Recherche fondamentale

6500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tués à l'issue et jusqu'à 100 réutilisés pour de la formation ou d'autres études. Un tiers subit une neurochirurgie crânienne d'environ une heure, puis les rats reçoivent des stimulations sonores et des injections de candidats médicaments jusqu'à deux fois par jour pendant 28 jours, avec des prélèvements sanguins répétés. Le porteur indique que les rats sont hébergés seuls après l'implantation, ce qui les isole socialement, et que les molécules testées peuvent provoquer perte de tonus, somnolence ou excitation. Il affirme que ces mécanismes complexes ne peuvent être reproduits par des modèles cellulaires ou informatiques et qu'une preuve d'innocuité chez l'animal est "indispensable" avant toute mise sur le marché.

Objectifs

Les maladies neurologiques et psychiatriques représentent un enjeu majeur de santé publique et touchent de plus en plus de personnes du fait de la croissance et du vieillissement de la population mondiale. Développer de nouvelles thérapies ciblant ces maladies est un axe majeur actuellement. L’objectif aujourd’hui est d’identifier des méthodologies précliniques précoces capables de sélectionner des composés sur la base de leur efficacité potentielle chez l’homme. Les méthodes se basent sur des biomarqueurs utilisables à la fois chez l’animal et chez l’homme. Parmis eux, les activités oscillatoires de base et les potentiels évoqués sont particulièrement intéressants. Dans ce projet, les activités oscillatoires spontanées et évoquées chez des animaux contrôles et des animaux reproduisant des symptômes de pathologies humaines seront étudiées.

Bénéfices attendus

Afin d'optimiser le développement de nouveaux médicaments et ainsi fournir aux patients des traitements efficaces, la priorité est donnée à la découverte et l'utilisation de marqueurs d'évaluation d'efficacité quantifiables, fiables et facilement transposables enter les études précliniques et cliniques. Les activités électriques cérébrales sont largement conservées à travers les mammifères permettant ainsi une transposition fiable entre l'humain et le rongeur. Dans ce projet nous utiliserons des rats.Nous chercherons à mettre en évidence de nouveaux marqueurs biologiques sur ces animaux. Ces marqueurs biologiques translationnels permettront de tester de nouveaux candidats médicament.

Procédures

1/3 des animaux de ce projet vont subir une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. Les animaux pourront être soumis à des stimulations sonores (2 heures maximum en pulse de stimulation, non continu) qui seront réalisées sur l’animal vigile une à deux fois par semaine. Lors des tests pharmacologiques en courte durée (injections aigues durant quelques minutes), un protocole de stimulation sonore sera appliqué avant et après l’administration d’un candidat médicament. Une période de repos de 2 jours minimum sera respectée entre 2 sessions (en fonction du delais possible d'admission des candidats médicaments). Lors des tests pharmacologiques en administration de longue durée (chronique), les injections pourront être réalisées jusqu’à deux fois par jour, sur une durée maximum de 28 jours. Des prélèvements sanguins (d'une durée de quelques minutes) pourront être faits au cours de la procédue expérimentale en fonction du plan expérimental établi. Le volume de prélèvement dépendra de la fréquence de prélèvement : le volume prélevé pourra aller jusqu’à 7.5% de volume sanguin circulant avec une période de récupération d’une semaine (pour un rat de 300g, 1.2 ml), et jusqu’à 10% avec 2 semaines de récupération (pour un rat de 300g, 2 mL). Les prélèvements seront effectués de manière à ne pas dépasser le volume de sang maximm autorisé (1.2 ml sur 1 semaine) pouvant etre fait en prelèvement retro-orbitaire, ou caudal (en fin d'EEG par exemple, ou 200 µl de sang sont prélévés, répatable (si besoin de prelevement à différents temps pour la pharmacocinétique, avec une limite de 3 prélèvements maximum par jour), avec en moyenne 2 EEG par semaine)

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, une diminution de l'activité locomotrice et une deshydratation passagère pourront être observées. Une douleur modérée pourra apparaitre dans les heures suivant l'intervention chirurgicale. Lors de la stimulation cérébrale, malgré l'intensité faible utilisée, une réaction comportementale (freezing, sursaut, clignement d'yeux) pourra être induite dans de rares cas. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tous tests de composés sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir, notamment une perte de tonus musculaire, une somnolence ou à l'inverse une excitation dûe au fait des mécanismes d'action des molécules testées. Les animaux sont hébergés en cage individuelle (portoir ventilé) après l'implantation des dispositifs d'enregistrement ce qui engendre un isolement social.

Devenir

Il sera nécessaire de vérifier l’exposition aux molécules testées et une caractérisation histologique des tissus de tous les animaux engagés dans ce projet. Si toutefois cette vérification n'est pas nécessaire (demandé dans le plan expérimental), les animaux pourront être réutilisés (pour de la formation ou pour un autre plan d'étude) si : - le nombre d'injection maximum n'a pas été atteint - le bien être de l'animal le permet.

Remplacement

Cette étude nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle adresse des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être représentés par des modèles plus simples (ex. modèle cellulaire ou computationnel). Pour toute demande de mise sur le marché, et quel que soit le pays de vente ciblé, il est indispensable pour les industries pharmaceutiques de prouver l’innocuité et l’efficacité d’une molécule. Avant de réaliser des essais cliniques, des tests in vitro et in vivo sont nécessaires. Les mécanismes d’apparition, puis de mise en place des troubles neurologiques, sont encore peu connus et nécessitent des explorations supplémentaires. Cette étude nécessite donc l'utilisation de modèles animaux car elle cible des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être récapitulés par des modèles plus simples (ex. culture de neurones).

Réduction

Dans ce projet, chaque animal est son propore contrôle et chaque animal recoit toutes les conditions pharmacologiques dans un ordre aléatoire (= plan d'étude croisée), ce qui permet de reduire le nombre de groupe d'animaux (évite d'avoir un groupe d'animaux contrôle). Le nombnre d'animaux nécessaire pour avoir des réultats significatifs est calculé avant d'établir le plan expérimental en utilisant des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Dès réception, les animaux s'acclimatent 1 semaine à leur environnement. Une injection de morphinique sera faite avant la procédure chirurgicale et sera renouvelée 6 à 8 h après afin de prévenir toute douleur liée à la phase de chirurgie. Les chirurgies se déroulent sous anesthésie générale volatile. L'état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et définissant les points limites adaptés. Cela permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les animaux seront hébergés dans des cages individuelles avec enrichissement. Il sera proposé aux animaux, 1 fois par semaine pendant 30 minutes, un temps de regroupement et de sociabilisation au sein d'une enceinte contenant différents enrichissements.

Choix des espèces

Dans ce projet nous utiliserons des rats. Ces animaux présentent des similarités anatomiques et fonctionnelles avec le cerveau humain et notamment au niveau des activités électriques cérébrales spontanées et induites et ils peuvent être utilisés pour le développement de nouveaux médicaments. Les animaux sont manipulés au minimum à l’age de 8 semaines puisque nous souhaitons évaluer les modifications électrophysiologiques chez des animaux adultes, car les circuits, à cet âge là sont matures.

243 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent en sous-cutané un biomatériau libérant du glucose, sont suivies par imagerie sous anesthésie répétée, et 80 d'entre elles subissent une thoracotomie pour visualiser les vaisseaux, avant mise à mort à des temps échelonnés jusqu'à huit semaines. Le porteur indique que la chirurgie d'implantation peut entraîner douleur, stress et infection, et que la taille de certains implants peut gêner l'animal. Il affirme qu'aucun modèle in silico ou in vitro ne reproduit l'environnement complexe de l'implantation et vise à terme une alternative aux autogreffes osseuses.

Objectifs

L’objectif du projet est de limiter la mort des cellules souches post-implantation dans le cas des défauts osseux dont la taille est trop importante pour permettre une réparation osseuse spontanée (défaut osseux de taille critique). Les autogreffes osseuses où le greffon est prélevé directement sur le patient sont la référence clinique. Cependant, ces greffons présentent des inconvénients tels que le recours à une deuxième chirurgie, et une quantité et qualité osseuses limitées. Une alternative développée est donc d’implanter des cellules souches dans le défaut osseux afin qu’elles induisent la formation osseuse soit en se différenciant en cellules osseuses soit en attirant les cellules osseuses environnantes. Malgré des résultats prometteurs, la réparation osseuse reste moins efficace qu’avec de l’autogreffe, à cause de la mort massive des cellules souches implantées (90%) observée lors des 15 premiers jours post-implantation. En effet, l’environnement dans lequel sont implantées les cellules souches est très peu vascularisé et caractérisé par un manque d’oxygène, de glucose et une accumulation de déchets métaboliques. Au laboratoire, nous avons démontré que le manque de glucose était le facteur responsable de cette mort cellulaire. L’objectif de ce projet est donc de limiter la mort des cellules souches transplantées afin de pouvoir augmenter leur contribution à la réparation du tissu lésé et à terme de remplacer les autogreffes. La stratégie développée par le laboratoire consiste donc à placer les cellules dans un biomatériau leur fournissant du glucose en quantité suffisante jusqu’à revascularisation du tissu. Le biomatériau comprend de l’amidon et une enzyme. Le glucose est ainsi fourni par dégradation de l’amidon sous l’action de l’enzyme. La preuve de concept de cette stratégie a déjà été établie in vitro et in vivo sur des temps courts, sans permettre cependant une survie cellulaire à long terme (28 jours). Une 2e version du biomatériau a donc été développée afin d’assurer une libération de glucose sur des temps plus longs. L’enzyme est cette fois-ci encapsulée dans des microparticules afin de ralentir sa libération et donc son effet sur l’amidon. Après une série de tests in vitro démontrant une survie des cellules souches sur du plus long terme, nous devons maintenant valider l’intérêt de cette 2e version du biomatériau sur la viabilité et fonctionnalité des cellules souches in vivo.

Bénéfices attendus

Ces expérimentations permettront dans un premier temps de tester la capacité de notre biomatériau d’assurer la survie des cellules souches transplantées dans un environnement physiologiquement pertinent et plus complexe que ce que permettent les études in vitro. Des résultats positifs permettraient de poursuivre les études en implantant cette fois-ci le biomatériau au sein d’un défaut osseux de taillle critique (chez la brebis, par exemple). L’objectif à long terme est ainsi de proposer une alternative aux greffes osseuses autologues qui présentent des limites comme le volume prélevable du greffon, sa qualité lorsqu’il s’agit de patients âgés ainsi que la nécessité d’avoir recours à un 2e site chirurgical. De plus, dans un cadre plus général d’ingénierie tissulaire ou de thérapie cellulaire, ce projet apportera une réponse au problème majeure que pose la mort massive de cellules transplantées qui sont confrontées à des conditions d’ischémie (transplantation de neurones dopaminergique pour Parkinson, transplantation de cellules souches pour les infarctus du myocarde).

Procédures

Pour tous les animaux (243 souris) : Mise en place des biomatériaux en sous cutané sous anesthésie générale et antalgie (1x, durée 20-30 min). Pour les animaux de l’étude 1 (43 souris) : Acquisition du signal fluorescent sous anesthésie générale gazeuse (8x, durée 5min, sur 4 semaines). Mise à mort des animaux au temps terminal de l’étude par anesthésie gazeuse suivie d’une surdose d’anesthésiant (1x, durée 10 min). Pour les animaux de l’étude 2 (100 souris) : Acquisition du signal bioluminescent sous anesthésie générale gazeuse (5x, durée 2x5min, sur 4 semaines). Mise à mort des animaux au temps terminal de l’étude par anesthésie gazeuse suivie d’une surdose d’anesthésiant (1x, durée 10 min). Pour les animaux de l’étude 3 (80 souris) : Infiltration du réseau vasculaire par un agent radio-opaque par thoracotomie sous anesthésie générale et antalgie (1X, durée 30 min). Pour les animaux de l’étude 4 (20 souris) : Mise à mort des animaux au temps terminal de l’étude par anesthésie gazeuse suivie d’une surdose d’anesthésiant (1x, durée 10 min). .

Impact sur les animaux

La chirurgie d’implantation en sous-cutané peut entraîner de la douleur et du stress chez l’animal. Une autre complication éventuelle est l’infection cutanée. Enfin, la taille de certains implants peut entraîner une gêne de l’animal. Les anésthésies (gaz anesthésiant) nécessaires à l’imagerie non invasive en fluorescence et en bioluminescence vont entrainer du stress au moment de la contention et de la perte de conscience. Les animaux subiront également plusieurs injections sous-cutanées pour la gestion de la douleur, l’anesthésie et l’imagerie en bioluminescence.

Devenir

Après implantation, suivi par fluométrie ou par bioluminescence, les animaux impliqués dans les procédures 2 et 3 seront mis à mort au temps terminal prévu (4 semaines) afin de pouvoir explanter les biomatériaux et approfondir les résultats par des analyses histologiques ou histochimiques. Tous les animaux concernés par la procédure 4 seront mis à mort suivant des temps prédéfinis (1, 2, 3 et 4 semaines) afin de suivre la formation des vaisseaux sanguins au cours du temps, car la visualisation des vaisseaux sanguins par agent de contraste nécessite la mise à mort de l’animal. Les animaux de la procédure 1 non impliqués dans les procédures 2,3 et 4 seront mis à mort à 4 et 8 semaines afin de pouvoir explanter les biomatériaux et quantifier la formation osseuse par examen radiologique de l'explant.

Remplacement

L’environnement post-implantatoire choisi est un milieu très peu vascularisé et complexe dont de nombreux facteurs (pH, oxygène, osmolarité, etc.) peuvent affecter la survie et la fonctionnalité des cellules implantées. Bien que certains de ces facteurs soient bien caractérisés (oxygène) d’autres n’ont pas ou peu étaient explorés (glucose, pH, etc.). Il n’est donc pas possible à ce jour de reproduire cet environnement post-implantatoire dans des modèles in silico ou in vitro. De plus, de nombreuses intéractions cellulaires (avec les cellules vasculaires ou les cellules de l’inflammation, par exemple) et moléculaires (par sécrétion d’alarmine, d’hormones ou de facteurs de croissance) peuvent également affecter le devenir des cellules implantées. Bien que des modèles in vitro (organoide, co-culture) permettent de reproduire certaines des intéractions cellules-cellules, ils n’incluent que 2 ou 3 intéractions (cellules souches/macrophages, par exemple) et ne capturent pas toute la complexité moléculaire et cellulaire de l’environnement post-implantatoire. Pour toutes ces raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier la survie des cellules stromales mésenchymateuses en vue d’une réparation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux, les études 1 et 2 seront des études de suivi longitudinal : les mêmes animaux seront imagés au cours du temps (et non un animal/temps). L’étude 1 permettra de sélectionner les groupes dans lesquels l’enzyme restera sur site d’implantation au moins 7 jours sans fuir hors du site. Ces groupes sélectionnés seront donc ensuite utilisés pour l’étude 2. Pour les études 3 et 4, seuls 2 profils sélectionnnés lors de l’étude 2 seront utilisés. Il s'agit du profil permettant la survie cellulaire la plus longue et du profil présentant une augmentation de la population cellulaire en début d’implantation. De plus, la comparaison avec le biomatériau de 1ère génération se fera en se basant sur les résultats historiques des études précédemment réalisées au laboratoire. En prenant en compte les variations de résultats observées dans nos études in vivo précédentes en site sous-cutané, nous affecterons 10 implants/groupe afin d’avoir un pouvoir statistique suffisant. Pour les analyses, un test statistique (test paramétrique) sera utilisé afin d'étudier l’effet de la composition des biomatériaux, l'impact de la durée d’implantation et leurs intéractions.

Raffinement

Une période d’acclimatation et de désensibilisation de 7 jours sera accordée aux animaux avant leur entrée dans le protocole expérimental. La souffrance liée à l’implantation sous-cutanée sera limitée par analgésie pré- et post-opératoire toutes les 12 heures pendant 24h. Un gel nutritif sera ajouté lors des 3 premiers jours post-opératoires pour faciliter la prise de nourriture et l’hydratation des animaux. Suite à la procédure chirurgicale, des points surveillés et scorés sur le comportement, l’aspect général (perte de poids) et les signes cliniques spécifiques à l’acte chirurgical (infection du site d'implantation) permettront d'objectiver la douleur ou la gêne de l’animal deux fois par jour pendant les 3 premiers jours post-opératoires, puis deux fois par semaine jusqu’aux points terminaux. En cas de manifestations douloureuses et/ou d’inconfort l’analgésie sera augmentée ou prolongée. Si ces manifestations sont réfractaires aux soins adaptés et/ou si le score des points surveillés dépasse le seuil limite défini en amont du projet, l’animal sera retiré de l’étude. Pour les protocoles d’imagerie non invasifs, les souris seront anesthésiées par voie gazeuse puis installées dans la chambre d’imagerie pour acquérir le signal fluorescent ou bioluminescent in vivo. Lors de ces acquisitions, les souris seront maintenues sous anesthésie au masque. Un gel oculaire sera appliqué pour éviter un éventuel déssèchement occulaire.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi est la souris immunodéficiente non consanguine. Le modèle souris est le mieux connu en termes de caractérisation génétique et immunologique. De plus, la fine épaisseur de la peau murine atténuant peu le signal, ce modèle permet d’utiliser des appareils d’imagerie non invasive, tel que la fluorescence ou la bioluminescence, pour un suivi longitudinal des implants. L'utilisation de souris immunodéficientes permet d’éviter une réaction immunitaire averse (rejet) lors de greffes d'origine humaine et ainsi d'évaluer le potentiel de cellules d'origine humaine. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes de 10 semaines pour avoir des animaux entre 25 et 30 g et qui permettent d'avoir un potentiel de néovascularisation et de néoformation osseuse optimal.

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales puis deux à cinq injections de molécules anticancéreuses, avec un suivi de la croissance des tumeurs sur les flancs, pour étudier la mort cellulaire dite immunogène. Le porteur indique que les tumeurs peuvent gêner les souris et que la chimiothérapie peut entraîner perte d'appétit et de poids, les analyses se faisant sur organes après mise à mort. Il revendique un modèle "complet et fonctionnel" irremplaçable in vitro et présente un algorithme d'intelligence artificielle comme moyen de réduire à terme le nombre d'expériences.

Objectifs

La chimiothérapie est un traitement clé contre de nombreux cancers. Certains médicaments peuvent provoquer un type de mort cellulaire spécifique appelé "mort cellulaire immunogène". Cela déclenche une réponse immunitaire antitumorale tout en protégeant contre la réapparition du cancer. Récemment, des recherches ont montré que bloquer la transcription de l'ARN est crucial pour déclencher cette mort. En utilisant un microscope, nous avons remarqué des changements spécifiques dans le noyau des cellules suite à l'utilisation de médicaments déclenchant la morte cellulaire immunogène. Ces changements sont liés à l'inhibition de la synthèse d'ARN. Nous avons développé un algorithme informatique capable de repérer ces changements dans les cellules sans avoir besoin d'utiliser des colorants. De plus, des études récentes ont montré que les effets secondaires de certains médicaments anticancéreux, comme la toxicité cardiaque ou la stérilité, sont liés aux dommages causés à l'ADN. Cependant, il existe des versions de ces médicaments qui conservent leur efficacité contre le cancer sans provoquer ces effets secondaires. C'est pourquoi nous examinons comment l'arrêt de la transcription de l'ARN et les dommages à l'ADN sont impliqués dans la mort cellulaire immunogène. Ce projet vise à confirmer dans des modèles animaux l'effet stimulant sur le système immunitaire de nouvelles molécules anticancéreuses. Ces molécules ont été sélectionnées soit par des tests sur des cellules évaluant leur impact sur la transcription et l'ADN, soit par des algorithmes informatiques capables de prédire ces effets à partir de leurs caractéristiques chimiques. Nous étudierons également leur effet sur la croissance des tumeurs.

Bénéfices attendus

Les expérimentations précliniques prévues visent à confirmer les effets antitumoraux des nouvelles molécules candidates et à approfondir notre compréhension de la potentielle implication du dommage à l’ADN dans l’immunogénicité. Ces études permettront d’explorer plus en profondeur les mécanismes sous-jacents à ce processus. De plus, nous pourrons évaluer si les molécules issues de l’algorithme d’intelligence artificielle permettant de prédire la capacité des différents composés à induire le dommage à l’ADN et l’inhibition de la synthèse d’ARN, présentent également des propriétés immunogènes. Cette approche constitue un atout en matière de criblage de molécules, offrant la possibilité de réduire considérablement le nombre d’expérimentations nécessaires.

Procédures

Suivant les groupes, les animaux recevront de 2 jusqu’à 5 injections, d’une durée de moins d’une minute chacune, sous anesthésie générale ou locale, dépendamment des injections. Ils seront manipulés brièvement (

Impact sur les animaux

Certains effets indésirables peuvent être observés chez la souris lors des expérimentations, notamment la manipulation et la contention régulière peuvent leur engendrer un stress léger. Les diverses injections pourraient générer des inconforts transitoires et légers. Les traitements chimiothérapeutiques peuvent entraîner des effets modérés comme une perte d’appétit et donc une perte de poids modérée chez la souris. Les tumeurs qui vont se développer sur les animaux pourront croitre et les gêner modérément au niveau des flancs.

Devenir

Chaque procédure requiert l’injection de cellules tumorales, ce qui implique l’impossibilité de garder les souris en vie à la fin de l’expérience. De plus, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez la souris afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro. Ce projet ayant pour objectif de tester si nos composés induisent une réduction de la croissance tumorale et une activation du système immunitaire, il est nécessaire d’utiliser un modèle mimant le plus fidèlement possible l’environnement tumoral et le système immunitaire. Il est actuellement impossible de reconstituer un système immunitaire in vitro/ex vivo du fait de sa complexité. Il est donc absolument nécessaire pour ce projet d’utiliser un modèle in vivo.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes de souris dont le nombre a été déterminé mathématiquement afin permettre une évaluation statistique solide des effets analysés. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail (les procédures sont en ordre séquentiel et non mises en oeuvre si l'hypothèse précédente est invalidé). Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque procédure.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début des expériences puis suivis quotidiennement. Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, et plusieurs fois par semaine lors de l'expérience décroissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux dispo-seront de nids, de tunnels en carton. Le stress des animaux sera évalué quotidiennement par un système de scoring. Des me-sures seront prises pour limiter le stress : plusieurs souris par cage pour un hébergement en groupes sociaux, animaux hébergés au calme. Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale ou locale selon le geste à l'écart des animaux hébergés et par des personnes expérimentées. Des points limite ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Le choix d'utiliser la souris dans cette étude repose sur plusieurs raisons importantes. Tout d'abord, la souris est un modèle complet et fonctionnel, offrant des similitudes intéressantes avec le système immunitaire humain, ce qui en fait un modèle utile pour cette recherche. De plus, nous connaissons bien sa génétique, ce qui facilite les études moléculaires et génétiques. Dans notre centre de recherche, la souris est souvent utilisée, ce qui présente des avantages pratiques. Nous disposons d'installations adaptées pour les élever, d’une solide expertise dans les techniques d'expérimentation animale ainsi que dans le suivi vétérinaire et microbiologique. La souris est également largement reconnue dans la communauté scientifique internationale comme un modèle animal standard pour les études précliniques. Son utilisation répandue facilite la comparaison des résultats entre différentes études, renforçant ainsi la validation des observations. Nous utilisons des souris adultes âgées de 8 semaines, car elles possèdent un organisme avec un développement complet et un système immunitaire fonctionnel. Les animaux sont utilisés au stade adulte (8 semaines), afin de disposer d’un organisme dont le processus de développement est achevé et qui possèdent un système immunitaire complet et fonctionnel.

32 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie fixe une ailette métallique sur le crâne, puis chaque souris est maintenue par la tête et imagée éveillée une fois par semaine pendant trois semaines pour valider une méthode d'échographie photoacoustique de l'activité cérébrovasculaire. Le porteur indique que l'ouverture du cuir chevelu peut provoquer une douleur au réveil et que la contention induit un stress qu'il compte atténuer par habituation. Les applications cliniques et l'étude de maladies neurodégénératives sont renvoyées au conditionnel et au long terme, l'objectif immédiat restant de valider l'outil d'imagerie.

Objectifs

Nous souhaitons étudier et valider une approche innovante d'imagerie non invasive de la fonction cérébrale chez la souris éveillée (mâles et femelles) grâce à l'utilisation des ultrasons à haute résolution associé à la photoacoustique.

Bénéfices attendus

Le développement de ce modèle nous permettra de mieux comprendre la fonction cérébrovasculaire chez des animaux éveillés en utilisant des approches novatrices d'imagerie non invasive. Ce modèle pourra être étendu à l'étude de pathologies comportementales ou de neurodégénérescence. À terme, nous pensons que l'imagerie fonctionnelle par échographie photoacoustique permettra d'identifier précocement des biomarqueurs de ces maladies, offrant ainsi un fort potentiel de transfert vers des applications cliniques

Procédures

La mise en place d'une ailette métallique sur le crâne de l'animal nécessitera une chirurgie peu invasive sous anesthésie et analgésie. La période de récupération post-chirurgicale sera de 7 jours. Une période d'acclimatation et d'habituation au système de fixation de l'ailette sur l'appareil de stéréotaxie sera réalisée pendant 7 jours. Cet appareillage permettra de maintenir la tête de l'animal sans entraver ses mouvements de marche. Le protocole d'imagerie par échographie/photoacoustique permettra l'enregistrement de l'activité cérébrovasculaire en réponse à différents stimuli. Ce protocole sera réalisé une fois par semaine pendant 3 semaines et durera de 20 à 30 minutes

Impact sur les animaux

L'intervention chirurgicale, impliquant l'ouverture de la peau du crâne et le placement d'une petite ailette métallique sur le crâne, peut provoquer une douleur chez les animaux au moment du réveil. En revanche, le suivi par échographie/photoacoustique à haute résolution est une approche non invasive et non douloureuse. La fixation de l'animal sur le système peut induire un stress temporaire (d'une durée de 20 à 30 minutes par animal), que nous atténuerons en habituant progressivement les animaux à ces procédures.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié à la fin du suivi échographique/photoacoustique pour des analyses des organes en biochimie et en histologie.

Remplacement

Malheureusement, il n'existe pas de modèle alternatif (in vitro ou in silico) bien validé pour étudier l'activité cérébrovasculaire dans sa globalité. Il est essentiel d'avoir des neurones connectés aux cellules gliales, au système immunitaire et aux vaisseaux sanguins pour étudier l'activité neurophysiologique au fil du temps. Le modèle d'imagerie sur animal éveillé est largement utilisé, accepté, documenté et adopté par la communauté des neurosciences. Le modèle d'imagerie sur animal éveillé est largement utilisé, accepté, documenté, et est largement adopté par la communauté des neurosciences.

Réduction

Nous avons limité le nombre de souris au minimum nécessaire. Cette étude permettra de faire des analyses en longitudinales répétées sur chaque souris. Les mêmes séries d'animaux seront utilisées pour les explorations fonctionnelles et en histologie pour les explorations moléculaires. Enfin, nous avons prévu de créer une banque d'échantillons à partir des prélèvements qui seront effectués (organes et sang). Elle nous servira à la suite du projet ou encore pour des études préliminaires pour des nouveaux projets.

Raffinement

Pour réduire la souffrance et le stress des animaux, des mesures sont mises en place pour gérer la douleur et le stress, comprenant l'utilisation d'analgésiques jusqu'à la mise à mort. Pour améliorer le bien-être des souris, des matériaux de litière et des structures de repos adaptées, tels que des mouchoirs en papier ou des rouleaux en carton, sont installés dans les cages.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris en fonction des modèles nécessaires à notre étude, tout en respectant les principes scientifiques des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) en recherche animale. Les souris sont fréquemment utilisées dans la littérature pour étudier la fonction cérébrale. Nous utiliserons des animaux âgés de 6 à 8 semaines pour étudier la fonction cérébrovasculaire, car il n'est pas techniquement possible de le faire chez des animaux plus jeunes. De plus, selon la littérature, la réactivité cérébrovasculaire en réponse à différents stimuli est optimale entre 6 et 8 semaines d'âge.

Les souris utilisées portent une modification génétique qui provoque un syndrome de Leigh : perte de poids et retard de croissance vers quatre semaines, difficultés croissantes à se déplacer, puis détresse respiratoire peu avant la mort, vers sept ou huit semaines. 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Dès le sevrage, à 21 jours, elles reçoivent dans leur nourriture deux molécules qui freinent le système immunitaire, et passent un test de coordination sur rotarod à 40 jours, après un entraînement à 30 jours. Le traitement dure jusqu'à la mise à mort, décidée par une grille de score : une perte de poids de plus de 20 %, une détresse respiratoire ou une mobilité fortement réduite suffit à atteindre le seuil de 3 points. Le porteur mesure l'efficacité au retard d'apparition des signes cliniques, et garde donc les souris en vie jusqu'à ce que leur état franchisse ce seuil.

Objectifs

Il n'existe aucun traitement disponible pour la plupart des maladies mitochondriales, maladies génétique du métabolisme entraînant un handicap grave et une mort prématurée. Le syndrome de Leigh en est une des formes plus graves. Il est causé par des mutations dans de nombreux gènes différents affectant la fonction des mitochondries, les centrales énergétiques de nos cellules. Cliniquement, cette maladie affecte généralement le cerveau et les muscles. Une étude récente a rapporté un effet positif de deux médicaments agissant sur l'inhibition du système immunitaire chez un modèle de souris développant un syndrome de Leigh suite à l'inactivation d'un gène mitochondrial particulier. Le but de notre projet est de tester ces deux molécules sur un deuxième modèle de souris du syndrome de Leigh, impliquant un autre gène, afin de déterminer si ces deux traitements peuvent être généralisable à tous les patients atteints par cette maladie.

Bénéfices attendus

Le projet vise à étudier l'implication du système immunitaire en tant que mécanisme principal à l'origine du syndrome de Leigh et la possibilté d'approches thérapeutiques le ciblant . Si les résultats sont solides et montrent des améliorations significatives, cela devrait permettre le développement de traitements cliniques pour le syndrome de Leigh et potentiellement pour d’autres maladies mitochondriales.

Procédures

Traitement pharmacologique: administration de deux molécules thérapeutiques dans la nourriture, de l'âge de 21 jours jusqu'à la mise à mort de l'animal basée sur l'observation de signes cliniques. Basé sur une publication sur un modèle similaire, le traitement pourrait s'étendre sur 6 mois. Test de coordination motrice: les souris seront placées sur une machine (rotarod) permettant de vérifier leur capacité à coordonner les mouvements de leurs pattes. Il y aura une phase d'entrainement à l'âge de 30 jours, puis une phase de mesure à 40 jours. Basé sur des publications scientifiques, les souris restent en moyenne 10 minutes sur le rotarod, par mesure. Trois mesures seront effectuées, espacées de 15 minutes de récupération.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées sur ce projet ont un phénotype dommageable qui commence par une perte de poids et un retard de croissance (vers 4 semaines), puis des difficultés progressives à se mouvoir, et enfin des difficultés respiratoires peu avant le décès (à 7-8 semaines). Les traitements pharmacologiques en question ont été déjà appliqués dans des études scientifiques publiés qui ne semblent pas attribuer effets indésirables spécifiques.

Devenir

Tous les animaux prévus sur ce projet seront mis à mort en fin de protocole expérimental en vue de prélèvements post-mortem

Remplacement

Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle en absence d’autre modèles cellulaires qui permettent d’étudier la réponse du système nerveux à des immunotraitements in vivo. De plus, les modèles physiopathologiques par définition étudient les conséquences pathologiques de la mutation sur l’ensemble de l’organisme. Les lignées cellulaires tels que les cellules de peau de patients atteints par le syndrome de Leigh ne peuvent pas reproduire les mécanismes complexes d'adaptation physiologique systémiques liés à ces dysfonctionnements des mitochondries.

Réduction

Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux à utiliser pour obtenir des résultats exploitables au niveau statistique et les effectifs ont été calculés à l'aide d'un logiciel. Ainsi nous allons utiliser les mêmes souris pour les analyses cliniques, pathologiques et moléculaires.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la structure de bien-être animal, les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). En raison du phénotype dommageable des souris, nous ajoutons de la nourriture directement dans les cages, et utilisons des biberons avec tétine longue, pour permettre aux animaux de s'alimenter plus facilement. Pour limiter l’inconfort lié aux procédures, les manipulations seront réalisées par des personnes compétentes et expérimentées. Le bien-être des animaux fera l’objet d’un contrôle quotidien par le personnel de l'établissement utilisateur et du laboratoire. De plus, dans le cadre du protocole expérimental, à partir du début du traitement à lâge de 3 semaines, le poids corporel, la température rectale, la consommation alimentaire, l’état clinique seront évalués en aveugle au moins trois fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi). Une pesée supplémentaire sera effectuée le dimanche à partir de l’âge de 6 semaines. Un score sera attribué aux signes cliniques selon la grille de points suivante: Perte de poids 20% = 3 points; Détresse respiratoire = 3 points; Diminution de la mobilité: légère = 1 point; modérée = 2 points; sévère = 3 points. Dès que les souris obtiendront un score de 3 points, elles seront sacrifiées (point limite).

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines, car l'organisation de ses gènes est très similaire à celle de l'homme. De plus, la disponibilité de souris génétiquement modifiées permet d'étudier finement les mécanismes sous-tendant la pathogenèse de ces maladies mitochondriales. Dans le cas présent, cela permettra de tester l'efficacité de molécules thérapeutiques sur le syndrome de Leigh à l'échelle d'un organisme par des observations concrètes sur la survie et l'évolution pondérale. Le début du traitement commencera dès le sevrage des animaux à 21 jours car les molécules testées étant dans la nourriture, il faut que les souris puissent se nourrir seules. Le traitement continuera jusqu'au moment de la décision d'euthanasier les souris, basée sur notre grille de score, car le critère principal d'efficacité du traitement pharmacologique est la survenue plus tardive des signes cliniques pathologiques.

Une souris, un rat ou un hamster immobile, au poil hérissé ou au dos courbé est mis à mort sur-le-champ, et une perte de plus de 20 % du poids en trois jours, associée à d'autres signes, conduit à la mise à mort ou à une adaptation de la dose. Au total, 4 750 rongeurs vont être utilisés (2 750 souris, 500 rats et 1 500 hamsters dorés), tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À partir de quatre ou six semaines d'âge et jusqu'à 34 semaines, ils reçoivent des régimes hypercaloriques, parfois avec des boissons enrichies en fructose, en éthanol ou en composé pro-inflammatoire, des traitements une à deux fois par jour et trois prises de sang, puis passent une échographie du cœur et 24 heures isolés sur grille en cage métabolique. Ces régimes doivent permettre de tester des molécules contre l'obésité, le diabète ou la stéatose hépatique. Le porteur retient le hamster pour l'alcool parce qu'il en "consomme spontanément", et invoque la hausse de la consommation pendant les confinements liés au COVID-19.

Objectifs

L’augmentation de l'urbanisation dans le monde, combinée à la consommation d'aliments contenant des quantités importantes de graisses, d’acides gras saturés et de fructose sont considérés comme les principaux responsables des troubles métaboliques. Les mécanismes physiologiques ancestraux favorisant le stockage de l'énergie sous forme de graisse dans le tissu adipeux, le foie et le sang pour assurer la survie de l’individu en cas d’absence de nourriture, sont maintenant associés à l’obésité, la résistance à l'insuline, au diabète de type 2 et la Stéatose Hépatique Non-Alcoolique (NASH) . Dans ce contexte, un effort de recherche continu est engagé pour développer un ou des traitement (s) pour lutter contre ces dysfonctionnements. Ces dysfonctions métaboliques sont très complexes et sont liées entre elles, les études in vitro servent pour cibler le potentiel thérapeutique des molécules mais il est essentiel de pouvoir tester ces molécules sur des modèles animaux proche de l'Homme. Il est important de mesurer les dysfonctions métaboliques, cardiaques et rénales car à ce jour, il n’y a pas de thérapies efficaces pour les traiter. En outre, ces modèles animaux ne tiennent pas compte du fait que les patients atteints de NASH consomment également de l'alcool. Il a été démontré que la consommation d'alcool favorise la progression de la NASH vers des formes plus sévères. De plus, cette consommation d'alcool a considérablement augmenté dans la population générale depuis la pandémie de COVID-19, à cause des périodes de confinements. Par conséquent, il est important d'inclure la contribution de l'alcool dans les complications hépatiques liées à l'obésité et la NASH afin de mieux modéliser le contexte humain. Si les modèles d'alcool chez le rat ou la souris ne sont pas très pertinents car ces deux espèces ne sont pas naturellement attirées par l’alcool, le hamster est un modèle intéressant car il consomme spontanément et métabolise efficacement l'éthanol. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés, a lieu dans la poche pré-gastrique. Ces modèles seront utiles pour tester des thérapeutiques potentielles ciblant l'obésité, le diabète, la dyslipidémie, la stéatose, la NASH, la fibrose et l'inflammation.

Bénéfices attendus

L'intérêt de ce projet est le développement de modèles nutritionnels ressemblant à la réalité humaine occidentale (sédentarité et régime hyperénergétique avec ou sans alcool) qui permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques et ainsi de tester et valider plus rapidement de nouvelles thérapies pour le traitement de l'obésité, de la NASH, de la fibrose, des maladies cardiovasculaires et rénales associées aux maladies métaboliques, qui sont parmi les maladies les plus problématiques pour la santé publique française et mondiale.

Procédures

Pour induire des dysfonctions métaboliques chez la souris, le rat et le hamster, des régimes hypercaloriques associés ou non à des boissons enrichies en fructose et/ou en éthanol et/ou en composé chimique pro-inflammatoire seront mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 4 ou 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 34 semaines). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles : orale, sous-cutanée et intrapéritonéale sur animal vigile et intraveineuse sur animal anesthésié. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. Trois prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal (en début, milieu et fin de projet) afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. Un test de tolérance au glucose et un test de tolérance à l’insuline pourront être effectué la semaine précédant la fin de projet. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Afin de déterminer si le traitement a un impact sur la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer l'impact sur la fonction rénale des animaux, nous mesurerons le débit de filtration glomérulaire (GFR) en début et en fin de projet et la mesure de divers paramètres urinaires en cage métabolique uniquement en fin de projet. La GFR consiste à administrer un composé fluorescent par voie veineuse (sous anesthésie pendant environ 10 minutes) et de mesurer sa distribution via un capteur posé sur la peau pendant 2h (animal vigile). Pour faire les échographies et les GFR, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes. Les récoltes d'urine se feront sur 24h en cage métabolique.

Impact sur les animaux

Les animaux seront nourris à partir de 4 ou 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 34 semaines) avec des régimes enrichis en graisse et ou en sucre, cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer de la douleur. Les administrations et les prélèvements peuvent engendrer un léger stress et une douleur légère. Les animaux auront des mises à jeun alimentaires de 6 heures maximum. Certaines techniques nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 24h.

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le foie, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...)

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screnning, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Avec un nombre final d'animaux égal à 10 par groupe de traitement, une différence de +/- 30% est théoriquement détectable. La stratégie expérimentale consiste à mesurer les valeurs de chaque paramètre mesurable de façon longitudinale (taux de lipides, glycémie, taux de transaminases, marqueurs inflammatoires dans le sang/plasma), l'animal est donc son propre contrôle, dans la mesure du possible, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux par groupe.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rongeurs de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant souvent longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal ne suit pas la courbe de poids attendue, une recherche approfondie d’éventuels symptômes sera faite. Les points limites de ce projet seront les suivants : absence de mouvement, piloérection et dos courbé. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une dermatite, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Si l'état de l'animal ne s'améliore pas dans les 48 heures, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et l'euthanasieront. Si un animal atteint l'un des points limites, il sera euthanasié immédiatement. Pendant la phase de traitement, si la perte de poids est supérieure à 20% en l'espace de 3 jours et associée à d'autres signes tels que la prostration, le dos courbé et l'absence de toilettage, l'animal doit être euthanasié ou la dose et la fréquence de traitement adaptées.

Choix des espèces

Les souris et les rats sont suffisamment caractérisés pour l'étude des maladies métaboliques. Les hamsters présentent un métabolisme du cholestérol et des acides biliaires semblable à celui des humains. Les rats et les hamsters peuvent aider à étudier les effets de médicaments potentiels pour les complications cardiovasculaires (dysfonctionnement diastolique) et rénales. Chez les hamsters, la combinaison d'un régime riche en graisses, en cholestérol et en fructose et de la consommation d'alcool peut imiter le mode de vie de certains patients atteints de NASH, notamment pendant et après le confinement lié à la pandémie COVID-19. Si le modèle associé à la consommation d'alcool chez le rat ou la souris n'est pas très pertinent, le hamster est un modèle intéressant car il consomme et métabolise l'éthanol très facilement. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés a lieu dans la poche prégastrique. Les animaux sont utilisés à partir de 4 ou 6 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique) dès le jeune âge.

1250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par voie intrapéritonéale des prélèvements biologiques humains ou animaux pour isoler et collectionner des souches de toxoplasme, puis sont tuées pour récupérer les tissus où le parasite s'est enkysté. Le porteur indique surveiller les signes d'infection dans les 72 heures et ne traiter qu'en cas de signes limites, l'infection restant le plus souvent asymptomatique. Sur le remplacement, il affirme que la culture cellulaire n'atteint pas la même sensibilité et conclut qu'il n'y a "pas d'alternative in vitro" à la souris.

Objectifs

La toxoplasmose est une parasitose dont la prévalence chez l’Homme, en France, est d’environ 40% dans la population générale. Il s’agit dans plus de 80% des cas d’une infection asymptomatique et bénigne. Plus rarement, cette infection peut revêtir un caractère de gravité, et un traitement médicamenteux peut être mis en place pour limiter les conséquences de la toxoplasmose. Ainsi, chez la femme enceinte,l’infection par ce parasite peut être responsable d’une toxoplasmose congénitale par atteinte du foetus (transmission transplacentaire). Le diagnostic de toxoplasmose congénitale réalisé à la naissance, repose sur la sérologie et l’analyse du placenta et du sang de cordon/sang de bébé. Seule la présence formelle du parasite dans ces liquides biologiques, par biologie moléculaire, permet de déterminer si les prélèvements sont positifs. Dans ce cas, ces prélèvements (liquide amniotique, placenta ou sang de cordon/bébé) venant de toute la France, sont envoyés pour isolements des souches. Le modèle murin, sensible à l’infection par le toxoplasme est donc le plus approprié et le seul disponible, il n'y a pas d'alternative in vitro. Dans le cadre de la recherche, l’inoculation par voie intrapéritonéale à la souris, d’échantillons biologiques permet aussi l’isolement et la collection des souches de toxoplasmes en vue de leur caractérisation phénotypique et génotypique.

Bénéfices attendus

Cette caractérisation contribue à l’étude de la biodiversité du parasite et permet une recherche fondamentale (identification de marqueurs de virulence, de résistance thérapeutique…).

Procédures

Inoculation intrapéritonéale, 2 fois, 30sec - prélèvement à la queue, 1 fois, 1minute

Impact sur les animaux

Dans de très rares cas, l’infection peut être suspectée sur des signes d’infection précoce (poils hérissés, gonflement de l’abdomen).

Devenir

L’euthanasie des animaux est nécessaire pour la récupération des tissus où se sont enkystés les parasites. La réutilisation ou l'adoption de l’animal n'est pas envisageable du fait du traitement préalable. Toutes les souris sont euthansiées.

Remplacement

Le modèle murin est le plus sensible à l’infection par le toxoplasme et est le seul actuellement disponible. Des essais antérieurs au sein du laboratoire n'a pas permis d'obtenir d'isolement de souches par culture. Cependant, des essais supplémentaires sont continuellement effectués pour améliorer la sensibilité de culture cellulaire permettant l'isolement des souches . A l'heure actuelle, il n'y a donc pas d'alternative in vitro.

Réduction

Suite à une comparaison d’efficacité, nous avons transposé ce protocole de diagnostic clinique pour l’isolement de toxoplasmes à partir d’autres prélèvements (animaux ou humains) puis optimisé le protocole en réduisant le nombre de souris nécessaire pour l’obtention de souches de toxoplasmes : le nombre de 2 ou 4 souris par prélèvement permet une optimisation entre la diminution du nombre de souris et la sensibilité de l’isolement. Il n' y aura pas de tests statistiques d'effectuer. Deux animaux pour les petits de volumes de prélèvements et 4 animaux pour des plus gros volumes.

Raffinement

Une surveillance accrue est effectuée dans les 72 heures après inoculation. En cas de signes cliniques limites (points limites) 72h après l’inoculation, laissant supposer une atteinte toxoplasmique, un traitement traitement anti-toxoplasmique sera institué. Ce traitement permet une amélioration des signes cliniques dans les jours suivants. Dans la majorité des cas, le traitement n'est pas nécessaire car il n'y a pas d'apparition de signes cliniques (asymptomatique). Le traitement anti-toxoplasmiques reste exceptionnel. Des copeaux et rouleaux de carton sont ajoutées dans la cage.

Choix des espèces

L’isolement à partir de prélèvements (animaux ou humains) pour l’obtention de souches de toxoplasmes ne peut être que la souris. La comparaison avec la culture cellulaire n'a pas permis d'avoir une sensibilité comparable que l'inoculation à l'animal. Souris de 8 semaines 20g, à ce stade de développement le système immunitaire est bien en place et fonctionnel.

743 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des tumeurs leur sont implantées dans le flanc ou les poumons, suivies de traitements par virus oncolytique et d'injections intrapéritonéales répétées jusqu'à 36 fois, les tumeurs pulmonaires pouvant gêner la respiration. Fortement immunodéprimées, ces souris humanisées sont plus sensibles aux infections, ce que le porteur décrit comme un phénotype dommageable. Il veut induire des structures lymphoïdes dans les tumeurs pour améliorer le pronostic des patients et affirme qu'aucune alternative, pas même les organoïdes, ne remplace le modèle animal.

Objectifs

Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) représentent une cible nouvelle dont le contrôle de la formation est devenu un enjeu en immunothérapie. En effet, les TLS sont à l’origine du développement de réponses immunitaires adaptatives favorables chez les patients atteints de cancers. Il a, récemment, été montré que certaines molécules pouvaient être à l’origine de leur induction. Notre projet vise à évaluer la capacité de ces molécules, exprimées par un virus capable d’infecter la tumeur (virus dit oncolytique), à induire la formation de TLS dans les tumeurs, dans des modèles de souris présentant un système immunitaire humain afin de se rapprocher au mieux de la physiopathologie humaine.

Bénéfices attendus

Notre projet a pour objectif de manipuler les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) à visée thérapeutique afin de les induire chez des patients atteint d’un cancer présentant peu ou pas de TLS, et d’augmenter ainsi leur pronostic vital. Pour répondre à cette problématique, il nous est impossible d’avoir recours à d’autres alternatives que les modèles animaux. En plus de nous permettre d’établir une nouvelle stratégie thérapeutique des cancers, les résultats issus de ce projet nous permettront d’approfondir nos connaissances sur les mécanismes fondamentaux et les molécules intervenant dans la formation de TLS. Si un effet probant est observé, le projet pourra se poursuivre vers un développement clinique.

Procédures

Des tumeurs seront implantées dans le flanc ou dans les poumons des souris par injection de cellules tumorales en sous-cutané ou intraveineuse, respectivement. L’intervention n’aura lieu qu’une fois, durera moins d’une minute et sera réalisée sur souris vigile. L’administration du traitement par voie intra-tumorale ou par voie intraveineuse sera aussi réalisée sur souris vigile, à une seule reprise, et ne durera pas plus d’une minute. L’administration du traitement par instillation intranasale se fera cette fois-ci sur souris anesthésiées et tenues à la verticale. L’opération durera environ 5 min par souris et sera répétée un jour sur deux pendant six jours. Le suivi de la croissance tumorale sous-cutanée se fera pas mesure du volume tumoral au pied à coulisse, 2 fois par semaine, sur souris vigile, et ne durera que quelques secondes. Les injections intrapéritonéales d’un inhibiteur de point contrôle immunitaire seront réalisées 3 fois par semaines en alternant de côté, sur souris vigiles et ne dureront pas plus d’une minute. Les souris seront systématiquement manipulées sous un poste de sécurité microbiologique (PSM) en raison de leur forte immunodéficience (sensibilité élevée aux infections).

Impact sur les animaux

La douleur potentielle liée aux actes d’injections des cellules tumorales et des virus oncolytiques se limitera à l'introduction de l'aiguille au site d'injection et aura lieu au maximum à 2 reprises par animal et par procédure. Il en est de même pour l’injection intrapéritonéale de l’inhibiteur de point de contrôle immunitaire qui aura lieu au maximum 36 fois par animal. La contention des animaux peut procurer un stress ponctuel (quelques minutes). La croissance des tumeurs sous-cutanées pourra générer une gêne physique et des difficultés à la mobilité. La croissance des tumeurs pulmonaires pourra occasionner une gêne respiratoire. Les tumeurs métastasées sont rarement observées. Cependant, si elles surviennent, elles pourraient entraîner de la douleur, perturber le fonctionnement des organes, causer des complications physiologiques, altérer l'alimentation et la nutrition, ainsi qu'impacter la qualité de vie des animaux concernés. Les anesthésies peuvent être associées à des risques d'hypothermie, d'hypoventilation ou encore d'arrêt cardio-respiratoires. Les souris utilisées ont un phénotype dommageable en raison de leur forte immunodépression, elles sont donc plus sujettes aux infections et peuvent être plus sensibles à certains traitements que des souris immunocompétentes.

Devenir

Toutes les souris de ce projet seront euthanasiées afin de prélever les tumeurs et d’analyser l’infiltrat immunitaire du microenvironnement tumoral après chaque procédure.

Remplacement

Nos travaux portent sur l’induction de structures lymphoïdes tertiaires au sein de tumeurs. Ce mécanisme fait intervenir plusieurs paramètres dynamiques et complexes (système immunitaire, systèmes vasculaire et lymphatique) qui ne peuvent pas être modélisés ailleurs que dans des modèles in vivo, pas même dans des modèles d’organoïdes. De plus, dans ce projet nous souhaitons valider de nouveaux virus oncolytiques candidats. Il est donc primordial d’utiliser des modèles in vivo afin d’appréhender leurs interactions potentielles avec l’organisme hôte.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Différents prélèvements seront faits sur les animaux destinés à être euthanasiés, afin d’évaluer la pharmacologie des virus et des substances anti-tumorales utilisés et de réduire ainsi le nombre d’animaux nécessaire. Du fait de la variabilité de la croissance tumorale entre les animaux, particulièrement élevée dans les modèles de souris humanisées, nous utiliserons 12 souris par groupe traité et nous réduirons le nombre de souris à 10 dans le groupe non traité. Nous répéterons jusqu’à trois fois les expériences car la reproductibilité des résultats est une question centrale dans les bonnes pratiques des laboratoires. Tous les groupes expérimentaux seront réalisés simultanément pour réduire le nombre d’animaux contrôles dans le projet. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Nous utiliserons au maximum 743 animaux dans ce projet.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des portoirs ventilés (6 souris maximum par cage) et ne seront expérimentées qu'après une semaine minimum de stabulation. Notre structure a un programme d'enrichissement (placement de nids végétaux et de tunnels en carton dans les cages) lors d'expérimentations supérieures à 15 jours. La stabulation sera conventionnelle et conforme à la réglementation (litière normale, cages ventilées individuellement, 6 animaux maximum par cage de type-IIL, éclairage alterné jour et nuit 12h-12h de 6h-18h), et celles-ci recevront un régime alimentaire classique (nourriture libitum et eau par abreuvage automatique). Compte tenu de leur caractère immunodéficient, les souris seront maintenues dans un environnement stérile (cages individuellement ventilées, change sous hotte, aliment/litière irradiée, autoclavage, etc.). Les animaux seront surveillés quotidiennement par les expérimentateurs et animaliers pendant la durée de chaque expérience. Les animaux seront pesés deux fois par semaine et leur état de santé sera reporté sur une grille de suivi individuel. La présence de points limite définis permettra de stopper les expériences en cas d’atteinte de ceux-ci. Les actes d’instillation intranasale seront réalisés sous anesthésie.

Choix des espèces

Les souris humanisées représentent le seul modèle d’étude préclinique d’une réponse immunitaire de cellules humaines, in vivo. De plus, les propriétés oncolytiques des virus de la vaccine sont nettement supérieurs dans les cellules cancéreuses humaines que dans les cellules cancéreuses murines. Un tel modèle permet d’apprécier à la fois les propriétés oncolytiques directes des virus oncolytiques sur des tumeurs humaines, la capacité d’un armement avec des molécules humaines à stimuler les défenses immunitaires anti-tumorales humaines et, d’appréhender la pharmacocinétique des virus face à un système immunitaire humain afin de mieux extrapoler les effets thérapeutiques du traitement à l’homme. Les souris humanisées seront reçues à l'âge de 22 semaines, puis mises en stabulation pendant une semaine minimum avant de débuter l'expérimentation. La tranche d’âge des souris a été choisi car à ce stade de développement, les souris sont sevrées, ont atteint une taille adulte. Les expériences, visant en partie à mesurer la survie des animaux en réponse à un traitement, dureront au maximum 3 mois ou jusqu’à l’apparition de signes de souffrance, dans le respect de la règle des 3R.