Recherche fondamentale

1800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à 72 administrations de composés, des applications de patch et des prélèvements de sang, le modèle induisant des douleurs inflammatoires des voies respiratoires et, en cas de traitements répétés, des hématomes. Le porteur met en place un modèle de rhinite allergique induite par l'ovalbumine pour tester de nouvelles molécules et voies d'administration. Sur le remplacement, il affirme que les études in vitro ne rendent pas compte des interactions systémiques et qu'il faut un "organisme complet".

Objectifs

La rhinite allergique est une maladie inflammatoire chronique des voies respiratoires supérieures souvent associée à l'asthme et a un impact majeur sur la santé globale. C'est une réponse d'hypersensibilité résultant d'une inflammation médiée par l'immunoglobuline E (IgE) au contact d'allergènes spécifiques avec la muqueuse nasale, caractérisée par des symptômes tels que démangeaisons nasales, frottements, éternuements, larmoiement et rhinorrhée. Les déclencheurs courants de la rhinite allergique comprennent les allergènes environnementaux. La fréquence de la rhinite allergique a été multipliée par quatre au cours des trois dernières décennies, affectant à présent plus de 25% de la population générale en France. Bien que cette affection soit bénigne, elle pose un vrai problème de santé publique, du fait de sa fréquence et de son impact important sur la qualité de vie. Dans les formes sévères, elle conduit à un véritable handicap, cause de troubles du sommeil, d’irritabilité, d’absentéisme scolaire, d’arrêt de travail… Actuellement, le traitement de la rhinite allergique passe par trois voies : l’éviction allergénique (réduire au maximum la charge allergénique de l’environnement), le traitement médicamenteux (antihistaminiques H1 qui constituent le traitement de première ligne de la rhinite allergique et représentent plus de 90% des prescriptions), la désensibilisation (administration régulière d’extraits allergéniques par voie sublinguale ou sous-cutanée pendant une période prolongée, idéalement 3 à 5 ans). De nouvelles approches en immunothérapie allergénique sont à l’étude. Des peptides synthétiques correspondant à des fragments moléculaires d’allergènes sont en cours de développement. Couplés à des fragments de protéines virales ou à des molécules immuno-modulatrices, ils pourraient améliorer la tolérance et l’efficacité de la désensibilisation. Parallèlement, d’autres voies d’administration des traitements « désensibilisateurs » sont en cours d’évaluation, telles que la voie épicutanée (patch) et la voie intra-ganglionnaire. L'objectif de ce projet est de mettre en place le modèle de rhinite allergique induit par l'ovalbumine au sein du laboratoire afin d'étudier ces nouvelles molécules thérapeutiques inhibitrices visant à réduire l'inflammation au niveau nasal et pulmonaire mais aussi les symptômes comme les éternuements. De plus ce projet a pour but de tester de nouvelles voies d'administrations, notamment la voie épicutanée.

Bénéfices attendus

A ce jour, 25% des français souffrent de rhinite allergique et il y a peu de traitements, des recherches sont en cours notamment pour améliorer la désensibilisation. Ce projet a pour but d’étudier l’effet de nouvelles molécules sur les symptômes de la rhinite allergique (éternuements, démangaisons/grattage) ainsi que sur l'inflammation des voies respiratoires chez la souris. Afin de déterminer si une molécule candidat a un potentiel effet dans ce modèle, des lavages pulmonaires et/ou nasaux ainsi que des prélèvements d'organes/tissus seront ensuite effectués pour des dosages.

Procédures

Administrations de composé: maximum 72 administrations (30 secondes/souris); Applications de patch sur la peau: maximum 15 applications (2min/souris); Prélèvements de sang: maximum 4 prélèvements (30 secondes/souris).

Impact sur les animaux

Ce modèle induit des douleurs inflammatoires des voies respiratoires à l'animal. Les animaux sont suivis quotidiennement pendant la durée de l'expérimentation. De plus dans le cas de traitements répétés, des hématomes peuvent se former et être douloureux et les injections peuvent entrainer une douleur légère (piqure).

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques, ainsi de valider notre modèle et d’analyser l’effet des différentes molécules testées.

Remplacement

Les études in vitro ne permettent pas l’étude des interactions systémiques (inflammatoires, immunitaires) intervenant dans la maladie. L’exploration des différentes fonctions physiologiques impliquées dans la rhinite allergique demande l’étude d’un organisme complet.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum (N=10) nécessaire pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Le test statistique utilisé pour déterminer les différences entre chaque groupe va changer selon la distribution des échantillons.

Raffinement

Les animaux sont observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être et pour détecter la douleur au moment de l’expérimentation. De plus, si des animaux présentent des signes de souffrance au cours de l'étude, un antalgique sera administrée. Les souris seront hébergées dans des cages en portoir ventilé. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et suivront un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux pour lesquels les outils génétiques, les anticorps spécifiques permettant la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire sont les plus développés. De plus leur génome possède 99% de similitude avec le génome humain, ne présente aucun gène manquant/supplémentaire pouvant modifier l’intensité de l’inflammation obtenu. Ces souches sont mondialement utilisées, permettant une continuité et un moyen de comparaison unique. Les animaux sont utilisés au stade adulte (8 à 16 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé). Les paramètres étudiés étant l’inflammation pulmonaire et son mécanisme, une souris juvénile ou trop âgée induira un biais dans l’expérimentation. Des souris de 8 à 16 semaines seront utilisées afin de pouvoir réaliser des études si besoin soit sur jeunes adultes ou sur des souris vieillissantes (sénescence par exemple).

672 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intracardiaque de cellules de cancer du sein sous anesthésie, un suivi par bioluminescence, puis sont tuées par cohortes de un à trente jours après l'injection pour prélever cerveau, foie et poumons, le développement métastatique pouvant réduire la mobilité. Le porteur cherche à identifier des régulateurs des métastases cérébrales, les bénéfices pour les patientes étant situés "à moyen ou long terme". Il indique utiliser en amont un dispositif "métastase-sur-puce" pour présélectionner les cibles.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’identifier les régulateurs moléculaires majeurs (master regulators) impliqués dans les étapes précoces du développement métastatique cérébral des cellules cancéreuses de sein triple négatif.

Bénéfices attendus

Les métastases cérébrales représentent un enjeu majeur dans le cancer du sein du sous-type triple négatif. Environ 25% des patientes atteintes de ce type de cancer développeront une métastase cérébrale à la suite d’une tumeur primaire, leur conférant une survie médiane de 6 mois. Dans ce contexte, il est nécessaire d’identifier des acteurs impliqués dans le développement métastatique cérébral qui représenteront de potentielles cibles pour en limiter le développement. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires activés lors de la dissémination de cellules cancéreuses dans le parenchyme cérébral et ainsi découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles bloquant le développement de métastases cérébrales. Ce projet sera donc bénéfique à moyen/long terme pour les patientes atteintes de cancer du sein métastatique (santé humaine).

Procédures

Après l’arrivée et l’acclimatation pendant 7 jours des animaux en zone d’hébergement, l’ensemble des 336 animaux seront manipulés tous les 2 jours pendant 3 semaines par l’expérimentateur avant le début des procédures afin de réduire leur stress et de les habituer à la manipulation humaine. Le projet se déroulera ensuite en trois parties. Plusieurs étapes sont communes à l’ensemble des parties. L’ensemble des animaux (336) sera soumis à une anesthésie gazeuse (durée 15min) afin, dans un premier temps de tondre une partie de leur pelage au niveau du torse. Ensuite, les animaux recevront une injection intracardiaque de cellules cancéreuses (cellules humaines de cancer du sein ; parties 1 et 2 : 240 animaux), de placebo (parties 1 et 2 : 24 animaux) ou de cellules cancéreuses dont on a retiré ou non une cible préalablement identifiée (partie 3 : 72 animaux). Tout au long de l’injection intracardiaque, les souris seront maintenues sous anesthésie à l’aide d’un masque et l’injection se fera sans chirurgie. Une fois les injections réalisées, l’état des souris sera contrôlé et les animaux seront pesés tous les 2 jours (2 min par animal). Une lecture de bioluminescence sera réalisée après injection intracardiaque puis une fois par semaine afin de suivre le développement des cellules tumorales. Pour cela les animaux seront soumis à une anesthésie gazeuse et recevront une injection de luciférine afin de permettre la lecture (durée totale de l’intervention : 10 min par animal). Pour les parties 1 et 2 : des cohortes de 44 animaux seront mises à mort à 1, 3, 5, 10, 15 et 30 jours après l’injection des cellules. Le foie, les poumons et le cerveau seront récupérés afin d’analyser le développement métastatique par imagerie et par analyse des gènes. Pour la partie 3 : les 72 animaux seront mis à mort 30 jours après l’injection des cellules. Le foie, les poumons et le cerveau seront récupérés afin d’analyser le développement métastatique et d’évaluer le potentiel d’inhibition du développement métastatique de la cible choisie.

Impact sur les animaux

Les procédures que nous prévoyons de réaliser pourraient être à l’origine d’un stress lié à la manipulation, de plus, le développement métastatique cérébral pourrait être à l’origine d’une réduction de la mobilité ou encore une perte de poids. Le suivi régulier des animaux permettra de pallier rapidement ces conséquences. L’étape initiale d’injection des cellules et les étapes ultérieures d’imagerie nécessitant l’injection d’une molécule pour visualiser la bioluminescence pourraient entraîner un stress ou une douleur chez les animaux. Par prévention, les souris subiront donc une anesthésie gazeuse pour ces différentes étapes. Les cellules injectées conduisant à la dissémination de métastases au niveau du parenchyme cérébral, un soin tout particulier sera apporté à la surveillance du comportement des animaux et à l’apparition d’un changement dans ce dernier ou d’éventuels signes de souffrance au moyen d’une grille de score.

Devenir

La récupération des différents organes pour analyse étant essentielle dans ce projet, les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure.

Remplacement

Nous avons réalisé une série d’expérience in vitro afin de définir au mieux les modèles à utiliser, ainsi que les conditions expérimentales à conduire in vivo. En parallèle, nous avons développé des dispositifs micro-fluidiques "métastase-sur-puce" pour réaliser une pré-validation des cibles identifiées. Le dispositif comprend une microvascularisation perfusée intégrée dans une matrice de collagène obtenue avec des canaux latéraux de collecte. Cette plateforme permet le suivi par imagerie confocale de cellules cancéreuses métastatiques traversant une structure de type endothélial vers un environnement modulable. Ce dispositif servira à sélectionner les cibles les plus pertinentes à valider in vivo.

Réduction

Pour ce projet, nous focalisons notre recherche sur le développement métastatique au niveau du cerveau, mais nous allons également récupérer de manière complémentaire les poumons, le foie et la moelle osseuse afin d’éviter une répétition de l’approche expérimentale pour chaque lieu métastatique. La veille de la littérature scientifique ainsi que des analyses statistiques ont permis de déterminer le nombre d’animaux strictement nécessaires pour l’obtention de résultats scientifiques valides.

Raffinement

Afin de limiter au maximum toute souffrance, stress ou angoisse des animaux, ces derniers seront hébergés selon les recommandations établies à raison de maximum 5 animaux par cage dans un environnement enrichi (maison, carré de coton, copeaux de cartons...) et dans des conditions classiques de stabulation (température régulée, cycle jour/nuit). Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés 7 jours dans leur salle d’hébergement. Les animaux seront manipulés individuellement par l’expérimentateur tous les deux jours pendant 3 semaines avant la mise en place de l’expérimentation et dans une pièce séparée des autres animaux afin réduire leurs stress et angoisse. Lors de l’expérimentation, les animaux seront anesthésiés avant chaque geste pouvant induire un stress ou une angoisse chez l’animal : tontes, injections intracardiaques et mise à mort. Une fois l’injection intracardiaque de cellules tumorales réalisée, les animaux seront suivis quotidiennement de manière à pouvoir détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance ou d’angoisse. En cas de souffrance (modification de l’apparence, prostration, poil hérissé, perte de poids...) un traitement analgésique sera envisagé. Les points limites à ne pas dépasser ont été définis. Dans le cas où un seuil limite serait atteint et que le traitement mis en place n’aurait pas d’effet, les animaux seront mis à mort selon la méthode définie (avec anesthésie au préalable).

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix dans les modèles d’études en cancérologie de par, notamment, la disponibilité des outils moléculaires et sa proximité génétique avec l’homme. Dans le cadre de notre étude, nous devons injecter des cellules cancéreuses humaines à notre modèle pré-clinique qui de ce fait doit être immunodéficient. Les animaux utilisés seront des souris femelles adultes âgées de 6 à 8 semaines (ayant atteint la maturité sexuelle) afin de bénéficier d’un environnement propice au développement de métastases de cellules de cancer du sein.

3600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une chirurgie stéréotaxique pouvant durer jusqu'à deux heures pour injecter un virus et implanter une lentille dans l'hypothalamus, puis des tests comportementaux de quatre à huit semaines, avec hébergement individuel et douleurs post-opératoires possibles. Le porteur étudie la réaction des réseaux neuronaux du comportement alimentaire face à une nourriture grasse, les retombées contre l'obésité étant annoncées "à plus long terme". Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne peut répondre à cette question.

Objectifs

Manger est un processus essentiel à la vie. Afin de de garantir la survie lorsque la présence d’aliment est incertaine, adapter l’apport d’énergie en fonction des besoins, et faciliter la reconnaissance des aliments riches en calories, des composantes plaisir et motivationnelle se sont mises en place pour faciliter la recherche des aliments. Ces deux composantes garantissent un apport en nutriments riches en calories au-delà des besoins immédiats. De nos jours, le déséquilibre qui existe entre cette pulsion naturelle à manger et la disponibilité des aliments 24 heures sur 24, contribue à augmenter le taux d'obésité et le diabète de type 2. Au niveau du cerveau, l'hypothalamus va interpréter les informations hormonales et neuronales, et va prévenir de la disponibilité des nutriments dans l'organisme. Cette structure est composée de plusieurs populations neuronales qui vont exercer des fonctions presque opposées dans la régulation du comportement alimentaire. Jusqu’à présent, nous n’avons que très peu d’informations sur la réaction de ces acteurs lors des premières présentations de nourritures riches en graisse, nous avons donc décidé de les étudier pour en apprendre plus.

Bénéfices attendus

Chez les personnes souffrant d'obésité la préférence pour les aliments riches en graisses et en sucres va prédire une prise de poids importante ou un risque accru d'obésité. Comprendre comment réagissent les neurones contrôlant la prise alimentaire lorsque la nourriture riche en graisse est proposée pour la première fois, lorsque l’animal a le choix entre une nourriture classique et une nourriture riche en graisse, lorsque l’animal aura la possibilité de prévoir la présence de nourriture riche en graisse à l’aide d’un indice extérieur, ou lorsque la nourriture sera à nouveau disponible après une période où elle aura été retirée, devrait nous aider à comprendre ce qu'il se passe lors de la consommation de tels aliments. A plus long terme, ces informations devraient profiter de manière significative à la société, en mettant en évidence de nouveaux mécanismes qui serviront de piste pour traiter l’obésité.

Procédures

Cette étude nécessite de recourir à une chirurgie d'une durée maximale de 120 minutes, qui permettra : 1/d’injecter un virus exprimant les outils génétiques nous permettant de visualiser l'activité neuronale 2/d’implanter une lentille nécessaire à la visualisation de cette activité dans des régions profondes comme l'hypothalamus 3/ d'utiliser des tests comportementaux permettant de relier l'activité des neurones à la présentation de nourriture riche en graisse. Une seule chirurgie sera pratiquée sur chaque souris. De même un seul test comportemental sera réalisé sur un même lot d’animal. Les tests comportementaux ont une durée de 4 à 8 semaines.

Impact sur les animaux

Les éventuelles nuisances que nous avons identifiées sont au nombre de deux : 1/un stress social suite à un hébergement des animaux en cage individuelle. Pour remédier à ces nuisances nous utiliserons un enrichissement accru de l’environnement, nous utiliserons des cages transparentes et rapprocherons au maximum les cages pour que les animaux gardent un contact visuel, olfactif et auditif avec les congénères. 2/de potentielles douleurs/perte de poids rencontrées suite à la chirurgie stéréotaxique. Pour éviter toute douleur, nous utiliserons une médication analgésique pré- et post-opératoire.

Devenir

Tous les animaux de cette études seront mis à mort, et les cerveaux seront récupérés pour des contrôles histologiques réalisés post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet de physiologie intégrée est de comprendre comment les neurones contrôlant le comportement alimentaire vont réagir en présence d’aliments appétissants et hypercaloriques et comment cela peut engendrer une surconsommation d'aliments qui pourrait être à l’origine d'une prise de poids ultérieure. Dans ce contexte, Il est donc nécessaire d’étudier ces phénomènes dans un organisme vivant. Il n'existe à ce jour aucune méthode alternative ou substitutive permettant de répondre à ce type de question par un remplacement in vitro ou in silico.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux à son plus petit nombre, nous avons utilisé un test de puissance statistique pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables.

Raffinement

1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 5 semaines et seront manipulés deux fois par semaine au minimum une semaine avant le début des expériences (souris alors âgées d'au moins 8 semaines). Ce qui permettra d’habituer les animaux aux expérimentateurs et de réduire le stress. 2) Enrichissement : carrés de cellulose/frises de kraft pour nidifier, bâtonnet en bois pour ronger et tunnel en carton pour se cacher. 3) Maintient des souris en cages collectives jusqu’à la réalisation des chirurgies stéréotaxiques 4) Utilisation d’anesthésiques et analgésiques pour les procédures douloureuses 5) Choix de points limites précoces et terminaux appropriés par évaluation de l’apparence, du poids, de l’attitude, des signes cliniques (température et respiration) et aspect de la plaie (le cas échant) 6) Pour la perfusion intracardiaque, utilisation d’un analgésique et de lidocaïne dans la solution barbiturique pour prévenir le risque de douleur abdominale.

Choix des espèces

Les caractéristiques suivantes font de la souris un animal de choix pour notre projet de recherche 1) sa physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain ce qui fait que les résultats obtenus chez la souris sont transposables à l’Homme 2) petite taille facilitant son hébergement 3) court cycle de reproduction permettant d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement 4) disponibilité de nombreuses souches 5) comportement alimentaire et la balance énergétique depuis longtemps étudié chez la souris 6) bon nombre des tests comportements existants chez la souris, donnent des résultats qui sont transposables à l’Homme Toutes les souris de cette étude seront étudiées à l’âge adulte (à partir de 8 semaines), âge qui correspond à un stade où le crâne a fini sa croissance, ce qui nous permet pour les chirurgies, d’utiliser les coordonnées stéréotaxiques des atlas de référence.

62 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une chirurgie d'implantation d'électrodes dans le cerveau, puis des enregistrements hebdomadaires sous anesthésie répétée pendant six à douze semaines, avec douleurs post-opératoires et isolement possible. Le porteur teste des électrodes flexibles en soie censées réduire la réaction inflammatoire, un dispositif qu'il qualifie de "révolution conceptuelle". Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe pas de moyen alternatif d'évaluer l'activité neuronale in vivo sur plusieurs semaines.

Objectifs

Malgré de nombreuses avancées technologiques dans le domaine des neurotechnologies, une problématique majeure réside dans la réalisation d’enregistrements électrophysiologiques stables sur le long terme in vivo. L’insertion d'électrodes rigides dans le cerveau induit une forte réaction inflammatoire dans le système nerveux central comme le fait tout corps étranger implanté dans un organisme. Cette réaction vient altérer avec le temps la stabilité mécanique et électrique des électrodes implantées. L’objectif de l’étude est d'améliorer la stabilité des électrodes implantables et de diminuer les réponses inflammatoires associées grâce à un dispositif plus adapté aux mesures dans le cerveau. Dans cette étude, nous utiliserons des électrodes implantables flexibles et biocompatibles qui minimisent leurs empreintes dans le cerveau et en réponse seront capables de détecter l’activité électrophysiologique. Nous allons regarder l’effet de nos électrodes sur le long terme sur le cerveau et essayer de comparer la réponse gliale entre mâle et femelle. Un tel dispositif serait une révolution conceptuelle dans le domaine des neurosciences en fournissant pour la première fois la possibilité de développer des implants biocompatibles stables sur le long terme. Récemment nous avons développé un nouveau type d’électrodes en soie car ce matériau possède des propriétés intéressantes telles que sa résistance, sa flexibilité et sa biocompatibilité et font d’elle un des matériaux les plus remarquables de la nature.

Bénéfices attendus

Les électrodes biocompatibles sont des électrodes conçues pour être utilisées en toute sécurité et bien tolérées par les tissus vivants. Elles sont couramment utilisées dans les dispositifs médicaux, tels que les appareils EEG pour enregistrer les signaux électriques du cerveau. Ce projet a pour objectif d'analyser les électrodes récemment mises au point dans le cerveau, visant spécifiquement à réduire les incompatibilités mécaniques, le stress, et l'activation immunitaire, dans le but de minimiser les dommages cérébraux associés à l'utilisation de ces électrodes.

Procédures

Chaque souris sera soumise à une chirurgie d'implantation d'électrodes unique dans le cerveau de 30 min et des enregistrements électrophysiologiques seront effectués pendant 15 minutes par animal 1 fois par semaine jusqu'à maximum 12 semaines maximum suivant le groupe après l'implantation sur souris anesthésiées.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie d’implantation des électrodes en soie, les nuisances attendues sont des douleurs post-opératoires, dans les heures suivant la chirurgie. La présence de l’électrode dans le cerveau de la souris pourra conduire à son isolement. De plus la nécessité de faire des enregistrements toutes les semaines implique des anesthésies répétées.

Devenir

A l’issu de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés car leur cerveau doit être prélevé pour analyse.

Remplacement

« Remplacer » les modèles animaux : il n'existe pas à l'heure actuelle de moyens alternatifs pour l'évaluation de l’activité neuronale in vivo. Des caractérisations in vitro ont été réalisées en amont au sein du laboratoire. Nous avons pu montrer que les cellules neuronales sont viables et fonctionnelles en présence des électrodes. Les cellules neuronales se différenciaient correctement sur les implants, validant ainsi la biocompatibilité des dispositifs avant les expériences in vivo. Ces études ne peuvent pas être effectuées in vitro car nous avons besoin de déterminer les conséquences directes dans le tissu cérébral pendant plusieurs semaines.

Réduction

L'expérience a été organisée afin de réduire au maximum le nombre d'animaux pour la totalité de l'expérimentation, à la fois pour une puissance statistique convenable et pour palier d'éventuelles pertes d’animaux au cours de l’expérimentation. Le nombre d'animaux a été calculé en fonction de la quantité de données que chaque animal fournira pour une analyse temporelle, pour la fonction de l'électrode et l'intégrité du tissu cérébral. La plupart des études dans la littérature de ce domaine utilisent le même nombre d’animaux pour les tests pilotes et les tests expérimentaux. Nous disposons d'une cohorte plus pertinente pour les études biologiques. Nous prévoyons d’utiliser 52 souris (+10 animaux en cas de problème d’ implantation, électrodes non fonctionnelles ou souffrance de l’animal) afin d’étudier l’effet sur le long terme et l’effet sur le genre (mâle, femelle). Dans un premier temps, nous effectuerons un premier test pendant 30 jours en utilisant au maximum 12 mâles C57bl/6. Nous prévoyons d’inclure un minimum n= 3 souris pour les études préliminaires. Pour les études nous prévoyons n= 4 pour les groupes contrôle et n= 6 pour les groupes implantés avec l’électrode en soie. Chaque souris sera suivie chaque semaine pendant 6 ou 12 semaines ce qui permettra alors à l’animal d’être son propre contrôle. Ces chiffres nous permettront d’obtenir suffisamment de données neurophysiologiques par groupe pour une analyse statistique satisfaisante.

Raffinement

Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. Le suivi quotidien des animaux permet d’identifier des signes de souffrance caractérisés par l’état du pelage, le comportement de la souris (agressivité / apathie), sa mobilité et son poids. Une fiche de suivi et les mesures conservatoires, jointes en annexe 2, détaillent les critères de points limites et les actions mises en place. Les mesures conservatoires graduées pour le site chirurgical (désinfection, crème cicatrisante, antibiotiques), la perte de poids (granulés de sucre, injection de glucose), l’hydratation (injection de solution saline) et la prise en charge de la douleur (injection d’analgésiques) sont détaillées en annexe 2. Dans le cas où un animal présenterait des signes manifestes de souffrance ou perte de poids excessive (≥20% du poids initial sur 3 jours), il sera sorti des procédures expérimentales et euthanasié si les signes persistent dans les 24h. Par ailleurs, les animaux sont hébergés dans un environnement enrichi (bâtonnets à ronger, nids). Enfin, l'eau et la nourriture sont mises à disposition "ad libitum".

Choix des espèces

L’espèce choisie est la souris qui est un modèle de choix qui permet de prendre en compte de manière intégrative l'impact de l’électrode dans le cerveau d’animal et dont notre équipe dispose de données antérieures concernant l’implantation d’électrodes. Nous allons utiliser des souris adultes âgées de 12 semaines car à cet âge le cerveau est considéré mature.

205 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du sein triple négatif, des traitements quotidiens sur cinq jours et l'injection d'un radiotraceur pour imagerie sous anesthésie, la tumeur pouvant atteindre 2000 mm³ avant mise à mort. Le porteur évalue un radiotraceur pour détecter ces tumeurs et suivre l'effet de traitements, en présentant l'imagerie longitudinale comme un moyen de réduire le nombre d'animaux. Il retient la souris comme le modèle majoritaire de la communauté pour tester les molécules anticancéreuses.

Objectifs

Le cancer du sein (CS) est le cancer féminin le plus important en France et dans le monde en termes d'incidence et de décès. Le CS dit triple-négatif (CS TN) est très agressif et de mauvais pronostic. Il est important de trouver de nouveaux moyens de le soigner. Nous avons identifié un onco-métabolite qui stimule la prolifération des cellules de CS TN. Nous avons identifié des traitements qui bloquent la production de cet oncométabolite et le développement des CS TN. Nous avons développé un nouveau radio traceur qui est capté par les cellules de CS TN en culture qui produisent cet onco-métabolite. Les objectifs de ce projet sont d'étudier, par imagerie médicale, la capacité de ce radio traceur à détecter les CS TN chez l'animal et à suivre l'inhibition du développement des tumeurs suite aux traitements.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet sont de valider, in vivo, le radio-traceur pour la détection non-invasive, par imagerie médicale, des tumeurs qui produisent cet onco-métabolite. De plus, les bénéfices seront de démontrer l'intérêt de ce radio-traceur pour le suivi de l’efficacité de deux traitements que nous avons identifiés pour inhiber les effets de l’onco-métabolite sur le développement des cancers mammaires triple-négatifs (CS TN). Les retombées seront de déposer de publier dans un article scientifique les résultats de ce projet et d’en faire bénéficier la communauté scientifique. A terme, ce projet permettra de proposer un radio-traceur pour la détection non-invasive des CS TN et le suivi des nouveaux traitements pour traiter les cancers du sein TN, qui sont de très mauvais pronostic et pour lesquels peu de thérapies efficaces sont disponibles.

Procédures

Les interventions sur les animaux seront : l'injection en sous cutanée des cellules tumorales pour établir une tumeur : 1 injection/expérience (Exp 1 à Exp 3), avec une durée de 1 min/souris ; Traitement avec une molécule : 1 fois par jour, 5 jours/7, avec une durée de 1 min/souris. Traitement avec deux molécules : 1 fois par jour, 5 jours/7, avec une durée de 2 min/souris. Traitement avec trois molécules 1 fois par jour, 5 jours, avec une durée de 3 min/souris.

Impact sur les animaux

Les études in vitro et in vivo avec le traceur n’a pas montré d’effets indésirables. Le radio-traceur n’a jamais été étudié et injecté chez la souris. L’onco-métabolite, à la dose qui sera utilisée, a été testé in vivo sur plusieurs modèles de cancers mammaires TN (dont celui étudié dans ce projet) et aucun effet indésirable n'a été observé. Les deux thérapies qui seront testés, ont déjà été utilisés in vivo (rapporté dans la littérature) sans effet indésirable observé sur les animaux aux doses qui seront testées mais jamais en combinaison. Les différents traitements qui seront administrés aux souris causeront une douleur modérée due à la piqure de l’aiguille lors de l’injection. Les modalités d'imagerie mises en œuvre ne causent aucune souffrance aux animaux car la piqure d’une aiguille pour injection du radio-traceur par voie intraveineuse dans la veine caudale est réalisée sous anesthésie des animaux. L’induction des tumeurs dans les animaux peut affecter la santé des animaux. Aussi, nous serons vigilants à ce que l’animal ne souffre pas de douleur, de la faim ou de la soif, d'inconfort, de blessures ou d’immobilité. Le suivi quotidien du bien-être des animaux impliqués dans ce projet nous permettra de nous assurer que les animaux ne souffrent pas de ces différents maux. Dans le cas contraire, les animaux seraient immédiatement mis à mort sous anesthésie.

Devenir

Pour les procédures 1 et 2 : Toutes les souris seront mises à mort sous anesthésie à J30-J45, car les organes et la tumeur seront prélevés à la fin des acquissions d'imagerie pour analyser la biodistribution du radio-traceur. Pour la procédure 3 : Toutes les souris seront mises à mort sous anesthésie à J80-100, car nous ferons un suivi dans le temps de l'efficacité des traitements d'intérêts par imagerie médicale non invasive et les souris seront mises à mort sous anesthésie au temps J80-J100 qui permettra d'analyser la croissance tumorale et la survie des animaux.

Remplacement

L’exploration non invasive par imagerie médicale est une méthode permettant d’assurer un suivi longitudinal en limitant la souffrance animale. Ainsi, il sera possible d’étudier la distribution du radio-traceur et sa captation dans la tumeur dans les mêmes cohortes de souris, dans le temps, au cours du développement tumoral. De même, cette méthode permettra de détecter les tumeurs et de suivre l’efficacité des thérapies. Cette procédure permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux mis en jeu par comparaison aux procédures classiques de biodistribution nécessitant le sacrifice d’un groupe d’animaux par condition et par temps d’observation.

Réduction

Le choix du nombre de souris par groupe selon les expériences et la répétition des expériences se base sur des travaux réalisés précédemment avec l'onco-métabolite sur les mêmes modèles de lignées cellulaires implantés chez la souris et sur l'analyse statistique des données. De plus, le suivi longitudinal des animaux par imagerie permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux mis en œuvre par comparaison avec la procédure de biodistribution ex-vivo nécessitant le sacrifice d’un groupe de souris par temps d’observation et par condition expérimentale. La fiabilité des résultats obtenus est par ailleurs renforcée du fait que le suivi d’un même animal au cours du temps permet de réduire le biais statistique induit par la variabilité interindividuelle.

Raffinement

Les animaux utilisés au cours de cette expérience seront maintenus dans des conditions optimales (Hébergement en surpression, 5 animaux par cage IVC ventilée, sous un éclairage et une température (19-21°C) contrôlés) avec une surveillance régulière de leur bien-être et un enrichissement du milieu adapté (igloo, tunnel ou paper wool). Ils seront manipulés dans des enceintes protégées. Les animaux auront un suivi clinique quotidien (observations, manipulation/palpation, état général) et pesés 2 fois par semaine afin d’intervenir rapidement si les animaux manifestent des signes de douleur (selon une grille de scoring). Une attention particulière sera apportée au maintien de la température corporelle des animaux anesthésiés qui seront mis sur un tapis chauffant. Si une souffrance est observée (selon une grille de scoring), un traitement pour éliminer la douleur sera mis en place sur prescription du vétérinaire désigné. Si des symptômes correspondant à des critères d’arrêt de l’expérience sont observés, voir ci dessous, l’animal sera mis à mort sous anesthésie. De même, les animaux seront mis à mort sous anesthésie si la tumeur atteint un volume supérieur à 2000 mm3, si elle est nécrosée ou présente une inflammation ou si des signes de souffrance apparaissent, voir ci-dessous. Les critères d’arrêt de l’expérimentation afin de minimiser la souffrance et/ou la détresse des animaux sont les suivants : Perte de poids rapide > 20 % du poids initial ou longue période de perte de poids, ulcération des tumeurs, comportement moribond, automutilation, diarrhée prolongée, paralysie, râle, écoulement nasaux, signes d'atteinte du système nerveux central, anorexie, saignement abondant par un orifice ou lésions interférant avec la prise de nourriture et d'eau.

Choix des espèces

La souris est le modèle utilisé majoritairement par la communauté scientifique internationale pour tester in vivo les effets de molécules anticancéreuses ou pro-tumorales et pour l’imagerie médicale et permet de comparer les résultats obtenus avec ceux d’autres laboratoires. Les modèles utilisés se reproduisent bien. De nombreux outils sont disponibles pour l’étude de cette espèce. Les souris sont achetées à l’âge de 6 semaines et greffées après la période d’acclimatation. Les souris sont adultes lorsqu'elles sont traitées car le cancer du sein se développe chez l'adulte.

1584 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de mélanome sous la peau, puis des injections de traitement trois fois par semaine sur animal vigile, la tumeur étant laissée croître jusqu'à un volume défini, avec perte de poids, altérations cutanées et nécroses possibles. Le porteur cherche à re-sensibiliser des mélanomes résistants au moyen d'une molécule ciblant le cuivre, ces validations étant présentées comme "indispensables" à un développement clinique. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit des interactions aussi complexes.

Objectifs

Le mélanome est un cancer très agressif qui risque fortement de développer des métastases, au niveau du foie ou des poumons par exemple. Si il est découvert assez tôt, le mélanome peut se soigner en retirant la partie cancéreuse par chirurgie. En revanche, si des métastases sont déjà présentes lors du diagnostic, le pronostic est souvent mauvais et il est alors nécessaire de traiter de manière systémique, c’est-à-dire sur tout le corps, afin de tuer les cellules de la tumeur d’origine ainsi que les métastases. En termes de traitements, il existe deux familles de médicaments qui sont utilisés aujourd’hui pour traiter le mélanome métastatique, les thérapies ciblées et les immunothérapies. Les thérapies ciblées, dont fait partie le PLX4032, (aussi appelé le Vemurafenib), sont utilisées en première intention et sont efficaces mais seulement chez les 50% de patients qui présentent une mutation spécifique (B-Raf). Cependant, après une période de traitement, le mélanome va se modifier pour devenir résistant au traitement, ce qui va entrainer une rechute. L'autre famille de traitements utilisés est l'immunothérapie, dont font partie les inhibiteurs de point de contrôle ou anti-PD1. Ils sont également utilisés pour traiter les patients atteints de mélanomes métastatiques et fonctionnent en interférant avec le système immunitaire pour induire la mort des cellules cancéreuses mais entrainent cependant une réponse positive dans seulement 10 à 30% des cas. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes cellulaires qui entrainent l’apparition de résistance aux traitements actuellement sur le marché. Pour cela nous étudierons une nouvelle molécule qui interfère avec les changements cellulaires induits par la résistance aux traitements dans le but que le traitement redevienne efficace afin d’éviter les rechutes. L’idée de ces expériences est de traiter la combinaison de cette nouvelle molécule avec les traitements utilisés aujourd’hui afin d’observer une resensibilisation des cellules de mélanome envers ces traitements.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une validation in vivo, chez la souris, des observations faites in vitro, sur la capacité d'une molécule ciblant le cuivre ainsi que d’autres inhibiteurs du métabolisme du cuivre, à re-sensibiliser les cellules de mélanomes résistantes aux thérapies ciblées. Il permettra également de vérifier les effets de ces drogues dans le contexte du système immunitaire et d’évaluer leurs rôles dans la résistance aux immunothérapies. Ces validations sont indispensables pour envisager un développement clinique de nos approches thérapeutiques (inhibiteurs en association avec les thérapies ciblées ou les immunothérapies) et permettre d’ajouter une nouvelle ligne de traitement aux patients atteints de mélanomes résistants aux traitements déjà existants.

Procédures

Les souris seront toutes injectées en une fois en sous-cutané (sous la peau) sur le flanc avec des cellules de mélanome (humaines ou murines). Après observation de la croissance tumorale, les souris sont traitées trois fois par semaine avec les différents produits décrits, par injection intra-péritonéale (au niveau de l'abdomen) en alternant les côtés à chaque injection. La durée de traitement sera définie par la croissance tumorale et l’expérience sera arrêtée lorsque la tumeur aura atteint un volume défini. Ces interventions ne nécessitent pas d’anesthésie et seront effectuées sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous seront très attentifs. Au niveau des expérimentations spécifiquement, les nuisances que subiront les animaux seront des contentions pour injecter les cellules tumorales ou les traitements, ainsi que des injections sous cutanées pour les cellules ou des injections intra-péritonéales (dans l'abdomen) pour les traitements. En ce qui concerne la croissance tumorale, la présence de la tumeur grossissante sur le flanc de la souris pourra être une nuisance. La croissance de la tumeur pourra entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance (poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite, prostration), ainsi que des altérations visibles de la peau (nécrose…). L’injection des traitements pourra également entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose...).

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de procéder à l’analyse des tissus et cellules récupérés de la tumeur formée ou des éventuelles métastases.

Remplacement

Pour ces expériences, il n'est pas possible de s'affranchir de l'utilisation de souris car il n'existe pas de méthodes alternatives qui permettent de reproduire des interactions physiologiques aussi complexes. Les études in vitro que nous avons réalisées dans un premier temps ont montré l’efficacité de la molécule ciblant le cuivre dans la resensibilisation de cellules de mélanome résistantes aux traitements utilisés aujourd'hui chez des patients.

Réduction

En termes de réduction, le nombre d'animaux nécessaires à cette étude a été déterminé à l'aide d'un test statistique indiquant la quantité minimale d’animaux qui permet d’observer une différence significative. Pour la réalisation de ce projet, il faudra 1584 souris. L'utilisation de ces animaux sera optimisée en prélevant les tumeurs, les métastases et les organes (comme le foie, la rate ou les poumons) pour des analyses histologiques et biochimiques ultérieures.

Raffinement

En termes de raffinement, les souris seront hébergées à plusieurs par cage avec un environnement enrichi (igloo) au sein de l’animalerie et surveillées quotidiennement. L'expérience ne commence qu'après une semaine d'acclimatation à l'animalerie et d'habituation aux expérimentateurs. Les souris seront observées trois fois par semaine par les demandeurs du projet afin de prendre en charge tout signe de douleur, de stress ou d’inconfort. Les manipulateurs sont en possession du niveau opérateur ou concepteur qui permet d’avoir une bonne vision et une excellente capacité à détecter les problèmes de santé, stress ou malaise. Le suivi est régulier et s'effectue par des méthodes non invasives (mesure des tumeurs sous cutanées au pied à coulisse, pesée des animaux régulières). Des points limites précis sont définis dans chaque procédure ainsi que la démarche à effectuer en fonction du point limite observé tels que la désinfection d'une plaie ou le changement des points d'injection en cas de gêne ou signes d'infections par exemple.

Choix des espèces

La souris est un mammifère ayant des similitudes avec l’homme. Elle a un cycle de vie court, un cycle de reproduction bien établi ainsi qu’une petite taille ce qui permet d’avoir des conditions d’hébergement plus faciles. Les deux modèles de souris que nous utiliserons dans ce projet sont commercialisés, bien connus et de nombreuses études ont déjà été réalisées à partir de ces modèles. Pour les procédures expérimentales, les souris sont utilisées au stade adulte (7 semaines). Elles sont commandées à 6 semaines, puis l’expérience commence après une semaine d’acclimatation à l’animalerie. Ceci est scientifiquement cohérent avec les expériences déjà faites dans l’équipe et les données de la littérature.