Recherche fondamentale

1038 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau, des injections de composés radioactifs et des prélèvements de sang, pour étudier la réponse immunitaire induite par la radiothérapie interne vectorisée. Le porteur affirme que cette radiothérapie n'induit aucune nuisance car utilisée à dose réduite, et fixe le volume tumoral toléré à 1500 mm3. Il conclut qu'il n'existe "pas de méthodes alternatives à ces expériences de preuve de concept in vivo".

Objectifs

Les mécanismes associant la radiothérapie et la réponse immunitaire dirigée contre les tumeurs restent à explorer. La radiothérapie conventionnelle utilisant des rayons X (RTE) est dédiée aux tumeurs localisées, la radiothérapie interne vectorisée (RIV) permet elle d'irradier spécifiquement les tumeurs métastatiques. Nous proposons d’étudier l’immunité induite par la RIV et la RTE. Dans ce projet, 4 approches complémentaires seront utilisées pour évaluer cette réponse immunitaire en fonction de la présence ou de l’absence de gènes d’intérêt dans les souris. Au maximum 1038 souris pourront être utilisées pour ces 4 études sur une durée de 5 ans. Le nombre d’animaux sera réduit au minimum tout en ayant un nombre suffisant pour obtenir un résultat statistiquement significatif. Toutes les expériences sont menées par du personnel formé et compétent. Ces études découlent de premiers résultats in vitro et in vivo réalisés au sein du laboratoire. Les animaux sont surveillés quotidiennement et pesés 2 fois par semaine. Dès qu’un animal présentera l'un des points limites définis dans le cadre de nos expériences, il sera pris en charge immédiatement.

Bénéfices attendus

La radiothérapie interne vectorisée (RIV) peut induire des molécules présentant un fort potentiel thérapeutique. Ces nouveaux agents pourraient constituer une avancée majeure pour la prise en charge des patients atteints de cancer et pour le maintien de leur qualité de vie.

Procédures

- Les greffes sous-cutanées seront effectuées avec un temps de contention réduit au maximum (

Impact sur les animaux

Les nuisances d’un traitement par VECs, administrées par voie intraveineuse ou par voie intratumorale, n’est pas supérieur à celle induite par une greffe de tumeur. Dans ce projet, la RIV n’induit pas de nuisance puisqu’elle est utilisée à la moitié ou au quart de la MTA (maximal tolerated activity). Nous avons démontré dans des études antérieures qu’il n’y a pas de perte de poids, une numération sanguine constante et au-dessus des seuils pendant toute la durée de l’expérience et aucun changement de comportement observable.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés soit parce qu'ils ont atteint un des points limites définis pour chaque procédure, soit pour prélèvements post-mortem à l'issue des expérimentations. En cours d'étude, tout animal démontrant une souffrance irréversible ou inacceptable sera immédiatement euthanasié.

Remplacement

Il s’agit ici d’évaluer l’impact d’une réponse immunitaire associée à la RIV et son impact sur le développement tumoral. Il n’existe pas de méthodes alternatives à ces expériences de preuve de concept in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique et fixé à 8 souris par groupe. Enfin, les expériences intègrent les impératifs éthiques, les modalités d’hébergement, d’enrichissement du milieu, de prévention de toute douleur, détresse, et/ou inconfort chez l’animal. En outre, le principe des 3R est respecté puisque nous utiliserons des mâles et des femelles (pas de tri dans la colonie). Enfin, une technique d’imagerie SPECT/CT sera mise en place pour visualiser et suivre dans le temps la biodistribution des VECs de manière non-invasive (pas d’animaux supplémentaires).

Raffinement

Concernant les greffes, le temps de contention sera réduit au maximum (20g) par méthode submandibulaire pendant la durée de l’expérience (espacé d’au moins 8 jours) par du personnel formé et compétent (procédure

Choix des espèces

La souris immunocompétente constitue un modèle expérimental de référence pour ce type d’expérience sur la réponse immunitaire. L’étude débutera quand les souris auront entre 6 et 8 semaines. En effet, à ce stade le système immunitaire sera mature.

1962 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections dans l'œil et, pour 606 d'entre elles, quatre lésions au laser de la rétine sur un œil, avant récupération des yeux après mise à mort. Le porteur classe l'injection intravitréenne en gravité modérée par précaution et affirme que les lésions laser sont indolores et compensées par le cerveau en moins d'une semaine. Il conclut qu'aucune alternative in silico ou in vitro ne donne accès aux "grandes fonctions physiologiques des mammifères", et prévoit d'arrêter si un vecteur atteint 80 % de neutralisation du VEGF.

Objectifs

Les maladies de la rétine sont des troubles neurologiques majeurs pour lesquels aucun traitement efficace n’existe, et ce malgré les découvertes mettant à jour certains mécanismes liés à leur progression. Pour la Dégénérescence Maculaire Liée à l'Age (DMLA) seuls existent des traitements palliatifs visant à réduire la prolifération de nouveaux vaisseaux immatures dans la rétine avec des anticorps administrés en Injection Intravitréenne (IVT) et qui sont dirigés contre un facteur de croissance des vaisseaux sangins : le VEGF. Ces nouveaux vaisseaux immatures ne sont pas étanches et laissent passer un liquide qui crée un œdème rétinien responsable de la perte de la vision. Ces traitements ne sont que palliatifs et ne ciblent en aucun cas les mécanismes à l’origine du développement de la pathologie. L’approche visant à bloquer en amont la fabrication du VEGF (avant sa synthèse) via des petits bouts d’ARN interférents (siARN) prend donc tout son sens. En effet dans la cellule, des petits bouts d’ARN quittent le noyau (ARN messagers) pour initier la fabrication du VEGF. Les siARN dirigés contre le VEGF entrent dans les cellules et viennent neutraliser les ARN messagers bloquant ainsi la fabrication du VEGF. Depuis plusieurs années notre société et ses partenaires ont mis en place un consortium permettant le développement de vecteurs (V) améliorant la délivrance de siARN dans le Système Nerveux Central (SNC) dont la rétine. Ces vecteurs se présentent sous la forme d’anticorps modifiés et ciblent les récepteurs impliqués dans le transport au travers des barrières biologiques, par exemple pour passer du sang vers le cerveau ou la rétine, ou pour rentrer directement dans les cellules. A ces vecteurs nous venons y accrocher des molécules thérapeutiques comme des siARN dirigés contre le VEGF. Issus du savoir-faire de notre société, nos candidats médicaments sont couplés à nos vecteurs (V-siARN) et transformés dans le but d’améliorer le transport vers la rétine pour augmenter le pouvoir d’action du traitement.

Bénéfices attendus

L’objectif principal de ce projet est donc de combattre plus efficacement les rétinopathies à prolifération vasculaire (la DMLA mais aussi la rétinopathie diabétique) au moyen de vecteurs combinées à des brins d’ARN interférents pour bloquer les messagers cellulaires responsable de la synthèse du VEGF et donc lutter contre la pousse de nouveaux vaisseaux dans la rétine. La valeur ajoutée consiste à tester de nombreux de siARN dirigés contre le VEGF et à améliorer leur délivrance grâce à notre technologie (nos Vecteurs). Cette première phase expérimentale nous permettra de sélectionner les meilleurs couples siARN-Vecteurs pour passer, dans une deuxième étape, aux tests d'efficacité sur des modèles animaux pathologiques. Les bénéfices attendus pour de futures applications chez l'homme sont multiples par rapport à l'utilisation d'anticorps actuellement administrés en IVT. En effet notre technologie autorise nos vecteurs à se lier qu’à un seul type de récepteur sur les membranes des cellules de la rétine, ce qui nous permet de cibler précisément les cellules à l'origine de la surproduction pathologique de VEGF. D'autre part, il est connu que l'utilisation de siARN permet de rallonger significativement l'efficacité d'un traitement dans le temps par rapport aux simple anticorps classiques dirigés contre le VEGF, ce qui en théorie permettrai aux patients d'espacer la fréquence (mensuelle) des injections qu'ils reçoivent ; administration IVT qui reste un geste chirurgical particulièrement anxiogène et porteur de potentielles complications.

Procédures

Les animaux anesthésiés seront soumis à des administrations dans l’œil (IVT) (1440 animaux, durée de l’acte : 5 min par œil) et à 4 lésions laser de la rétine sur un seul œil (606 animaux, durée 30 min environ). Ils seront ensuite hébergés de 4 jours jusqu'à 3 mois maximum (4, 7, 14 jours, 1 et 3 mois pour un petit sous-groupe seulement) avant leur mise à mort pour récupération des yeux. Dans la partie concernant la mise en place du modèle pathologique de pousse de nouveaux vaisseaux immatures induit par lésion laser un groupe restreint d'animaux (30) subira 4 contrôles en imagerie rétinienne des lésions (le jour de la lésion, puis à, 4, 7 et 14 jours, durée 30 min) sous anesthésie générale. Lors de ces contrôles les animaux recevront à chaque fois une injection d’un traceur vasculaire fluorescent (1 min) pour la visualisation des vaisseaux rétiniens. En point final tous les animaux seront mis à mort dans nos expériences.

Impact sur les animaux

La procédure d'administration IVT est considérée comme légère chez l'homme mais pour plus de sureté nous la classons en modérée. Seule une désinfection du pourtour de l’œil est requise avant de commencer. Pour éviter de stresser les animaux, cette procédure sera effectuée sous anesthésie générale avec des antidouleurs. Avec une très faible fréquence, les nuisances pouvant être rencontrées dans ce type d’administration seront surveillées attentivement tous les jours (infections notamment). Pour éviter ce type de complication une pommade antibiotique sera systématiquement déposée sur la cornée. Concernant nos composés, nos données issues de projets précédents avec les mêmes molécules ne montrent pas de réaction du système immunitaire, ni de toxicité apparente. L'autre aspect susceptible d'affecter les animaux concerne les lésions rétiniennes par laser. Ces dernières, indolores, aboutissent à des déficits visuels qui correspondent à des tâches noires dans le champs visuel (< 15° d'angle visuel, ce qui correspond à peu près à des cercles de 10 cm de diamètre à un mètre de distance de l’œil). Au nombre de 4 par animal (en haut, en bas, à gauche et à droite), ces lésions couvrent au total moins de 10% du champ visuel des animaux et ceci sur un seul œil. De plus il est connu que des mécanismes corticaux au niveau des aires visuelles du cerveau compensent une partie de cette perte en moins d'une semaine (la lésion dans la rétine est toujours présente mais l’animal ne voit plus ces tâches sombres : mécanisme de remplissage perceptif). De fait, ces lésions n’affecteront que très peu la fonction première de cette voie sensorielle et donc le bien-être des animaux mais nous nous contenterons d'effectuer ces lésions sur un seul œil pour plus de sureté.

Devenir

Dans la procédure 1, un groupe de 720 animaux est inclus pour étudier le potentiel de nos vecteurs couplés au siARN. Si les analyses montrent qu'un couple de nos Vecteur/si ARN atteint plus de 80% de neutralisation des ARN messagers du VEGF-A alors le reste des animaux ne sera pas utilisé. Sinon le reste des animaux inclus sera mis à mort car il est nécessaire pour les analyses de les perfuser pour enlever le sang et nous récupérons les deux yeux pour analyse. Etant donné que nous commandons les animaux pour chaque expérience individuellement, les animaux inclus dans le projet et non utilisés ne seront pas à replacer. Dans la procédure 2 tous les animaux seront mis à mort car ils doivent être perfusés avant récupération des yeux pour analyse.

Remplacement

Toutes études de mesures physiologiques, de tests de molécules thérapeutiques, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l’heure actuelle aucune alternative (in silico ou in vitro) qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions physiologiques des mammifToutes études de mesures physiologiques, de tests de molécules thérapeutiques, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l’heure actuelle aucune alternative (in silico ou in vitro) qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille, de petite taille, facile d'utilisation, facile à reproduire et disposant d'une large panoplie de modèles génétiquement modifiés est idéale pour la mise en place de premières approches visant à développer de nouveaux médicaments. L’évaluation de l’efficacité de nos vecteurs couplés à une molécule thérapeutique ne peut être réalisé que par une approche in vivo pour réellement mesurer le bénéfice des molécules développées. A noter que la présélection des siARN qui vont être testés passe par une phase de sélection in sillico sur des bases de données informatiques ce qui permet d'éviter d'avoir recours aux animaux et ces derniers sont ensuite testés in vitro sur des cellules en culture avant de passer chez l’animal pour en mesurer l’efficacité.ères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille, de petite taille, facile d'utilisation, facile à reproduire et disposant d'une large panoplie de modèles génétiquement modifiés est idéale pour la mise en place de premières approches visant à développer de nouveaux médicaments. L’évaluation de l’efficacité de nos vecteurs couplés à une molécule thérapeutique ne peut être réalisé que par une approche in vivo pour réellement mesurer le bénéfice des molécules développées. A noter que la présélection des siARN qui vont être testés passe par une phase de sélection in sillico sur des bases de données informatiques ce qui permet d'éviter d'avoir recours aux animaux et ces derniers sont ensuite testés in vitro sur des cellules en culture avant de passer chez l’animal pour en mesurer l’efficacité.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été réduit au minimum requis pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Pour réduire d'avantage le nombre d'animaux nous avons opté pour des injections IVT bilatérales chez l’animal sain pour la sélection des différents siARN couplés à nos vecteurs car le geste, bien que classifié ici comme modéré, est à considérer comme une procédure légère sans composante douloureuse, ni impact au niveau de la vision. Le fait d'injecter les deux yeux dans cette phase de sélection nous permet donc de réduire le nombre d’animaux de moitié. Le nombre total d'animaux dans cette procédure fait l'hypothèse de l’échec des précédents V-siRNA testés. Si un des composés atteint plus de 80% de neutralisation du VEGF (observation systématiquement quantifiée dans chaque expérience) alors notre objectif sera atteint et le reste des animaux inclus dans le projet ne sera pas utilisé.

Raffinement

Les animaux seront soumis à un protocole anesthésique et analgésique rigoureux. Dans ce projet nous avons remplacé notre précèdent anesthésique par un de nouvelle génération car il permet un réveil plus rapide des animaux et n'entraine pas d'augmentation de la pression intra-oculaire (problématique pour l'IVT). Une couverture analgésique générale et locale permet d'éviter toute souffrance pendant l'expérimentation. Etant donné le court laps de temps d’exposition de nos V-siRNA dans l’œil (en moyenne 14 j et jusqu'à 3 mois pour un petit sous-groupe), ce type d’action n’est pas à même d’entrainer l’apparition de problèmes dommageables chez les animaux (observation effectuée dans nos précédentes études). Pour des questions de raffinement et de bien-être animal les groupes de lésions rétiniennes au laser passeront de 4 à 8 individus : en effet un seul œil sera lésé pour affecter le moins possible leur vision. De fait, ces lésions n’affecteront que très peu la fonction première de cette voie sensorielle et donc le bien-être des animaux. Enfin Le fait de choisir une administration IVT pour combattre les pathologies rétiniennes permet d’utiliser des doses largement revues à la baisse par rapport à une injection intra-veineuse avec une diminution des risques toxiques et immunitaires associés ainsi qu'une distribution dans tout le corps qui n’est pas voulue. Pour éviter toute souffrance animale, nous avons mis en place une grille d'évaluation de la condition des animaux avec toute une série de points limites et les actions y étant associées. Enfin les souris seront hébergées par 4 sous un cycle lumière-obscurité de 12 heures à 21°C (portoirs ventilés) et dans des cages avec un environnement enrichi (alternance entre dômes de plexiglas et dômes en papier, accompagné de nids en coton, de la frisure de papier craft et nous mettrons également à l’intérieur des cages quelques croquettes).

Choix des espèces

Dans ce projet nous avons choisi des souris saines adultes et pigmentées pour 3 raisons : En ophtalmologie il est indispensable d’utiliser des espèces pigmentées (non albinos) car elles ne sont pas dépourvues d’un type de photorécepteur dans la rétine. De plus leur utilisation est indispensable car nos Vecteurs ont été développés pour cibler la version « souris » du récepteur auquel ils se lient. Certains de nos Vecteurs ciblent également la version humaine de ce même récepteur d'où le choix d'une deuxième espèce, des souris adultes, pigmentées et humanisées pour le récepteur ciblé par nos vecteurs et ceci pour évaluer le potentiel de transfert de nos avancées chez l'homme. Enfin nous utiliserons ici uniquement des souris mâles et adultes car il a été prouvé que le modèle de lésion de la rétine que nous allons utiliser est beaucoup plus variable chez les jeunes individus et chez les femelles.

2500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris immunodéprimée reçoit une transplantation de cellules pancréatiques humaines sous la capsule rénale et un prélèvement sanguin hebdomadaire à la queue, pour évaluer la fonction du greffon avant transplantation chez le patient. Le porteur indique n'avoir noté aucune incidence sur le bien-être des souris lors du projet précédent et traiter la douleur chirurgicale, toutes les souris étant tuées pour récupérer le rein porteur du greffon. Il affirme travailler à une technique in vitro de remplacement mais la juge encore trop peu robuste pour fournir des résultats exploitables.

Objectifs

Lors de la transplantation des îlots de Langerhans chez le patient, la fonction primaire du greffon apparait comme le principal facteur pronostic de succés et son amélioration représente l'un des principaux enjeux dans le domaine. Aprés l'isolement de ces cellules, même aprés avoir obtenu une préparation d'îlots quantitativement importante, il est difficile de prédire la fonction après transplantation. L'évaluation pré-greffe (in vitro) consiste en un comptage, une viabilité, la pureté et la capacité à secréter de l'insuline. Malheureusemment, ces techniques ne corrèlent pas avec la fonction greffée chez le patient. Le modèle de souris xénogreffée montre, quant à lui, une bonne corrélation de fonction. L'objectif général du projet est donc, d'étudier les cellules pancréatiques humaines transplantées chez le patient, en transplantant une fraction chez la souris immunodéprimée, afin d'en évaluer la fonction. Cela se fait notamment par dosage spécifique du Peptide-C humain circulant dans le plasma de la souris.

Bénéfices attendus

La transplantation des cellules pancréatiques nous permettra : - D'une part, d'étudier la fonction des cellules pancréatiques humaines provenant de donneurs de phénotype différent (age, taille, poids, habitus...) et - D'autre part, de prédire la fonction du greffon cellulaire transplanté chez le patient recevant les cellules issues du meme donneur.

Procédures

Les animaux subiront un seul acte chirurgical à savoir la transplantation de cellules humaines sous la capsule rénale, traité par les anti-douleur adéquats (durée 15 minutes). Aussi, un prélevement sanguin hebdomadaire au niveau de la queue permettra de doser les hormones plasmatiques.

Impact sur les animaux

Ce projet etant un renouvellement d'un projet précédent, nous n'avons noté aucune incidence néfaste au bien etre des animaux transplantés. Les eventuelles douleurs notamment dues à la chirurgie sont palliées par un traitement anti-douleur adéquat. De la même manière, un traitement anti-douleur local (xylocaine) sera effectuée au niveau de la queue pour la prise de sang hebdomadaire.

Devenir

Nous envisageons la mise a mort de tous les animaux car en fin de protocole, nous récupérons le rein proteur du greffon pour étude immunohistochimique ou étude dynamique ex-vivo.

Remplacement

L'étude de fonction des ilots transplantés ne peut se faire sans faire avoir recours à l'animal car il n'xiste pas de technique in vitro performante qui permet de maintenir les cellules pancréatiques vivantes sur le long terme. Nous travaillons sur la mise en place d'une technique in vitro d'étude des cellules appelée périfusion en vue de remplacer l'animal, mais les données ne sont actuellement pas suffisemment robustes pour obtenir des résultats quantifiables et statistiquement exploitables. De plus, du fait de l'extreme hétérogénéité des donneurs d'organe, il n'existe pas de modèle d'étude ex vivo, organe-sur-puce, ou autre modele biostatistique qui permettent d'obtenir des résultats satisfaisants à l'heure actuelle. Aussi, l'usage de l'animal est necessaire pour 1) reproduire l'acte de la transplantation, 2) étudier les cellules humaines dans un organisme entier, et 3) maintenir les cellules vivantes pendant plusieurs semaines.

Réduction

Nous utiliserons le juste nombre d'animaux (n=5 animaux par pancréas traités) afin d'obtenir des résultats probants et statistiquement satisfaisants.

Raffinement

Les animaux seront hébergés et traités avec soin (nourriture et eau en illimité, visite quotidienne, cycle jour/nuit régulier). Les animaux recevant une chirugie seront surveiller pluriquotidiennement les 3 premiers jours après chirurgie puis quotidiennement. L'acte chirugicale se fera sous anesthésie et traitement de la douleur (pré et post opératoire - buprénorphine 0,05mg/kg) renouvelé selon le besoin. De plus, la chirurgie et les prélèvement sont réalisées par du personnel formé et sensible aux régles d’éthique expérimentale et qui manipule les animaux quotidiennement afin de les faire coopérer.

Choix des espèces

Les outils génétiques permettent de générer des animaux mutants immunodéficients disponibles facilement. De plus, nous disposons de tous les outils (anticorps, kits de dosages, animalerie) pour mener une étude facilité sur cet animal. Les souris Swiss Nude constituent un bon compromis puisque leur déficience d'immunité permet une bonne implantation des cellules humaines. Nous utiliserons des animaux adultes pour un geste chirurgical aisé.

648 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent différentes molécules par injection quotidienne pendant trois à cinq jours ou par voie orale, pour étudier comment les forces mécaniques régulent le renouvellement de l'épithélium intestinal. Le porteur ne décrit que des désagréments brefs, stress de contention et sensibilité locale de quelques minutes, un contraste avec la gravité modérée déclarée pour le projet. Il indique utiliser en priorité des organoïdes in vitro mais affirme qu'une analyse in vivo reste nécessaire pour tenir compte du microenvironnement de l'organe.

Objectifs

L'épithélium intestinal est un tissu qui se régénère rapidement et qui résiste aux agressions tout en maintenant sa fonction de barrière tout au long de la vie adulte. Bien que nous connaissions certains types de cellules qui le composent, nous ne savons pas comment ces cellules sont capables de se renouveler sans perturber l'intégrité du tissu. Le but de ce projet est d'étudier comment les forces mécaniques régulent le renouvellement de l'épithélium intestinal chez les souris. Nos principaux objectifs sont de caractériser le comportement de types de cellules intestinales rares (cellules de « goblet » et « tuft ») et de comprendre les mécanismes de renouvellement et d'intégrité de l'épithélium dans l'homéostasie intestinale.

Bénéfices attendus

Étant donné le rôle essentiel de l'homéostasie épithéliale dans la (patho)physiologie, la recherche proposée aura de vastes implications et applications dans un certain nombre de domaines. L'extrapolation des données à différents contextes physiologiques ou pathologiques, notamment les troubles inflammatoires de l'intestin, le vieillissement et le cancer, sera déterminante pour la recherche fondamentale et appliquée. • En ce qui concerne la recherche fondamentale, l'identification des mécanismes impliqués dans l'établissement et le maintien du renouvellement épithélial aidera à comprendre le développement et la fonction normale des organes, ainsi que la façon dont la dérégulation de ce processus contribue aux troubles du développement, au vieillissement et, en particulier, au cancer. • Comprendre comment le nombre homéostatique de cellules est préservé dans l'intestin des mammifères est essentiel pour comprendre comment la pathologie peut se produire - le dérèglement du renouvellement épithélial, que ce soit par une prolifération excessive, une migration aberrante ou une extrusion, pourrait conduire au développement de tumeurs. Ainsi, l'élucidation de la manière dont ces processus sont régulés et couplés pour atteindre l'équilibre sera d'un intérêt particulier pour la communauté médicale, qui pourra également bénéficier de nos systèmes modèles et de nos technologies. • L'intégrité de l'épithélium est essentielle pour sa fonction de barrière, qui consiste à isoler le microbiome gastro-intestinal de l'environnement interne ; si cette fonction est compromise, elle peut conduire ou contribuer à une maladie inflammatoire. La découverte des voies de signalisation qui sont activées en réponse à des niveaux physiologiques ou pathologiques de stress mécanique sera utile pour le développement et la thérapie des maladies. • Les études sur l'intégrité épithéliale et la perméabilité de l'intestin sont bénéfiques pour l'industrie pharmaceutique ; de nouveaux médicaments pourraient être testés sur nos modèles ex vivet in vitro, afin d'évaluer leur sécurité avant de les tester sur des modèles animaux et des humains.

Procédures

Les animaux recevront différentes molécules par deux voies d'administration différentes, soit par injection, une fois par jour pendant 5 secondes pendant 3 à 5 jours selon la molécule, soit par administration orale d'une molécule une fois pendant 10 secondes.

Impact sur les animaux

Les souris recevront des injections qui provoqueront un stress léger lié à la contention et l’introduction de l’aiguille pendant moins de 30 secondes. Certaines injections peuvent induire une certaine sensibilité locale. Ce désagrément ne dure que quelques minutes au maximum.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à la fin de chaque procédure pour recueillir les tissus.

Remplacement

Pour compléter et réduire les études in vivo, nous avons développé des modèles d'organoïdes intestinaux en 2D ou 3D. Nous les utilisons en priorité par rapport à l’expérimentation in vivo. Toutefois, ces études in vitro devront être complétées par une analyse in vivo pour étudier l'influence du microenvironnement de l'organe et du tissu sur la biologie de l'épithélium intestinal.

Réduction

Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, sur la base de notre expérience antérieure et de tests statistiques, les analyses seront réalisées sur 3 expériences indépendantes, avec toutes les souris en double, ce qui donne une fourchette de 12 à 24 souris nécessaires au total pour 3 expériences indépendantes. Ceci constitue un minimum nécessaire pour obtenir des données statistiquement fiables.

Raffinement

La surveillance renforcée permettra une vigilance accrue pendant l'expérimentation et la détection des atteintes des points limites. Les souris seront quotidiennement observées et pesées par du personnel compétent. Des grilles de scoring seront utilisées pour suivre les animaux en expérimentation afin de mettre en place, lorsque nécessaire, des mesures pour atténuer la douleur, l'angoisse ou le stress.

Choix des espèces

La souris de laboratoire est largement utilisée car ce modèle apporte plusieurs avantages : la maîtrise de son élevage, sa reproduction facile et rapide qui permet l’obtention de cohortes d’animaux d’un génotype approprié, la relative facilitée de modification génétique. Les modèles transgéniques proposés ont déjà été utilisés avec succès pour étudier le rôle du cytosquelette et des forces mécaniques dans l'homéostasie de l'épithélium intestinal. Ces modèles nous permettront d'évaluer la contribution des forces mécaniques dans la régulation de l'homéostasie intestinal chez l'adulte, ce qui devient un sujet d'intérêt majeur dans le domaine de la recherche, ainsi que pour la communauté biomédicale. Nous utiliserons des souris adultes (2-4 mois) pour étudier l'homéostasie épithéliale dans l'intestin des mammifères adultes.

496 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après trois mois d'un régime induisant surpoids et troubles métaboliques, elles subissent un test au glucose puis une chirurgie reproduisant un accident vasculaire cérébral, suivie de tests comportementaux non précisés à sept et vingt et un jours. Le porteur indique que le modèle provoque douleur peropératoire, perte sensorimotrice, perte de poids et déshydratation, les souris étant tuées pour prélever les tissus. Il affirme que l'étude de l'ischémie cérébrale dans ce contexte métabolique ne peut s'envisager que dans un "organisme entier" et présente les retombées cliniques comme applicables à l'humain.

Objectifs

Les maladies cardiaques sont l'une des principales causes de problèmes de santé et de décès chez les personnes âgées, en raison des problèmes de santé associés (vieillissement de leurs artères et troubles métaboliques). Ce projet de recherche se concentre sur l'accident vasculaire cérébral, maladie de plus en plus fréquente chez les personnes de plus de 60 ans. Aujourd’hui aucune thérapie ne permet une bonne prise en charge de la maladie. Chez ces patients, les comorbidités, telles que l’hyperglycémie et l’hyperlipidémie sont des facteurs de risque bien identifiés, aggravant les conséquences de la maladie. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre et caractériser le rôle des comorbidités liées à l’âge dans la modulation de la réponse des mécanismes de réparation après la survenue d’un accident vasculaire cérébral. Nous utiliserons un modèle classiquement utilisé et qui est proche de l’accident vasculaire cérébral chez l’Homme. Par ailleurs, la prise en compte des problèmes de santé associés à l'âge est nécessaire pour déterminer l’impact de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cette étude, qui sera menée sur 2 établissements utilisateurs, permettra de mieux comprendre les caractéristiques de l'accident vasculaire cérébral dans le contexte de vieillissement et ses problèmes de santé associés dans l’optique d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des comorbidités dans les conséquences de l'accident vasculaire cérébral. Les bénéfices attendus concernent la progression des connaissances scientifiques, connaissances qui pourront être appliquées à l'Homme et ce grâce à la prise en compte de la réalité de la clinique (âge et comorbidités).

Procédures

Après 3 mois d’administration d’un régime riche en protéines et en lipides et pauvre en glucides, les souris suivent un test d’intolérance au glucose (une injection de glucose intrapéritonéale et mesure de la glycémie). Cette première intervention sera réalisée dans un des 2 établissements utilisateur (EU1 et EU2). Puis, nous mimerons l’accident vasculaire cérébral en utilisant un modèle in vivo (chirurgie de 10 min) au sein de l'EU2. Les effets du régime sur la réponse après AVC seront analysés à J7 et J21 après la mise en place du modèle d’AVC à l’aide de tests de comportement.

Impact sur les animaux

L’âge (animaux âgés de plus de 6 mois) et le changement de l’alimentation induit une prise de poids (animaux de 35 – 60g). L’injection intrapéritonéale de glucose et la mesure de la glycémie sont également une nuisance pour l’animal. Le modèle d’AVC induit une douleur peropératoire et perte sensorimotrice. Une perte de poids et déshydratation peuvent également être attendues. Les tests comportementaux peuvent également être une source de stress pour les animaux.

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour récupérer les tissus et faire les analyses histologiques, protéiques et génomiques

Remplacement

Notre projet a démarré par des études in vitro rapportant les effets d’un modèle de stress métabolique sur les fonctions de cellules endothéliales de vaisseaux cérébraux, notre but est maintenant d’étudier l’ischémie cérébrale dans ce contexte de stress métabolique (comorbidités), qui met jeu en des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants puisque l'étude des conséquences métaboliques du vieillissement et son retentissement sur le vaisseau et sa fonctionnalité, avec ou sans traitement, ne peut s'envisager que dans un organisme entier.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant en accord avec notre expérience sur ces modèles et un calcul de puissance. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront une analgésie en pré- per- et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 48h. Avant la chirurgie, une anesthésie locale sera appliquée. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse). En post-chirurgie une attention particulière sera portée aux animaux jusqu’au réveil. Un suivi clinique et une surveillance des animaux seront réalisés à l’aide d’une grille de score avec la mise en place de points limites. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge et/ou mis à mort selon le score. Enfin, le bien-être animal sera aussi amélioré par l’enrichissement du milieu. Les cages seront pourvues de coton, bâtonnets de bois, igloo. Les souris sont placées dans une pièce au calme. Une chambre de réveil thermostatée sera utilisée en post-chirurgie. Le transport des animaux sera effectué en conditions ventilé et suivi de température.

Choix des espèces

Des études précédentes ont montré la pertinence du modèle souris pour étudier les maladies cardiovasculaires liées à l’âge et ses comorbidités. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’accident vasculaire cérébral (AVC) et pour lequel les outils sont nombreux pour le suivi de cette étude et ultérieurement pour le suivi de cette pathologie (anticorps, imagerie, modèles génétiquement modifiés). L’AVC étant essentiellement une pathologie de l’âge adulte. Le choix du modèle sera réalisé en utilisant des animaux âgés d’au moins 6 mois, âge permettant de mimer la physiologie du vaisseau à l’âge adulte. Pour prendre en compte les comorbidités liées au vieillissement, les animaux seront préparés par la mise en place d’un régime conduisant à des comorbidités en accord avec les recommandations données par le groupe de réflexion sur les modèles précliniques d’AVC. Les souris C57BL/6J utilisées pour cette étude seront âgées de 24 semaines (6 mois) avant les 3 mois de régime.