résultats significativement exploitables. Pour cela nous utiliserons des tests statistiques adaptés en fonction du type d’analyses réalisés. Afin d’extraire le plus de données possibles sur un nombre minimum d’animaux, le matériel biologique sera utilisé au maximum et différentes expériences seront combinées. Si les résultats sont concluants avant l’utilisation de tous les animaux alors ils ne seront pas tous utilisés. La variabilité interindividuelle peut être élevée il est donc nécessaire de tester 13 souris par génotype et par sexe (en deux réplicas). Nous utiliserons 2210 souris au cours des 5 années du projet. Les tissus collectés pour les analyses histologiques et biomoléculaire seront pris sur ces 2210 souris.
Raffinement
Les cages sont maintenues en portoirs ventilés avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau (biberon). La nourriture est adaptée au stade physiologique. Les conditions de température et d’hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (8h-20h). Les animaux seront hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum). Toutes les cages sont enrichies d’un nid et de stick en bois. Les cages d’accouplements bénéficient également d’une maison et/ou de papier kraft. Dans le cadre du maintien courant de la lignée les souris seront examinées quotidiennement par le personnel qualifié des animaleries. Dans le cadre du maintien de la lignée, les accouplements de maintien de lignée sont réalisés avec des femelles sans mutation d’un fournisseur agréé afin d’éviter toute dérive génétique qui pourrait aggraver le phénotype dommageable. Les animaux seront euthanasiés avant 6 mois afin que les effets dommageables de la mutation ne soient pas atteints. Les animaux seront également particulièrement surveillés à l’approche des 6 mois afin de reconnaitre des potentiels signes précoces de souffrance dû à la mutation. Seront particulièrement surveillé : une perte de poids anormal, des difficultés locomotrices et une prostration qui sont 3 signes caractéristiques de souffrance lié à la mutation. Des points limites sont établis et seront respectés pour éviter toute souffrance aux animaux. Concernant la procédure d’euthanasie des souris un protocole d’analgésie sera utilisé afin que l’euthanasie médicamenteuse de l’animal se fasse sans douleur. De plus les animaux seront surveillés quotidiennement par un personnel expérimenté.
Choix des espèces
Le but de ce projet est de suivre le développement du cerveau aux âges suivants : • Stade embryonnaire, donc femelle gestante : pour suivre la mise en place des couches du cortex • Jour post-natal 0, 7 et 10 : Il s’agit de stade critiques pour la maturation du cerveau. • Jour post natal 21 : à ce stade on estime que le cortex est mature. Enfin nous utiliserons des souris adultes à 3 mois pour considérer des effets de la maladie sur un cerveau adulte. L’étude du développement du cerveau nécessite le recours au modèle murin car il permet de préserver l’environnement du développement du cortex qui implique l’interaction de différents types cellulaires entre eux, ce qui ne peut être reproduit en culture cellulaire. L’influence d’un développement cérébral anormal sur le cerveau adulte ne peut se faire qu’avec des modèles murins.
Etude de l’impact de perte de la protéine EGFR dans le fonctionnement des valves cardiaques dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les souris de ce projet sont invalidées pour un récepteur de la voie EGF, ce qui doit provoquer chez elles une maladie des valves cardiaques. 40 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour la moitié et modéré pour l'autre. Elles subissent deux anesthésies gazeuses de trente minutes pour des échographies cardiaques, et peuvent recevoir des diurétiques en cas d'œdème pulmonaire. Le porteur indique que ce modèle n'a jamais été caractérisé, qu'il ignore la vitesse d'évolution de la maladie et son impact sur le bien-être des animaux non-humains concernés, et que l'anesthésie de souris au cœur défaillant augmente le risque de mort.
Objectifs
Les maladies des valves cardiaques, appelées aussi valvulopathies, sont le plus souvent provoquées par l’usure (maladies dites dégénératives). C’est pourquoi le risque de développer des valvulopathies augmente avec l’âge. Il existe cependant d’autres causes comme les anomalies congénitales. Les valves jouent le rôle de clapets, s'ouvrant et se fermant alternativement au gré des pressions régnant dans les cavités, empêchant le reflux du sang flux sanguin. Ces structures sont donc soumises au flux sanguin qui peut probablement participer à l’apparition progressive du dysfonctionnement des valves cardiaques. Nous avons identifié une voie de signalisation qui conduit à une valvulopathie. Notre projet a pour objectif d’étudier la fonction valvulaire d’un modèle invalidant le récepteur de cette voie de signalisation pour mieux comprendre la physiopathologie des valvulopathies et développer éventuellement une approche thérapeutique ciblée.
Bénéfices attendus
Nous attendons de ce projet d’augmenter les connaissances sur la physiopathologie des valvulopathies associées à la déficience de la voie EGF et ainsi améliorer au mieux la prise en charge thérapeutique des patients.
Procédures
A l'âge de 3 semaines, les souris seront identifées à l'aide d'un poinçon à l'oreille. Les animaux seront soumis à deux anesthésies générales gazeuses durant environ 30 minutes afin de réaliser une échographie cardiaque. En cas d'apparition de signes d'oedème pulmonaire, les animaux pourraient recevoir un traitement diurétique par injection intrapéritonéale (2 fois par jour, maximum 3 jours). En cas de signe de douleur, un traitement anti inflammatoire pourrait être proposé par injection sous cutanée (une fois par jour, maximum 3 jours).
Impact sur les animaux
Les animaux devraient développer une valvulopathie dont nous ne connaissons pas les vitesses d’évolution ou l’impact sur le bien-être. Si les souris développent des symptômes proches de ceux identifiés chez l’homme, elles pourraient développer une insuffisance cardiaque (avec des oedèmes dont des oedèmes pulmonaires associés à des difficultés respiratoires, une fatigabilité et des difficultés à se déplacer), des troubles du rythme et des morts subites. Les points limites mis en place permettront de limiter au strict miminum la durée de ces effets. Les échographies réalisées pour le suivi de la fonction cardiaque seront réalisées sous anesthésie générale pour limiter le stress des animaux. Cependant, les anesthésies pourront être réalisées sur des animaux dont la fonction cardiaque n'est pas optimale. Le risque de mort inhérent à toute anesthésie pourrait être augmenté chez ces animaux.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort pour prélèvement et analyse d'organes.
Remplacement
Les premières étapes de notre projet ont consisté à étudier l’effet de la modification de l’activation de la voie EGF sur des cultures primaires de cellules valvulaires issues de la valve aortique de rat. Malheureusement, le développement de la valvulopathie ne peut être modélisé avec des cultures cellulaires. Afin de comprendre l’impact du dysfonctionnement de la voie EGF sur la fonction valvulaire, nous devons maintenant passer à l’analyse d’un modèle in vivo.
Réduction
Afin de réduire au strict minimum le nombre d’animaux utilisés dans notre projet, nous utiliserons différentes approches : - étude longitudinale : nous avons prévu de réaliser un suivi par échocardiographie des animaux afin d’analyser leur phénotype et son évolution au fil du temps (âges de 1 et 3 mois) sans sacrifier les animaux pour lesquels ce n’est pas nécessaire. - approche statistique : nous analyserons les données (morphologie et fonction). En fonction de ces paramètres, il nous faut au moins 17 souris par groupe. Afin de faire face à d’éventuelles pertes d’animaux ou incidents techniques, nous avons augmenté ce nombre de 15%, nous arrivons à un total de 20 souris par groupe.
Raffinement
Dès la naissance des animaux dans notre établissement utilisateur, nous porterons une attention au bien-être animal. Nous avons opté pour une méthode d’identification couplée au prélèvement pour génotypage ce qui permet de réduire la douleur et le stress des animaux. Les animaux seront hébergés en groupe. L’environnement sera enrichi en fonction des préférences des animaux à l’aide de bandelettes de kraft ou de dômes en carton ou de batônnets à ronger. La manipulation des animaux sera faite par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention à faible stress (préhension avec les mains en coupelle et avec tunnels). Le modèle que nous allons utiliser n’a jamais été caractérisé d’un point de vue phénotypique. Nous allons donc procéder à des observations très poussée des animaux et identifier de la manière la plus précoce l’apparition de signe de souffrance ou de détresse. Les points limites seront revus régulièrement en discussion avec la structure chargée du bien-être animal de notre établissement. Au cours du projet, des échocardiographies seront réalisées sur les souris. Bien que cette technique d’imagerie soit indolore, elle nécessite que l’animal soit immobilisé. Afin de réduire le stress et limiter la contention des souris, l’échographie sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse.
Choix des espèces
L’anatomie et la fonction du cœur des souris sont proches de celles du cœur humain. Les souris génétiquement modifiées sont de bons modèles d’étude des atteintes des cardiopathies, de leurs conséquences hémodynamiques et de leurs causes génétiques. Afin de réaliser une cinétique d’apparition de dysfonctionnement des valves cardiaques, le souris seront étudiées aux âges de 1 et 3 mois, correspondant aux stades clés du développement post natal des valves.