Recherche fondamentale

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par un nématode intestinal par gavage et par un Plasmodium responsable du paludisme murin, puis saignées deux fois par semaine par incision de la queue, la croûte de cicatrisation étant retirée à chaque nouveau prélèvement. L'infection détruit leurs globules rouges et provoque une anémie qui culmine autour du quatorzième jour. Le porteur affirme que les interactions entre l'hôte, le ver et le parasite ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier le rôle d’effecteurs immunitaires spécifiques dans la dynamique de l’infection par un nématode intestinal et un Plasmodium murin lorsqu’ils coïnfectent leur hôte. Les infections par des nématodes intestinaux sont toujours très prévalentes dans les pays en voie de développement et on estime que 3 milliards d’êtres humains souffrent d’au moins une infection par des helminthes au cours de leur vie. La carte de prévalence des infections par des helminthes coïncide en grande partie avec celle d’endémicité du paludisme, et on constate que souvent ces populations sont coïnfectées par les deux parasites. La coïnfection entraine des dynamiques différentes par rapport à celles observées quand les helminthes ou les plasmodiums infectent seuls leurs hôtes et cela peut également avoir des conséquences sur l’état de santé des individus coïnfectés. En particulier, lorsque le deuxième parasite infecte un hôte préalablement infecté par l’autre espèce (indépendamment de l’ordre avec lequel les deux parasites infectent l’hôte) on constate un rebond de la dynamique de l’infection. Dans ce projet, nous souhaitons étudier le rôle que joue la réponse immunitaire de l’hôte dans ce rebond.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier le rôle de la réponse immunitaire dans la dynamique de l’infection quand les hôtes sont coïnfectés par un nématode intestinal et Plasmodium. Ces parasites infectent des millions de personnes chaque année dans les pays du Sud en voie de développement. On estime que 600.000 personnes décèdent chaque année des suites d’une infection par une des espèces de Plasmodium, essentiellement en Afrique subsaharienne. Ces mêmes personnes souffrent souvent d’infections chroniques par différentes espèces d’helminthes. Dans le cas de coïnfection la dynamique des deux parasites est altérée avec des rebonds qui peuvent affecter la santé de l’hôte. Notre projet vise donc à contribuer à élucider le rôle que la réponse immunitaire de l’hôte joue dans ces rebonds et par extension dans le risque encouru par les populations où helminthes et paludisme sont endémiques.

Procédures

Les animaux sont soumis aux interventions suivantes (tous les animaux ne sont soumis à toutes ces interventions, cela dépendant des différents groupes expérimentaux): gavage (une seule fois, durée

Impact sur les animaux

Le nématode intestinal produit des infections asymptomatiques dans le sens qu’aucun changement comportemental ou dans l’apparence de l’animal n’est constaté. Dans des très rares cas, l’émergence des vers adultes dans la lumière intestinale peut provoquer une augmentation de la perméabilité intestinale et un passage de LPS dans le sang. La souche de Plasmodium yoelii que nous allons utiliser s’appelle 17X NL où l’acronyme NL signifie « non létal ». Cependant, l’infection par Plasmodium produit une lyse des globules rouges entrainant une anémie. Cette anémie est transitoire (culminant entre les jours 14 et 16 post-infection) et après jour 24 les valeurs de concentration de globules rouges par microlitre de sang reviennent à la normale. Le gavage ne comporte de nuisances particulières si ce n’est le stress lié à la contention de l’animal. Chaque individu n’est gavé qu’une seule fois. Les injections intrapéritonéales sont réalisées sur animale vigile et sont réalisées en quelques secondes (volume injecté = 100 µl), la nuisance étant donc limitée à cette phase de contention. Les injections intraveineuses sont réalisées à la veine caudale sur animal vigile à l’aide d’un appareil de contention. La nuisance est attendue est donc également liée au stress engendre par la contention. Cependant, la contention et l’injection durent moins d’une minute. Les prélèvements de sang à l'extrémité de la queue sont réalisés en pratiquant une petite incision à la pointe de la queue pour le premier prélèvement et en ôtant la croute de cicatrisation pour les prélèvements successifs, ce qui ne devrait pas engendre des nuisances particulières. Les collectes de fèces sont effectuées en isolant les souris. L’isolement peut provoquer du stress, cependant les souris ne sont isolées que pendant 1 heure, étant pour le reste hébergées en groupe (5 souris par cage). Etant donné que deux prélèvements sont effectués par semaine, le temps passé en isolement ne constitue que 1% du budget temps hebdomadaire.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin de pouvoir prélever les organes en vue d’analyses ultérieures.

Remplacement

L’objectif de notre étude est d’évaluer le rôle de la réponse immunitaire dans la dynamique de la coïnfection mettant en jeu un nématode intestinal et un Plasmodium murin. Ceci met en jeu des interactions complexes entre les trois acteurs (l’hôte, le nématode et le Plasmodium) qui ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Réduction

L’effectif de souris utilisé dans ce projet a été calculé afin d’en minimiser le nombre tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour obtenir des résultats fiables. Il s’agit en effet de 10 souris par groupe expérimental. Une analyse de puissance montre qu’avec les différences que nous avons observé dans la dynamique de la coïnfection lors d’expériences précédentes, un effectif de 10 souris par groupe confère une puissance de 90% au seuil de significativité de 0.01.

Raffinement

Plusieurs mesures sont prises pour réduire au minimum l’inconfort et le stress des animaux utilisés dans ce projet. D’abord, tous les animaux sont hébergés en groupe (5 individus par cage) afin de permettre l’expression des comportements sociaux. Toutes les cages sont enrichies et ont du matériel pour la construction de nids. Toutes les manipulations sont effectuées par du personnel expérimenté, dans un environnement calme qui minimise le stress des animaux. Dans la mesure du possible, les animaux sont transférés d’une cage à l’autre grâce à la technique du tunnel (au lieu de la préhension par la queue) ce qui a été démontré réduire le stress des animaux. Enfin, tous les animaux sont surveillés au moins une fois par jour pour évaluer leur état général. Si une dégradation de l’état de santé est constatée, nous utiliserons une grille quantitative de notation qui permet de définir des points limites suffisamment prédictifs.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour ce type d’expérience. Les parasites sont des parasites spécifiques de souris qui reproduisent assez fidèlement les coïnfections observées chez l’homme entre nématodes intestinaux et malaria. Nous utiliserons des animaux entre 8 et 10 semaines. Il s’agit d’individus adultes avec une système immunitaire complétement développé.

Une anesthésie tous les deux jours pendant deux semaines, chacune précédée d'une injection intrapéritonéale: 936 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse des organes. Elles reçoivent des cellules tumorales par voie intraveineuse ou intrapéritonéale, développent des tumeurs pulmonaires ou péritonéales, et certaines déclarent une réaction du greffon contre l'hôte avec perte de poids et perte de poils. L'objet est de tester deux modifications génétiques de cellules immunitaires humaines, censées mieux attaquer les tumeurs solides. Le porteur décrit les cocultures en deux et trois dimensions déjà menées au laboratoire, puis conclut que le modèle animal reste "indispensable" avant toute application clinique.

Objectifs

Le développement des récepteurs antigéniques chimériques (CAR) a révolutionné l'immunothérapie du cancer pour certains types de cancer. Ce nouveau type de traitement par immunothérapie consiste à prélever les cellules immunitaires du patient, de les modifier génétiquement en laboratoire pour qu’elles expriment le CAR, puis elles sont réinjectées au patient afin qu’elles reconnaissent et combattent les cellules cancéreuses. Cependant, des améliorations des thérapies CAR restent nécessaires afin de cibler d'autres types de tumeurs et d'assurer une fonction antitumorale durable des cellules modifiées. Nous proposons ici deux nouvelles stratégies de modification génique ciblant chacune des cellules immunitaires différentes, les lymphocytes T et les macrophages, dans le but d'amplifier leurs fonctions antitumorales. Ces cellules sont des leucocytes (globules blancs) qui ont pour but de détruire d’autres cellules : les lymphocytes T détruisent les cellules reconnues comme étrangères (immunité cellulaire) ; et les macrophages phagocytes « mangent » les cellules étrangères ou leurs débris et participent à la présentation des antigènes et à la libération de cytokines. Dans la première stratégie, nous augmenterons la fonction antitumorale des cellules CAR issues de lymphocytes T, augmentant leur production d'interféron (cytokine/protéine produite par les cellules immunitaires afin d’activer la réponse immunitaire chez d’autres cellules impliquées dans la réponse inflammatoire) grâce à de nouveaux mécanismes que nous avons récemment découverts. Dans la deuxième stratégie, nous améliorerons la survie des CAR issus de macrophages, en les dotant d'une protection anti-apoptotique (=mécanisme de mort cellulaire). Nos résultats in vitro dans des modèles de tumeurs en 3D sont très encourageants, il nous faut les confirmer in vivo au sein d’un organisme entier permettant les interactions avec tous les types cellulaires. Nous utiliserons des approches expérimentales similaires dans les deux stratégies, pour établir la preuve de concept d'une activité antitumorale accrue in vivo. De plus, ce projet ayant une visée clinique, il est essentiel d’évaluer certains critères tels que les toxicités, le dosage et l’efficacité grâce à un modèle in vivo. Nous voulons également comprendre davantage les mécanismes liés au contrôle tumoral et les interactions entre les différentes populations immunitaires permettant d’éliminer les cellules tumorales.

Bénéfices attendus

L’immunothérapie cellulaire par récepteurs antigéniques chimériques (CAR) permet de cibler et de tuer les cellules tumorales. Néanmoins, elle représente deux limites i) elle n’a pas permis de cibler les tumeurs solides, ii) elle rencontre des rechutes et des résistances chez près de 50% des patients répondeurs à deux ans. Nous proposons donc deux stratégies pour contrer ces limites et améliorer les capacités à cibler les cellules tumorales, le tout en s'accompagnant de moins d'effets secondaires. La première stratégie permet l’amélioration de la fonction antitumorale des CAR-T (lymphocytes T modifier génétiquement). Cela est assuré par le contrôle de la production d’interféron par les cellules T. La forte production d’interféron induite par ces manipulations a permis l’augmentation de la capacité de destruction des cellules tumorales. La deuxième stratégie tend à améliorer la persistance et la survie des CAR-MAC (macrophages modifier génétiquement). Ces cellules sont prometteuses pour la thérapie cellulaire contre les tumeurs solides par leur capacité à se diriger vers la tumeur et leur capacité de phagocytose des cellules tumorales. La solution apportée pour améliorer leur survie a permis d’obtenir des effets thérapeutiques plus importants. De plus, elle a l’avantage de reposer sur une ingénierie génétique stable. Les monocytes ont non seulement la capacité de tuer directement les cellules tumorales via la phagocytose, mais aussi de sécréter des facteurs solubles qui peuvent à leur tour attirer d'autres cellules immunitaires. Celles-ci peuvent à leur tour rendre l'environnement de la tumeur plus accessible aux cellules « Natural Killer » du système immunitaire (sous-catégorie de lymphocytes, proches des lymphocytes T, qui ont un rôle cytotoxique). Une meilleure compréhension du mécanisme peut également contribuer à l'avenir au développement de méthodes thérapeutiques encore plus efficaces.

Procédures

Dans les trois procédures, nous visons à évaluer l’effet d’un traitement cellulaire sur la progression tumorale, par différentes étapes : A. Plusieurs lots (un par lignée tumorale) d’animaux vigiles recevront une injection de cellules tumorales par voie intraveineuse ou par voie intra-péritonéale (durée du geste inférieure à 30 sec, 1 fois au cours de l’expérience), puis 4 jours après cette injection, les animaux seront anesthésiés pour être imagés. Ces imageries seront renouvelées tous les 2 jours pendant 2 semaines (durée de l’anesthésie : 15 min). 15 minutes avant chaque session d’imagerie, les animaux recevront une injection intrapéritonéale (durée du geste inférieure à 10 sec). Cela afin de comparer la cinétique de progression des différentes lignées tumorales. B. D’autres lots d’animaux vigiles recevront les cellules thérapeutiques par voie intraveineuse (durée du geste inférieure à 30 sec). 3 heures après cette injection, les animaux seront anesthésiés pour être imagés. Ces imageries seront renouvelées tous les 2 jours pendant 2 semaines (durée de l’anesthésie : 15 min). 15 minutes avant chaque session d’imagerie, les animaux recevront une injection intrapéritonéale (durée du geste inférieure à 10 sec). Cela afin de déterminer la localisation et la persistance des cellules. C. D’autres lots d’animaux vigiles recevront une injection de cellules tumorales par voie intraveineuse ou par voie intra-péritonéale (durée du geste inférieure à 30 sec, 1 fois au cours de l’expérience), puis 4 jours après les animaux vigiles recevront un traitement par voie intraveineuse (durée du geste inférieure à 30 sec). 3 heures après cette injection, les animaux seront anesthésiés pour être imagés. Ces imageries seront renouvelées tous les 2 jours pendant 2 semaines (durée de l’anesthésie : 15min). 15 minutes avant chaque session d’imagerie, les animaux recevront une injection intrapéritonéale (durée du geste inférieure à 10 sec). Cela afin de déterminer l’efficacité de notre traitement sur la croissance tumorale.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons à un stress et à une douleur minimale au moment des injections, mais nous nous efforçons de les maintenir à un niveau aussi bas que possible grâce à une manipulation professionnelle. L'un des effets attendus de ces essais est l'apparition de GvHD au cours de certains protocoles. La "Graft versus Host Disease" est une maladie dans laquelle les cellules immunitaires humaines transplantées attaquent le corps de l'hôte, ce qui entraîne des symptômes tels que la perte de poids et la perte de poils. Dans le cas des greffes de tumeurs, les animaux développeront des tumeurs pulmonaires ou dans le péritoine, en fonction de la voie d’injection. Ces effets se manifesteront de façon croissante au cours de l’expérience. Les nuisances attendues lors de l’administration de cellules tumorales par voie intraveineuse ou intrapéritonéale seront celles liées à l’injection elle-même (gêne de courte durée).

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour des analyses post mortem sur des organes ex vivo.

Remplacement

Les approches thérapeutiques décrites dans ce projet, avec des lymphocytes T et monocytes modifiés, ont déjà été évaluées in vitro à l’aide de méthodes alternatives telles que la coculture en 2D et la coculture 3D formant des sphéroïdes qui nous ont permis de sélectionner les meilleurs candidats prometteurs pour une efficacité contre les cellules tumorales. De plus, ces techniques in vitro nous ont également permis de mieux comprendre certains mécanismes d’action des monocytes modifiés. Néanmoins, malgré le développement de méthodes alternatives in vitro auxquelles le laboratoire a eu recours (coculture en 2D, coculture en 3D) l’utilisation du modèle animal reste indispensable pour la suite du projet avant d'envisager une application clinique chez l'homme en thérapie cellulaire. Une étape passant par un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré est nécessaire. Cette étape est indispensable pour tester les mécanismes de régulation et d’action, ainsi que la toxicité éventuelle de cette thérapie cellulaire.

Réduction

En nous basant sur notre expérience dans le domaine de l'immunothérapie, nous pouvons déjà nous appuyer sur quelques résultats. Les expériences de croissance des lignées de cellules tumorales in vivo, en particulier, ont été récemment établies dans notre institut et nous utilisons ces connaissances pour planifier nos expériences. Nous savons également que nous pouvons nous attendre à une croissance homogène des lignées de cellules tumorales in vivo, ce qui nous permet de limiter à 6 ou 8 le nombre de souris par groupe d'expériences selon l’objectif des expériences. Nous observons la croissance des tumeurs dans l'abdomen à l'aide d'un système d'imagerie in vivo, ce qui nous permet de garder les animaux sous surveillance pendant toute la durée de l'expérience. Néanmoins, nous allons travailler avec des cellules sanguines humaines primaires, ce qui entraîne souvent une grande variabilité. C'est pourquoi il est indispensable de répéter les expériences au moins trois fois avec des donneurs différents afin de pouvoir prouver les résultats de manière statistique. Le nombre de souris par groupe est ajusté au minimum selon que ce sont des expériences de mise au point ou des expériences de test d'efficacité de traitements afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Afin d’assurer le bien-être des animaux, ils auront une période d’acclimatation d’une semaine afin de s’habituer à leur nouvel environnement. Nous surveillerons régulièrement leur état général. Les lignées cellulaires tumorales qu’on utilisera expriment la luciférase, ce qui permet de suivre la croissance tumorale par bioluminescence qui sera faite deux fois par semaine. Une corrélation entre le niveau de bioluminescence pour chaque lignée cellulaire utilisée et l’état général des souris (évalués à l’aide de la grille de score jointe) sera faite, afin de s’assurer que les tumeurs ne dépassent pas un niveau maximal de bioluminescence et éviter le mal-être des animaux. Nous pèserons également les souris pour s’assurer qu’il n’y ait pas de perte de poids ou prise de poids anormale traduisant un mal-être. Nous travaillons avec des personnes ayant une grande expérience avec les souris et reconnaissant rapidement les comportements et signes de douleur et d’inconfort. Nous agirons en fonction de la grille de score jointe au document. Des soins complémentaires seront apportés si nécessaire tels que des compléments alimentaires.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les expériences menées en recherche de thérapeutique du cancer et elle a depuis longtemps servi à l'étude de thérapies antitumorales, notamment parce que la physiologie de la souris est proche de celle de l'Homme. La souris est aussi le modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins, et de la disponibilité de souches murines parfaitement définies. La connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques permettant d'identifier des cibles précises pour la thérapie. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (entre 6 et 10 semaines) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux. De plus, cet âge est adapté pour générer des modèles de tumeurs par la greffe de lignées de cellules tumorales. Pour chaque protocole expérimental on utilisera des groupes d’animaux d’âge identique.

2 816 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant passer de huit à vingt-quatre semaines sous régime gras pour développer obésité et diabète, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines sont irradiées puis greffées de moelle osseuse, d'autres placées seules en cage sept jours, immobilisées deux à cinq minutes dans un tube pour mesurer leur graisse corporelle, ou laissées une nuit sur une grille pour récupérer leurs fèces. Le porteur reconnaît que les injections intrapéritonéales répétées pourraient provoquer une péritonite et que les gavages peuvent causer des microlésions. Le projet ne teste aucun traitement et vise à comprendre le rôle des macrophages du foie, quand l'atteinte des souris, elle, est acquise dès la mise au régime.

Objectifs

Les macrophages sont des cellules du système immunitaire présents dans tous les tissus. Ils participent au maintien de l’organisme en éliminant notamment les cellules mortes ou bien des pathogènes (bactéries, virus). Ces cellules ont toutefois été aussi fortement impliquées dans un grand nombre de maladies dites chroniques, où on leur prête bien souvent un rôle délétère, et notamment dans la maladie du foie gras (NAFLD), l’athérosclérose (maladie des artères à l’origine des infarctus du myocarde) ou bien dans le tissu adipeux chez les individus avec surcharge pondérale (obésité) et diabète. Les macrophages sont des cellules très diverses qui sont fortement influencées par le tissu où elles résident et leur environnement, notamment en conditions pathologiques. Notre projet vise à mieux définir le rôle des macrophages du foie dans le développement des pathologies dites cardio-métaboliques (hyperlipémie, maladie du foie gras (NAFLD), obésité). Pour reproduire les différents contextes pathologiques, des modèles animaux seront nourris avec différents types de régimes alimentaires qui favoriseront la survenue d'obésité, de la NAFLD ou bien encore de l'hypercholestérolémie (facteur de risque majeur de l’athérosclérose). Certains traitements pourront aussi être conduits sur les animaux pour modéliser un aspect bien précis de l’évolution pathologique de la NAFLD, à savoir la fibrose du foie. En modifiant, la fonction de ces macrophages, leur capacité à survivre ou bien même en éliminant ces cellules du foie de manière momentanée ou durablement, nous essaierons de comprendre leurs rôles et l’importance de leur diversité (origine, activation) dans le contexte de la pathologie et comment ces cellules peuvent influencer le développement des maladies cardio-métaboliques.

Bénéfices attendus

La prévalence des maladies métaboliques, comme l’obésité, a augmenté à un rythme exponentiel au cours des dernières décennies. Il est important de noter qu'en plus d'avoir ses propres comorbidités, l'obésité a un impact considérable sur la santé d'un patient et augmente sa susceptibilité à d'autres conditions, comme le cancer. Les comorbidités reconnues depuis longtemps de l’obésité comprennent la résistance à l’insuline et le diabète de type 2, l’hypertension, la dyslipidémie, les maladies cardiovasculaires et la stéatose hépatique. Il est à noter que la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) soit également un facteur de risque indépendant majeur pour le développement de maladies cardiovasculaires, notamment l’athérosclérose. Il existe de plus en plus de preuves d’une association étroite entre l’obésité et la NAFLD, et une attention considérable de la recherche est désormais portée sur cette association en raison de la prévalence croissante de la NAFLD et de sa capacité à évoluer vers un dysfonctionnement et une insuffisance hépatique. Le fardeau de la NAFLD devrait augmenter et les projections actuelles estiment que, d’ici 2030, plus de 300 millions de personnes développeront la NAFLD en Chine, plus de 100 millions aux États-Unis et 15 à 20 millions dans les principaux pays européens. Les coûts économiques actuels associés à la NAFLD et à ses comorbidités sont extrêmement élevés. Ainsi, de gros efforts sont en cours pour développer des traitements innovants pour lutter contre cette maladie, pour laquelle il n’existe actuellement aucun traitement approuvé. Dans ce contexte, ce projet vise à mieux comprendre le rôle et l’importance que jouent les macrophages (origine, quantité tissulaire, activation) dans le développement de ces pathologies dites cardio-métaboliques (hyperlipémie, maladie du foie gras ou NAFLD, obésité).

Procédures

Les animaux seront nourris avec différents types de régimes riches en graisses de 8 à 24 semaines pour les faire grossir et développer un diabète. Ils pourront également être nourris en alternance avec un régime riche en graisses ou avec un régime normal. Ils pourront être mis à jeun pendant quelques heures, recevoir un gavage ou une injection et subir 1 ou 2 tests de 2 heures avec quelques petites prises de sang sur animal vigile pour évaluer leur diabète. Les animaux pourront être anesthésiés et recevoir une injection en intra-veineux (durée de quelques minutes) une seule fois. Certains animaux pourront avoir deux prises de sang (vigile, une minute de contention) à quelques jours ou quelques semaines d’écart. Certains animaux pourront être placés dans un tube ou dans un compartiment d’une boite avec restriction de mouvements pendant 2 à 5 mins pour mesurer leur graisse corporelle. Certains animaux pourront être placés seuls dans une cage de dimension normale pendant 7 jours (isolement des animaux avec contact visuel et olfactif avec ses congénères) pour évaluer leur état général et leur niveau d’activité. Certains animaux recevront des traitements par injection de molécules (une seule fois ou deux fois par semaine pendant 6 semaines) ou par addition de molécules dans la nourriture pour induire des perturbations hépatiques. Certains animaux pourront être irradiés quelques minutes et subir une greffe de moelle osseuse immédiatement après par injection sous anesthésie (durée quelques minutes) pour étudier les cellules de leur moelle osseuse. Certains animaux pourront être placés sur une grille déposée sur le sol de leur cage pendant une nuit pour récupérer leur fèces. Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure.

Impact sur les animaux

Les prélèvements pour génotypage pourront induire une douleur légère et de courte durée. Les animaux nourris avec les régimes riches en graisses présenteront une prise de poids importante pouvant modifier leur mobilité avec diminution de leur activité quotidienne. La composition de ces régimes riches en graisses les rend plus mous et pourrait favoriser une pousse des dents plus importantes. Les contentions de courtes durées, les administrations par gavage, les injections et les prélèvements sanguins sur animal vigile nécessaires aux différents tests pourront être sources de stress et d’inconfort pour l’animal. Les injections intra-péritonéales répétées pourraient induire un risque de péritonite. De façon rare, les gavages pourront induire des microlésions ou des irritations. Certains tests pourront également induire un stress pour les animaux en raison d’une courte période de mise à jeun. Les mesures de composition corporelle (mouvements limités dans un tube pendant 2 mins) pourront être source de stress et d’inconfort pour l’animal. Les courtes anesthésies gazeuses pour les injections intra-veineuses pourront engendrer un stress thermique et les injections une douleur temporaire au réveil. Certaines injections ou administration de molécules pourront induire une inflammation temporaire, être source d’inconfort pendant 1 à 2 jours, et s'accompagner parfois d'une perte de poids. L’isolement (une nuit) sur grille pour la récupération des fèces pourront induire un stress. Les animaux irradiés (doses modérées) pourront être stressés au cours de l’irradiation par restriction de leur mouvement (durée 5 mins) dans une petite boîte.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour réaliser l'analyse de leurs tissus post-mortem.

Remplacement

L’animal dans son intégrité est nécessaire pour étudier les acteurs cellulaires pouvant orienter le développement des pathologies cardio-métaboliques (hyperlipémie, maladie du foie gras, obésité). Nous avons besoin d’étudier spécifiquement l’influence de l’inactivation de certains gènes dans nos cellules d’intérêt, et d'étudier les conséquences dans le développement de la maladie. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires qui rentrent en jeu et la répercussion de leur activité sur le fonctionnement du tissu.

Réduction

Un total de 2816 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats significatifs et reproductibles. Sur la base de notre d’expérience utilisant des approches similaires et à l’aide d’un calcul de puissance, nous estimons que 2 lots de 8 animaux par condition seront suffisants pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Pour certaines expériences mâles et femelles seront étudiés séparément car les réponses tissulaires peuvent différer selon le sexe de l’animal. Toutefois, pour certaines études les mâles seront préférentiellement utilisés. Les femelles générées seront alors utilisées pour d'autres expériences, permettant de réduire le nombre d’animaux. A l'issue des expérimentations, nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. Dans la mesure du possible, les groupes expérimentaux partageant un même groupe contrôle seront analysés en parallèle afin de limiter le nombre d’animaux requis pour l'étude.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux dans les conditions standard d'animaleries EOPS (exempte d'organismes pathogènes spécifiques) avec hébergement en portoirs ventilés, avec respect des cycles jour et nuit de 12h, un contrôle de l’hygrométrie et de la température comprise entre 20 et 24 degrés. Les changes litière et de nourriture sont effectués de façon hebdomadaire avec surveillance quotidienne par le personnel de l’animalerie. Les souris disposeront de lanières de papier kraft, favorisant la nidification et diminuant ainsi leur stress. Si des males se battent ou se blessent, ils seront immédiatement pris en charge avec l’avis de la SBEA (Structure chargée du Bien Etre des Animaux) et ou du vétérinaire de l’établissement utilisateur. Une solution la plus adaptée et la moins contraignante pour les animaux sera recherchée (enrichissement supplémentaire si l’isolement est validé, possibilité de rassemblement, etc.). Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie). Après transfert des animaux des zones d’élevages, les animaux seront acclimatés à l’animalerie pendant 1 à 2 semaines et habitués à être manipulés afin de réduire leur stress. Pour toutes les procédures, les injections, les administrations de molécules ou les prélèvements sanguins seront réalisées par une personne en charge de l'étude, habilitée à réaliser les expérimentations sur ce modèle, maîtrisant le geste et avec un matériel adapté afin de réduire le stress et la douleur des animaux. Pour les procédures où une douleur est attendue, les animaux seront suivis quotidiennement. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (analgésique, soins, etc.) et la SBEA et,ou le vétérinaire pourra être sollicité, le cas échéant. Si des points limites définis en amont sont atteints, les animaux en souffrance seront immédiatement euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est la seule espèce de mammifère pour laquelle des invalidations géniques et spécifiques de certains tissus et cellules peuvent être facilement réalisées. De plus, de nombreuses lignées ont déjà été développées et sont donc disponibles pour les chercheurs. La physiologie murine est proche de celle de l’Homme, justifiant ainsi l’utilisation de cette espèce à des fins de recherche thérapeutique en médecine humaine. L’expression des maladies cardio-métaboliques est par ailleurs assez bien reproduite dans le modèle murin avec un recul expérimental de plusieurs décennies à travers le monde. Les animaux utilisés devront avoir atteint la maturité sexuelle et être de jeunes adultes au début des expérimentation. Ils seront donc utilisés à partir de l’âge de 8 semaines.

Anesthésiés cinq minutes, amputés d'un morceau de nageoire caudale, puis isolés jusqu'à trois jours pour le génotypage, 910 poissons zèbres subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. D'autres reçoivent une injection de cellules cancéreuses sous anesthésie, au stade larvaire, et sont tués au plus tard huit jours après la fécondation. Le porteur écrit avoir réduit à dix le nombre de poissons reproducteurs, tout en prévoyant qu'un grand nombre d'œufs sera produit puis trié avant cinq jours. Les poissons retenus pour perpétuer les lignées sont gardés en vie jusqu'à un an et demi, puis mis à mort.

Objectifs

La communication intercellulaire est indispensable pour réguler les grandes fonctions de l’organisme. Récemment, une nouvelle voie de communication prend une place croissante dans la plupart des processus physiopathologiques : les vésicules extracellulaires. Ces vésicules de 100nm à 1µm sont relarguées par tous les types cellules dans tous les organismes. Leurs propriétés ouvrent de nouvelles perspectives, aussi bien du point de vue fondamentale que thérapeutique, notamment dans leur utilisation comme marqueurs ou véhicules thérapeutiques. Ces vésicules sont impliquées dans la progression des cancers mais leur étude se fait principalement in vitro, du fait que leur taille limite leur étude et utilisation in vivo. Pour répondre à ce besoin, nous avons développé un modèle de poisson zèbre qui permet de suivre ces vésicules en temps réel, à l’échelle de la vésicule unique par imagerie. L’utilisation du poisson zèbre apparait maintenant comme une solution incontournable pour étudier les vésicules dans la communication entre la tumeur et son micro-environnement, dans une situation la plus physiologique possible que ne permet pas les études in vitro. Notre projet aura pour but de générer différentes lignées transgéniques pour suivre ces vésicules et manipuler leur production et leur ciblage, en exprimant de façon stable des constructions d’ADN modifié. Nous pourrons alors étudier la communication médiée par ces vésicules entre différents types cellulaires et entre ces types cellulaires, des cellules cancéreuses greffées dans les larves obtenues à partir de ces lignées. L’évolution et le maintien de ces lignées seront suivis afin de parer à l’éventuelle apparition de phénotypes dommageables. Pour cela, une observation macroscopique quotidienne sera réalisée dès la microinjection, puis une vérification du génotype sera réalisée à partir du deuxième mois. Par la suite, pour perpétuer ces lignées, une sélection d’animaux reproducteurs sera réalisée après maturité sexuelle qui apparait vers 3 mois. Ces lignées permettront ensuite de caractériser les propriétés biologiques et fonctionnelles des vésicules in vivo en temps réel, dans des protocoles expérimentaux effectués dans des embryons de moins de cinq jours post fertilisation. Ce projet permettra alors une meilleure compréhension de la biologie des vésicules, notamment sur leur rôle dans la propagation des cancers et plus particulièrement dans le cancer de la prostate ou le cancer cérébral (glioblastome).

Bénéfices attendus

La création de ces nouvelles lignées contribuera à une meilleure compréhension de la biologie des vésicules extracellulaires chez l’animal et fournira des données cruciales sur leur rôle dans la progression tumorale in vivo dans un contexte physiologique (flux sanguin, barrière biologique). Nos études sur les embryons de poisson zèbre permettront également d’établir cet organisme modèle comme un modèle préclinique pour tester in vivo le potentiel thérapeutique notamment en tant que véhicules thérapeutiques dans le cadre des cancers.

Procédures

Prélèvement de morceau de nageoire caudale, en une fois, sous anesthésie pendant 5 minutes. Isolement pour génotypage, en une fois, pendant 3 jours maximum. Injection de cellules, en une fois, sous anesthésie pendant 5 minutes.

Impact sur les animaux

D’après la littérature, aucun phénotype dommageable n’est attendue par l’expression de nos constructions. Bien que peu probable, le ou les phénotypes dommageables pourront se traduire par : l’apparition de malformations de l’animal au cours de son développement (tératogenèse), la formation d’œdème, ou une altération du comportement. Les seules nuisances attendues seront le stress de l’anesthésie, la douleur liée au prélèvement pour le génotypage.

Devenir

A la fin de la procédure 1, les animaux seront toujours utilisés notamment pour maintenir leur lignée et donc perpétuer les futures générations. Cependant, les animaux seront gardés en vie jusqu’à leur un an et demi, après cela, ils seront mis à mort. En ce qui concerne la deuxième procédure, les animaux seront mis à mort après observation de la propagation ou progression des cellules injectées (maximum 8 jours post-fécondation).

Remplacement

Ce projet repose sur la création de nouvelles lignées transgéniques de poissons zèbres pour l’étude du comportement des vésicules extracellulaire en temps réel chez un organisme vivant. En ce sens, aucune méthode de remplacement in vitro n’est possible pour cette question.

Réduction

Dans le but de réduire et selon des calculs de puissance ainsi que des différentes observations concernant le taux d’intégration d’ADN modifié et le pourcentage de survie de nouveaux descendants en général, nous estimons et avons réduit le nombre de poissons à 10, de manière à toujours avoir 90% de chance d’obtenir des différences significatives, bien que la morbidité et viabilité de ces nouvelles lignées transgéniques restent encore inconnues. Dans le but d’obtenir ces 10 poissons, il faut prendre en compte ces différents paramètres de viabilité et morbidité, ainsi théoriquement, un grand nombre d’œufs seront générés, mais seront triés avant les 5 jours post-fertilisation, pour leur expression de l’ADN injecté, de manière à réduire le nombre de poissons nécessaires. Dès l’obtention des 10 poissons avec autant de mâles que de femelles, le génotypage sera stoppé. Dans le cadre des greffes, nos études utilisent des approches de microscopie qui limitent le nombre de poissons à une dizaine de larves de 6 à 8 jours post-fertilisation par expérience.

Raffinement

Afin d’améliorer la qualité de vie des animaux, nous porterons une attention toute particulière à l’apparition très peu plausible de phénotypes dommageables. Nous effectuerons un enrichissement de milieu, notamment par l’utilisation d’un fond imagé lors des accouplements, mais également par l’approvisionnement en plancton une fois par jour, en fonction de la production de plancton au sein de l’animalerie. De la même manière, afin de limiter la souffrance et/ou stress de l’animal lors du prélèvement de nageoire pour le génotypage, un analgésique et un anesthésique seront utilisés. Nous veillerons également à réduire au minimum la quantité du prélèvement, pour cela nous prélèverons un morceau de 1mm au niveau de la nageoire caudale. Un système d’hébergement spécifique au génotypage sera également mis en place et relié au système aquatique, de manière, à ce que les poissons soient séparés les uns des autres mais qu’ils puissent se voir au travers de parois transparentes et bénéficie des mêmes conditions (alimentation en eau donc en oxygène continue) que les poissons hébergés dans le système aquatique. De plus, le temps d’isolement sera le plus court possible, c’est-à-dire le temps de la réalisation des techniques de génotypage, soit maximum 3 jours.

Choix des espèces

Le poisson zèbre est un modèle animal où son développement rapide et en dehors de leur mère permet de réaliser facilement des manipulations génétiques pour l’obtention de lignées dont le génome a été modifié. Du fait de la transparence des embryons, l’observation des organes internes à l’échelle de l’organisme entier est facilitée. Cette caractéristique ainsi que la taille de ce modèle sont un grand avantage pour la visualisation des vésicules extracellulaires (notamment dans les fluides biologiques) et de leur interaction avec des tissus récepteurs. Les poissons seront utilisés jusqu’à leur un an et demi de manière à pouvoir vérifier le génotype de ces poissons, à partir de leur deuxième mois, lorsqu’ils auront une taille suffisamment grande ; mais également pour perpétuer les lignées dont le génome a été modifié, par reproduction sexuée.

Cette étude pilote sert à tester des sondes implantées avant leur commercialisation éventuelle. 30 souris vont être utilisées, toutes tuées à la fin de l'expérience, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous anesthésie générale une capsule de verre de 2 à 5 millimètres sous la peau, avec des douleurs possibles au réveil et pendant la récupération, puis retourne dans sa cage d'élevage où des capteurs enregistrent ses paramètres en continu. Le porteur présente le dispositif comme un progrès pour le bien-être des animaux non-humains, puisqu'il éviterait les tests comportementaux et les prélèvements de sang répétés, tout en le validant sur des souris qu'il tuera à l'issue.

Objectifs

Le but de ce projet est de phénotyper des souris dans leur cage d'élevage standard. Pour cela nous utilisons de nouvelles sondes communicantes implantées dans la souris. Ces implants peuvent enregistrer des paramètres physiques, chimiques et biologiques de la souris en continu, pendant le jour et la nuit et tous les jours de la semaine. Ces enregistrements ne nécessitent aucune intervention de l'expérimentateur. Les souris sont hébergées en condition optimale dans une cage, groupe de males ou femelles, couple. Les données sont collectées par un réseau de capteurs communicants localisés à l'extérieur de la cage. Le fonctionnement des lecteurs RFID n'interfère pas avec les souris. Dans cette phase du projet, nous testerons cette nouvelle technologie avant leur éventuelle commercialisation.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à reduire le nombre d'animaux et de cages que nous utilisions pour la caractérisation des mutants ou les analyses des conséquences de traitements pharmacologiques par exemple. Le premier bénéfice de ces technologies est le suivi longitudinal et individualisé de parametres physiologiques (physiques, chimiques, biochimiques). Les données sont collectées 24/24 7/7 et non plus au cours d'examen clinique. Ces sondes sont autonomes tout au long de la vie de la souris (pas de remplacement nécessaire). Le second bénéfice de ces technologie est que ces données sont collectées sans interaction avec un opérateur. En outre, le système est modulaire, il est possible d'adapter les sondes et les capteurs au besoin de l'expérience.

Procédures

Chaque souris subira l'implantation unique sous cutanée de sonde RFID 2 à 5 mm de diametre sous anesthésie générale courte.

Impact sur les animaux

Les animaux seront implantés avec une capsule de verre (diamètre de 2 à 5 mm) sous anesthésie générale et analgésie pour limiter au maximum la douleur associée à l'acte. Il est possible que cet acte entraine des douleurs chirurgicales au réveil ou post-chirurgicales pendant la récupération. Ces implants ont un format standard et n'affectent pas les 5 libertés individuelles de la souris.

Devenir

A l'issue de la procédure (mise en place d'un implant sous cutanée), les animaux sont remis dans leurs vivariums en condition d'hébergement classique pour la collecte de données physiologiques de base. A la fin de l'expérience, les souris sont mises à mort.

Remplacement

Notre but est de comprendre les liens entre cognition, activité physique, métabolisme, et génétique. Pour cela il faut quantifier les conséquences des communications entre les organes (muscle cerveau tube digestif) qui ne peuvent se comprendre par l'étude individuelle de chaque organoide (cerveau, muscle...). La souris est un modèle pertinent par le controle de la génétique et des conditions expérimentales de l'élevage.

Réduction

Ce projet est une étude pilote pour évaluer de nouveaux senseurs qui permettent de collecter simultanément des données permettant de quantifier l'activité physiques, des données permettant d'évaluer le métabolisme et de données permettant d'évaluer le comportement. La collecte simultanée de ces données dans plusieurs souris hébergée dans une cage d'élevage au cours du temps (suivi longitudinal) permettra à terme de diminuer le nombre de souris d'animaux utilisés dans des études ultérieures.

Raffinement

Dans cette étude pilote, les données ne sont pas seulement collectées pour chacune des souris en continue dans une cage d'élevage sans interférence avec l'homme, 24h/24 7j/j, la collecte de ces données est aussi localisée dans les différents domaines de la cage dans laquelle plusieurs souris sont hébergées. La validation de cette approche pourra permettre d'étudier le comportement de souris et leur état physiologique sans les soumettre à des tests stressants (dispositif de comportement, prélèvements répétés de sang) augmentant ainsi leur bien-être.

Choix des espèces

La souris est un mammifère extrêmement bien caractérisé et qu'il est possible de modifier génétiquement. Il s'agit d'un modèle de prédilection pour de nombreuses maladies que nous étudions au laboratoire. Par ailleurs les chercheurs impliqués dans ce projet témoignent d'une grande expérience dans l'analyse et le maniement de données de recherche issues de l'expérimentation animale sur souris. Les données, outils et savoir générés au cours de ce projet seront indispensables pour continuer les activités de recherche déjà en cours et nécessitent d'être comparées avec la littérature d'ores et déjà publiée. Les animaux seront adultes males et femelles agés de plus d'un mois.

Pour tester si la perte d'action de l'insuline dans l'intestin fragilise la barrière intestinale, 816 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, chaque souris subit un jeûne de quatorze heures, de deux à neuf contentions de trente secondes pour jusqu'à sept gavages, un prélèvement de sang et une ou deux injections, le prélèvement final se faisant sous anesthésie. Le porteur envisage, dans les modèles d'inflammation ou d'infection intestinale, des poils hérissés, une léthargie, une ataxie, des tremblements, des diarrhées et des saignements rectaux. Le bénéfice annoncé, concevoir des stratégies préventives et thérapeutiques, reste une hypothèse, là où les jeûnes et les gavages sont déjà planifiés.

Objectifs

L’intestin exerce trois fonctions principales, qui sont cruciales pour le maintien de l’homéostasie : i) la digestion et l’absorption des nutriments ii) la production de messages circulants et iii) un rôle de barrière contre l'entrée de substances toxiques ou de micro-organismes dans le corps. Bien que la perte d'étanchéité intestinale et le passage consécutif de produits bactériens dans le sang aient été proposées comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique qui accompagne l'obésité et le diabète, les mécanismes à l’origine des défauts d’intégrité intestinale lors de ces pathologies demeurent mal compris. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action de l’insuline, une caractéristique du diabète, conduit à une altération de la fonction barrière de l'intestin et une susceptibilité accrue à l'inflammation intestinale.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est la mise en évidence que la perte d'action intestinale de l'insuline contribue à l'hyperperméabilité et au risque accru d'inflammation ou d'infection intestinales au cours du diabète. Ce projet identifiera à la fois les cellules cibles impliquées et les mécanismes intracellulaires permettant l'action de l'insuline dans l'épithélium intestinal, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques.

Procédures

Sur animaux vigiles : 240 animaux (1 mise a jeun de 14h, 2 à 7 contentions de 30 secondes pour 0 à 5 gavages de produit, 1 prélèvement de sang et 1 injection de produit), 216 animaux (1 mise a jeun de 14h, 3 à 8 contentions de 30 secondes pour 0 à 5 gavages de produit, 1 prélèvement de sang et 2 injections de produit), 144 animaux (2 mises à jeun de 4h, 1 mise a jeun de 14h, 4 à 9 contentions de 30 secondes pour 2 à 7 gavages de produit, 1 prélèvement de sang et 1 injection de produit), 216 animaux (1 mise à jeun de 4h, 1 mise a jeun de 14h, 3 à 8 contentions de 30 secondes pour 1 à 6 gavages de produit, 1 prélèvement de sang et 1 injection de produit). Sur animaux anesthésiés : 816 animaux (un prélèvement sanguin, 30 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Aucune des lignées d'animaux génétiquement modifiés ne présente de caractère dommageable. Il y a un stress lors de l’anesthésie, de la contention et des injections. Concernant les modèles d'inflammation intestinale ou d’infection par un pathogène intestinal, l’apparition de signes généraux de souffrances (tels que poils ébouriffés ou hérissés, perte de poids, écoulement des yeux, léthargie, dos courbé, ataxie, tremblement, diarrhées et saignements rectaux) est envisageable.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en vu de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Les modèles animaux seront développés dans le but d'obtenir des modèles de pathologies métaboliques (diabète) et inflammatoires (inflammation intestinale, infections entériques), qui reposent sur des phénomènes complexes et faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Ces modèles seront utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro car ils permettent d'obtenir une représentation de systèmes biologiques impossibles à étudier directement chez l'Homme. Cependant, dans des études préliminaires, nous avons utilisé des systèmes de culture à partir de fragments intestinaux pour démontrer que la perte d'action de l'insuline altère certaines fonctions propres à l'épithélium intestinal.

Réduction

L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux sera réalisée avec un logiciel approprié. La "significativité" des résultats sera évaluée par des tests adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus, pour caractériser la réponse de l’intestin à l’insuline, nous avons utilisé une technique qui nécessitant pas de traitement sur animaux vigiles et permettant d’étudier plusieurs parties de l’intestin et l'effet de plusieurs traitements à partir d’une seule souris, réduisant ainsi considérablement le nombre de souris.

Raffinement

La durée et dose des traitements seront réalisées selon les protocoles préétablis. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures (analgésiques, anesthésiques) afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. L’application des points limites établis (apparence, mobilité, comportement, changement de poids, suivi post- opératoire) pour chaque procédure de ce projet sera effectué.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Seule cette espèce possède des modèles présentant une délétion spécifique du récepteur de l'insuline dans des tissus d’intérêt, permettant ainsi la caractérisation de l'action de l'insuline au cours de ces pathologies. Les souris utilisées seront âgées de 8 semaines. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.