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Mécanismes moléculaires et physiologiques de la synchronisation photique des rythmes circadiens dans des modèles de rongeurs
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour savoir comment la lumière recale les horloges biologiques, 600 souris privées de certains photorécepteurs vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles passent quinze à vingt jours en obscurité constante, isolées en cage individuelle, sous un capteur infrarouge qui enregistre leur activité. Vient ensuite une injection dans l'œil sous anesthésie, un réveil d'une heure, trente minutes de stimulation lumineuse, puis la mise à mort une heure plus tard pour prélever les tissus. Le porteur annonce que les points limites "spécifiques au projet" seront appliqués, sans dire lesquels.
Objectifs
Le fonctionnement autonome des horloges circadiennes repose sur des mécanismes impliquant des gènes d’horloges et leurs protéines, dont certains forment une boucle de rétroaction autorégulée, avec une rythmicité de 24 heures. L'horloge centrale du noyau suprachiasmatique, dont l'activité est synchronisée par la lumière via les photorécepteurs rétiniens, contrôle par des voies de sortie directes et indirectes, les rythmes de sécrétions hormonales, d'activité locomotrice, de température, de vigilance et le cycle veille/sommeil. En plus de son rôle synchronisateur de l’horloge centrale, la rétine contient également un oscillateur circadien autonome à l’origine de nombreux processus cellulaires, biochimiques, et physiologiques. Dans ce projet, nous évaluerons chez l’adulte et au cours du développement 1) les conséquences de l'absence spécifique d'un type de photorécepteurs sur le fonctionnement endogène des horloges (rétine et horloge centrale) et leur réponse à la lumière, 2) le rôle respectif des différents photorécepteurs sur la réponse à la lumière de ces horloges et 3) les voies de signalisation mise en jeu dans la transmission de l'information photique par les bâtonnets dans la rétine.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer les conséquences de l'absence spécifique d'un type de photorécepteurs sur le fonctionnement des horloges circadiennes (rétine et noyau suprachiasmatique) et leur réponse à la lumière en utilisant des modèles murins transgéniques, déficients en photorécepteurs. L'altération de la réception de l'information lumineuse chez ces modèles devrait se traduire par des dysfonctionnements de nombreuses fonctions physiologiques des horloges. De plus, l'approche pharmacologique in vivo d'activation/inhibition des voies de signalisation des bâtonnets au sein de la rétine devrait nous permettre de décortiquer de manière précise les mécanismes par lesquels la lumière agit sur nos rythmes circadiens.
Procédures
Les interventions, d'une durée d'environ 3h30, sont listées ci-dessous : 1) Tout d'abord, les animaux adultes seront isolés dans des cages individuelles du début et jusqu’à la fin de l’expérimentation. 2) Les animaux adulte subiront, sous anesthésie générale et locale, une injection intravitréenne de molécules pharmacologiques avec réveil (1h). Après injection et réveil (1h), les animaux seront exposés à une stimulation lumineuse (30 min) et mise à mort 1h après la stimulation.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent être soumis à différentes nuisances : 1) Tout d'abord, les animaux seront placés individuellement dans des cages munies d’un capteur infrarouge permettant de mesurer le rythme de leur activité locomotrice en continu. 2) Afin d’évaluer les paramètres de leur système circadien (période endogène, décalage de phase comportemental), les animaux seront placés pendant 15-20 jours à l’obscurité constante. Le placement de l’animal en condition constante (obscurité constante) est le protocole standard utilisé afin d’évaluer le fonctionnement endogène et la réponse à la lumière du système circadien. 3) Les animaux subiront une chirurgie avec ou sans réveil.
Devenir
Mise à mort pour prélevements de tissus et fin d'expérimentation.
Remplacement
Le but de ce projet est de déterminer 1) les conséquences de l'absence spécifique d'un type de photorécepteurs sur le fonctionnement endogène des horloges et leur réponse à la lumière, 2) le rôle respectif de ces différents photorécepteurs sur la réponse à la lumière des horloges circadiennes. Compte tenu de la complexité de l’environnement tissulaire et le réseau complexe constituant les horloges circadiennes, ne pouvant être reproduits in vitro, ce projet nécessite la réalisation d’expériences dans un environnement intégral, à l’échelle de l’animal. De plus, ce projet fait appel à des modèles murins non transgéniques et transgéniques sélectionnés car ils permettent d'aborder différents aspects scientifiques de notre projet.
Réduction
Pour réduire le nombre total d'animaux: - Nous utilisons des approches non invasives (comportement) ne conduisant pas à la mise à mort de l'animal. -Ceratains animaux utilisés lors des approches noninvasives pourront être utilisés dans des approches ex-vivo. - Plusieurs prélèvements de tissus et certaines mises au point techniques seront réalisés chez le même animal. - Enfin, dans certains cas, chaque animal pourra être son propre contrôle. Le nombre d'animaux requis a été déterminé par une approche statistique.
Raffinement
Ce projet repose sur des procédures maitrisées. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (asepsie, anesthésie et analgésie). Un soin particulier sera porté à la limitation du stress, au moyen notamment d’un enrichissement varié. Un suivi régulier des animaux sera effectué afin de détecter immédiatement tout signe d’inconfort ou de douleurs. Les soins et les expérimentations seront réalisées par du personnel qualifié. Les points limites spécifiques au projet seront appliqués.
Choix des espèces
Ce projet fait appel principalement à des modèles murins non transgéniques ou modifiés génétiquement. Cette espèce a été sélectionnée car elle présente une grande similitude avec les photorécepteurs chez l’homme et représente donc un modèle expérimental privilégié pour l’étude des mécanismes moléculaires des horloges circadiennes et leur régulation par la lumière. De plus, elle permet d'avoir accès à plusieurs lignées dont le phénotype est bien établi. Les différentes souches sélectionnées sont pertinentes pour évaluer le rôle respectif des différents photorécepteurs, de l’horloge et des connexines dans le fonctionnement endogène et la réponse à la lumière des horloges rétinienne et centrale. Ces souris sont déficientes en : a) photorécepteurs : mélanopsine, opsine des cônes MW, ou bâtonnets. b) connexine 36 : invalidée dans les bâtonnets ou les cônes. c) Horloge dans les bâtonnets ou présentent une mutation conduisant à la dégénérescence des bâtonnets couplée à l’absence d’une horloge fonctionnelle dans les bâtonnets. Afin de mieux comprendre le fonctionnement moléculaire endogène et la réponse à la lumière des horloges circadiennes, des expérimentations chez l'adulte (2-5 mois) et le nouveau né sont indispensables. En effet, les horloges se mettent en place progressivement chez la souris durant la période post-natale. De plus, les différents photorécepteurs réceptionnant l'information lumineuse maturent progressivement et à des stades différents au cours du développement. Nous utiliserons différents stades postnataux : 8, 15 ou 30 jours après la naissance.
Shadow imaging in vivo pour l’étude du milieu extracellulaire et la perfusion intracardiaque
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une fenêtre d'imagerie de trois millimètres percée dans le crâne sous anesthésie, puis pour 1 770 d'entre elles une injection directe dans le cerveau : 2 718 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Pour 948 autres, un dispositif implanté permet des injections répétées, et 420 subissent des injections dans l'arrière de l'œil, un traumatisme crânien ou l'implantation de cellules tumorales. L'objectif est de cartographier l'espace entre les cellules du cerveau à l'échelle du nanomètre, sur des souris vivantes maintenues tête fixée. Le champ officiel du devenir ne mentionne aucun animal gardé vivant, alors que le texte annonce que les souris porteuses du dispositif implanté seront maintenues en vie, les autres étant tuées pour prélever le cerveau entier.
Objectifs
Environ 25% du volume cérébral est occupé par l'espace extracellulaire (ECS) qui correspond à l’espace se trouvant entre les cellules et qui sert d’environnement à l’échelle microscopique pour le cerveau et forme un chemin de communication chimique entre les cellules. Il a été montré que la structure et la diffusion de l'ECS sont composés d’éléments de nature différentes et qu'elles dépendent de conditions internes et externes, telles que le système de sommeil/éveil ou d’un œdème cellulaire provoqué par un traumatisme cérébral. De plus, l’ECS fournit un réservoir pour les ions impliqués dans l'activité électrique des neurones et joue un rôle clé dans la transmission de substances entre les cellules. Ainsi, l’ECS n'est pas seulement le siège de toutes sortes d'interactions cellule-cellule, mais peut également jouer un rôle important dans des fonctions neuronales cruciales, telles que la mémorisation ou la formation de circuits neuronaux. Afin de visualiser la structure de l'ECS à très petite échelle (nanomètre), nous utiliserons une nouvelle approche d'imagerie, à savoir la technique de Shadow imaging (SUSHI). C'est une méthode de marquage où un produit fluorescent est injecté localement dans le cerveau afin de visualiser l’ECS avec une très haute résolution. En outre, comme le produit fluorescenr ne pénètre pas les cellules saines, toutes les cellules apparaissent en noires, ce qui permet d'imager également la structure anatomique des cellules non marquées. Cette méthode présente de grands avantages puisqu’elle n’est pas sensible à la perte de fluorescence de la molécule (la diffusion du produit fluorescent permet de maintenir un signal constant) ni à la toxicité (puisque le produit fluorescent reste en dehors des cellules). Dans ce projet, nous comptons tester plusieurs produits fluorescents qui présentent tous une gamme de longueur d’onde proche de celui de la GFP (Protéine fluorescente verte) et ne pénètrent pas les membranes cellulaires.
Bénéfices attendus
Cette technique sera utilisée pour imager l’ECS au travers d’un dispositif d'imagerie posée soit sur le cortex soit sur l’hippocampe (petite partie du cerveau qui sert pour la mémoire, le comportement et certaines émotions). Partant de là, nous nous proposons d'effectuer des séances d'imagerie répétées d’un même animal pour cartographier, sur animal vivant et avec une résolution spatiale inédite, la morphologie de l’ECS et caractériser la dynamique (quelques minutes à quelques semaines) des structures fines de l’ECS afin de voir les interactions cellule/cellule à l'échelle des circuits intégrés.
Procédures
Toutes les souris auront la pose d'un dispositif d'imagerie (2718 souris). Pour avoir ce dispositif il faut procéder à une chirugie sur animal endormi qui dure environ 1h avec utilisation de produits anti douleur. Un dispositif d'imagerie de 3mm de diamètre sera fait dans le crâne de la souris et une lamelle sera posée dessus afin de protéger le cerveau de l'extérieur. 1770 souris auront une injection directe dans le cerveau pendant qu'elles seront endormies. L'injection prendra environ 15 minutes et sera faite qu'une seule fois sur ces souris. 948 souris auront une pose d'un dispositif implantatoire dans le cerveau permettant d'injecter plusieurs fois le produit fluorescent. Ce dispositif implantatoire sera posée pendant la chirugie pour le dispositif d'imagerie. Chaque souris de ce groupe aura un dispositif implantatoire et plusieurs injections dans le temps d'une durée de 15 minutes environ chacune. Une injection rétro-orbitales sera faite sur 420 souris. Une injection par oeil et 2 injections par animal au maximum. L’induction d’un traumatisme cranien (impact fait en une fraction de secondes) et l’induction de cellules tumorales (une dizaine de minutes) sera faite sur un total de 420 souris. Toutes les souris auront une préparation des tissus pour l'étude des propriétés cellulaires après une ou plusieurs injections injection (si la souris a un dispositif d'injection ou non). Cette préparation des tissus se fera sur animal endormi avec utilisation d'anti douleur. L'animal sera ensuite euthanasié et le cerveau sera récupéré.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et l'induction du traumatisme cranien et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies, injection retro-orbitale et aux implants 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte. Le risque de rejet des animaux non sevrés et le stress de la séparation peuvent également entrainer une nuisance ou un effet indésirable.
Devenir
Les souris subissant la préparation des tissus pour l'étude des propriétés cellulaires seront euthanasiées à la fin de l'expérimentation afin de prélever le cerveau entier. Les souris ayant subi une chirurgie pour l'implantation d'un dispositif d'imagerie seront utilisées pour la microscopie puis euthanasiées à la fin de l'expérimentation si elles ne sont pas utilisées pour la préparation des tissus. Les souris ayant un dispositif implantatoire seront maintenues en vie.
Remplacement
La souris est l'espèce de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Ce protocole nécessite l'utilisation d'animaux. L’objectif de ce projet étant de caractériser l’ECS dans les conditions les plus naturelles possibles, cette étude ne peut être réalisée de manière pertinente avec des modèles sur ordinateurs (in silico) ou sur micro-organismes, organes ou cellules en dehors de leur contexte naturel (in vitro). Le microscope sera, dans un premier temps, validé en imageant de toutes petites particules (nanoparticules) fluorescentes. Toutefois, ces échantillons ne permettent pas réellement de reproduire l’ensemble des paramètres optiques observés dans les échantillons biologiques. C’est pourquoi une seconde étape de validation dans des tranches organotypiques (tranches de partie de cerveau sur une lamelle) apparait cruciale pour optimiser les conditions d’imagerie qui seront utilisées à terme pour l’imagerie sur animal vivant (in vivo).
Réduction
Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode de production : en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
A chaque étape du projet, le bienêtre de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Nos animaux naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventilés, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L’expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposées. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'Homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'Homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'Homme. Le projet sera réalisé sur des animaux de 1 et 21 jours. Puis sur ces mêmes animaux de 2 à 6 mois, période qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau homogène pour une meilleure reproductibilité des résultats.
Enregistrement de neurones spinaux pour le criblage de candidats médicaments antalgiques
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 390
390 rats et 360 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les expérimentateurs leur provoquent des douleurs chroniques par chirurgie, par injection d'adjuvant complet de Freund, par un agent de chimiothérapie ou par induction d'un diabète, avant 5 436 sessions de tests comportementaux de von Frey et d'immersion de la patte. Chaque animal finit par une chirurgie sous anesthésie terminale de deux à quatre heures, pendant laquelle des laboratoires pharmaceutiques font tester leurs candidats antalgiques sur des neurones de la moelle épinière. Le porteur décrit cette approche comme un raffinement permettant de tester des stimulations très nociceptives "sans aucune souffrance pour l'animal", dans un projet qu'il classe lui-même en gravité sévère.
Objectifs
Le projet consiste à mesurer l’effet de candidats médicaments de l'industrie pharmaceutique sur l'activité de neurones à l’origine de la sensation douloureuse.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'obtenir de meilleures connaissances des mécanismes conduisant aux douleurs chroniques et contribura à l'etablissement de nouveaux traitements des douleurs chroniques.
Procédures
Chirurgie sous anesthésie avec réveil (10 min): 312. Injection d'une substance inflammatoire sous anesthesie (5 min) : 111. Prélèvement d'une goutte de sang sur la queue chez l'animale vigile (30 s) : 468. Injection d’un agent utilisé en chimiothérapie ou d'une substance induisant le diabete chez l'animal vigile (15 s) : 252. Tests comportementaux (30 min) : 5436. Chirurgie sous anesthésie terminale (2-4 h) : 750.
Impact sur les animaux
Les modèles mis en œuvre induisent un état de douleur chronique. Cela est nécessaire pour la mise au point de traitements analgésiques efficaces contre les douleurs chroniques.L’injection d’adjuvant complet de Freund et les interventions chirurgicales induisent une douleur localisée au niveau de la patte, après le stress induit par l’induction de l’anesthésie à l’isoflurane. La douleur est modérée à sévère dans les heures qui suivent l’intervention, puis légère à modérée par la suite. Les injections chez l’animal vigile induisent un stress et une douleur légère de brève durée due à la contention et l'injection. Il en est de même pour le prélèvement d'une goutte de sang sur la queue. Le diabète peut induire des dysfonctions physiologiques prononcées (dyspepsie, cachéxie) et donc un stress sévère chez certains animaux. Les tests comportementaux de Von Frey et d’immersion de la patte induisent un stress léger dû à l’isolement et à la contention, respectivement. La stimulation induit une douleur légère puisque l’animal est en mesure d’éviter la stimulation.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés avec une overdose d’anesthésique à la fin de chaque expérience, car les mesures physiologiques pratiquées ici chez l'animal anesthesié sont trop invasives pour permettre la survie de l'animale.
Remplacement
L’utilisation d’animaux pour les tests d'efficacité de candidats médicaments analgésiques est rendue nécessaire par le fait que les mécanismes d'action de ces molécules sont des processus complexes impliquant la totalité du système nerveux (de manière imagée, des communications réciproques entre le cerveau, la moelle épinière, et les tissus périphériques).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit par 3 actions conjointes : 1) le soin apporté à chaque expérience (une spécialisation extrême est indispensable pour obtenir un taux de succès élevé dans ces expériences délicates) ; 2) le ciblage d’une population de neurones essentielle dans la génération de la sensation douloureuse ; 3) une approche par étape, avec des lectures intermédiaires des résultats, afin d’arrêter rapidement les expériences inutiles.
Raffinement
Les approches physiologiques chez l’animal anesthésié permettent un certain nombre de raffinements. Premièrement, il est possible de pouvoir tester l’efficacité de candidats médicaments sur la réponse à des stimuli très nociceptifs sans aucune souffrance pour l'animal (impossible chez un animal vigile). Deuxièmement, plusieurs doses de candidat médicaments peuvent être testées chez un même animal dans la même expérience. Troisièmement, chaque animal est son propre contrôle lors du test de candidats médicaments (principe des mesures répétées avant/après).
Choix des espèces
Les rongeurs, rats et souris, sont des espèces appropriées pour l’étude et le développement de médicaments analgésiques et antalgiques, et sur lesquels nous disposons de beaucoup de connaissances. Le rat a l’avantage sur la souris d’être plus robuste du point de vue physiologique, et donc de mieux supporter de longues anesthésies. La souris permet de profiter des manipulations génétiques plus facilement. Les animaux sont utilisés au stade adulte, car ce projet ne s'intéresse ni au développement, ni à l'animal âgé.
Evaluation de la sécrétion pancréato-biliaire chez les souris Knock-out CD36 lingual
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Six heures de jeûne, une laparotomie, une ligature de l'œsophage et la pose d'un cathéter dans le canal biliaire : 60 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tuées sous anesthésie à la fin de l'intervention pour prélever leurs organes. L'opération mesure les sécrétions du pancréas et de la bile chez des souris privées du récepteur CD36 dans les papilles gustatives, pour préciser le rôle du "goût du gras" dans la préparation de la digestion. Le bénéfice annoncé à court terme se limite à la description de cette nouvelle lignée, qui pourra ensuite servir de modèle pour d'autres questions. Le choix de l'espèce tient à la lignée elle-même, le porteur écrivant que ce modèle génétiquement modifié n'existe que chez la souris, ce qui le rend selon lui "indispensable".
Objectifs
Il a été rapporté que le goût du gras représente une sixième modalité gustative aux côtés du sucré, du salé, de l'amer, de l'acide et de l'umami. C’est plus précisément les récepteurs gustatifs, exprimés par les cellules des bourgeons du goût (de type 1, 2, et 3) qui permettent la détection des saveurs. Les récepteurs de lipides (CD36, GPR120) exprimés dans les papilles gustatives sont responsables non seulement de la perception lipidique mais également du renforcement de la préférence alimentaire pour les repas riches en gras. Le signal gustatif est transmis au cerveau par les nerfs gustatifs, conduisant à une augmentation des sécrétions digestives préparant le corps à l'arrivée des aliments. On parle alors de l’axe langue – cerveau – intestin. Les études réalisées chez les souris n’exprimant pas CD36 ont démontré qu’elles perdent la perception du goût du gras, due à une altération de l’axe langue – cerveau – intestin, avec notamment une diminution des sécrétions digestives déclenchées lors d’une application linguale de lipides. Comme CD36 est exprimé dans plusieurs tissus et organes, il a été difficile de déterminer chez ces souris, le rôle oral dans les effets observés. Ainsi, des souris génétiquement modifiées qui n’expriment pas CD36 uniquement dans les papilles gustatives ont été générées. Le but de ce projet est d’étudier le rôle de CD36 lingual dans l’activation des sécrétions digestives chez les souris qui n’expriment pas CD36 dans les papilles gustatives.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet permettra la description d’une nouvelle souche de souris génétiquement modifiées qui n’exprime pas le récepteur CD36 dans les papilles gustatives et qui pourra donc servir de modèle animal pour de nouvelles questions sur l’expression de CD36 et le « gout du gras ».
Procédures
L’ensemble des souris sera nourri avec un régime standard et sera pesé de façon hebdomadaire. Six heures avant la manipulation, les souris seront mises à jeun (de nourriture seulement). Lors de la manipulation, une injection sous-cutanée d’analgésiant puis une injection intrapéritonéale d’anesthésiant seront effectuées. Un anesthésique local sera également appliqué. Les souris endormies seront tondues au niveau de l’abdomen. Une laparotomie, une ligature de l’œsophage et cathétérisation du canal biliaire seront réalisés sous anesthésie générale. Un prélèvement sanguin intracardiaque (sous anesthésie toujours) sera réalisé puis les souris seront mises à mort (toujours anesthésiées). Après euthanasie, les organes d’intérêt seront prélevés.
Impact sur les animaux
Le projet requiert de mettre à jeun les souris pendant 6 heures (phase diurne) avant la procédure chirurgicale ce qui peut engendrer un stress pour les animaux, ils auront toutefois un accès ad libitum au biberon d’eau pendant cette période. Les animaux peuvent subir une peur des suites de la contention nécessaire pour les injections sous-cutanées (analgésiques) et intrapéritonéales (anesthésiques). Une douleur est également à prévoir lors de cette injection sous-cutanée et lors de cette injection intrapéritonéale.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélèvements d’organes.
Remplacement
La sécrétion pancréato-biliaire est une étude faisant intervenir une communication inter-organes ainsi qu’une sécrétion pancréatique in vivo. C’est un paramètre métabolique qui ne peut s’étudier que sur des animaux vivants, ceci expliquant la nécessité de toute la partie expérimentation in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer l’utilisation de modèles animaux
Réduction
L’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique valable . Ainsi, après estimation confirmée, la taille des groupes minimale est de 15 animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes dans les conditions habituelles de l’animalerie, le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement et une visite quotidienne sera réalisée. Pour le bien être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. De plus, habituer les souris à la contention permettra de diminuer le stress induit par le geste. Pour maximiser l’asepsie, plusieurs précautions seront prises, notamment la tenue du manipulateur, la désinfection des surfaces, l’utilisation d'un champ stérile, la stérilisation des outils de dissection, la tonte de la zone d’incision et la désinfection de la peau.
Choix des espèces
Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix qui est assez documenté sur la phase post-ingestive et le comportement alimentaire. Bien que techniquement plus difficile que l’utilisation du rat, notre modèle animal génétiquement modifié est réalisé seulement chez la souris, c’est pourquoi ce modèle est indispensable. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils contribue au choix de modèle de souris. De plus, l’élevage et l’induction de la modification génétique étant plus facile sur les souris, cette espèce est un modèle de choix quant à notre étude.
Role de la barrière intestinale et du passage de composants bactériens dans le développement de l’arthrite inflammatoire.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever intestin, rate, foie, reins et articulations. Une arthrite leur est provoquée par injections sous la peau à la base de la queue, ou bien elle se déclare seule chez les lignées génétiquement modifiées, et elles reçoivent jusqu'à onze gavages de composants de membranes bactériennes sur dix semaines. Le porteur indique que l'analgésie restera limitée, les antidouleurs modifiant la perméabilité intestinale qu'il veut mesurer. Ces expériences complètent un travail antérieur, en réponse aux commentaires demandés par un journal scientifique avant publication.
Objectifs
Les rhumatismes inflammatoires correspondent à une inflammation articulaire (arthrite) dans le cadre de maladies générales de l'organisme avec un risque de handicap et une baisse de la qualité de vie dont la cause est inconnue. Les causes des rhumatismes inflammatoires restent mal connues. Le but de notre recherche est d'étudier si des modifications au niveau du tube digestif peuvent changer l’issue de l’arthrite. L'exploration du lien entre le tube digestif et l'arthrite inflammatoire doit tenir compte des intéractions complexes entre le contenu du tube digestif et les nombreuses structures mécaniques, chimiques et immunologiques présentes dans l'intestin. L’étude de la physiologie gastro-intestinale ne peut être réalisée que sur des animaux puisqu’à ce jour aucun système cellulaire ne permet de reproduire les interactions complexes. Nous avons choisi d'utiliser des modèles murins pour des raisons de faisabilité, les modèles d’arthrite expérimentale étant largement documentés dans la littérature, y compris des souris génétiquement modifiées qui développent spontanément de l’arthrite à l'âge adulte.
Bénéfices attendus
Nous formulons l’hypothèse que des modifications au niveau du tube digestif peuvent changer l’issue de l’arthrite. En cas de résultats positifs, ce projet permettrait une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le développement de l'arthrite et participerait à ouvrir la voie vers de nouvelles approches thérapeutiques pour agir sur l’alimentation et l’intestin.
Procédures
Pour étudier l'effet des composants bactériens sur l'arthrite nous administrerons différents composants de la membrane bactérienne par gavage gastrique. Les souris recevront ces composants par voie orale une fois par semaine pendant maximum 10 semaines soit maximum 11 administrations selon les procédures. La perméabilité intestinale sera mesurée chez la souris après gavage par un sucre couplé à un marqueur fluorescent suivi d’un prélèvement de sang au niveau de la veine de la joue pour mesurer la fluorescence. Les souris seront prélevées maximum 5 fois à des intervalles de deux à trois semaines selon les procédures. Ces manipulations ne nécessitent pas d’anesthésie. Dans le modèle d’arthrite induite, l’arthrite est induite par injections sous la peau à 2 semaines d’intervalle à la base de la queue sous anesthésie générale. Pour l’étude du passage de composants bactériens à travers l’intestin, nous utiliserons un composant bactérien radioactif administré par gavage une fois. Les prélèvements ultérieurs seront réalisés après euthanasie de l’animal par dislocation cervicale. L’évaluation des souris sera faite à l’aide d’un score prenant en compte l'arthrite, la sensibilité articulaire, l'apparence, les fonctions du corps et le comportement.
Impact sur les animaux
-Selon notre expérience, l’arthrite apparaît progressivement dès 2 semaines pour être maximale vers 6 semaines. Cela provoque un gonflement des pattes qui peut affecter la mobilité de la souris. Néanmoins dans notre modèle, selon nos observations antérieures, la mobilité reste fonctionnelle et les souris ne sont pas prostrées. - Dans le modèle d’arthrite induite au collagène, à peu près 5-10% des souris peuvent développer des lésions cutanées aux sites d'injection. Il s’agit ici de réaliser des expériences complémentaires en réponse à la demande de commentaires d'un journal, utilisant des procédures d’un précédent travail. Ainsi, les procédures et les traitements sont bien connus. Et le nombre de souris a été restreint. Les points limites ont bien été définis. Selon nos observations antérieures, notre modèle ne génère que très peu de signes généraux et affecte peu la mobilité de la souris. En effet, dans le cadre du précédent travail, seul un petit nombre de souris (< 0,3%) ont nécessité une euthanasie précoce.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les souris seront immédiatement euthanasiées par un personnel compétent. Cela permettra l’analyse des tissus (intestin, rate, foie, rein, articulations) post mortem pour mieux comprendre le rôle des composés bactériens dans l’arthrite inflammatoire.
Remplacement
L'exploration de cette hypothèse doit tenir compte des intéractions complexes entre le contenu du tube digestif et les nombreuses structures qui forment la barrière intestinale. Ainsi, l'exploration de notre hypothèse ne peut être faite que dans le contexte d’un être vivant.
Réduction
Les expériences ayant été déjà réalisées dans le cadre d’une précédente autorisation de projet, et s’agissant d’expérimentations supplémentaires demandées par le journal, chaque expérience ne nécessitera pas d’être répétée. Cela permet de réduire au maximum le nombre de souris nécessaires pour ce projet.
Raffinement
Les moyens de soulager la douleur seront limités à cause de l'impact des médicaments sur la perméabilité intestinale et l'arthrite. Cependant, un système d'évaluation clinique donnant lieu à des mesures adaptées comme la disponibilité de la nourriture directement dans la cage, de l’eau gélifiée et une surveillance rapprochée a été mis en place. Si les points limites sont atteints : déshydratation, score d’arthrite très élevé ou prostration/immobilité persistante entraîneront la mise à mort . Les animaux seront évalués 2 fois par semaine avec un suivi plus rapproché lors de la deuxième phase de l’arthrite. La durée de l'arthrite est limitée. Elle apparait 3 à 4 semaines après la 1re injection dans le modèle d’arthrite induite au collagène et vers l’âge de 4 semaines dans le modèle transgénique. Dans les deux modèles (arthrite induite au collagène et transgéniques), les souris développent de l’arthrite et sont surveillées et évaluées de la même manière. La procédure sera donc interrompue au plus tard 10 semaines après l'induction ou après l'apparition de signes cliniques dans le modèle d'arthrite spontanée. Dans le modèle d’arthrite induite au collagène, à peu près 5-10% des souris peuvent développer des lésions cutanées aux sites d'injection. En cas d'apparition de lésions cutanées, celles-ci seront désinfectées et surveillées.
Choix des espèces
La souris est un mammifère avec une physiologie et un système immunitaire très proche de l’homme pour laquelle il existe un grand nombre de lignées mutée sur des gènes permettant des études mécanistiques approfondies. Ainsi, les résultats expérimentaux seront très probablement transférables à l’homme. Les souris seront de jeunes adultes (souris à maturité sexuelle) d’au moins 5 semaines d’âge au début de l’expérience. À cet âge, la maturation du système immunitaire et l'homéostasie sont établies dans l'intestin - des conditions stables et requises pour nos études.
Production d’anticorps par immunisation génétique ou protéique/peptidique chez le rat et la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Rats : 1500
Dépilés à la crème jusqu'à dix fois, immunisés jusqu'à douze fois, piqués jusqu'à sept fois pour des prises de sang, 1 500 rats et 750 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le but est de produire des anticorps monoclonaux et polyclonaux à partir d'un seul animal, à la demande de partenaires industriels qui commandent les cibles. Les animaux dont la réponse immunitaire reste faible sont tués sans attendre, les autres partent vivants chez le client, qui prélève ensuite le sang, la rate, les ganglions et la moelle osseuse. Aucun calcul statistique n'a fixé les effectifs, le porteur indiquant s'être entendu avec ses partenaires sur trois à dix animaux par cible.
Objectifs
L’objectif de ce projet est la création d’une grande diversité d’anticorps monoclonaux et polyclonaux à partir d’un seul animal. Pour cela, un antigène (sous forme d’ADN ou de peptide/protéine) est administré à des rongeurs, afin que le système immunitaire produise des anticorps multiples. Le sang (contenant les cellules lymphatiques) et les organes (ganglions lymphatiques, la rate et la moelle osseuse) de ces animaux seront collectés pour récupérer ces anticorps. Les antigènes en question seront des récepteurs cellulaires humains ciblés et permettront de développer de nouveaux candidats médicaments. La découverte et le développement de ces anticorps appropriés à l'action très spécifique est donc indispensables dans le traitement de maladies infectieuses et des cancers ainsi que dans le diagnostic de ces maladies.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont l'obtention d'outils thérapeutiques afin de traiter des pathologies telles que les cancers, les maladies inflammatoires et neurologiques notamment. Ils constituent donc des solutions thérapeutiques majeures.
Procédures
Les animaux seront soumis aux dépilations (jusqu'à 10), aux immunisations (jusqu'à 12) et aux prélèvements sanguins (juqu'à 7). Chaque intervention dure environs 3 minutes/animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont la douleur des administrations/injections/prélèvements sanguins, la douleur aux niveaux des sites d'administrations/injections (irritations, légères réactions inflammatoires), et le stress causé au moment de la dépilation (crème dépilatoire), des immunisations, des prélèvements de sang et de la contention aux moments de ces interventions.
Devenir
Les animaux sont soit expédiés, soit mis à mort. Si aucune réponse immunitaire significative ne peut être détectée chez un animal, l’immunisation est arrêtée et l’animal est mis à mort. Par contre si la réponse immunitaire est présente, les animaux sont expédiés a notre partenaire pour collecter les Anticorps.
Remplacement
La bibliographie montre que le remplacement des anticorps d’origine animale par des anticorps synthétiques a été initié depuis plusieurs années dans différents domaines mais que, dans l’état actuel de la technologie, il reste des situations dans lesquelles soit les anticorps synthétiques restent inadaptés donc inutilisables (anticorps dirigés contres des protéines dénaturées, anticorps anti-peptides), soit l’évolution vers l’utilisation d’anticorps d’origine non animale en production sera un processus de longue durée et les obstacles techniques subsistent (anticorps à usage thérapeutique ou diagnostic). La production d’anticorps monoclonaux et polyclonaux spécifiques de l'antigène, nécessite l'interaction complexe de toutes les cellules (surtout des cellules B) et d’organes lymphatiques impliqués dans le système immunitaire d'un organisme vivant mammifère. Le développement d’une grande diversité d’anticorps par leurs séquences n'est pas possible en l'état actuel de la recherche, tant par les techniques de culture cellulaire que par l'utilisation d'organes isolés, raison pour laquelle l'immunisation d'organismes entiers (souris et rats) est nécessaire. Les dernières découvertes oncologiques ont montré que des facteurs individuels dans les voies de signalisation cellulaire humaines qui jouent un rôle central dans le développement du cancer (ou d'autres maladies importantes) sont donc appropriés comme "cibles" de nouveaux médicaments pour combattre ces maladies. Les anticorps conviennent particulièrement bien comme "candidats médicaments", car ils se caractérisent généralement par une spécificité d'action très élevée et une action sélective par rapport à la cible (moins d'effets secondaires), contrairement à de nombreux autres candidats médicaments (par ex. par voie chimique) qui ont des effets secondaires importants, car ils agissent de manière très peu spécifique. C'est pourquoi la découverte et le développement d'anticorps appropriés et très spécifiques sont indispensables pour de meilleures mesures thérapeutiques contre des maladies telles que le cancer.
Réduction
Nous réalisons ce protocole à la demande de nos partenaires avec qui nous échangeons sur le nombre minimal et suffisant d’animaux pour atteindre leurs objectifs scientifique. Aucune approche statistique n'a été réalisée. Le nombre d'animaux utilisés par projet d'immunisation varie entre 3 et 10 animaux par immunogène ; le nombre d'animaux utilisés dépend de l'antigène et de l'espèce animale à immuniser. Afin d'obtenir une diversité suffisamment élevée des anticorps à développer, 3 à 10 animaux sont immunisés par groupe et par cible, en fonction de la cible et de l'espèce. Une fois l'immunisation effectuée, les cellules lymphatiques (provenant des organes cibles pertinents pour les cellules immunitaires comme la rate, les ganglions lymphatiques et la moelle osseuse) sont prélevées sur les animaux immunisés. Il n'y a pas de groupe d'animaux de contrôle par essai/antigène cible. Les sérums pré-immunitaires des mêmes animaux immunisés servent de contrôle dans les essais. De plus, pour une bonne campagne d'immunisation pour le criblage des cellules B, il est important de prélever les organes des animaux le plus frais possible et de les traiter directement après le prélèvement. Une cryoconservation des organes lymphatiques ou de leurs cellules après le prélèvement serait réalisable, mais serait également responsable d’une très grande perte de matériel cellulaire, en raison de la mort des cellules due au processus de congélation et de décongélation, ce qui nécessiterait l’utilisation de plus d’animaux immunisés pour avoir la quantité d’anticorps voulu. C’est pour cette raison, que les animaux immunisés sont transportés vivants jusque chez notre client, ce qui permet de réduire au maximum le nombre d'animaux à utiliser pour une campagne d'immunisation.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages contenant de l'enrichissement (bâtons de bois et matériel de nidification) et une surveillance est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation. Les contentions, épilations, immunisations et prélèvements sanguins sont réalisés par un personnel formé et expérimenté. En cas d'inflammation (au niveau des sites d'administrations/injections), une injection sous-cutanée d'analgésie sera réalisée, elle pourra etre répétée 24 h après si nécessaire.
Choix des espèces
Les animaux à immuniser doivent être des mammifères possédant une réponse immunitaire humorale (anticorps sécrétés par les cellules lymphocytaires B). Pour qu'une immunisation avec un antigène cible humain s'accompagne d'une réponse immunitaire significative de l'espèce immunisée, il est nécessaire que l'homologie de l'antigène cible entre l'animal et l'homme soit suffisamment différente pour que l'antigène cible soit reconnu comme "étranger" chez l'animal et que celui-ci produise des anticorps spécifiques à l'antigène cible. C'est le cas chez le rat et la souris qui produise des anticorps de bonne qualité. Les animaux seront tous utilisés au stade adulte pour que leur système immunitaire soit mature. Les animaux utilisés auront au minimum 6 semaines d’âge et maximum 20 semaines (au démarrage du protocole). A cet intervalle d'âge, les animaux présentent une réponse immunitaire particulièrement bien développée et réagissent avec une diversité aussi grande que possible de différents anticorps contre un antigène. Une grande diversité de séquences d'anticorps différentes est importante pour le développement d'anticorps candidats, car l'objectif est de reconnaître le plus grand nombre possible d'épitopes et de liaisons à l'antigène avec différentes affinités. A partir de l'âge d'environ 20-25 semaines, la réactivité et la diversité peuvent diminuer.
Compréhension de la leucémogenèse, développement de modèles de remplacement et tests précliniques pour les leucémies pédiatriques humaines agressives
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Greffées de cellules leucémiques prélevées chez des enfants, par voie intraveineuse ou directement dans le fémur sous anesthésie générale, 3 842 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune peut subir jusqu'à douze prises de sang, trois ponctions de moelle osseuse, une irradiation sub-létale de sept minutes et un gavage quotidien pendant quatre semaines. Les souris développent une leucémie qui provoque perte de poids et affaiblissement général, et toutes sont tuées, pour analyse post-mortem ou parce qu'elles sont transgéniques. Le projet se donne pour objectif d'identifier des approches alternatives à l'utilisation d'animaux non-humains pour l'étude des leucémies pédiatriques, tout en prévoyant 3 842 souris sur sa durée.
Objectifs
Les leucémies aiguës myéloblastiques de l’enfant et de l’adolescent sont des cancers des cellules sanguines, dont le pronostic s’est peu amélioré au cours des 25 dernières années. Les taux de rechute et de survie sont respectivement d’environ 45% et 65%. Le traitement standard comprend une polychimiothérapie, parfois associée à une greffe de cellules souches hématopoïétiques pour les patients de haut risque ou en rechute. La greffe de cellules souches hématopoiétiques (CSH) est un traitement lourd, source de séquelles à long terme. Des progrès sont donc nécessaires pour réduire le taux de rechute, améliorer la survie et limiter les séquelles. L’objectif de nos études est de caractériser les mécanismes mis en jeu dans les leucémies l’enfant à mauvais pronostic. Pour tester l'efficacité de nouvelles approches thérapeutiques, il est essentiel de pouvoir travailler sur les cellules tumorales les plus proches possibles de celles présentes chez les patients afin de prendre en compte la complexité génétique des tumeurs. La xénogreffe dérivée du patient développée après transplantation de la tumeur primaire humaine directement dans divers modèles murins immunodéprimés a été utilisée largement pour modéliser différents types de cancer. En effet, ces tumeurs conservent les caractéristiques histologiques des tumeurs parentales, reflètent mieux l'hétérogénéité de l'échantillon du patient et constituent une plate-forme pour évaluer les médicaments anticancéreux (molécules pharmacologiques et immunothérapies, dans des conditions physiologiques. Le projet a également pour objectif d'identifier des approches alternatives à l’utilisation de modèles animaux pour l’étude des leucémies pédiatriques. Pour cela, nous utiliserons des modèles de cellules pluripotentes induites humaines cultivées in vitro pour caractériser les propriétés tumorales des cellules exprimant les oncogènes des leucémies issues des cellules souches en comparant les cellules obtenues in vitro et in vivo à celles provenant des patients. A terme, l'utilisation de cellues souches pourrait permettre de réduire l’utilisation d’animaux pour réaliser certaines approches exclusivement in vitro. Nous utilisons des outils statistiques permettant de définir le nombre minimal d'animaux à utiliser pour obtenir des conclusions significatives pour chaque approche.
Bénéfices attendus
L'objectif de ce projet est d'améliorer les modèles utilisés afin d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de leucémies agressives. Spécifiquement, nous attendons du projet qu'il permette : -D'amplifier des cellules leucémiques de patients afin de réaliser leur analyse moléculaire et définir l'efficacité de réponse à plusieurs molécules pharmacologiques qui seront identifiées par les analyses moléculaires. -D'identifier la trajectoire de transformation entre une cellule normale et une cellule leucémique afin de caractériser les spécificités des cellules leucémiques exprimant différents oncogènes. -De définir si des cellules souches pluripotentes induites pourraient, à l'avenir, être utilisées à la place des cellules humaines primaires et dans les approches in vitro pour réduire l'utilisation de souris. -De caractériser l'efficacité anti-tumorale d'approches précliniques, incluant certaines immunothérapies . -D'améliorer les modèles développés dans le but de réduire le nombre de souris utilisées et de définir les prérequis pour le replacement de certains modèles murins in vivo par des approches in vitro.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: -Injection intra-veineuse sous anesthésie locale de cellules: les injections sont ponctuelles (une fois par animal). Chaque injection prend quelques secondes. -Injection intra-veineuse de molécules sous anesthésie locale: injections dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et pourront être biheddomadaires sur une durée de 4 semaines. Chaque injection prend quelques secondes. -Injection intra-fémorale sous anesthésie générale de cellules: les injections sont ponctuelles (une fois par animal) et chaque injection prend 3 à 5 minutes. -Gavage oral: dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et pourront être journalier sur une durée de 4 semaines. Chaque gavage prend 10-20 secondes. -Prélèvement de sang sous anesthésie locale: jusqu'à 12 prélèvements par souris avec une fréquence ne dépassant pas 1 fois/semaine. Chaque prélèvement prend ~1 minute. -Prélèvement de moelle sous anesthésie générale : jusqu'à 3 prélèvements par souris avec une fréquence d'au moins 15 jours. Chaque prélèvement prend 2 à 3 minutes. Irradiations sub-léthale, une seule fois, durée 7 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances sur les animaux sont dues au développement d'hémopathies malignes. Chez les animaux qui présentent une pathologie avancée, cela se traduit par une perte de poids et un affaiblissement général. Les interventions répétées de type injection ou prélèvements de sang peuvent éventuellement occasionner rarement des hématomes ou des lésions locales. Les injections intrafémorales ou les prélèvements de moelle dans le fémur peuvent rarement occasionner des douleurs persitantes et des boîteries. Les irradiations sub-léthales n'ont aucun effet indésirables au-delà des manipulations légères pour les pratiquer.
Devenir
Tous les animaux du projet sont transgéniques et seront donc euthanasiés. De plus, beaucoup développeront des maladies de type leucémie et seront euthanasiés pour analyses post-mortem.
Remplacement
L'utilisation de modèles animaux dans ce projet est incontournable pour les raisons suivantes : 1-La génération/maturation terminale des lignées hématopoïétiques à partir de cellules souches n’est actuellement pas possible par des techniques de culture exclusivement in vitro; 2-Des lignées cellulaires immortalisées et poussant in vitro ne sont pas disponibles pour la plupart des oncogènes que nous étudions. D’autre part, plusieurs études montrent que ces lignées cellulaires cultivées in vitro divergent significativement des échantillons leucémiques de patients; 3-Les approches précliniques in vivo sont indispensables pour prendre en compte la pharmacologie des composés utilisés incluant la formulation, la biodisponibilité et la détection d’éventuels effets secondaires délétères; 4-Pour mettre en place des modèles de remplacement (ex: modèles de leucémie à partir de cellules souches pluripotentes induites), il est indispensable avant tout, de démontrer que les cellules obtenues par cette approche sont capables de reproduire in vivo des leucémies proches de celles observées chez les patients.
Réduction
De nouvelles lignées de souris immunodéficientes sont développées régulièrement par d'autres laboratoires et certaines sont rapportées comme ayant un taux de greffe des cellules hématopoïétiques humaines supérieur et donc permettant de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces approches. Nous comparerons l'efficacité de ces modèles à celui du modèle de référence pour la prise de greffe de nos échantillons leucémiques afin de sélectionner le modèle qui permettra de réduire le nombre de souris utilisées pour les greffes primaires. Des méthodes statistiques seront utilisées pour déterminer précisément le nombre d'animaux nécessaire et suffisant et pour analyser les résultats. Au cours des années passées, nous avons identifié un modèle plus réceptif aux greffes de cellules hématopoïétiques primaires ou issues de cellules souches pluripotentes induites. Nous utilisons donc maintenant régulièrement cette souche qui permet de réduire le nombre de souris utilisées. Nous poursuivrons la comparaison avec de nouvelles souches de souris immunodéficientes qui deviendraient disponibles au cours du projet. Dans le cas où elles montreraient une efficacité, nous serons donc amenés à utiliser de nouvelles lignées et à diminuer le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront suivis quotidiennement pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un traitement analgésique. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Afin de réduire l’invasivité des prélèvements, nous introduisons des rapporteurs luminescents dans les cellules humaines utilisées pour les approches précliniques afin de pouvoir suivre la prise de greffe et l’efficacité des traitements par des approches d’imagerie corps entier sans prélèvements (ex: sang ou moelle) permettant une meilleure quantification de l'efficacité globale du traitement.
Choix des espèces
Les souris représentent une espèce relativement facile à élever qui permet l’obtention de résultats rapides du fait de leur temps de génération réduit. Elles possèdent un système hématopoïétique proche de celui de l’homme. Pour cette étude, nous utilisons des souris immunodéficientes, car ces souris permettent une prise de greffe efficace de cellules humaines, avec un risque de rmaladie du greffon contre l'hôte réduit et peuvent être utilisées pour les approches précliniques. Par le passé, nous avons contribué à des approches précliniques pour un composé qui ont conduit à des phases cliniques. Ces modèles sont également utiles pour le test d'immunothérapies. Nous utiliserons des souris adultes entre 6 et 10 semaines pour avoir des tests efficaces et reproductibles. Pour l'étude des pathologies de l’enfant, des article récents montrent l’importance d'utiliser des souris receveuses nouveau-nés. Ainsi, nous pourrons transplanter les cellules soit dans des receveurs nouveau-nés ou adultes pour comprendre l'importance de l'âge de l'organisme lors du dévéloppement des leucémies retrouvées chez l'enfant.
Etude de l’impact du polymorphisme N363S du gène NR3C1 codant le Récepteur Glucocorticoïde sur le rétrocontrôle négatif de l’axe corticotrope par les glucocorticoïdes exogènes
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
Opérées sous anesthésie générale pour recevoir un dispositif de perfusion porté cinq semaines, une partie des 282 souris de ce projet subit des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les autres reçoivent une injection sous anesthésie locale, et le porteur prévoit de réutiliser certains animaux dans une seconde procédure avant de les tuer pour analyser leur sang et leurs organes. Le projet porte sur une mutation du récepteur des glucocorticoïdes que portent 2 à 4 % des humains, et cherche à savoir si elle aggrave le risque d'insuffisance corticotrope après un traitement prolongé aux corticoïdes. Un test comportemental d'évaluation du stress de cinq minutes est annoncé, répété deux fois dans la vie de chaque souris, sans que le porteur précise lequel.
Objectifs
Les hormones glucocorticoïdes sont sécrétées par la glande surrénale. Elles sont sécrétées pour permettre à l’organisme de s’adapter en cas de stress et de diminuer la réponse inflammatoire. C’est pourquoi les glucocorticoïdes sont largement utilisés comme traitement. Ils sont utilisés notamment dans le traitement des maladies inflammatoires, des allergies, de l’asthme ou de nombreux cancers. Les glucocorticoïdes n’agissent pas seulement sur la réponse inflammatoire mais sur de nombreux autres organes. C’est pourquoi, lorsqu’il y a un déséquilibre, ils peuvent entrainer des effets secondaires. Lors d’un traitement prolongé par glucocorticoïdes, il n’y a plus de production par l’organisme de glucocorticoïdes. Lorsqu’on arrête le traitement, la production de glucocorticoïdes par l’organisme ne reprend pas chez 40% des patients. Cela entraine un manque de glucocorticoïdes qui peut entrainer des complications graves et s’appelle l’insuffisance corticotrope. Pour le moment, il est difficile de prédire chez quels patients surviendra cet effet secondaire. C’est pourquoi nous essayons de mieux comprendre cette maladie pour améliorer la prise en charge des patients. Les glucocorticoïdes agissent par l’intermédiaire du récepteur glucocorticoïde. Chez 2% de la population mondiale, il existe une mutation de ce récepteur qui entraine une augmentation de l’effet des corticoïdes et donc, théoriquement, une augmentation du risque de complications. Pour étudier si cette mutation augmente le risque d’insuffisance corticotrope, l’utilisation de modèles cellulaires est insuffisante. En effet, ils ne permettent pas de reproduire la complexité de la sécrétion de glucocorticoïdes ainsi que les différents niveaux de régulation. Aussi, il est nécessaire de générer un modèle murin afin d’évaluer les différents acteurs impliqués dans la régulation de l’axe corticotrope. Ce modèle murin permettra d’étudier l’effet de la mutation sur la sécrétion de glucocorticoïdes et d’évaluer si elle constitue un facteur de risque d’insuffisance corticotrope.
Bénéfices attendus
La variabilité inter-individuelle dans la sensibilité aux corticoïdes est un enjeu important en médecine, en effet on considère que près de 2% de la population mondiale reçoit un traitement par glucocorticoïdes exogène. La mise en évidence du variant N363S, retrouvé chez 2-4% de la population, comme facteur de risque pourrait permettre d’adapter de façon personnalisée leur prescription afin de limiter la survenue d’effets indésirables.
Procédures
Pour l’évaluation du bien-être d’une nouvelle lignée génétiquement modifiée, les animaux seront soumis à un test comportemental d’évaluation du stress, d’une durée de 5 minutes, 2 fois au cours de leur vie. Nous évaluerons également la préférence au sucre grace à un test d'une durée de 2 jours. Une partie des souris adultes recevront une injection après anesthésie locale. D’autres souris seront opérées par anesthésie générale pour mise en place d’un système de délivrance de traitement par perfusion pour une durée de 5 semaines. Ce dispositif permet de ne faire qu’un geste chirurgical, sans avoir à faire plusieurs injections. De plus, les souris seront soumises 5 semaines plus tard à un test comportemental d’évaluation du stress, d’une durée de 5 minutes.
Impact sur les animaux
La modification génétique des animaux ne devrait pas entrainer de souffrance spécifique puisqu’il n’existe pas chez l’être humain de pathologie liée à cette mutation. Cependant, les personnes ayant cette mutation ont tendance à avoir plus de troubles métaboliques et à être plus à risque d’obésité, ces aspects seront donc recherchés et pris en charge le cas échéant chez les animaux génétiquement modifiés. Les nuisances des procédures proposées sont faibles à modérées pour les animaux. L’injection de traitement peut entrainer une douleur au niveau du point d’injection et la pose d’un dispositif sous cutané peut entrainer des douleurs. Ces douleurs sont prévisibles et prises en charge par l’anesthésie.
Devenir
Dès que possible, les animaux seront utilisés dans plusieurs procédures, afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaire. Les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures quand cela sera nécéssaire pour permettre les analyses de sang et des organes post-mortem.
Remplacement
Les corticoïdes agissent sur l’ensemble de l’organisme et sont sous le contrôle de l’axe corticotrope, composé de plusieurs niveaux, comprenant une partie du cerveau, la glande hypophyse et la glande surrénale. Leurs effets sont très finement contrôlés car un excès de corticoïdes entraine des complications métaboliques, psychiatriques et cardiovasculaires et un manque de corticoïdes entraine le décès. Pour permettre cet équilibre, leur sécrétion est contrôlée à différents niveaux, qui est difficile d’étudier de façon dissociée. C’est pourquoi il est nécessaire d’avoir recours à un modèle vivant permettant de reproduire le dialogue entre les différents organes impliqués. L’utilisation de modèles cellulaires in vitro est compliqué, d’une part car il existe un seul modèle de cellules corticotropes immortalisées hypophysaires, issu de cellules tumorales ne réagissant pas forcément de la même façon que des cellules saines aux corticoïdes. D’autre part, car la culture cellulaire ne permet pas de rendre compte de la dynamique de l’axe corticotrope au cours du temps.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé en utilisant un calcul de puissance afin d'inclure uniquement le nombre d'animaux nécéssaire pour répondre à la question posée dans chaque procédure. Le nombre minimal d’animaux a été choisi pour l’ensemble des procédures. Dès que possible, les animaux seront utilisés dans deux procédures pour permettre la réduction du nombre d'animaux nécéssaires.
Raffinement
Les conditions d’élevage et d’hébergement seront appropriées pour réduire la douleur, la souffrance, l’angoisse ou les dommages durables que pourraient ressentir les animaux : cages adaptées à l’animal et à sa taille en maintenant les animaux par deux minimums dans chaque cage, et par enrichissement du milieu par copeaux de bois/tunnel en carton et cabanes. * Souris : 5 animaux par cage au maximum (nombre susceptible de varier en fonction de la taille des animaux) - Les animaux seront observés quotidiennement par les membres qualifiés de l’animalerie et les responsables du projet afin de ne pas méconnaître les points limites. - Les mesures des animaux (poids, taille) seront couplés afin de réaliser l’analyse de plusieurs paramètres pour limiter au maximum le stress des animaux. - Une anesthésie générale ou locale de courte durée sera réalisé pour chaque procédure entrainant une douleur.
Choix des espèces
Les animaux utilisés sont des souris, en effet, les souris sont souvent utilisées dans la recherche car les manipulations génétiques sont bien connues et maitrisées dans cette espèce. De plus, la séquence du gène chez la souris est très proche de celle de l’être humain, ce qui permettra d’extrapoler les données obtenues. Les souris étudiées seront des souris adultes, car les effets attendus de la mutation s’expriment à l’âge adulte.
Etude des effets cardiovasculaires de l’infection au Sars-Cov2 dans des modèles murins EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système respiratoire
Infectées par le SARS-CoV-2 au moyen d'une administration intranasale sous anesthésie, 1 680 souris humanisées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées après mesure de leur pression pulmonaire. Certaines passent trois semaines en hypoxie chronique, d'autres subissent une chirurgie du cou avec injection intratrachéale. Le porteur reconnaît que l'infection peut conduire à la diarrhée, à l'affaiblissement, à la malnutrition puis à la mort, et revendique un protocole jamais mené ailleurs dans le monde. Il qualifie la mesure de pression artérielle à la queue de "procédure indolore", et liste par ailleurs l'hémorragie, la douleur post-opératoire et l'arrêt cardio-respiratoire parmi les suites possibles des chirurgies.
Objectifs
L’objectif de notre recherche est de mieux comprendre les altérations vasculaires et cardiaques liées à l'infection au SARS-Cov2. Nous allons utiliser des modèles murins (des souris transgéniques exprimant le récepteur humain du virus) afin de pouvoir suivre in vivo les effets de l'infection et de l'inflammation induite par cette infection. Notre but est d'augmenter les connaissances sur les conséquences au long cours du Covid19 pour améliorer la prise en charge des patients. Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Ces études nous permettront d’évaluer au long cours les altérations de la fonction cardiovasculaire à la suite d’une infection au SARS-Cov2. Nous utiliserons 2 lignées de souris afin de déterminer les mécanismes impliqués dans ces effets. Les résultats serviront à mieux comprendre été prévenir les conséquences pulmonaires, vasculaires et cardiaques du Covid19
Procédures
Chaque animal sera soumis une seule fois dans sa vie à un prélèvement caudal pour génotypage (EU1). Cet acte ne dure que quelques secondes. Certaines souris seront soumises à une administration intra-nasale sous anesthésie pendant 15 minutes (EU1). Certaines souris recevront dans l’eau de boisson un anti-hypertenseur pendant 10 jours (EU1). Certaines souris seront étudiées par échocardiographie effectuée sous anesthésie pendant 20 minutes (EU2). La pression artérielle sera aussi mesurée à la queue sur animaux vigiles (procédure indolore) après accoutumance à la contention pendant 5 jours (EU2). Certaines souris seront en plus soumises à une hypoxie chronique pendant 3 semaines avant l’étape finale (EU2). Pour les procédures chirurgicales sous anesthésie, la douleur sera évitée par l’administration d’anesthésiques et d’analgésiques (EU2). Certaines souris subiront une petite chirurgie au niveau du cou comprenant une anesthésie et une analgésie pendant 15 minutes et une injection intra-trachéale avant l’étape finale (EU2). Certaines souris recevront 1 à 5 injections intrapéritonéales (1 par jour) ou administrations intranasales sous anesthésie générale pendant 15 minutes avant l’étape finale (EU2). Pour toutes les souris, l’étape finale sera une procédure chirurgicale effectuée sous anesthésie avec analgésie pendant 15 minutes avant l’euthanasie (EU2).
Impact sur les animaux
Le transport des animaux entre les 2 sites peut engendrer une anxiété temporaire. L’infection induit une maladie pulmonaire et chez certains animaux une maladie intestinale avec des conséquences qui peuvent être très sévères selon la lignée murine: les plus forts sont la perte de poids, la diarrhée, l’affaiblissement allant jusqu’à la malnutrition puis la mort. les souris seront soumises à un stress hypoxique. L'hypertension pulmonaire induite par l’hypoxie chronique est modérée chez la souris normale mais pourrait être sévère chez les souris post infection induisant un stress physique. Un stress (peur ou détresse) des animaux est possible lors de l’acclimatation à la prise de pression systémique vigile. L’anesthésie peut induire des effets tels que l’hypothermie, des difficultés respiratoires ou dans les cas les plus critiques un arrêt cardio-respiratoire. La procédure chirurgicale peut également être source d’hémorragie ou de douleur post-opératoire. Les procédures d’injection peuvent potentiellement conduire à des infections.
Devenir
Les 1680 animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés en fin d’expérimentation à l’issue d’une mesure de la pression pulmonaire sous anesthésie. Les animaux sont utilisés à des fins expérimentales qui nécessitent leur euthanasie afin de pouvoir mesurer leurs paramètres hémodynamiques et étudier les tissus.
Remplacement
Pour comprendre les conséquences au niveau de la fonction et de la structure des vaisseaux pulmonaires de l’infection au SARS-Cov2, il est nécessaire d’infecter des animaux afin d’être dans les conditions les plus proches des patients et afin de conserver l’ensemble des phénomènes intervenants dans la régulation des vaisseaux pulmonaires : inflammatoires (interactions cellules immunes et cellules vasculaires), vasculaires (interactions des cellules vasculaires entre elles), respiratoires (hypoxie locale) et éventuellement nerveux. Les études in vitro ne permettent pas d’évaluer les conséquences de façon intégratives. De plus, la régulation de la pression artérielle pulmonaire ou systémique et de la fonction cardiaque ne peuvent être évaluées qu'in vivo. Cependant, une fois ces conséquences tissulaires et cellulaires identifiées in vivo, les voies et les molécules impliquées seront étudiées in vitro sur des cellules en culture (cellules vasculaires en culture) infectées ou non.
Réduction
1680 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Ces expériences n'ont jamais été réalisées ni en France, ni dans le monde, par d'autres équipes dans un protocole expérimental semblable.
Raffinement
Les volumes injectés sont les plus petits possibles en accord avec le poids de l’animal. Le poids des animaux est suivi tout au long des procédures. Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec eau et nourriture ad libitum et une température et hygrométrie constantes. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés à plusieurs et le milieu est enrichi. Pendant l’ensemble des procédures, une surveillance quotidienne sera effectuée et le poids des animaux sera mesuré régulièrement. Les points limites seront évalués selon une grille de suivi. Après infection, les souris seront observées quotidiennement et pesées tous les jours pendant 1 semaine, puis toutes les semaines. La douleur sera soulagée par l’administration d’analgésique systémique au cours de la procédure finale. Si le comportement d'un animal est altéré, il sera pesé avec un point limite à 20 pour cent de perte de poids. Une perte de sang importante, des signes de souffrance (prostration, poil hérissé, yeux fermés) qui se maintiennent, une prostration, une incapacité à se déplacer, des yeux larmoyants et exorbités constituent également des points limites. Les infections éventuelles seront traitées localement par application de crème antibiotique.
Choix des espèces
Nous effectuons des expériences avec des souris modifiées par transgénèse afin d’humaniser les souris pour en faire un modèle d’étude de l’infection au SARS-Cov2 dont la pertinence a été démontrée comme modèle pour étudier les effets liés au Covid19. Ces modèles de souris sont plus connus et plus facilement utilisables pour des études in vivo et pour les analyses d’organes que les autres modèles animaux existants (e.g. furet). Les études sur les effets de l’infection au SARS-Cov2 seront effectuées au stade adulte, lorsque le développement pulmonaire, vasculaire et cardiaque est fini, après l'âge de 8 semaines.
Relation entre les dysfonctionnements sérotoninergiques et les troubles respiratoires associés à l’épilepsie dans un modèle du syndrome de Dravet chez la souris (EU 2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Exposées chaque jour pendant dix jours à un gaz convulsivant, le flurothyl, 418 souris porteuses de la mutation du syndrome de Dravet vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Cent quarante d'entre elles subissent une chirurgie de quatre-vingt-dix minutes pour l'implantation d'électrodes cérébrales, d'un capteur nasal et d'électrodes musculaires, puis des enregistrements de six heures par jour un jour sur deux pendant quatre semaines. Le porteur écrit qu'en dehors de perturbations transitoires du comportement, "aucun autre effet nuisible n'a été rapporté", tout en précisant que chez 30 % des souris la crise se termine par un arrêt respiratoire fatal. Chaque animal subit de trois à quarante-cinq interventions entre sa naissance et sa mise à mort, au terme de laquelle le cerveau est prélevé.
Objectifs
La mort soudaine inattendue en épilepsie (SUDEP) est la cause majeure de mortalité précoce chez les patients souffrant d’un syndrome de Dravet (SD). La SUDEP est décrite comme faisant suite à la survenue d’une crise épileptique entrainant un arrêt respiratoire fatal. L’unique stratégie qui est proposée de nos jours pour prévenir la SUDEP consiste à contrôler la survenue des crises épileptiques chez le patient. Cette stratégie comporte certaines limites dès lors que l’on considère que le SD est une forme d’épilepsie qui répond mal aux médicaments anti-crises actuellement disponibles. Pour prévenir la SUDEP, il est essentiel de trouver une autre alternative thérapeutique en identifiant de nouveaux candidats pharmacologiques à cibler chez le patient souffrant de SD. La sérotonine cérébrale joue un rôle majeur dans la survenue des crises et dans le contrôle de la respiration. L’hypothèse sur laquelle repose ce projet est que l’arrêt respiratoire survenant à la suite d’une crise et à l’origine des SUDEP dans le SD est favorisé par l’installation progressive d’une vulnérabilité de la fonction respiratoire en lien avec la répétition des crises d’épilepsie. Les objectifs de ce projet sont ainsi : (1) de caractériser la chronologie d’installation de la vulnérabilité respiratoire dans le SD, (2) d’identifier le(s) marqueur(s) sérotoninergique(s) associés à la vulnérabilité respiratoire et au risque de SUDEP, (3) et de tester un candidat pharmacologique en lien avec la cible sérotoninergique identifiée pour prévenir cette vulnérabilité respiratoire. Pour répondre à ces objectifs, nous aurons recours à un modèle expérimental chez la souris R1648H, qui porte la mutation du gène SCN1A, à l’origine du SD chez l’humain.
Bénéfices attendus
Aujourd’hui, nous ne savons pas comment la répétition des crises chez les jeunes patients souffrant de SD peut aggraver la vulnérabilité cardio-respiratoire qui conduit à la SUDEP. La souris R1648H est un modèle qui mime la symptomatologie du SD décrite chez l’humain et l’utilisation de ce modèle dans ce projet devrait fournir des éléments précieux qui permettront une meilleure prise en charge des patients SD. En ciblant le système sérotoninergique qui est fortement impliqué dans le contrôle de la respiration et dans la genèse des crises, nous espérons mettre en évidence des éléments de ce système qui pourraient être (1) utilisés comme des marqueurs permettant l’identification des patients SD à risque de SUDEP, et (2) ciblés par des agents pharmacologiques visant à prévenir l’installation de la vulnérabilité ventilatoire et le décès qui lui est associé.
Procédures
Le génotypage et le tatouage de l’ensemble des souris de la portée sera effectué à P7 (durée
Impact sur les animaux
En dehors des perturbations transitoires sur le comportement de la souris lors de la survenue de la crise par le flurothyl, aucun autre effet nuisible n’a été rapporté chez les animaux qui seront utilisés dans ce projet. Comme décrit dans l’annexe 3, la sévérité de la crise durant l’exposition au flurothyl est progressive et s’intensifie au cours du protocole d’ICF. Cela comprend 7 stades avec le stade 1 décrit comme celui qui est de plus faible sévérité comprenant des clonies de la face et des membres postérieurs ou antérieurs. Les caractéristiques des crises de stades plus sévères se traduisent par la présence de clonies plus intenses, des rebonds et/ou course de l’animal dans la cage et la présence d’une phase de tonus musculaire. A noter que la durée de la crise des stades 1-6 est de 15 à 60 sec ; toutefois, chez 30% des souris R1648H, la crise conduira dans les secondes qui suivent à un arrêt respiratoire fatal défini comme le stade 7.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort et le cerveau sera prélevé pour des investigations ex-vivo.
Remplacement
Le caractère inattendu de la SUDEP chez le patient SD rend les expériences prévues dans ce projet non envisageables chez le sujet humain. L’étude des rythmes cérébraux et cardio-respiratoires au cours ou en dehors d’une crise épileptique nécessitent l’utilisation d’animaux vivants et ne peut s’envisager sur des modèles in vitro. La souris R1648H modèle du SD est aujourd’hui la seule espèce qui présente une physiopathologie similaire à celle observée chez l’humain.
Réduction
Pour mener ce projet, nous aurons besoin d’utiliser 418 souris sur une durée de 5 ans. Ce nombre a été réduit au maximum sans compromettre toutefois les objectifs scientifiques du projet, en nous basant sur les données bibliographiques antérieures et des outils statistiques.
Raffinement
Les conditions de stabulation sont conformes à la réglementation et prennent compte du bien-être animal. Le poids des animaux sera suivi hebdomadairement, et les animaux seront soumis à une surveillance attentive à l’aide d’une grille d’évaluation du bien-être (annexe 1), pour limiter au maximum stress et douleur, et apporter des soins adaptés, le cas échéant. Les animaux qui auront été isolés pour leur confort seront manipulés quotidiennement pendant 5 minutes. Pour évaluer la respiration de façon non-invasive, nous utiliserons la pléthysmographie à corps entier qui permet d’obtenir des enregistrements chez un animal vigile et libre de se mouvoir. Le temps d’enregistrement est limité à son minimum durant la période inter-ictale avec 40 min par animal. Les enregistrements en imagerie cérébrale seront effectués sur un animal anesthésié pour réduire le stress de la contention. Toutes les mesures seront prises pour limiter la souffrance et la douleur. L’utilisation d’analgésiques par voie i.p. sera systématique avant la chirurgie (buprénorphine) puis quotidiennement et durant les 3 jours qui suivent le jour de l’implantation chirurgicale (Carprofène). L’expérience sera stoppée si les points limites définis dans la grille de score sont atteints. A la fin de chaque procédure expérimentale, les souris seront mises à mort.
Choix des espèces
Nous souhaitons modéliser trois aspects du SD : 1) la pathologie génétique sous-jacente (mutations SCN1A), 2) l'impact progressif de la répétition des crises observées chez les patients, et 3) un risque modéré de décès (environ 20-40%) qui permettrait facilement de dichotomiser un groupe de survivants et un groupe SUDEP. Le modèle que nous utiliserons sera la souche de souris Scn1aRH+ (R1648H) qui répond parfaitement à ces objectifs. Les animaux seront utilisés entre 7 jours et 72 jours. A l’âge de 7 jours, le génotypage et le tatouage des animaux sera réalisé durant un temps inférieur à 5min puis les souriceaux seront remis avec leur mère. Les crises d’épilepsie se manifestant dès le plus jeune âge dans le SD, nous avons choisi un modèle expérimental de SD permettant de contrôler le déclenchement des crises d’épilepsie aussi bien à 21 jours post-natal (sevrage), qu’à un stade plus avancé (P60).
Elevage de rats immunodéficients et présentant une dégénérescence rétinienne
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Porteurs par construction d'une dégénérescence de la rétine et d'une déficience majeure du système immunitaire, 1 680 rats vont être élevés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur immunodéficience s'accompagne d'une alopécie qui fait s'accumuler des poils sous la paupière, source d'irritation oculaire, et d'une malocclusion dentaire qui peut conduire à la malnutrition. Chaque rat subit une biopsie de queue ou d'oreille dans les dix jours suivant la naissance, et certains une coupe des dents. Une partie sera transférée à trois mois vers un autre établissement pour y recevoir des greffes de cellules humaines, une autre sera gardée pour la reproduction, les rats au mauvais génotype, ceux dont la fertilité baisse, ceux qui atteignent un an et ceux dont la malocclusion devient trop importante étant tués.
Objectifs
La transplantation de cellules comme traitement des maladies dégénératives de la rétine est une des plus prometteuses parmi les thérapies visant à restaurer la vue et l’utilisation de cellules souches humaines, est une des approches les plus prometteuses; L’évaluation de son bénéfice thérapeutique et l’absence d’effet néfaste nécessite sa mise en œuvre et l’évaluation de ses conséquences positives comme négative à l’aide d’un modèle animal présentant des caractéristiques proches de la maladie humaine. Cependant, la transplantation de cellules humaines chez l’animal, donc dans une autre espèce, est par nature source de rejet sévère de la greffe (barrière d’espèce) par le système immunitaire compromettant notre capacité à évaluer son efficacité. Notre projet consiste à réaliser un élevage d’animaux modèles porteur d’une mutation génétique responsable d’une dégénérescence rétinienne et d’une autre mutation, responsable d’une déficience majeure du système immunitaire. cette déficience du système immunitaire empeche le rejet de greffet et permettra par la suite de mettre en place de nouveaux traitements basés sur la greffe de cellules.
Bénéfices attendus
Les travaux de thérapie cellulaire humaine de ces dernières années utilisant des dérivés de cellules souches humaines ont permis d’établir sa faisabilité en termes de survie et d’intégration dans le tissus hôte à court terme. En revanche, la plupart des études témoignent d’une absence ou d’une faible récupération fonctionnelle, liée notamment à un suivi dans le temps trop court en raison d’une faible survie des cellules greffées en raison de la barrière d’espèce. L’immunodéficience (système immunitaire défaillant) des animaux qui seront élevés dans ce projet, permettront de réaliser des greffes en limitant significativement le rejet des cellules transplantées. Une survie à plus long terme laisse présager la mise en évidence d’un véritable bénéfice fonctionnel de la transplantation. L’élevage de ces animaux permettra également de s’affranchir des traitements pharmacologiques immunosuppresseurs (traitement visant à réduire voir bloquer la réponse immunitaire) à l’efficacité variable sur le moyen et long terme.
Procédures
Un prélèvement d'un petit bout de queue ou d’oreille (biopsie) pour analyse génétique est réalisé une seule fois dans les 10j jours suivant la naissance. Les animaux qui seront utilisés dans ce projet sont immunodéficients et peuvent présenter un phénotype dommageable due à une malocclusion dentaire (défaut de pousse des dents) pouvant dans certains cas nécessiter une intervention invasive rapide de quelques secondes (coupes des dents) voir une euthanasie en cas de malocclusion trop sévère.
Impact sur les animaux
Les animaux qui seront utilisés dans ce projet peuvent présenter un phénotype dommageable caractérisé par une malocclusion dentaire (défaut de pousse des dents) pouvant poser des problèmes de malnutrition. Dans certains cas cette malocclusion nécessite une intervention invasive (coupes des dents) qui peut provoquer un certain stress. Par ailleurs, les animaux subiront un prélèvement au niveau de la queue (biopsie) pour identifier certaines caractéristiques génétiques. Le prélèvement est rapide et n’est réalisé qu’une seule fois mais peut être une source de douleur ou d’inconfort au moment du geste. Les animaux présentent une défaillance du système immunitaire (immunodéficient) impliquant un risque accru de maladie. Par ailleurs, l’alopécie caractéristique des animaux présentant une déficience du système immunitaire peut conduire à l’accumulation de poils dans le cul de sac conjonctival (sous la paupière) responsable d’irritation et donc d’une certaine gêne.
Devenir
Une partie des animaux seront transférés (à l’âge de 3 mois) dans un autre établissement utilisateur dans le cadre d’une utilisation continue et rattaché à d’autres projets faisant l’objet d’autorisations distinctes. D’autres permettront de maintenir la colonie (élevage ; reproduction). Les animaux ne présentant par les caractéristiques génétiques nécessaire pour le projet, ceux présentant une baisse de fertilité, ou ayant atteint l’âge d’1 an ou enfin ceux présentant un point limite seront euthanasiés.
Remplacement
Le projet consiste à élever des animaux qui permettront la réalisation d’autres projets (utilisation continue) bénéficiant d’une autorisation et dont l’objectif est de développer une thérapie cellulaire pour des maladies dégénératives de la rétine conduisant à la cécité. Cette évaluation ne peut donc pas être faite par des approches in vitro. Ce projet ne peut être réalisé que chez l’animal.
Réduction
Le projet nécessitera 1680 animaux. Il s’agit du nombre strictement nécessaire pour permettre le maintien de la colonie et produire le nombre d’animaux requis pour les autres projets expérimentaux disposant d’une autorisation de projet (dans le cadre d'une utilisation continue). Le nombre d’animaux a été calculé afin d’obtenir des résultats robustes d’un point de vue statistique. Le nombre total tient compte du fait que certains animaux ne pourront pas être inclus dans l’étude en raison de malocclusions (défaut de pousse des dents) ou d’un profil génétique incompatible avec les projets expérimentaux associés.
Raffinement
L’alopécie précoce des animaux de phénotype « Nude » peut se traduire par une petite accumulation de poils sous la paupière, source d’irritation oculaire et potentielle source d’infection locale si elle n’est pas traitée. Les procédures prévoient une surveillance accrue de ces animaux et un nettoyage des yeux au sérum physiologique en cas de besoin. Les animaux sont par ailleurs hébergés par 2 dans des cages de stabulation standard avec enrichissement. Une alimentation et un enrichissement spécifique présentant un risque de malocclusion sera mis en place afin de limiter son développement. Pour protéger les animaux au maximum en raison de leur faible immunité, tout le matériel est stérilisé par autoclavage (cage, litière, enrichissement) ou irradié (croquettes). La manipulation des animaux s’effectue uniquement sous hotte et les animaux sont hébergés en portoir ventilé à pression positive. L’atteint d’un point limite, principalement une malocclusion trop importante conduira à l’euthanasie de l’animal.
Choix des espèces
le projet prévoit l’élevage d’animaux génétiquement immunodéficients et présentant une dégénérescence rétinienne Ces rats sont porteurs d’une mutation ayant des conséquence identique à celles retrouvés chez de nombreux patients souffrant de dégénérescence rétinienne. Ces animaux présentent également une autre mutation qui compromet le système immunitaire des rats (immunodéficience) qui a pour conséquence le non rejet des cellules greffées. Ce modèle permet l’étude de xénogreffes (donneur et hôte d'espèces différentes) sur le long-terme en réduisant drastiquement le rejet des cellules transplantées normalement provoqué par une forte réponse immunitaire (barrière d'espèce). Il permet également d’éviter les traitements anti-rejets potentiellement toxiques à long terme. Enfin, la dégénérescence rétinienne chez ces animaux est rapide permettant de réaliser la transplantation chez des animaux relativement jeunes (3 mois), àge auquel les animaux présentant les caractéristiques génétiques attendues seront transféré sur un autre projet. le transfert d’animaux jeunes (trois mois) permettra de limiter les atteintes liées aux vieillissement tout en permettant un suivie à moyen/long terme des cellules transplantées (prévu jusqu’à 6 mois post-transplantation). Les animaux en élevage et présentant les bonnes caractéristiques génétiques seront mis en accouplement à partir de l’âge de 10 semaines, âge auquel les animaux présentent une fertilité permettant leur reproduction.
Etude des fonctions oncogéniques du facteur de transcription CDX2 et de la protéine de fusion UBTF-ATXN7L3 dans le système hématopoïétique à l’aide de modèles murins d’expression conditionnelle
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
Tatouées et biopsiées de la queue avant huit jours, puis injectées quatre jours de suite dans la cavité abdominale, 688 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyses post-mortem. Le tamoxifène injecté peut provoquer chez les mâles un œdème testiculaire, voire une hernie inguinale. Deux à cinq prises de sang et jusqu'à deux ponctions de moelle osseuse au genou suivent l'apparition d'une leucémie lymphoblastique aiguë, dont le porteur écrit ignorer le délai, et qui dégrade l'état des souris en quelques jours: perte de poids, détresse respiratoire, anémie, masses sous la peau, prostration. Il présente ces prélèvements comme respectant "les délais réglementaires permettant une récupération complète des animaux", tout en indiquant que la ponction du genou peut léser le cartilage et perturber les déplacements.
Objectifs
Sur la base de données scientifiques obtenues au laboratoire à partir de patients atteints de leucémies aiguës lymphoblastiques B d’un sous-type particulier de mauvais pronostic, les objectifs de notre projet de recherche sont de déterminer l’implication, dans le processus leucémogène de cette hémopathie, de deux protéines retrouvées dans les cellules leucémiques de ces patients. Pour cela, nous développerons un modèle murin dans lequel ces deux protéines sont exprimées dans les cellules lymphoïdes pour voir si elles sont à l’origine de la maladie. Ce modèle, s’il mime cette hémopathie humaine, nous permettra de mieux comprendre les mécanismes responsable de l’émergence de ce type de leucémie chez l’Homme. Notre projet a pour but : (1) de caractériser les anomalies morphologiques, cellulaires et moléculaires dans le système hématopoïétique des souris qui expriment les deux protéines dans leurs cellules lymphoïdes, (2) de comparer ces anomalies aux anomalies décrites pour ce type de leucémies chez l’Homme, (3) d’étudier expérimentalement la pathogénicité de ces deux protéines. Ces connaissances nous ouvriront de nouvelles pistes pour développer des thérapies adaptées à ce sous-type particulier de leucémie lymphoblastique qui échappe aux thérapies conventionnelles.
Bénéfices attendus
Ce projet s’intégre dans une projet de recherche translationnelle, à partir d’observations cliniques, qui ont permis de mettre en évidence un sous-type particulier de patients atteints de leucémies lymphoblastique B de mauvais pronostic. Une meilleure compréhension des mécanismes de leucémogenèse de ce type particulier de leucémies permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Le projet décrit ici est intégré dans un projet plus vaste qui inclut plusieurs groupes de recherche et, entre autre, le criblage de molécules sur des lignées cellulaires de patients de ce sous-groupe de leucémie pour identifier de nouveaux médicaments qui permettraient de cibler ces cellules leucémiques particulières, et de guérir les patients.
Procédures
Les souris transgéniques seront tatouées et une biopsie de queue sera réalisée avant 8j. Les animaux au génotype d'intérêt seront soumis à quatre injections dans la cavité abdominale de produits chimiques (1 injection par jour pendant 4 jours sur animal vigile) au cours de la procédure. Pour suivre l’évolution de la leucémie attendue, 2 à 5 prises de sang, à raison d’une prise par ou au maximum deux prélèvements de moelle osseuse réalisés sur animal anesthésié), avec au minimum 2 mois entre les deux prélèvements, pourront être réalisés sur ces souris. Les souris immunodéprimées seront soumises à une injection de cellules de moelle osseuse murine (sur animal vigile en contention). Deux à quatre prises de sang, à raison d’une prise par mois (sur animal anesthésié ou vigile selon la voie de prélèvement choisie pourront être réalisées pour suivre l’évolution de la leucémie.
Impact sur les animaux
Le tatouage et la biopsie de queue induiront une douleur légère de courte durée. Les animaux transgéniques recevront une dose définie de tamoxifène par injection intra-péritonéale. Ceci peut s’accompagner d’une inflammation au site d’injection et de douleur abdominale au moment de l’injection. Chez les mâles, un œdème testiculaire peut apparaître secondairement, voire une hernie inguinale. De même, l’injection intra-veineuse de cellules de moelle osseuse murines dans les souris immunodéprimées peut s’accompagner d’inflammation au site d’injection. Etant donné l’immunodépression des souris , il ne devrait pas y avoir de réaction de rejet. Sur le plus long terme, notre hypothèse de travail est que les souris développeront des leucémies aiguës lymphoblastiques. Nous ne connaissons pas le délai d’apparition des symptômes. Lorsque la maladie se déclare, l’état de santé des souris se dégrade rapidement (quelques jours). Les cellules leucémiques se propagent, se multiplient et envahissent la moelle osseuse. Ceci entraine une forte perturbation de la production de cellules sanguines. Les souris perdent généralement du poids et, dans les stades avancés, présentent des signes de détresse respiratoire, d’anémie, parfois des masses sous la peau, deviennent inactives et prostrées, et leur pelage n’est plus bien entretenu. La ponction de moelle osseuse étant réalisée au niveau du genou, la souris peut avoir des lésions au niveau du cartilage qui perturbent ses déplacements. Enfin, il existe toujours un risque d’infection au niveau du point de ponction.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélèvements et analyses post-mortem.
Remplacement
La fonction des deux protéines dans la cancérogénèse sera étudiée sur les modèles animaux, en les exprimant dans leur environnement médullaire complexe difficilement modélisable in vitro ou ex vivo. Les études mécanistiques seront réalisées à partir de modèles de cultures ex vivo de cellules de moelle osseuse issues de ces souris et/ou de lignées cellulaires humaines exprimant ou non les deux protéines en culture. Nos collaborateurs disposent également de lignées de B-LAL du sous-type CDX2/UBTF. Mais ces lignées ne permettent pas répondre aux questions concernant l’émergence des leucémies dans une moelle saine.
Réduction
Les chiffres indiqués dans le dossier correspondent au nombre estimé maximal d’animaux utilisés pour les expériences envisagées. Comme il s’agit d’études exploratoires, il est difficile de prévoir exactement l’impact des de l’expression des deux protéines étudiées sur la leucémogenèse. Sur la base de notre expérience et de la littérature, et en tenant compte de la variabilité observée dans les études précédentes entre les animaux eux-mêmes, un nombre d’animaux minimum et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs a été estimé à n=4 à 20 animaux par groupe expérimental en fonction de l’étude. Le nombre d'animaux nécessaire par expérience a été déterminé par fonction mathématique à 10 animaux par groupe pour obtenir des résultats robustes et fiables statistiquement. De plus, la possibilité d’analyser la numération sanguine des animaux par prise de sang et d’immunophénotyper les cellules de moelle osseuse ponctionnées au niveau du genou permet une étude longitudinale et ainsi, de diminuer le nombre des animaux utilisés. Dire seulement qu’une partie du projet repose sur une étude longitudinale avec réalisation de prélèvements répétés sur les mêmes animaux en respectant les délais réglementaires permettant une récupération complète des animaux entre chaque prélèvement.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes dans des conditions sanitaires contrôlées et permettant un bien-être optimal dans des portoirs ventilés (baton, coton et frisure pour faire un nid). Ils seront acclimatés au moins deux semaines après leur arrivée à l’animalerie et avant le début de toute procédure. Les procédures ont été établies afin de réduire au maximum le stress et la souffrance des animaux soumis aux expérimentations. Une anesthésie sera pratiquée pour certain protocole pour limiter le stress et la douleur. Les animaux seront surveillés quotidiennement durant les procédures. En cas de signes d’infection, la plaie sera traitée avec un antiseptique local. En cas de signes de douleur, les animaux recevront un traitement analgésique. Des points limites précoces ont été définis afin d’interrompre les procédures et garantir le bien-être animal en évitant des souffrances inutiles.
Choix des espèces
L'espèce utilisée est la souris (Mus musculus) qui représente l’espèce animal la plus propice pour ce type d’étude pour les raisons suivantes : •nombreux protocoles bien établis pour cette espèce •possibilité d'avoir accès à des animaux génétiquement modifiés •modèles mimant très bien les cancers hématologiques et qui ont déjà fait l’objet de nombreuses applications dans le domaine. Ce seront des animaux adultes de 8 semaines minimum qui seront utilisés car les potentielles applications thérapeutiques s'adresseront à une population humaine adulte.