Recherche fondamentale
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Pollution aux mélanges de métaux lourds : effets directs et transgénérationnels sur la physiologie du diamant mandarin EU2/2
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
980 diamants mandarins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 510 tués, 420 réutilisés et 50 placés chez des particuliers. Ils sont exposés à un mélange de métaux lourds sur plusieurs générations, avec pose de puces, prises de sang, prélèvements de plumes et de sperme, pour mesurer les effets de la pollution urbaine sur leur physiologie et leur reproduction. Le porteur s'appuie sur des expériences antérieures pour affirmer n'attendre ni mortalité ni douleur importante, seulement un stress lié à la manipulation. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne rend compte de "l'organisme entier" d'un oiseau vivant.
Objectifs
Les activités humaines sont une source de stress pour la faune sauvage. Cependant, il est difficile de mettre en évidence les effets dissociés de différentes sources de stress dans le milieu naturel. Pour établir des relations causales, des études en laboratoire sont nécessaires. C’est pourquoi dans ce projet nous adoptons une approche écotoxicologique en laboratoire sur le modèle d’étude diamant mandarin (Taeniopygia guttata) qui est une espèce d’oiseau modèle en écophysiologie. Nous nous concentrerons sur les effets de la pollution en éléments traces métalliques, comme le plomb, le cadmium, le cuivre. Ces éléments peuvent avoir des effets importants sur la santé humaine et sur celle de la faune sauvage. Dans des expériences précédentes nous avons testé l’hypothèse que le stress oxydatif est le mécanisme physiologique sous-jacent à ces effets négatifs sur la santé. Le stress oxydatif résulte d’une surcharge des défenses antioxydantes par des espèces réactives de l’oxygène et peut causer des dommages sur les lipides, les protéines et l’ADN. Nous avons notamment montré un lien entre expositions aux polluants et dommages sur l’ADN chez les mâles adultes de diamant mandarins. A la suite de ces études, nous allons maintenant travailler à l’échelle de plusieurs générations, notamment car certains polluants peuvent avoir des effets uniquement sur certains stades de développement ou pendant certaines périodes du cycle de reproduction, ou des effets sur les cellules germinales qui ne se détectent qu’à la génération suivante. Le premier objectif de ce projet est donc de tester les possibles effets sur plusieurs générations de l’exposition aux polluants : des effets sur le développement des jeunes aux effets à long terme qui peuvent être aussi transmis aux descendants. Notre deuxième objectif est de travailler à la fois sur des jeunes et des adultes mâles et femelles pour étudier l’effet sexe et aussi les effets des polluants sur la reproduction.
Bénéfices attendus
Habituellement les études en écotoxicologie se limitent à un seul polluant, un seul sexe et une seule génération. Notre projet permet de répondre à toutes ces limites en étudiant des effets à long terme sur plusieurs générations d’un mélange de polluants metalliques représentatif du milieu urbain. Les résultats attendus nous permettrons donc de mieux comprendre la complexité des réponses des organismes à ce type de pollution. Notamment nous pourrons identifier des relations causales entre un mélange de polluants et les paramètres physiologiques des oiseaux. Nous pourrons également déterminer si la sensibilité des mâles et des femelles est identique et quel stade de développement est le plus vulnérable face à ces polluants. Enfin, même s’il est connu que certaines molécules peuvent avoir des effets sur les générations suivantes, comme le DDT (insecticide) sur les coquilles d’œufs, les effets inter-générationnels sont encore peu étudiés. Notre étude permettra d’une part de mesurer ces potentiels effets mais aussi de mieux comprendre les modes d’action (distinction des effets pré et post nataux par exemple). A long terme notre projet permettra d’apporter des clés de compréhension sur les effets de l’urbanisation sur les populations d’oiseaux. Par exemple, certaines des mesures physiologiques utilisées sont réalisables sur des animaux sauvages (prise de sang, plumes, morphométrie) ce qui permet d’envisager de les utiliser comme marqueur des effets de la pollution sur la santé des oiseaux in situ.
Procédures
Les différentes interventions sur les oiseaux : - pose de puces d'identification (30 secondes) – mesures morphométriques et pesées (entre 6 et 8 mesures, 3 minutes, animal vigile) - imagerie médicale sous anesthésie générale (10 oiseaux et 4 mesures par oiseau pour les tests et 40 oiseaux et 2 mesures par oiseau pour l'expérience principale, la prise d'image dure environ 3 min) - mesure de la coloration du bec (3 mesures, 2 min, animal vigile). Tous les prélèvements seront effectués sur des animaux vigiles : - prise de sang (entre 1 et 5 prélèvements, environ 30 secondes) - plumes (entre 1 et 5 prélèvements, environ 1 seconde) - sperme (1 prélèvement, 1 à 3 minutes).
Impact sur les animaux
Les animaux seront exposés à un mélange de polluants représentatif d’une pollution urbaine caractérisée par une faible concentration de chaque polluant. De ce fait, et aussi d’après nos précédentes expériences (APAFIS#26929), nous n’attendons pas d’effets indésirables majeurs (mortalité, perte de poids conséquente, perte de mobilité), de douleur ou de stress chronique. Les différents prélèvements (plumes, sang…) et manipulations (pose de puces d'identification, pesée…) ne sont pas invasifs et ne génèrent pas de douleur importante, néanmoins il y a quand même un stress pour les oiseaux liés à leur prise en main. Nos précédentes expériencesmontrent que ce type de prélèvement et le stress associé n’engendrent pas d’effets indésirables ou chroniques sur les oiseaux.
Devenir
Les animaux seront soit gardés en vie jusqu’à leur mort naturelle, soit réutilisés dans d’autres projets, soit replacés chez des particuliers.
Remplacement
Les méthodes actuelles de remplacement in vitro et in silico ne sont pas utilisables car on s’intéresse aux effets sur l’organisme entier et les modèles actuels ne permettent pas de prendre en compte la complexité d’un oiseau vivant et les polluants en mélange. Notre étude sur la physiologie et le comportement doit donc être réalisée sur des oiseaux vivants. Nous avons choisi une espèce modèle en laboratoire pour ne pas impacter la faune sauvage.
Réduction
Pour les tests de nouvelles méthodes sur les adultes (métabolisme, cytomètre) nous avons prévu une taille d'échantillon minimale avec réutilisation des animaux entre les deux tests (total de 10 individus). Pour le test de la technique d'imagerie nous avons là aussi 10 individus avec des mesures répétées sur chaque individu pour limiter le nombre total d'oiseaux utilisés. Pour l'expérience principale, la taille d’échantillon proposé (20 couples par groupe) permet d’avoir un échantillon suffisant pour réaliser des analyses statistiques en prenant en compte les aléas possibles liés au travail sur des animaux vivants. Effectivement, certains couples ne se reproduiront pas ou auront des pontes stériles. Cette proportion est estimée à 30% des couples. De plus, nous souhaitons travailler sur plusieurs générations et il faut donc qu’à chaque génération nous ayons suffisamment d’individus. Les tests statistiques prévus sont des modèles linéaires mixtes pour prendre en compte les mesures répétées sur un même individu. Nous mettrons des covariables dans les modèles quand cela est pertinent, par exemple : poids de l’oiseau, nombre d’œuf pondus.
Raffinement
Les différentes phases du protocole ont été conçues avec soin pour favoriser le bien-être des animaux : - Enrichissement structurel (branchages et perchoirs, litière pour fouiller au sol, nichoirs et fibres de coco lors de la reproduction, baignoires dans les volières extérieures) et enrichissement alimentaire (millet, os de seiche, gravier) - Attention particulière portée à l’état du plumage et à la posture des oiseaux lors des visites quotidiennes (indicateurs majeurs du bien-être) - Écartement de la procédure d’un animal si signe de souffrance (voir les indicateurs de bien être ci-dessus) et/ou perte de masse > 20% (= points limites) - Surveillance accrue au réveil de l’anesthésie lors des mesures par imagerie - Les oiseaux seront dérangés au minimum pendant l’expérimentation, c’est-à-dire que les mesures, prises de sang et autres prélèvements (plumes, œufs…) seront regroupés autant que possible. Le stress des oiseaux est donc limité en réduisant la fréquence des dérangements. Les dérangements sont aussi réduits de par l’utilisation d’antenne RFID pour enregistrer le comportement d’incubation. - transport des oiseaux dans des boîtes de transport individuelle. Les boîtes sont opaques pour limiter le stress et elles sont rembourrées avec de la fibre de coco pour garantir le confort des oiseaux.
Choix des espèces
Espèce modèle largement utilisée en laboratoire dans des études en écologie et évolution, notamment sur le stress oxydant, le comportement social, la sélection sexuelle et les effets maternels. Cela nous permet d’avoir des valeurs de référence 2) Continuité avec nos travaux précédents Nous travaillerons sur des adultes (âgés entre 1 et 3 ans au début de l’expérience) pour étudier les effets sur la reproduction et sur des jeunes (de la naissance à la mort) pour étudier les effets du traitement sur le développement
Recherche de traitement adjuvant à l’immunothérapie par injection d’anticorps monoclonaux anti-PD1 dans un modèle murin de tumorigenèse pulmonaire.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
84 souris mâles âgées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur pulmonaire par voie veineuse, une immunothérapie anti-PD1, une supplémentation nutritionnelle, et passent des tests de force et d'endurance sur dynamomètre, tapis roulant et rotarod. Le porteur indique que la pousse tumorale peut entraîner difficultés respiratoires, perte de poids, isolement et léthargie. Il affirme que la culture cellulaire ne permet pas d'aborder les relations inter-organes et conclut à la nécessité de l'animal.
Objectifs
L’immunothérapie est une stratégie thérapeutique en plein essor, notamment dans le cancer du poumon, car elle n’induit pas de toxicité secondaire comme les traitements par radiochimiothérapie. Son efficacité reste cependant à améliorer car tous les patients ne répondent pas aux traitements d’où la nécessité de travailler sur des traitements adjuvants. Nous souhaitons combiner 2 approches pour améliorer cette efficacité : - nutritionnelle : supplémentation en acides gras polyinsaturés et en béta-hydroxybutyrate - activité physique : mise en place d’enrichissement dédié à l’augmentation de l’activité physique volontaire.
Bénéfices attendus
Nous attendons à ce que nos traitements améliorent l’efficacité de l’immunothérapie. Pour voir cela, nous suivrons l’évolution du volume tumoral. Des traitements adjuvants tels qu’une supplémentation nutritionnelle ou la mise en place d’une activité physique adaptée est envisageable au cours du traitement par immunothérapie chez les patients. Il y a donc une réelle possiblité de transfert des résultats obtenus dans ce projet en clinique.
Procédures
Les supplémentations nutritionelles se feront ad libitum, par remplacement de l’eau de boisson par le béta-hydroxybutyrate et avec des croquettes pour les acides gras en débitant une semaine vant la tumorigenèse puis pendat les 30 jours du suivi tumoral. L’implantation des tumeurs sera effectuée par injection I.V dans la veine de la queue. Le suivie du volume tumoral par imagerie de biolomuminescence durera 30jours. L’administration de l’immunothérapie sera effectuée tous les 4 jours pendant les 30 jours de tumorigenèse par injection intra-péritonéale d’anicorps anti PD-1. La tumorigenèse sera suivie par imagerie avec calcul du volume tumoral sous anesthésie à l’halothane. La mesure de la synthèse protéique sera effectuée après injection sous cutané d’un traceur (isotope stable). Le test d'agrippement sera réalisé à l'aide d'un dynamomètre munie d'une grille où la souris s'accroche, le manipulateur tire alors la souris par la queue. La mesure de la vitesse maximale de course sera effectuée sur un tapis roulant, le test s'arrête quand la souris est épuisée, elle reste alors sur une grille en bout de tapis. Le test dure en moyenne une quizaine de minutes. Une habituation au tapis de course aura leiru en amont du test. Le test d'équilibre au rotarod se déroule sur un cylindre en rotation, les souris seront habituées à cette procédure en amont. Le test dure en moyenne 2-3 minutesLe passage en echoMRI implique une légère contention des animaux dans un tube placé dans l'appareil. La mesure dure 1 minute environ. Les mesures de performances physiques ainsi que l'echoMRI auront lieu juste avant l'implanttaion (J0) puis à J15 et J30 post-implantation.
Impact sur les animaux
La tumorigenèse peut s'accompager de difficultés respiratoires, d'une perte de poids, de comportements anormaux, tels que l'isolement social, la léthargie, l'agressivité́ accrue ou une altération de la locomotion. Les souris seront surveillées quotidiennement pour suivre leur comportement général.
Devenir
tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole pour prélèvements de sang et de tissus
Remplacement
L’utilisation d’animaux, dans ce projet est absolument nécessaire et ne peut être remplacer par l’utilisation de systèmes de culture cellulaire à 2 voire 3 dimensions. En effet, ces systèmes ne permettent pas d’aborder les relations inter-organes et de mesurer simultanément la digestibilité des acides gras polyinsaturés w3 et du béta-hydroxy-butyrate, l’évolution de la fonctionnalité musculaire, de la performance et de la mobilité, le métabolisme protéique musculaire et le statut inflammatoire circulant et enfin l’évolution du volume tumoral.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans en compromettre les objectifs. Il a été déterminé par un calcul d’échantillonnage. Le nombre de souris nécessaires à l’étude est calculé pour une différence attendue de 25% pour le volume tumoral entre les souris supplémentées en acides gras ou en béta-hydroxybutyrate + activité physique et les souris nourries avec un régime standard. Des études antérieures ont montré que la variabilité du paramètre choisi est de 14%. L’effectif est calculé pour un risque de 1ère espèce alpha de 5% et un risque de 2ème espèce béta de 5%. Ainsi, le nombre de souris nécessaires par groupe est de 8. Toutefois, afin d’anticiper une mortalité éventuelle liée à la tumorigénèse, nous avons choisi de débuter l’étude avec des groupes de 12 souris. Le nombre total de souris nécessaires à la réalisation de ce projet est donc de 84. Pour comparer les résultats des différents paramètres mesurés, nous utiliserons une ANOVA (analyse de la variance) à 2 voies (effet régime, effet activité physique, interaction) suivie d’un test de comparaisons multiples, le test de Tukey si les conditions d’utilisation de l’ANOVA sont remplies (normalité des résidus et égalité des variances). Dans le cas contraire, le test non paramétrique de Kruskal-Wallis suivi d’un test de comparaisons multiples non paramétriques, le test de Dwass-Steel, seront réalisés.
Raffinement
Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Les souris seront hébergées par 6. Tous les animaux auront un accès illimité à leur régime et à l’eau de boisson. Quotidiennement, l’animalier observera le comportement général de chaque souris, son apparence et contrôlera la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur le cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Une grille d'évaluation définissant des points limites sera mise en place. Elle permettra d'identifier des points limites notables et des points limites graves. Si un animal présente 3 points limites notables ou 1 point sévère, il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum.
Choix des espèces
Pour réaliser notre projet d’étude, nous avons choisi la souris C57BL/6 car nous allons leur injecter des cellules tumorales issues de souris C57BL/6. Le modèle de tumorigenèse est donc syngénique et orthotopique. De plus, ces souris sont très actives en environnement enrichi ce qui est crucial pour tester l’effet de l’activité physique volontaire. Nous avons utilisé cette espèce par le passé et validé toutes les procédures détaillées dans ce dossier avec ces souris. Chez l’homme, le cancer du poumon non à petites cellules est diagnotiqué à l’âge moyen de 65 ans. Nous utiliserons par conséquent des souris mâles adultes de 50 semaines.
Etude de l’efficacité d’un composé chimique dans le développement du cancer du pancréas chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
540 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales pancréatiques humaines et des injections répétées, la tumeur pouvant provoquer gêne, douleur et démangeaisons au-delà d'un certain volume. Le porteur indique que les souris ne peuvent être ni replacées ni réutilisées, aucune technique ne garantissant l'absence de prolifération des cellules greffées. Il affirme qu'il est "primordial" de tester d'abord le composé chez la souris avant les patients.
Objectifs
Le cancer du pancréas est un cancer rare, l'un des plus difficiles à soigner. En effet, étant longtemps asymptomatique, il est souvent détecté à des stades avancés, ce qui rend son traitement difficile. Un composé d'intérêt donne de bons résultats sur des cellules cancéreuses du pancréas en culture. L'objectif de ce travail est donc d'évaluer l'impact thérapeutique de ce composé chimique sur l'évolution du cancer du pancréas, dans un modèle de tumeurs pancréatiques, greffées chez la souris immunodéprimée.
Bénéfices attendus
En validant l'efficacité de cette chimiothérapie sur un modèle de cancer pancréatique chez la souris, ce projet pourrait améliorer à long terme la survie des patients souffrant d'un cancer du pancréas.
Procédures
Tous les animaux subiront les traitements suivants: Injections sous-cutanées, 1 fois par animal, 10s; Greffe cellules tumorales, 1 fois par animal, durée maximale: 2 mois; Injection intrapéritonéale, 5 fois par animal, 10s ; Anesthésie gazeuse, 1 fois par animal, 3 min maximum.
Impact sur les animaux
S’il y a prise de greffe et formation de tumeurs sous-cutanées, les effets de la tumeur peuvent être indésirables et générer une gêne et une douleur lorsqu’elles dépassent un certain volume. La tumeur peut induire une tension de la peau, ce qui peut engendrer des démangeaisons et des irritations. Les injections intrapéritonéales répétées peuvent induire aussi une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection. Une hypothermie peut être observée à l'issue de l'anesthésie gazeuse.
Devenir
Tous les animaux entrant dans la procédure seront mis à mort en fin de procédure. L'injection de cellules tumorales entraîne le développement de tumeurs, développement qui doit être surveillé. Ces souris ne peuvent donc pas être replacées, ni réutilisées, même si la greffe ne semble pas avoir pris: ces cellules peuvent à plus ou long terme induire le développement de tumeurs. Nous n'avons pas de techniques qui permettent d'affirmer qu'aucune des cellules injectées ne prolifère, dans le cas où la greffe ne semble pas avoir pris.
Remplacement
Nous avons démontré en culture l'efficacité du composé chimique sur la survie des cellules tumorales pancréatiques. Pour tester son efficacité chez les patients, il est maintenant primordial de le tester d’abord sur un modèle murin, animal proche de l’homme dans le développement tumoral.
Réduction
Nous avons effectué des hypothèses statistiques pour calculer la taille d'échantillon optimale pour chaque procédure.
Raffinement
Pour s’assurer du bien-être des souris durant la prise de greffe tumorale, elles bénéficieront d'un milieu avec un enricissement adapté. Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l’animalerie et par la personne en charge de la procédure tous les deux à trois jours, afin de détecter tout signe de douleur. Pour limiter la possibilité de souffrance induite par des injections intrapéritonéales répétées, les injections seront réalisées à l’aide d’aiguilles très fines, quasi indolores. Des points limites spécifiques à chacune des procédures ont été définis. Tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques, en particulier grâce à l'utilisation d'animaux génétiquement modifiés et à l'élaboration de nombreux outils d'analyse mis en point pour cet animal. L'expérimentation sur animal est d'autre part indispensable pour tester nos modèles in vitro chez l'animal et ainsi vérifier la faisabilité d'études cliniques. Le modèle de souris utilisé ici est le meilleur modèle animal connu pour éviter tout rejet de greffe de cellules tumorales humaines. En effet, ces souris peuvent supporter une greffe de cellules humaines.
Création et recanalisation d’une thrombose veineuse par ultrasons
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Le dispositif à ultrasons testé ici est un prototype conçu par le laboratoire pour rouvrir les veines bouchées par un caillot, avant de futures études chez l'humain. 28 porcs charcutiers de 40 à 50 kg vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Chacun subit une procédure endovasculaire de trois heures, par ponction de la veine jugulaire et de la veine fémorale, pour créer une thrombose veineuse profonde, puis une heure de traitement par ultrasons. La mise à mort permet de prélever les poumons, la veine et l'artère fémorales, et le porteur la présente aussi comme "motivée par le souci du bien-être animal" et destinée à "assurer une conclusion éthique" à leur participation, pour des porcs qui ne sortent pas de l'anesthésie.
Objectifs
L'objectif principal de notre projet est l'évaluation de l'efficacité de notre dispositif en termes de recanalisation de la thrombose veineuse aigue. Nous évaluerons l'efficacité de ce dispositif grâce à la mise en évidence d'un chenal et la présence d'un flux sur l'écho-doppler veineux réalisé en fin de procédure. Les objectifs secondaires du projet sont l'évaluation de la sécurité du dispositif, à la lumière d'un examen clinique de la jambe de l'animal pour constater l'absence de lésion cutanée, d'une échographie doppler afin de constater l'absence de lésion artérielle ou veineuse, et d'un examen histologique de la veine de l'artère et des poumons du porc permettant de conclure à l'absence de lésion artérielle ou veineuse ainsi qu'à l'absence d'embolie pulmonaire.
Bénéfices attendus
Nous avons obtenu des résultats très encourageants avec le dispositif préliminaire. Nous souhaitons évaluer le nouveau dispositif de thérapie développé au sein du laboratoire qui sera le prototype utilisé chez l'homme afin de valider la sécurité et l'efficacité pour pouvoir ensuite envisager des études chez l'homme.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure endovasculaire sous anesthésie générale sans reveil avec une ponction jugulaire et fémorale pour la création de la thrombose veineuse profonde : 1 fois par procédure pour une durée de 3h et une procédure sous anesthésie générale de thérapie par ultrasons non invasive : 1 fois par procédure pour une durée d'1h
Impact sur les animaux
Aucun effet indésirable n'a eu lieu lors des premières expérimentations. Nous surveillerons les points limites pouvant entrainer une prescription d'antalgique ou une mise à mort de l'animal. - Hémorragie - Ischémie du membre - Hypotension - Tachycardie - Hypothermie - Mouvement anormaux de l'animal - Plaie avec écoulement - Oedeme du membre inférieur
Devenir
La décision de mettre à mort les animaux à l'issue de la procédure est prise après une réflexion approfondie et dans le strict respect des principes éthiques qui guident notre recherche. Les raisons sous-jacentes à cette mesure sont les suivantes : - Nécessité scientifique : La mise à mort des animaux est considérée comme essentielle pour obtenir des données cruciales à la compréhension des mécanismes biologiques ou des effets de la procédure étudiée. Il est impératif d'analyser les tissus ou organes spécifiques post-mortem afin d'obtenir des informations détaillées et pertinentes pour les objectifs de recherche.Cette mise à mort est nécessaire ici car le projet requiert un prélèvement des poumons, de la veine et de l'artère fémorales pour analyse histologique après mise à mort de l’animal afin d'évaluer la sécurité de notre dispositif. - Minimisation des souffrances : La mise à mort des animaux à l'issue de la procédure est également motivée par le souci du bien-être animal. Cette approche permet d'éviter toute détresse inutile ou prolongée qui pourrait résulter de complications postopératoires ou d'effets à long terme de l'intervention. - Respect des lignes directrices éthiques : Notre protocole s'aligne strictement sur les lignes directrices éthiques nationales et internationales régissant l'utilisation d'animaux dans la recherche. La mise à mort est envisagée comme une étape nécessaire pour garantir la conformité avec ces normes et pour éviter toute prolongation injustifiée de la présence des animaux dans des conditions potentiellement inconfortables. - Responsabilité envers le bien-être animal : Nous nous engageons à assumer notre responsabilité envers le bien-être des animaux participant à notre étude. La décision de mettre fin à leur vie est prise dans le souci de minimiser leur éventuelle souffrance et d'assurer une conclusion éthique à leur participation à la recherche.
Remplacement
Nous accordons une importance primordiale à la considération des alternatives avant de recourir à l'utilisation d'animaux dans nos recherches. Avant d'atteindre le point où l'utilisation des animaux devient nécessaire, nous nous engageons à explorer des alternatives viables et éthiquement justifiables. Dans le cadre de l'évaluation de ce dispositif, nous avons initialement travaillé sur un modèle in vitro de thrombus de sang frais dans un tube en silicone, nous permettant l'optimisation des paramètres ultrasonores et l'évaluation de l'éfficacité. En revanche le modèle animal est indispensable pour réunir les conditions les plus proches de l'homme, et faire une analyse de sécurité. Pour ce travail, seul un modèle de gros animal pouvait convenir du fait de la nécessité d’un calibre de veine accessible de plus de 2 mm, d’où l’utilisation d’un modèle porcin indispensable déjà validé pour la thrombose aiguë, limitant ainsi l’utilisation d’animaux pour la création d’un nouveau modèle. Nous continuerons à surveiller les avancées scientifiques afin d'incorporer de nouvelles méthodes et technologies alternatives, garantissant ainsi que notre utilisation des animaux reste minimale, justifiée et respectueuse des principes éthiques.
Réduction
Dans le cadre de notre engagement envers le respect du bien-être animal, notre projet de recherche intègre activement des mesures visant à réduire le nombre d'animaux utilisés tout en assurant la rigueur scientifique de nos investigations. Les principales stratégies mises en œuvre à cet égard sont les suivantes : - Optimisation expérimentale : Nous avons minutieusement conçu notre protocole expérimental pour maximiser l'information obtenue à partir de chaque animal participant. Cela comprend la mise en place de mesures permettant d'atteindre nos objectifs de recherche avec un nombre minimal d'individus. - Échantillonnage raisonné : L'approche statistique prévue pour notre projet repose sur un échantillonnage stratégique visant à garantir la représentativité tout en minimisant le nombre d'animaux nécessaires. Les techniques statistiques appropriées seront appliquées pour assurer la validité des résultats avec un nombre optimal d'individus. Nous évaluons à 28 le nombre total de porcs nécessaires. Concernant la détermination du nombre d'animaux spécifique à notre projet, celui-ci a été évalué en tenant compte des considérations éthiques, scientifiques et statistiques. Nous avons pris en compte la variabilité biologique attendue, la puissance statistique nécessaire pour détecter les différences significatives. Nous sommes engagés à maintenir une utilisation minimale et justifiée des animaux dans le cadre de notre recherche, en mettant en œuvre des pratiques rigoureuses et en évaluant continuellement les possibilités d'optimisation tout au long du projet.
Raffinement
Le raffinement est obtenu par l’utilisation de points limites validés avec l’animalerie, et dédiés pour les procédures sous anesthésie générale avec la possibilité d'une mise à mort précoce en cas de mauvaise tolérance de l'animal.
Choix des espèces
Pour rendre l’expérimentation possible, il nous faut un animal d’un poids suffisant, un diamètre de veine fémorale ≥5mm. Les animaux plus petits ne permettent pas d’obtenir ces conditions. Pour rendre des résultats interprétables, l’anatomie doit être comparable aux caractéristiques humaines et le porc présente un système veineux proche de l’homme. Par ailleurs, la technique de création d’une thrombose veineuse profonde a déjà été validée dans un modèle porcin. Jeunes porcs charcutier avec un poids variant entre 40 et 50kg ce qui correspond a 14- 15 semaines d’age. (suffisamment âgés pour obtenir un diamètre de la veine fémorale commune > 5mm). Le poids est choisi afin de pouvoir realiser les echographies-Doppler veineux comme déjà publié dans la litterature et pour tester la faisabilite de notre therapie ultrasonore sur une anatomie similaire a l’homme.
Etude des effets de candidats médicaments dans un modèle préclinique d’hypertension artérielle pulmonaire
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Injectés sous anesthésie d'un composé qui freine la formation des vaisseaux, puis enfermés trois semaines dans une enceinte pauvre en oxygène où l'humidité dépasse 80 %, 1 800 rats développent une hypertension artérielle pulmonaire, à côté de 120 rats témoins. De retour en hébergement classique, pour une période qui peut aller jusqu'à six semaines, les rats malades reçoivent une à deux fois par jour des candidats médicaments par gavage, injection ou voie intranasale, pendant que la maladie s'aggrave et devient irréversible. Le porteur prévoit que 15 % d'entre eux meurent de la maladie au cours du protocole, et jusqu'à 40 % quand cette phase dépasse trois semaines. Au total, 1 920 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. À la fin, sous anesthésie, un cathéter est introduit dans la carotide, puis le thorax est ouvert pour en glisser un autre dans le ventricule droit et l'artère pulmonaire. Le porteur juge ces mesures trop invasives pour envisager un réveil, et les rats sont tués par surdose.
Objectifs
L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie cardiovasculaire et pulmonaire rare et grave : sa prévalence dans la population générale en France est estimée à 15 cas par million et la survie médiane sans traitement après diagnostic est inférieure à 3 ans. Elle se caractérise par l’augmentation des résistances artérielles pulmonaires, responsable d'une hypertension, et aboutit à une insuffisance cardiaque. Cette maladie peut survenir de cause inconnue, dans un contexte familial ou compliquer l’évolution de certaines pathologies (insuffisance cardiaque). En identifiant et en traitant les patients le plus tôt possible, il est possible de retarder la progression de l'HTAP. Malheureusement, cette maladie est souvent mal diagnostiquée et traitée, car les symptômes initiaux sont légers et peu spécifiques (essoufflements, lipothymie et asthénie). Si les options thérapeutiques ont progressé ces dix dernières années et ont permis d'améliorer les conditions de vie des malades, la prise en charge de l'HTAP demeure incomplète car ne prolonge pas significativement le durée de vie après diagnostic. Ainsi, la recherche de médicaments ciblant de nouveaux mécanismes physiopathologiques reste un enjeu majeur pour les années à venir. Les tests de nouvelles molécules doivent se réaliser sur des modèles animaux suffisamment prédictifs de la maladie, afin d’optimiser la sélection des candidats médicaments qui entreront en phase clinique. Le modèle présenté d'HTAP chez le rat, induit conjointement par l’administration d'un composé diminuant la formation de vaisseaux sanguins et par une hypoxie (diminution des apports en oxygène) chronique, est un modèle qui reproduit l'ensemble des caractéristiques physiopathologiques décrites chez l'Homme, à savoir une atteinte vasculaire qui est associée à long terme avec le développement d'une insuffisance cardiaque droite. De plus, les traitements actuellement proposés chez l'Homme montrent des résultats bénéfiques significatifs dans ce modèle. Ainsi, ce modèle d'HTAP représente un modèle préclinique de choix pour l’étude de l’HTAP. Ce modèle nous permettra d’évaluer, chez le rat, l’efficacité de nombreux candidats médicaments qui s’intéressent à des mécanismes d’actions connus (atteintes vasculaires) et des cibles thérapeutiques nouvelles (atteintes cardiaques). Ce modèle nous permettra également une meilleure compréhension des mécanismes mise en jeu dans la maladie afin d’améliorer la prise en charge des patients.
Bénéfices attendus
L’HTAP est une maladie rare et grave pour laquelle il n’existe actuellement pas de traitements curatifs efficaces. Si les traitements prescrits actuellement, essentiellement des vasodilatateurs, permettent une amélioration de la qualité de vie des patients et une prolongation de la survie en freinant l’évolution de la pathologie, la moitié des patients décèdent dans les sept ans qui suivent le diagnostic. Compte-tenu de l’évolution de l’HTAP dans ce modèle animal qui mime fidèlement la maladie humaine, la réalisation d’études précliniques utilisant des candidats médicaments novateurs apparait primordiale pour mettre en évidence de nouvelles pistes thérapeutiques. Ainsi, à terme, l’utilisation de ce modèle animal permettra de sélectionner des composés présentant des bénéfices sanitaires significatifs en vue d’essais cliniques.
Procédures
Une injection sous-cutanée (S.C.) du composé diminant la formation des vaisseaux est réalisée sous anesthésie gazeuse. Les animaux sont ensuite placés dans une enceinte d’hypoxie pendant 3 semaines avant de retourner en condition de normoxie (conditions d'hébergement classique) durant 0 à 6 semaines. Pendant la période de normoxie, les animaux pourront être traités quotidiennement, une à 2 fois par jour selon le composé testé, par gavage, injection intrapéritonéale (I.P.), sous-cutanée (S.C.), ou intranasale (I.N.). Des injections intraveineuses sous anesthésie gazeuse pourront également être réalisées 1 à 2 fois par semaine. Durant la normoxie, des prélèvements de sang à la veine jugulaire ou des examens échocardiographiques de suivi pourront être réalisés sous anesthésie gazeuse. A la fin du protocole, une chirurgie sous anesthésie gazeuse et analgésie est réalisée afin de mesurer les pressions artérielles en insérant un cathéter relié à un capteur de pression dans l’artère carotide. Une thoracotomie est ensuite réalisée afin d’insérer un cathéter dans le ventricule droit puis dans l’artère pulmonaire pour des mesures de pressions. Un prélèvement de sang terminal intracardiaque pourra être réalisé avant la mise à mort des animaux par surdose de produit euthanasiant.
Impact sur les animaux
Les animaux sont soumis à une anesthésie gazeuse et reçoivent une injection sous-cutanée pour induire une hypertension artérielle pulmonaire. Ils sont ensuite placés dans une enceinte d’hypoxie pendant 3 semaines. L’humidité dans l’enceinte est supérieure à 80%. En hypoxie, les animaux présentent une prise de poids ralentie de 50% par rapport à une stabulation conventionnelle à cause du stress et de l’asthénie provoqués par la déplétion en oxygène. De plus, le confinement dans l'enceinte d'hypoxie génère un inconfort, indépendamment de l'hypoxie elle même, via une humidité élevée et un risque d'accumulation d'ammoniaque et de CO2. A la fin de ces 3 semaines d’hypoxie, ils retournent dans la pièce d’hébergement conventionnelle pendant 0 à 6 semaines, période pendant laquelle la pathologie va s’aggraver et devenir irréversible. A long terme, les animaux peuvent mourir de la pathologie. Pendant la période de normoxie, les animaux pourront être traités quotidiennement, une à 2 fois par jour selon le composé testé, par gavage, injection intrapéritonéale (I.P.), sous-cutanée (S.C.), ou intranasale (I.N.). Ces administrations répétées peuvent êtres associées à des risques de fausses route, d'irritation ou de lésions de l'oesophage (PO), et d'irritations (I.P., S.C.). Des injections intraveineuses sous anesthésie gazeuse pourront également être réalisées 1 à 2 fois par semaine. Des anesthésies gazeuses seront potentiellement réalisées au cours du protocole afin de réaliser des prélèvements de sang à la veine jugulaire ou des examens échocardiographiques de suivi. A la fin du protocole, les animaux sont anesthésiés afin de réaliser un acte chirurgical qui permet de mesurer les pressions artérielles en insérant un cathéter relié à un capteur de pression dans l’artère carotide. Une thoracotomie est ensuite réalisée afin d’insérer un cathéter dans le ventricule droit puis dans l’artère pulmonaire pour des mesures de pressions. Un prélèvement de sang terminal intracardiaque pourra être réalisé avant la mise à mort des animaux par surdose de produit euthanasiant.
Devenir
A la fin de la procédure, tous les animaux HTAP seront mis à mort afin de récupérer des organes pour des analyses de tissus (cœurs, poumons, artères pulmonaires) et/ou des analyses de morphologie des organes (pesée des deux ventricules du cœur). Les mesures de pressions dans le ventricule droit sont également trop invasives pour envisager un réveil des animaux. Un prélèvement de tissu sur les animaux Sham (non porteurs d'un HTAP) est nécessaire pour comparer aux conséquences cardiovasculaires des animaux porteurs de la maladie.
Remplacement
S'il existe un certain nombre de modèles de culture de cellules musculaires lisses, ces modèles in vitro sont utilisés en première intention (modèles de screening) et sont utilisés uniquement pour tester des activités moléculaires et identifier des voies de signalisation. Ces modèles cellulaires in-vitro ne permettent pas de tester l'efficacité d'un candidat médicament sur l'aspect de la restauration hémodynamique et morphologique mais sont utilisés en amont afin de sélectionner les meilleurs candidats à tester sur nos modèles in vivo. La validation de la formation aux techniques de mesures de pressions nécessite d’avoir recours à des animaux vivants car les phases critiques de l’approche chirurgicale reposent sur les risques hémorragiques qui peuvent entraîner des mesures de pression faussées, voir la mort de l’animal.
Réduction
Pour chaque groupe avec une HTAP, le nombre d'animaux nécessaire par groupe est fixé à 11. Ce nombre a été déterminé par un calcul de N, sur la base de données obtenues préalablement et prenant en compte les moyennes et déviations standards mesurées pour chaque paramètre. Basés sur les données historiques dans ce modèle d’HTAP, un pourcentage de perte de 15% est attendu jusqu’à 3 semaines de normoxie, correspondant aux animaux qui meurent au cours du protocole à cause du développement de la pathologie. Le nombre d’animaux inclus dans chaque groupe en début d’étude est donc de N=13. Lorsque le protocole inclus une période de normoxie supérieure à 3 semaines (jusqu’à 6 semaines), le nombre d’animaux par groupe est fixé à N=18 car le développement de la pathologie entraîne une mortalité plus importante des animaux (jusqu’à 40% de perte). Généralement, le groupe contrôle négatif (non malade) n’est composé que de 6 animaux car il y a peu de variabilité des paramètres cardiovasculaires étudiés. Ainsi, 1800 rats HTAP sont prévus dans le cadre de cette procédure et 120 rats Sham. Des échantillons de plasmas et/ou de tissus d'animaux sont prélevés à l'issue de certaines séries expérimentales et conservés pour pouvoir être utilisés dans le cadre d’autres projets de recherche (par exemple recherche d’un récepteur cible présent dans le plasma ou dans les tissus cardiaques ou vasculaires). L'utilisation de ces banques de tissus pour d'autres projets de recherches permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés car il permet de réduire le nombre de séries expérimentales réalisées.
Raffinement
l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 5 jours est respectée. L'administration du composé induisant la pathologie est réalisée sous anesthésie gazeuse. Pendant les 3 semaines d'hypoxie, les animaux sont hébergés dans des grandes cages en plexiglass prévues à cet effet avec une sciure particulièrement absorbante (8 animaux par cages). Les caissons d’hypoxie sont ouverts et nettoyés tous les jours. De la chaux sodée est placée dans le caisson pour absorber le C02 et changée tous les jours, de l'acide borique permet d'absorber l'ammoniaque générée par les urines et est remplacé toutes les semaines ; et des absorbeurs d'humidité sont présents pour absorber l'humidité assurant des conditions correctes pour les animaux. La ventilation des caissons peut également être adaptée à l’aide d’aérations présentes sur les caissons dont l’ouverture et la fermeture peut être ajustée pour diminuer une humidité excessive. Les animaux sont observés quotidiennement et tout signe de douleur ou de détresse entraîne l’établissement d’un score grâce à une grille d’évaluation du bien-être animal. En fonction du score obtenu, un protocole d’analgésie approprié est mis en place si besoin. Des points limites spécifiques au protocole sont également établis (présence de plaies cutanées, fausse route…) Si des prélèvements de sang sont réalisés au cours du protocole, les animaux sont anesthésiés. Une anesthésie locale est également réalisée. Les rats sont placés sur un tapis chauffant avec contrôle de la température, et une réhydratation est réalisée en injectant en S.C. 3 fois le volume prélevé en NaCl ou Ringer Lactate. Si des injections en voie I.V. sont réalisées, les animaux sont anesthésiés avec une analgésie locale et contôle de la température corporelle. Les mesures hémodynamiques réalisées en fin de protocole se font sur animaux anesthésiés ayant reçus une injection préalable d'analgésiant au minimum 30 minutes avant la première incision. Pour chaque anesthésie, les animaux sont placés sur un tapis chauffant retro-contrôlé et du gel ophtalmique est déposé sur leurs yeux
Choix des espèces
Même si de nombreuses espèces animales sont concernées, la majorité des modèles d’HTAP ont été développés chez le rat adulte parce qu’il permet d’obtenir, après induction de la pathologie, des données hautement reproductibles. De plus, les rats présentent des modifications cardiovasculaires similaires à l’homme : modifications des pressions, remodelage vasculaire et cardiaque, perte de fonction. Finalement, ce modèle d'HTAP développé chez le rat représente un modèle de référence pour l’étude de l’HTAP car la progression de la pathologie est continue au cours du temps et mime ainsi l’évolution délétère de la maladie observée chez l’homme. Des rats de 4/6 semaines au moment où ils arrivent en acclimatation dans nos locaux sont utilisés pour ce modèle. Ce modèle est sensible à l’âge et des animaux plus âgés ne présentent pas le même développement de la pathologie.
Inflammation et réponse immune au cours de la stéatohépatite
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des régimes carencés ou enrichis en gras et sucre pendant seize semaines, des injections répétées, des gavages, et 90 d'entre elles une chirurgie d'accès aux ganglions et au tissu adipeux, avant prélèvement des organes. Le porteur répertorie une gêne à l'administration, des variations de poids et une douleur modérée liée à la chirurgie soulagée par antalgiques. Il affirme que les expériences in vivo sont "absolument essentielles" faute de système in vitro assez complexe.
Objectifs
Ce projet s'intéresse au rôle du microenvironnement immunitaire des organes périphériques comme le foie et l’intestin en conditions physiologiques et au cours de l’inflammation. L’inflammation s'accompagne de modifications des cellules immunitaires au voisinage du site d’inflammation et même jusqu’aux organes plus centraux producteurs de nouvelles cellules effectrices. Pour comprendre la régulation cellulaire et moléculaire de la réponse des cellules immunitaires dans l’intestin et le foie lors de stimuli inflammatoires, les souris sont mises dans des contextes de régimes alimentaire inflammatoires (MCD) et un régime gras et sucré (High-fat High glucose Diet, HFHG). Globalement, les désordres tissulaires engendrés par ces stimulations vont modifier le comportement des cellules immunitaires en agissant à différents niveaux (métabolisme, survie, prolifération, activation...). Ainsi, les cellules immunitaires seront étudiées pour leur propriété de prolifération, différenciation, de motilité et de circulation au niveau des organes primaires du système immunitaire (thymus et moelle osseuse), des organes lymphoïdes secondaires (ganglions, rate, plaques de Peyer) ainsi qu’au niveau des organes périphériques (poumons, l’intestin, le foie et le tissu adipeux). L’étude de la réponse immunitaire des différentes populations impliquées dans l’inflammation tissulaire, permettra de cibler les processus cellulaires et moléculaires mis en place par le système immunitaire en parallèle des modifications globales corporelles et systémiques (infiltration tissulaire, réponse systémique pathophysiologique avec l’analyse des caractéristiques hématologiques, biochimiques, cytologiques et histologiques). L’étape suivante consistera en l’analyse de molécules permettant de moduler la réponse inflammatoire et d’évaluer leur potentiel thérapeutique et leur mode d’action sur les cellules immunitaires et la répercussion sur l’état inflammatoire tissulaire.
Bénéfices attendus
Ce projet permet de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en place lors d’inflammation tissulaire au cours de pathologies de type stéatose non alcoolique. A court terme, ce projet scientifique permettra de comprendre ce qui régit l’accumulation de certaines populations immunitaires dans le foie et l’intestin à la suite des inflammations causées par des régimes alimentaires spécifiques. Cela devrait renseigner sur les mécanismes moléculaires mis en jeu dans les tissus en inflammation pour réparer ou amplifier la stéato-hépatite et l’implication des modifications métaboliques associées comme l’insulinorésistance. Le rôle des différentes populations immunitaires sur l’évolution de la pathologie du foie et la perméabilité intestinale associée est encore mal compris. Cependant, des études indiquent que ces populations immunitaires seraient cruciales pour lutter contre une mise en place de modifications irréversibles, comme la fibrose. De plus, nous étudierons si ces processus relancent une hématopoïèse et quels en sont les mécanismes moléculaires associés. A long terme, ces données moléculaires sur l’inflammation pourraient représenter une source importante de moyens thérapeutiques avec des actions supplémentaires pour lutter contre l’évolution de la pathologie de type stéato-hépatite. Le nombre de cas est en constante progression au vu de l’augmentation mondiale de l’obésité qui y est associée.
Procédures
Les interventions sont: Un régime riche en gras et en sucre donné sur une période de 16 semaines à un grand nombre des souris en parallèle de leur contrôle sous régime alimentaire « normal ». Des injections intra-péritonéales (ip) (quelques secondes) tous les 5 jours pendant un maximum de 8 semaines. Des injections ip (quelques secondes) réalisées quotidiennement pendant 7 jours sur d’autres lots de souris. Une seule injection en ip (quelques secondes) sera réalisée soit 10H ou 24H avant la mise à mort. Un gavage de 2 minutes en 1 seule fois par animal sera suivi d’un dosage sanguin de quelques secondes sur une cinétique de 1, 3 et 5 heures pour certains animaux ou de 5, 15, 30, 60, 90, et 120 min pour les autres (quelques gouttes sur bandelettes). 90 animaux subiront une procédure chirurgicale (avec un maximum de 10min) permettant d’accéder aux ganglions et tissu adipeux. Des antalgiques sont administrés en pré et post opératoire et la chirurgie se fait sous anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
Nous avons répertorié 4 points de nuisances qui sont les suivants : 1- Une gêne légère liée à l’administration et/ou les prélèvements effectués. 2- Une perte de poids légère à modérée à la suite du régime alimentaire déficient en Methionine et choline (MCD). 3- Une prise de poids légère à modérée à la suite du régime alimentaire enrichi en gras et en sucre (High-fat High glucose Diet, HFHG). 4- Une douleur modérée liée à la chirurgie et améliorée par la prise d’antalgiques.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils sont tous utilisés pour prélèvement de leurs organes et l’isolement des populations immunitaires dans les différents tissus.
Remplacement
La réponse des populations immunes à des signaux inflammatoires tissulaires, donc provenant du dialogue entre divers sous-types cellulaires dans différents organes est très contrôlée. Les cellules passent par une circulation sanguine et lymphatique qui sont des environnements complexes et impossible à mimer sur des tests in vitro. Afin de pouvoir conclure sur des fonctions différentielles de nos cellules et de comprendre les mécanismes moléculaires en jeu, les expériences in vivo sont absolument essentielles et aucun système in vitro assez complexe n’existe pour obtenir ces résultats. Pour les études dans une seconde étape, toutes les simulations d’activation cellulaire par des cytokines seront entreprises en culture afin d’éviter l’utilisation d’animaux dans le cas de questions mécanistiques.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires, notre étude ne prendra en compte que des points de temps bien précis pour la cinétique car les effets du régime sont déjà décrits dans la littérature et nous avons aussi le recul nécessaire avec notre précédent projets sur les mêmes régimes alimentaires. Par exemple, nous savons que l’insulinorésistance et la résistance au glucose ne sont à tester qu’à partir de la 12ème semaine de régime pour des souris sauvages. Les mécanismes cellulaires et leurs modulations ne seront analysés qu’aux stades précis de la cinétique correspondant aux points de temps avec des différences significatives des populations immunitaires détectées lors de la première procédure du projet. De plus, la compilation de données de la littérature et de données déjà générées au laboratoire (sur animal non manipulé), ainsi que des expériences de culture cellulaire nous permettent de limiter le nombre d’hypothèses à tester. Enfin, le nombre de souris à utiliser a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. De plus, nous aurons des résultats des procédures qui s’enchainent qui permettront d’éliminer des hypothèses concernant l’implications de certaines populations et/ou molécules. Ainsi, le nombre d’analyse à faire sera réduit par rapport à ce qui a été anticipé en prenant en compte toutes les lignées utilisées à la procédure précédente sans tenir compte de la significativité des résultats. Pour les tests statistiques, nous avons évalué nos nombres finaux à analyser selon les comparaisons à faire entre les variables et selon un niveau de risque fixé à 0.01 et une puissance fixée à 0.66. Quand cela était nécessaire, nous avons appliqué un possible effet cage et donc pondéré par le facteur correspondant. Seulement dans les conditions adéquates (point de cinétique précis) où l'augmentation du taux circulant des cellules immunes est validé, une étude du blocage des molécules de circulation se fera par l’injection des anticorps bloquants. Nous vérifierons ainsi en étudiant le tissu cible si les populations bloquées avaient plutôt un effet pro-inflammatoire ou réparateur. Appliquer les bloquants uniquement dans le cas d’une circulation statistiquement signifiante permet de réduire les effectifs requis et visera à réduire le nombre de souris nécessaires pour maintenir une interprétation biologique robuste.
Raffinement
Les animaux sont manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences car ils sont souvent pesés et cela limite leurs stress de suivre cette habitude d’interactions. Une fiche d’observation tout au long des régimes permettra de vérifier leur état (pelage, poids, respiration, mobilité…) et des scores seront tenus afin de vérifier que le traitement n’induit pas de modifications des habitudes et du bien-être animal. En cas de changement des scores, des points limites sont établis (perte de poids rapide, modification aspect pelage/alopécie, déshydratation, changement de consistance/couleur des selles) et le suivi rapproché des animaux permettra de définir s’il est nécessaire de - diminuer la dose et/ou d’administrer un analgésique selon la gravité des changements de comportement. Ces conditions s’appliquent à toutes les procédures. Pour la plupart des procédures, les animaux sont mis à mort très peu de temps après le geste invasif. Quand les animaux sont conservés en vie, un suivi quotidien s’assurera de leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress selon la grille de score précédemment décrite dans ce paragraphe.
Choix des espèces
La souris de laboratoire, mammifère modèle, comporte tous les composants moléculaires et cellulaires clés du système immunitaire : l’analyse des nombreux lignages qui contribuent à la structure et aux fonctions complexes du système immunitaire des souris est précieuse pour appréhender la structure et les fonctions du système immunitaire humain. De plus, il existe un grand nombre de lignées de souris mutantes et transgéniques, qui permettent des études mécanistiques approfondies. Le recours à ces souris génétiquement modifiées va nous permettre d’identifier et de caractériser les processus sous-tendant la stéato-hépatite. Le détail du nombre d'animaux par procédure est mentionné dans le protocole. Toutes les souris seront analysées à l’âge adulte et les régimes débutés chez le jeune adulte âgé de 6 semaines. Cette date a été retenue comme la plus significative pour observer la mise en place et le suivi de la stéatose chez la souris. C’est le stade le plus précoce auquel les souris ont un poids assez stable et assez important pour en perdre suite au régime . De plus, comme le régime se pratique sur au moins 16 semaines, les souris doivent être prises à un stade qui évite qu’elles ne soient trop vieilles après le régime et que l’on ne soit pas sur l’interprétation d’un facteur vieillissement.
Production de sérums hyperimmuns et collecte d’organes spécifiques des différents variants du virus SARS-CoV-2 pour le développement et la validation d’outils de diagnostic.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
280 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par voie nasale avec des variants du SARS-CoV-2, puis soumis à une prise de sang intracardiaque terminale sous anesthésie pour produire des sérums et prélever des organes. Le porteur indique n'attendre qu'une perte de poids transitoire et aucun autre symptôme, et présente la production de mini-organes comme un moyen de réduire à terme le recours aux animaux. Il affirme que le hamster est "le modèle animal le plus sensible" à l'ensemble des variants.
Objectifs
Le virus SARS-CoV-2 continue d'évoluer pour échapper aux réponses des anticorps neutralisants et s’adapter à de nouveaux hôtes. Il est important de comprendre et détecter la réponse immunitaire spécifique aux différents variants pour mieux suivre une éventuelle circulation des variants SARS-CoV-2 dans les populations animales. La proximité d’espèces sauvages partageant les mêmes espaces que l’Homme et la détection de matériel génétique du SARS-CoV-2 et ses variants dans les eaux usées incitent à poursuivre les recherches sur le rôle que ces espèces pourraient jouer en tant que réservoir secondaire des variants du SARS-CoV-2, avec un risque d’émergence d’un nouveau variant pour l’Homme. Il apparait donc nécessaire de développer de nouveaux outils de diagnostic permettant d’appréhender plus rapidement le risque pour l’Homme. Le hamster est le modèle animal le plus sensible à l’ensemble des variants et peut facilement être utilisé pour produire des matériaux de référence comme du sérum et des organes spécifiquement infectés par ces variants. Ces matériaux de référence issus de sérums/organes d’animaux infectés ou non-infectés permettront de développer un panel de méthodes de diagnostic. Par ailleurs les organes collectés permettront de mettre au point des méthodes de recherche d'anticorps intra-tissulaires pour chaque variant lorsque l’obtention de sérum ne sera pas possible. Ils permettront également de mettre au point des cultures de mini-organes en vue de constituer une réserve d’organes limitant ainsi l’utilisation d’animaux par la suite. Dès l’identification d’un nouveau variant d’intérêt par les pouvoirs publics (en fonction du nombre de personnes infectées), nous envisageons d’infecter 6 hamsters avec ce variant. Une prise de sang terminale sera effectuée en fin de procédure pour collecter du sérum, et après mise à mort, les organes/tissus infectés (cœur, rate, poumons, feces, écouvillonnages salivaire et rectal et intestins) seront collectés. Un groupe de 2 hamsters non infectés sera également utilisé afin de fournir un matériel de référence négatif. En se basant sur la fréquence d’apparition annuelle de variant, et en prenant en compte les variants actuellement disponibles au laboratoire, on estime que 35 variants maximum seront testés au cours des 5 années du projet, soit un total de 280 hamsters (35 x 8).
Bénéfices attendus
L’approche expérimentale utilisée pour ce projet permettra de développer et valider des outils de détection sérologiques adaptés à chaque variant et aux investigations dans la faune sauvage potentiellement réservoir du virus SARS-CoV-2 ou de ses variants (microprélèvements, organe/tissus d’intérêt…). La collecte des différents organes/tissus permettra de rechercher les marqueurs d’une infection passée (anticorps) pour chaque variant et de valider de nouvelles matrices lorsque l’obtention de sérum ne sera pas possible dans les conditions du terrain. Le travail innovant sur les mini-organes permettra l’étude in-vitro des mécanismes d’infection d’un variant sur une espèce sensible, limitant ainsi l’utilisation d’animaux de laboratoire. Dans un second temps, ce travail pourra être étendu aux espèces de la faune sauvage afin d’obtenir des réserves de mini-organes permettant de tester la réceptivité/sensibilité de ces espèces vis-à-vis des nouveaux variants. Dans cette optique et sur le long terme, cela permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés. Ces modèles pourront ensuite être utilisés dans d’autres études ou pour tester d’autres agents pathogènes.
Procédures
Les hamsters seront infectés une seule fois par voie intra-nasale (40μl - animaux anesthésiés - durée = 15 secondes environ) Une prise de sang intracardiaque sous anesthésie profonde (+ traitement anti-douleur) est effectuée sur tous les hamsters (durée 3 minutes)
Impact sur les animaux
Une possible perte de poids, progressive et s’étalant sur une période allant de J+1 à J+6 post-infection, est potentiellement attendue chez les hamsters infectés avec du SARS-CoV2. A partir de J+7 post-infection, les animaux commencent à reprendre du poids. Hormis cette possible perte de poids, il n’y a eu, et ce quel que soit le variant isolé depuis l'apparition de la Covid-19, aucun autre symptôme clinique durant la période d’infection et aucun décès lié à cette infection.
Devenir
Mise à mort pour collecte de sérums et tissus
Remplacement
A l'heure actuelle, seul le modèle hamster naturellement sensible au virus SARS-CoV-2 et à ses variants nous permettra d’obtenir d’une part des informations sur les mécanismes d’infection par les différents variants et d’autre part de collecter des échantillons pour développer des outils sérologiques et cellulaires adaptés à leur détection ou à leur étude dans d’autres espèces animales.
Réduction
35 variants seront testés au cours des 5 années du projet, soit un total de 280 hamsters (35 x 8). Le nombre de hamsters pour chaque variant testé a été déterminé de façon à obtenir les volumes de sérum et la quantité de tissus nécessaires pour pouvoir mener à bien le développement et la validation des différentes techniques qui permettront une meilleure compréhension de la réponse immunitaire induite suite à l’infection par chaque variant. Aucune analyse statistique n’est réalisée. La collecte des organes permettra de disposer de matériel qui pourra être utilisé pour le développement notamment de mini organes qui à moyen terme permettra des études in vitro, réduisant ainsi l’utilisation d’animaux de laboratoire.
Raffinement
Les hamsters seront hébergés en cage de 2 individus avec un enrichissement composé de nombreux tunnels, abris (afin de satisfaire leur besoin de cachette), cellulose, et de bâtonnets de bois à ronger. Un contrôle de leur état de santé sera assuré tous les jours. Des points limites précis et suffisamment précoces pour leur éviter toute souffrance prolongée et inutile ont par ailleurs été définis.
Choix des espèces
Les études scientifiques menées sur le SARS-CoV-2 ont maintenant largement démontré que le hamster doré était un modèle expérimental qui présentait une forte sensibilité au virus (atteintes respiratoires, perte de poids) ainsi qu'une forte réceptivité (multiplication du virus dans les poumons). Le hamster est donc un modèle d’infection de choix. Nos précédentes expérimentations nous ont permis de caractériser la réceptivité et la sensibilité des hamsters adultes vis à vis des souches SARS-CoV-2 utilisées au laboratoire. Nous utiliserons donc des hamsters adultes de 8 semaines à réception.
Conséquences d’une altération du métabolisme des monocarbones pendant le développement, dans la physiopathologie de Huntington
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Une partie reçoit pendant la gestation une injection intra-abdominale d'un traceur, les descendants subissant ensuite des prélèvements de sang sous anesthésie et une batterie de tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé, jusqu'à douze mois. Le porteur relie ce projet à un précédent et cherche à établir si une carence en vitamines B pendant la gestation aggrave la maladie de Huntington. Il affirme qu'aucun modèle non-animal ne convient à cette approche développementale et comportementale.
Objectifs
Ce protocole in vivo est complémentaire du premier de même type précédemment validé (2020-2023). Le précédent projet a confirmé que la carence en vitamines B pendant la vie adulte était un facteur aggravant de la maladie de Huntington, notamment en terme de précosité des symptômes. Mais, alors qu'il est connu que les carences en vitamines B sont en lien avec des effets à long terme de type "programmation foetale", nous émettons l'hypothèse qu'une carence géstationnelle en vitamines B pourrait avoir une influence sur les mécanismes de développement embryonnaires et post-embryonnaires, sur la survenue et la gravité de la maladie de Huntington, dont les manifestations sont plutôt caractéristiques des âges adultes. Or cette maladie est incurable et cette étude pourrait nous permettre de mieux comprendre les mécanismes liant la carence en vitamines B12/B9 et la mise en place éventuellement précoce de la maladie. L'objectif final serait alors de trouver des potentiels cibles thérapeutiques pour freiner la progression de la maladie.
Bénéfices attendus
La maladie de Huntington est incurable et cette étude pourrait nous permettre de mieux comprendre les mécanismes liant la carence en vitamines B12/B9 et la mise en place éventuellement précoce de la maladie. Et ainsi trouver des potentiels cibles thérapeutiques pour freiner la progression de la maladie.
Procédures
30 souris seront injectées (cavité abdominale) avec 200 µl d'une solution aqueuse d'un traceur de multiplication cellulaire, une seule fois pendant la gestation, durée de l'intervention moins d'une minute. 240 animaux nés et suivis au cours de leur vie seront prélevés d'une goutte de sang (100µl) sous anesthésie une seuls fois à 3, 6 et 9 mois d'âge; intervention d'une durée d'environ 1 minutes (hors temps d'anesthésie). 240 animaux nés et suivis au cours de leur vie passeront une batterie de tests comportementaux observationnels; chaque test ponctuel ayant une durée relativement courte (5 minutes ou moins).
Impact sur les animaux
Le seul effet indésirable prévisible sera l'injection ponctuelle intra-abdominale du traceur de prolifération cellulaire chez les mères et le prélèvement de d'une goutte de sang chez les animaux après la naissance. Une étude du même type précédemment autorisée a montré que parfois certaines souris âgées de plus de 12 mois peuvent présenter des démangeaisons cutanées. Cependant, pour ce projet, nous n'irons pas au delà de 12 mois d'âge.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure pour effectuer les prélèvements de tissus nécessaires à l'étude.
Remplacement
Il n’est pas possible de faire cette étude sur des modèles non-animaux, en raison de l'approche développementale puis comportementale. L’utilisation du modèle murin de la maladie permet de mimer au mieux la phytopathologie de la maladie de Huntington retrouvé chez l’Homme. Ce modèle nous permet de suivre la mise en place et la sévérité des symptômes moteurs, cognitifs et/ou psychiatriques retrouvés chez l’Homme, au cours d’une temporalité, elle aussi, semblable à celle retrouvée chez l’Homme. Ceci nous permet de mieux comprendre les mécanismes impliqués et d’espérer trouver des nouveaux biomarqueurs et/ou cibles thérapeutiques chez la souris mais transposables à l’Homme.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est calculé au plus juste avec l'utilisation d'un logiciel statistique et selon (1) l'expérience des porteurs du projet sur les carences vitaminiques et (2) l'analyse des résultats de la précédente étude du même type. D'après notre prospective, 10 individus par groupe sont suffisants, alors qu'auparavant, certaines études comportementales proposaient 12 à 15 individus par groupe.
Raffinement
Un enrichissement des conditions d'hébergement est prévu avec buchettes de bois et du papier absorbant. Lors des procédures d'injection et de prélèvement de sang, les animaux seront anesthésiés à l'aide d'isoflurane (5% air) et ces actes ne dureront que très peu de temps (moins d'une minute hors temps d'anesthésie). Les points limites sont déterminés à l'aide de différents paramètres observables, dont la posture, les comportements quotidiens et l'évolution de la masse corporelle de l'animal (frêle, inactif, peu ou pas de prise de poids, voir perte de poids).
Choix des espèces
La souris est le seule espèce permettant une étude de la maladie de Huntington selon un modèle génétiquement modifié. L'étude à long terme dite "de programmation foetale" se déroule en 2 temps: 30 souris (gestantes) seront mises à mort pour prélèvement des embryons au jour embryonnaire 12 et au jour embryonnaire 19. Pour la cinétique post-natale, l'étude sera menée dès la naissance, durant la lactation des souris, et après le sevrage à 21 jours et jusqu'à 12 mois d'âge. En effet, durant cette période nous pourrons évaluer les effets de la carence et les symptomes comportementaux de la maladie de Huntington. Plusieurs tests comportementaux s'enchaineront de 5 à 65 jours d'âge, puis à 270 et à 360 jours d'âge. Des prélèvements d'une goutte de sang (100 µl) seront réalisés pour suivre l'aspect carence à 90, 180, 270 jours d'âge.
Inhibition d’une lipide kinase comme nouvelle stratégie thérapeutique pour prévenir la progression des lésions post-AVC
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie provoquant un accident vasculaire cérébral, reçoivent un inhibiteur en injection quotidienne, puis sont tuées 24 heures après pour analyse des lésions. Le porteur décrit une paralysie latérale, une perte de sociabilité et de vitalité, qu'il présente comme non douloureuse par transposition de l'observation humaine. Il affirme que le recours au modèle murin est "irremplaçable" en raison de la complexité des mécanismes de l'AVC.
Objectifs
Les accidents vasculaires ischémiques cérébraux (AVC) sont la deuxième cause de mortalité dans le monde. Ils sont causés par l’obstruction d’une artère cérébrale par un caillot sanguin. La restauration de la circulation sanguine le plus rapidement possible dans l’artère occluse est le seul traitement des infarctus cérébraux. Toutefois, dans environ 30% des cas, cette restauration du flux sanguin dans l’artère cérébrale occluse, bien qu’indispensable, entraine l’apparition de nouvelles lésions appelées « lésions de reperfusion ». Les mécanismes sont complexes et impliquent un dysfonctionnement du vaisseau et une réponse inflammatoire importante conduisant à une perméabilité vasculaire et à la mort neuronale. Notre équipe étudie le rôle d’une famille de protéines dans différents contextes physiopathologiques. Alors que les souris exprimant une forme inactive de cette protéine sont normales, nous venons de mettre en évidence son rôle dans le contexte pathologique de l’AVC. Ces souris sont protégées de la perméabilité vasculaire, de l’œdème, et présentent des lésions cérébrales réduites. Ces résultats identifient la protéine d’intérêt comme une cible thérapeutique intéressante dans le contexte de l’AVC. Nous avons établi un partenariat pour générer un inhibiteur (bloqueur) de cette protéine que nous allons tester sur le modèle murin d'AVC. A terme, ce projet a pour but d’améliorer la prise en charge des patients en protégeant le vaisseau au moment de la reperfusion de l’artère bouchée, afin de diminuer les lésions cérébrales post-AVC et donc les séquelles chez les patients.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider l’efficacité de molécules candidates les plus prometteuses sur la protection des lésions post-AVC.
Procédures
Les animaux seront soumis à 1 injection/jour d’un inhibiteur pour induire l’inhibition de la protéine d'intérêt. Une procédure chirurgicale sera réalisée pour induire un AVC (intervention qui dure environ 15 min sous anesthésie et analgésie). Les animaux seront ensuite euthanasiés (24h après la chirurgie) pour être analysés. Pour l'évaluation de la perméabilité des vaisseaux sanguin : 1 seule injection (veine de la queue) de colorant sera réalisée (animal anesthésié) suivie de l'euthanasie de la souris 30min apres l'injection pour analyse.
Impact sur les animaux
Les souris seront soumises une chirurgie pour induire un AVC (chirurgie réalisée sous anesthésie générale en présence d’analgésique en prè-opératoire et post-opératoire). Les souris seront euthanasiées 24h après la chirurgie et l’ischémie cérébrale sera analysée. L’ischémie cérébrale entraine une paralysie latérale (patte avant rétractée, œil fermé, animal tourne sur lui-même toujours dans le même sens ou dans certains cas vrille sur lui-même), une perte de sociabilité et de vitalité. Chez l’Homme, cette paralysie latérale due à l’ischémie, bien qu’impressionnante, n’est pas douloureuse. Nous pouvons donc penser qu’il en est de même chez l’animal. Les animaux ne seront pas impliqués dans plusieurs procédures.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin d'analyser les lésions d'ischémie cérébrale.
Remplacement
Le recours au modèle murin est irremplaçable pour le déroulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexité des mécanismes mis en jeu dans un contexte physiopathologique intégré non modélisable par des approches in vitro et (ii) le test d’inhibiteurs sélectifs pour la protéine d'intérêt que nous souhaitons valider in vivo.
Réduction
Les doses d’inhibiteurs à injecter ainsi que la voie d’administration (intraveineuse ou orale) seront déterminés en fonction des tests ADME (Absorption, Distribution, Métabolisme, et Excrétion) et de pharmacocinétiques (concentration maximale, demi-vie, volume de distribution, clairance et biodisponibilité) qui sont en cours de réalisation par notre collaborateur. Le nombre de souris sera diminué en fonction des résultats obtenus au cours de la procédure. Nous obtiendrons dans un premier temps des résultats préliminaires sur 1 lot de 6 animaux nous permettant de définir s'il peut exister des différences statistiquement quantifiables entre les différents groupes (traité / non traité). Si ces différences existent, elles seront statistiquement affinées avec des groupes de 10 souris si besoin. Le traitement « antiplaquettaire + inhibiteur » sera réalisé uniquement si des résultats concluants sont obtenus avec l’inhibiteur seul.
Raffinement
Les souris ont un accès illimité à la nourriture et boisson. Si besoin de l’aliment hydraté sera mis à disposition dans la cage. Du papier, du carton et/ou des cubes de bois seront rajoutés dans la cage. Une observation quotidienne (plusieurs fois par jour) des souris sera réalisée par les zootechniciens et les expérimentateurs. Expérimentation réalisée sur souris anesthésiées et analgésiées. L’injection de l’analgésique sera également réalisée en post-opératoire (6 à 8h après la chirurgie puis après 8 à 12h). Un anesthésique local en injection intradermique sera également administré avant l’incision (chirurgie). La procédure sera réalisée sur plaque chauffante à 37°C pour le confort de l'animal au réveil. Expérience en manipulation des animaux et en chirurgie des expérimentateurs (formation en chirurgie validée). Le suivi des souris sera réalisé 3 fois par jour par les zootechniciens (matin) et l’expérimentateur (midi et soir) tout au long de la procédure. La vitalité et les expressions faciales seront évaluées (ouverture des yeux, nez et joues « froncées », position des oreilles et des moustaches). Les points limites seront basés sur la perte de poids (maximum 20% du poids initial) et sur l’examen visuel des signes suivant : léthargie, inconscience.
Choix des espèces
Ce projet a pour but de tester l’impact d’inhibiteurs nouvellement synthétisés spécifiques de la protéine d’intérêt (aucun inhibiteur n’est actuellement disponible sur le marché) dans la progression des lésions cérébrale post-AVC afin de voir si nous reproduisons l’effet protecteur obtenu avec des souris exprimant une forme inactive de la protéine d’intérêt. A terme, cette étude a pour but d’améliorer la prise en charge des patients en protégeant l’endothélium au moment de la reperfusion. Les effets pléïotropes dans ce contexte font intervenir des fonctions cellules multiples dans l'organisme non modélisables par des approches in vitro. Le recours à l'expérimentation animale est donc l'unique approche permettant de tester ces molécules dans ce contexte physiopathologique de l’AVC. Nous utiliserons des souris de 10 à 12 semaines (âge adulte).
Décontamination de lignées murines par transfert d’embryons
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
7800 souris vont être utilisées, tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les femelles donneuses sont soumises à une stimulation hormonale puis tuées pour la récolte d'ovocytes, les femelles receveuses subissent une microchirurgie de transfert d'embryons sous anesthésie, et les mâles reproducteurs et vasectomisés sont tués en fin de projet. L'opération vise à réintroduire des lignées de souris génétiquement modifiées avec un statut sanitaire contrôlé, les jeunes issus des transferts étant conservés pour la recherche. Le porteur affirme que le transfert d'embryons est "la seule méthode possible" de redérivation des lignées.
Objectifs
Les équipes de recherche utilisent de nombreux modèles génétiques différents chez la souris, pour supporter des programmes de recherche visant à la fois à étudier le rôle de gènes dans le développement, à caractériser l’impact de mutations génétiques identifiées chez des patients et à évaluer des stratégies thérapeutiques. Les opérations d'assainissement et de décontamination des lignées génétiques impliquées vise à préserver le statut sanitaire des animaux. Le statut sanitaire des colonies de rongeurs correspondantes conditionne à la fois leur état de santé, leur bien-être, et leur pertinence en tant que modèle. Ce projet a pour but l'introduction de nouvelles lignées murines originales après décontamination au sein des zones d'animalerie de différents centres de recherche afin dêtre utilisées dans diférents domaines dont notamment la recherche fondamentale en oncologie, sur le système immunitaire et endocrinien.
Bénéfices attendus
Le statut sanitaire des colonies de souris de laboratoire utilisées comme modèles animaux pour les recherches scientifiques et biomédicales conditionne à la fois leur état de santé, leur bien-être, et leur pertinence en tant que modèle. L’évolution des connaissances concernant les pathogènes spécifiques des rongeurs, et des contaminations accidentelles, imposent des procédures d'entrée de nouvelles lignées murines par transfert d’embryons afin de garantir pour ces nouveaux modèles murins un statut sanitaire approprié.
Procédures
-hébergement en situation d'isolement de 1 à 2 semaines maximum - Stimulation hormonale : 2 injections intrapéritonéales (durée inférieure à 30 secondes) réalisées à 48h d'intervalle - Microchirurgie sous anesthésie générale (durée de l'intervention inférieure à 30 min) nécessitant 2 injections, une en intrapéritonéale et une en sous-cutanée
Impact sur les animaux
Les mâles stérilisés et les mâles reproducteurs utilisés pour la production des embryons sont hébergés en situation d'isolement intermittent entre deux périodes d'accouplement. Les femelles receeveuses d'embryons peuvent faire l'objet de douleurs post-chirurgicales suite à la réimplantation des embryons par micro-chirurgie. Un stress peut aussi apparaitre en raison de la contention des animaux lors des stimulations hormonales ou pour l'anesthésie des femelles receveuses d'embryons.
Devenir
Les mâles reproducteurs sont mis à mort en fin de projet et ceux ayant servis à produire les femelles pseudo-gestantes (mâles vasectomisés) également. Les femelles ayant été sujettes à la chirurgie de transfert d'embryons ne peuvent subir un deuxième transfert d'embryons. Les femelles donneuses sont mises à mort pour permettre la récolte d'ovocytes post-mortem. Les animaux issus des transfert d'embryons seront conservés.
Remplacement
Il n'y a pas de remplacement possible, le transfert d'embryon est la seule méthode possible pour la redérivation de lignées murines. La redérivation des lignées sera limitée aux lignées originales pour lesquels ces lignées ne sont pas disponibles sous une forme respirante auprès d'un centre de ressouces.
Réduction
Les nombres d'animaux utilisés sont réduits au maximum et l'estimation a été faite en se basant sur la littérature scientifique et sur la base des années d'expérience dans ces approches.
Raffinement
La procédure chirurgicale de transfert d'embryons associe anesthésie générale et analgésie post et per-opératoire, avec la mise en oeuvre de points limites opérationnels pour le monitoring du temps post opératoire. Des points limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de maisons en carton.
Choix des espèces
La redérivation de lignées murines s'appuie sur l'intérêt et la justification pré-existante des modèles animaux disponibles pour répondre aux multiples objectifs scientifiques des programmes de recherche concernés. Il s'agit ici d'un prolongement de leur utilisation dans le sens d'une utilisation plus pertinente dans un contexte sanitaire protégé. Les animaux utilisés sont d'âge adulte pour les mâles reproducteurs, les femelles receveuses et les males vasectomisés, aprés la puberté et avant tout vieillissement. Les femelles donneuses utilisées sont des femelles impubères (4 semaines) pour faciliter l'efficacité du traitement de superovulation. Les animaux issus des transferts d'embryons seront âgés de 7 à 10j.
Maladies métaboliques et inflammation à bas bruit chez la souris: Cause ou Conséquence ?
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
48 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime obésogène pendant douze à vingt-quatre semaines, des injections deux fois par semaine, des mises à jeun et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline nécessitant gavages et prélèvements caudaux répétés. Le porteur indique que le surpoids peut gêner les déplacements et que la contention dans le tube d'échoMRI peut être anxiogène. Il affirme que le recours au modèle animal est "indispensable" pour une approche intégrée de plusieurs organes, et limite l'étude aux mâles.
Objectifs
L'obésité et le diabète de type 2 constituent des défis majeurs pour la santé publique à l'échelle mondiale, engendrant des conséquences graves sur la qualité de vie des individus et imposant un fardeau économique croissant. Ces affections sont souvent associées à un état inflammatoire , communément appelée "inflammation à bas bruit". L'inflammation à bas bruit représente un état caractérisé par des niveaux d'inflammation systémique faibles, mais persistants, qui peuvent ne pas être détectés par les symptômes cliniques traditionnels. Cette inflammation chronique de bas niveau a été étroitement associée à la pathogenèse et à la progression de l'obésité et du diabète de type 2. Cependant cette inflammation à bas bruit est-elle la cause ou la conséquence de ces pathologies est une question qui n’est pas encore tranchée dans la communauté scientifique. Comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent cette relation complexe est impératif pour développer des stratégies de prévention et de traitement efficaces visant à atténuer l'inflammation à bas bruit et, par conséquent, à améliorer la prise en charge des maladies métaboliques. Ce projet de recherche vise à approfondir notre compréhension de cette interaction complexe en examinant en détail les voies biologiques et les facteurs déclencheurs qui contribuent à l'inflammation à bas bruit dans le contexte de l'obésité et du diabète de type 2. En particulier nous allons étudier l’effet d’un composé pharmacologique aux propriétés anti inflammatoire développé par une start-up dans deux situations distinctes : La prévention ou la thérapie de ces maladies métaboliques. En d’autres termes nous espérons apporter des éléments de réponse à la question : Inflammation et maladies métaboliques :cause ou conséquence ?
Bénéfices attendus
Ce travail devrait permettre de répondre aux questions suivantes : Le composé pharmacologique aux propriétés anti-inflammatoires démontrées, est-il en capacité de prévenir l’installation des maladies métaboliques et/ou de traiter ces maladies une fois qu’elles sont installées. Les résultats obtenus devraient nous permettre d’apporter des éléments de réponses quant à l’association des maladies métaboliques à l’inflammation à bas bruit. De plus si ce composé à des effets bénéfiques, alors on peut imaginer que cela puisse un jour être un traitement pour ces maladies.
Procédures
L’ensemble de l’effectif du projet recevra un régime alimentaire obésogène de type HFHS et sera soumis à un suivi de masse corporelle hebdomadaire (12 24 pesées sur 12 ou 24 semaines de régime pour la procédure 1 ou 2 respectivement ). Une mesure de masse grasse et masse maigre par EchoMRI (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 3 minutes) en semaines 12 et 24 sera réalisée. Des prélèvements sanguins au niveau caudal après légère incision du bout de la queue (0,5-1mm) et post anesthésie locale (crème EMLA 30-45 minutes avant le premier prélèvement) seront également réalisés en semaines -S11 (pocédure 1 et 2) et S23 (procédure 2) pour la réalisation des tests métaboliques (OGTT et ITT). Dans chaque procédure il y a aura deux injections par semaines pendant 12 semaines soit 24 injections. Une injection IP (volume 100µl), réalisée par un expérimentateur maitrisant le geste technique ne prends pas plus de 10 secondes, préhension de l’animal incluse. Concernant OGTT et ITT, respectivement 6 et 5 prélèvements caudal seront nécessaire. Un prélèvement réalisé par un expérimentateur maitrisant le geste technique ne dépasse pas 15 secondes, préhension de l’animal incluse
Impact sur les animaux
Les animaux en régime High Fat /High Sucrose peuvent avoir des difficultés à se mouvoir en raison du surpoids. Toutefois, cela n’a jamais observé après 12 semaines de régime. Une attention particulière sera portée aux animaux de la procédure 2 qui eux seront sous régime HF/HS pendant 24 semaines Les préhensions des animaux lors des pesées, des injections intra péritonéales peuvent causer au moins au début du protocole un peu de stress sur les animaux. Pour diminuer au maximum ce stress (et éviter également que ce dernier puisse perturber le protocole), les animaux seront manipulés lors de la deuxième semaine d’acclimatation par le même expérimentateur qui procédera au différentes mesures hebdomadaires. De la même manière, les injections intrapéritonéales seront réalisées par un expérimentateur maitrisant parfaitement ce geste technique Les test de tolérance oral au glucose (OGTT), les test de tolérance à l’insuline (ITT) nécessitent des mises à jeun de 4h. Les mises à jeun de 4h se font sur la matinée en dehors de leur phase de nourriture nocturne et n’a donc que peu d’impact mais permet de s’affranchir des variations interindividuelles du métabolisme glucidique. L’OGTT, nécessite une préhension des animaux afin de les gaver avec la solution de glucose ce qui est invasif pour les souris (maîtrise du geste par un expérimentateur formé). L’ITT nécessite une préhension des souris et une injection intrapéritonéale d’insuline qui peut également être invasive (maîtrise du geste par un expérimentateur formé). OGTT et ITT nécessitent des mesures de glycémie pendant 2h. Ces mesures sont réalisées à l’aide d’un glucomètre par prélèvement d’une micro goutte de sang L’EchoMRI nécessite de faire entrer les souris dans un tube plastique dans lequel elles doivent rester 3 minutes, ce qui peut être anxiogène (maîtrise du geste par un expérimentateur formé).
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés sous anesthésie selon le planning prévu par l’étude afin de réaliser des prélèvements sanguins et tissulaires.
Remplacement
Le remplacement est impossible car il s’agit d’étudier des processus physiologiques mettant en jeu plusieurs organes (intestin, tissu adipeux et foie). Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour une approche intégrée.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires et le nombre d’expériences réalisées sur chaque animal, nous avons adopté la stratégie suivante : - Réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à une analyse statistique robuste de cette expérience à l’aide de tests non paramétrique sachant qu’il y a des variations individuelles dans la mise en place de l’obésité. - Cette série d’expérience se fait uniquement sur les mâles. Si des effets sont observés, la necessité impérative de reproduire les données avant publication se fera alors sur les deux sexes.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales avec un enrichissement de leur milieu adapté. Ils bénéficieront d’un suivi quotidien de leur état général. Lors des procédures expérimentales, les actes susceptibles d’entrainer une souffrance ou une douleur seront réalisés soit sous anesthésie locale, soit sous anesthésie générale. S’agissant d’un projet nécessitant l’utilisation d’animaux vivants, l’utilisation de techniques non invasives et indolores est privilégiée afin d’acquérir les paramètres physiologiques nécessaires au projet tout en respectant les questions d’éthiques en expérimentation animale et la règle des 3R. De plus, des points limites en adéquation avec ce projet ont été définis. En cas d’atteinte d’un de ces points limites, l’animal concerné sera retiré du projet. Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet.
Choix des espèces
La souris est utilisée car son métabolisme présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme. . Ce modèle est largement documenté dans la bibliographie scientifique dans les études de maladies métaboliques Les animaux seront réceptionnés au centre de zootechnie à l’âge de 8 semaines, stade adulte des souris. Le début du régime HF/HS commencera à partir de 10 semaines et se terminera soit a 22 semaines (S12) (procédure 1) soit à 34 (S24) semaines (procédure 2)
Déchiffrer le code de la myélinisation chez la chimère Drosopus (Xénope et Drosophile)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
400 têtards de xénope vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit sous anesthésie une transplantation de cellules de drosophile dans le chiasma optique, puis est disséqué pour observer l'enroulement de ces cellules autour des neurones. Le porteur indique qu'une transplantation peut traverser une veine et provoquer une hémorragie, l'animal étant alors tué dans les cinq minutes, et que l'exposition au métronidazole tue environ 10 % des têtards. Il revendique le remplacement de vertébrés comme la lamproie par un invertébré, la drosophile, et justifie le xénope par sa transparence et sa position sur l'arbre évolutif.
Objectifs
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie du système nerveux central qui dans sa forme la plus fréquente évolue par poussées et régressions des symptômes. La régression des symptômes, plus ou moins complète en début de la maladie, devient de moins en moins complète au cours de la progression de la maladie. La SEP associe une atteinte inflammatoire et de dégénérescence des neurones. Depuis les 30 dernières années des progrès considérables ont été réalisés dans la prise en charge du volet inflammatoire de la maladie. En nous attaquant à la compréhension du processus de mise en place des couches (myéline) qui entourent les neurones, pour les protéger et permettre une conduction nerveuse rapide, nous espérons pouvoir identifier des cibles thérapeutiques pour lutter contre la dégénérescence des neurones dans la SEP.
Bénéfices attendus
Dans un premier temps le bénéfice de notre projet est fondamental, conduisant à comprendre les signaux minimums qui permettent la mise en place de la couche de protection autour des neurones (myéline). A plus long terme notre ambition est d’ouvrir des voies thérapeutiques dans les maladies dégénératives dont la plus fréquente est la sclérose en plaques.
Procédures
Dans notre protocole expérimental, les têtards seront soumis à une étape de transplantation des cellules dans le chiasma optique sous anesthésie générale. Du début à la fin de l’anesthésie nous estimons que la durée ne dépassera pas 10min. Le chiasma optique est la structure anatomique dans laquelle les deux nerfs optique (un pour chaque œil) se croise. Réaliser la transplantation dans le chiasma optique, nous permet d’envisager que les cellules transplantées migreront dans les nerfs optiques et seront facilement identifiables et analysables. Cette procédure de transplantation n’a lieu qu’une seule fois par animal, sous anesthésie générale, avec un taux de survie dépassant les 90 pour cent pour les concentrations de cellules injectées. L’exposition au métronidazole (molécule permettant de mettre en place le modèle) entraine une perte d’environ 10 pour cent de têtards. La même technique d’anesthésie est utilisée pour une observation du nerf optique au macroscope, mais le têtard est cette fois ci placé sur une petite boite dans une goutte d’anesthésiant, l’observation ne dépasse pas 5 min, ce qui fait que le têtard est anesthésié au maximum pendant 10 min. Ces observations auront lieu 5 fois pendant toute la durée du protocole. Pour le comportement, les têtards sont amenés dans la pièce agréée dans leur bac, et prélevés délicatement avec une épuisette pour les placer dans une large boite avec leur milieu de nage. Leur nouvel environnement ne semble pas induire de stress car aucun comportement de fuite n’est observé. Cette expérience n’est réalisée que 2 fois et dure moins de 5 minutes par têtard. A la fin de la procédure les têtards seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
L’anesthésie est maintenue durant toute la durée de la procédure pour ne pas engendrer de stress chez le têtard mais peut entrainer des risques cardio-respiratoires, les battements du cœur sont donc fréquemment contrôlés durant l’anesthésie (facilement visible chez les têtards). La capture avec une épuisette peut générer un stress, ainsi que le changement d’environnement lors du test comportemental. L’exposition au métronidazole (molécule permettant de mettre en place le modèle) entraine une perte d’environ 10 pour cent de têtards. Lors de la transplantation, il est possible de traverser une veine, ce qui provoque une hémorragie, dans ce cas-là, à la reprise de la nage à la suite de l’anesthésie, le têtard peut soit nager de travers, soit avoir une poche de sang visible. Le têtard est donc directement euthanasié dans les 5 minutes après la transplantation.
Devenir
Suite aux transplantations, les têtards sont euthanasiés pour observer les cellules gliales de Drosophile qui ont été injectées dans le chiasma optique. Cette euthanasie est nécessaire pour observer l’enroulement possible des cellules gliales de Drosophile autour des neurones de Xénope, et cette observation n’est possible qu’après dissection des têtards.
Remplacement
L’enroulement autour des axones par des cellules gliales (myélinisation), comme la remyélinisation (suite à une ablation de ces cellules gliales, évènement de démyélinisation), ne peut que difficilement s’étudier sur un autre modèle que chez les vertébrés. Une autre possibilité eut été d’utiliser deux espèces de vertébrés : Tous les vertébrés sont myélinisés sauf les plus anciens, dépourvus d’une mâchoire à savoir la lamproie et la mixine. Nous aurions pu ainsi transplanter des cellules gliales de lamproie dans le système nerveux de Xénope. Afin d’éviter l’utilisation de ces vertébrés nous avons préféré les remplacer par la Drosophile, qui est un invertébré, dont les cellules gliales ne s’enroulent par autour des axones (au plus 1 à 2 tours) mais forment des empilements protégeant les axones.
Réduction
La transparence des têtards de Xénope permet de suivre in vivo la progression des expériences et ainsi d’éviter des suivis histologiques nécessitant l’euthanasie des têtards expérimentaux à différents points critiques du protocole. Le chiffre de 400 têtards utilisés pour ce projet a été déterminé de sorte à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en s’assurant de résultats statistiquement robustes. Il est à noter que dans un souci de respecter au plus près la règle des 3R ces expérimentations in vivo ne seront que l’aboutissement d’études préalables, n’entrant pas dans le champ d’une demande Apafis, réalisées sur des co-cultures de cellules de Drosophile et de Xénope.
Raffinement
Les têtards sont placés dans un bain à une température de 23 degrés celsius avec une pompe pour oxygéner l’eau. L’eau (moitié osmosée moitié dure) est renouvelée régulièrement pour maintenir un volume suffisant et réduire l’accumulation des déchets urémiques. L’eau est oxygénée de manière plus importante après anesthésie pour permettre une meilleure récupération du têtard. Les têtards sont observés quotidiennement, et ceux qui présentent des anomalies (déformations, retard de développement, troubles de la nage…) sont euthanasiés, les cadavres liés aux problèmes de développement et les surplus de nourriture sont aussi retirés de l’eau quotidiennement. De plus, des branches de plantes artificielles sont placées dans les bacs des têtards, qui leurs permettent de se cacher dessous. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Pour les manipulations, les têtards sont attrapés par une épuisette, ce qui n’entraine normalement pas de blessures ou de comportements anormaux suite à la capture. Pour le comportement, les têtards sont amenés dans la pièce agréée dans leur bac, et attrapés par une épuisette pour les placer dans une large boite de Pétri (145 x 20mm) avec leur milieu de nage. Leur nouvel environnement ne semble pas induire de stress car aucun comportement de fuite n’est observé. Les têtards sont isolés seulement 5 minutes avant d’être replacés dans leur bac d’origine avec leurs congénères, ce qui n’entraine pas de troubles de comportement visible. Durant l’exposition au métronidazole (molécule permettant de mettre en place le modèle), les têtards sont placés dans un incubateur opaque. Cette absence de cycle jour/nuit n’impacte pas les têtards car nous n’avons pas observé de stress ou d’augmentation de la mortalité durant les 10 jours d’exposition. De plus, les têtards aiment les zones qui sont peu lumineuses, ils se cachent naturellement dans les plantes et dans les tuyaux. Le passage à l’obscurité n’est donc pas une perturbation pour eux.
Choix des espèces
Le choix du Xénope se justifie pour 3 raisons : 1) le Xénope vit à la même température que les Drosophiles, critère indispensable pour créer les transplantations 2) les têtards de Xénope sont transparents, ce qui facilite le suivi in vivo de l’expérimentation (respect du critère réduction) ; 3) contrairement aux poissons (osteichtyens(danio) ou chondrichtyen) les amphibiens (Xénope) sont les premiers vertébrés sur l’arbre évolutif à utiliser un profil protéique myélinique différent dans le système nerveux central et périphérique. Les transplantations seront réalisées à différents stades de développement : au début de la myélinisation (stade 48) et des têtards déjà bien myélinisés juste avant la métamorphose (stade 55-60). Ceci afin de déterminer le stade auxquels les axones sont le plus "aptes" à être myélinisés.