Recherche fondamentale

28 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ovariectomie sous anesthésie avec pose d'un implant d'estradiol, des traitements intranasaux au sulfate de zinc, la pose d'une éponge intravaginale pendant douze jours et trois mises à jeun de quinze heures, pour étudier comment les odeurs de béliers activent certains neurones du bulbe olfactif. Le porteur indique que ces interventions peuvent provoquer hématomes, douleurs et perte de poids. Il rattache l'étude à l'"effet mâle" utilisé en élevage et affirme qu'elle exige des "animaux entiers", sans substitution possible, les brebis étant euthanasiées pour prélever leurs tissus.

Objectifs

Chez les mammifères, les neurones exprimant la gonadolibérine (GnRH) ont un rôle déterminant dans le contrôle de la fonction de reproduction. En effet, ceux ci, permettent la stimulation des cellules de l'hypophyse et la sécrétion d'hormones gonadotropes (que sont les hormones lutéinisantes et folliculo-stimulantes). A leur tour, ces hormones vont agir sur les gonades (ovaires chez les femelles, testicules chez les mâles) pour stimuler la production de gamètes (ovules, spermatozoïdes) ainsi que la prodction d'hormones stéroidiennes (estradiol, progestérone), qui vont rétroagir au niveau central sur le cerveau formant ainsi une boucle de régulation. Il a été montré que, au niveau central, cette boucle de régulation est, chez les ovins, sensible à l'exposition aux odeurs des partenaires sexuels, permettant ainsi de stimuler également le comportement sexuel. Dans ce contexte, les neurones à GnRH de l'hypothalamus semblent être une cible de choix. Cependant, les neurones à GnRH sont également localisés dans le bulbe olfactif, et sont relativement peu étudiés dans le contexte des expositions olfactives de congénères. L'objectif de ce projet est donc de déterminer dans quelle mesure les neurones exprimant la GnRH et localisés dans le bulbe olfactif de la brebis sont stimulés par les odeurs de partenaires sexuels chez la brebis. Le projet se déroule dans 2 etablissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Le présent projet vise à étudier l'activation des neurones à GnRH présents dans le bulbe olfactif de brebis suite à l'exposition aux odeurs de mâles. Celui ci apportera une meilleure compréhension de l'implication de ces neurones dans l'effet mâle et donnera lieu à d'autres expérimentations visant à décortiquer le circuit neuronal contrôlant l'effet mâle.

Procédures

Sous anesthésie générale, les brebis seront soumises à des ovariectomies avec pose d'implant d'estradiol sous cutané ainsi que des traitements intranasaux au sulfate de zinc ou solution saline, des injections d'antibiotiques et d'anti-inflammatoires non stéroidiens. La procédure complète nécessite une anesthésie générale d'environ 30 minutes. Ces interventions seront menées dans l'établissement n°1 (EU1). Les animaux seront soumis à 3 mises à jeun de 15h maximum, à la pose d'une éponge intravaginale (procédure d'une durée inférieure à une minute) qui restera en place pendant 12 jours, et à des déplacements de quelques minutes pour le transfert d'un batiment à un autre. Les batiments étant très proches les uns des autres, la durée estimée des déplacement sera inférieure à 15 minutes. Ces interventions seront menées dans l'établissement n°2 (EU2).

Impact sur les animaux

A la suite de ces interventions, des hématomes, douleurs, perte de poids, de mobilité peuvent cependant être observées. Les différentes injections nécessaires aux anesthésies et les différentes étapes de transport peuvent engendrer du stress pour les animaux. La pose des éponges intravaginales peut aussi constituer un acte désagréable pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés et les tissus seront récupérés pour des études immunohistochimiques ultérieures

Remplacement

L'effet mâle est une pratique qui est utilisée en élevage pour induire l'activation de la fonction de reproduction en dehors de la saison sexuelle chez les animaux d'élevage. L'étude de l'effet mâle et des processus neurologiques mis en jeux nécessite, de fait, l'utilisation d'animaux entier et ne peux être substitué par une approche alternative. Le modèle ovin a été choisi ici, car c'est un modèle pour lequel cet effet a été le plus caractérisé. Les résultats acquis par le présent projet viendront donc s'ajouter à la masse de connaissances sur le sujet afin de nourrir la compréhension du phénomène physiologique et préciser le rôle des neurones à GnRH du bulbe olfactif dans le contrôle de l'effet mâle.

Réduction

Notre protocole expérimental a été mis en place de sorte à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. Aussi, une partie des animaux utilisés dans le cadre de ce protocole sont des animaux issus d'un protocole précédent. A la lumière des études publiées dans le domaine et de notre expérience, il nous sera nécessaire de constituer des groupes de 9 animaux par type d'exposition afin d'obtenir une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Nous raffinerons chaque procédure dans le but de réduire au maximum l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subie par les animaux. Les animaux seront hébergés en groupes lors des procédures afin de réduire le stress au maximum. Aussi, la priorité sera mise sur l'habituation des animaux au maniements et aux différents déplacements nécessaires à l'étude. Ces habituations permettrons de réduire le stress au maximum et d'obtenir des résultats beaucoup plus propres (le moindre stress pouvant induire une activation neuronale pouvant biaiser les résultats finaux). Le comportement (notamment l'isolement du groupe) et l'apparence des brebis sera suivi avec attention et les animaux seront pesés pendant 3 jours après l'ovariectomie, en pretant attention à ce que je lpourcentage de perte de poids ne dépasse pas 15%. Ce suivi permettra d'évaluer le bien-être des animaux et de décider de l'euthanasie ou le soulagement de la douleur des animaux suivant le stade d'atteinte des points limites. Dans tout les cas, la décision sera prise avec l'appui d'un avis vétérinaire. En cas d'hémorragie post-opératoire (muqueuses pâles), l'naimal sera réanesthésié et nous rechercherons le site hémorragique pour procéder à la suture vasculaire.

Choix des espèces

L'effet mâle est une pratique qui est utilisée en élevage pour induire l'activation de la fonction de reproduction en dehors de la saison sexuelle chez les animaux d'élevage. L'étude de l'effet mâle et des processus neurologiques mis en jeux nécessite, de fait, l'utilisation d'animaux entiers et ne peux être substituée par une approche alternative. Le modèle ovin a été choisi ici, car c'est un modèle pour lequel cet effet a été le plus caractérisé. Les résultats acquis par le présent projet viendront donc s'ajouter à la masse de connaissances sur le sujet afin de nourrir la compréhension du phénomène physiologique. L'étude nécessite des animaux ayant une fonction de reproduction bien développée et mature, donc des animaux ayant passé le stade de la puberté. Ainsi les brebis auront atteint l'âge adulte.

1 258 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale de bactéries provoquant une septicémie, puis des antibiotiques toutes les deux heures, pour tester l'efficacité de nouveaux traitements contre des Escherichia coli ultrarésistantes selon la quantité de bactéries. Le porteur décrit une septicémie apparaissant deux heures après l'inoculation et une surveillance par grille de score déclenchant la mise à mort dès l'atteinte d'un point limite. Il affirme que la complexité d'une infection in vivo rend le remplacement par des tubes à essai "non réalisable" et le passage par l'animal "indispensable".

Objectifs

Il est urgent de développer de nouvelles molécules antibiotiques pour lutter contre les bactéries ultrarésistantes. Parmi elles, Escherichia coli (E. coli) est la bactérie la plus fréquemment responsable d’infections urinaires et digestives et d’infections généralisées (septicémies) chez l’homme. Elle est aussi parmi les plus touchées actuellement par la résistance aux antibiotiques, avec parfois plus aucun antibiotique efficace (bactéries ultrarésistantes). De nouveaux antibiotiques ont été très récemment développés et ont montré leur efficacité pour tuer certaines bactéries ultrarésistantes. Ces antibiotiques ont montré leur efficacité au laboratoire dans des tubes à essai contre des souches de E. coli ultrarésistantes, mais chez l’homme, faute de données d’efficacité suffisamment nombreuses et du fait d’échecs de traitement rapportés chez certains malades, ces antibiotiques ne peuvent être utilisés qu’en dernier recours et lorsque le recours aux autres options disponibles n’est pas envisageable. On dispose actuellement de très peu de travaux de recherche sur l’utilisation de ces nouveaux antibiotiques, notamment peu de choses sur leur efficacité quand il y a une quantité importante de bactéries (appelé « inoculum important »). L’étude de l’efficacité des antibiotiques sur des quantités de bactéries différentes se fait au laboratoire « in vitro » c’est-à-dire dans des tubes à essai, mais l’utilisation de modèles vivants sont pour l’instant indispensables pour prendre en compte aussi les défenses immunitaires des êtres vivants et des paramètres de distribution dans le corps de l’antibiotique. C’est pourquoi avant de les tester chez l’homme il est nécessaire de faire des expériences chez l’animal, en l’occurrence la souris. L’objectif de notre travail est l’analyse de l’efficacité de ces nouveaux antibiotiques sur des quantités de bactéries différentes (ou inoculum différent) pour s’assurer qu’ils restent efficaces même pour tuer de grandes quantités de bactéries. Nous utilisions pour ces expériences un modèle d’infection intra abdominale de la souris qui provoque une septicémie et avec lequel on peut faire varier la quantité de bactéries. L’efficacité des antibiotiques sera évaluée en termes de survie des animaux infectés et nombre de bactéries présentes apres traitement au niveau de la rate des animaux (qui correspond à ce qui se trouve dans le sang).

Bénéfices attendus

Les résultats de ce travail pourront permettre de mieux définir les conditions de l’utilisation de ses molécules chez l’Homme et comprendre pourquoi parfois elles ne marchent pas.

Procédures

Les souris seront infectées par une injection dans le ventre (intra péritonéale) à l'aide d'une aiguille fine de 250μL contenant un mélange de bactéries sur animal vivant non anesthésié (durée du geste environ 5 secondes) et traitées par antibiotiques par une injection sous la peau du cou de 0,2mL toutes les deux heures (durée du geste 5 secondes). Elles seront surveillées de façon très rapproché puis euthanasiées si elles montrent le moindre signe de souffrance avant la fin de l'expérimentation. Aucun prélèvement ne sera réalisé sur souris vivante. Un prélèvement stérile de liquide péritonéal (2mL) et de la rate seront réalisés après euthanasie de la souris. Un prélèvement sanguin (2mL) par ponction intra-cardiaque sera également réalisé après l’euthanasie.

Impact sur les animaux

Ce modèle représente un modèle de sévérité modérée d’infection péritonéale bactérienne avec septicémie qui apparait à partir de 2h après l’inoculation bactérienne. Aucune douleur n’est à attendre, en revanche les souris peuvent être stressées, avec des signes tels que les poils hérissés et une fatigue.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées à la fin de l'experimentation ou avant en cas d'atteinte d'un point limite pour limiter au maximum des souffrances inutiles. La durée totale est de 30h au maximum (2h infection + 24h traitement + 4h post traitement). Tous les animaux seront mis à mort, car nous aurons à faire des prélèvements des organes et du sang, qui ne peut se faire sur animal vivant.

Remplacement

L’étude de l’efficacité des antibiotiques sur des quantités de bactéries différentes se fait au laboratoire « in vitro » c’est-à-dire dans des tubes à essai, mais l’utilisation de modèles vivants sont pour l’instant indispensables pour prendre en compte aussi les défenses immunitaires des êtres vivants et des paramètres de distribution dans le corps de l’antibiotique. C’est pourquoi, avant de les tester chez l’homme, il est nécessaire de faire des expériences chez l’animal. En effet, la complexité d'une infection in vivo rend pour l’instant le remplacement de ce modèle expérimental par des modèles in vitro (tube à essai) non réalisable.

Réduction

De nombreuses analyses seront réalisées en amont pour réduire les conditions testées et les animaux utilisés. Les analyses déjà réalisées au sein de l’équipe seront une base pour cibler les doses des traitements antibiotiques nécessaires, permettant de limiter le nombre d'animaux utilisés. Toutes les molécules testées sont des antibiotiques. Pour le cefiderocol, une étude de dose (pharmacocinétique) sera nécessaire car cette molécule n’a jamais été utilisée dans le modèle ; en revanche pour l’avibactam et aztreonam l’étude a déjà été réalisée dans notre laboratoire et ne sera donc pas refaite, pour limiter le nombre de souris utilisées. Des souris dites "contrôles", c'est a dire traitées avec des antibiotiques dont on sait qu'ils sont efficaces, seront utilisées, mais ces contrôles ne seront pas répétés à chaque experimentation pour limiter le nombre de souris utilisées. Les organes (rate, liquide péritonéal) seront congelés et conservés à -80°C pour permettre une analyse ultérieure en cas de besoin sans devoir recourir à nouveau à l'expérimentation chez la souris.

Raffinement

En ce qui concerne le raffinement, il sera obtenu grâce au respect d’un délai d’au moins 72h entre l’arrivée des souris au laboratoire et le début de l’expérimentation animale, le respect des conditions optimales d’hébergement des souris en animalerie en portoirs ventilés, c'est à dire en cages adaptées bien ventilées (5 souris par cage) et la surveillance des animaux toutes les 2 heures pendant toute l’expérimentation, avec accès facile à l’eau et à la nourriture. L’apparition de signes chez l’animal de souffrance avec un score de points limites sera surveillée de près. Les délais entre l’infection par les bactéries et le traitement antibiotique sont réduits à deux heures pour limiter le risque de souffrance. L’euthanasie sera programmée 4h après la fin du traitement antibiotique qui dure 24 h, sans attendre de décès spontané, ou avant si des signes de souffrance apparaissent (torpeur, poil hérissé ...). Un score de points a été établi, prenant en compte 3 paramètres, avec à chaque fois une gradation de 0 à 4: la posture normale voutée, voutée+ et voutée ++, la mobilité: normale, altérée, altérée + et prostrée et le poils: sans atteinte, hérissés, hérissés + et hérissés ++. Le point limite est atteint si la somme des points est > ou = à 6 ou si le score de 3 est atteint pour la mobilité ou la posture. En cas d’atteinte du point limite, l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

La souris est un animal vertébré dont l’anatomie et la physiopathologie de l’infection intrapéritonéale sont suffisamment proches de celle de l’homme pour autoriser l’étude des thèmes mentionnés plus haut. La souris est l’espèce la plus utilisée par la communauté scientifique internationale dans la thématique de l’infection intra-péritonéale. Les souris utilisées ont 8 semaines (environ 25 grammes). Ce sont des animaux adultes pour utiliser des souris de poids suffisant.

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié subit une ischémie oculaire chirurgicale de 90 minutes par augmentation de la pression, avec injections virales intravitréennes, tests visuels et électrorétinogrammes, pour étudier le rôle d'un récepteur des cannabinoïdes dans la protection des neurones de la rétine. Le porteur indique que la manipulation de l'œil peut provoquer douleurs, cataractes et baisse de l'acuité visuelle. Il affirme qu'une caractérisation in vitro a été menée mais que le mécanisme ne peut être étudié que sur un modèle de lésion in vivo, les yeux étant prélevés après la mise à mort.

Objectifs

La rétine, située dans l'œil, transforme la lumière en signaux électriques pour nous permettre de voir. Bien qu'elle se trouve en périphérie, la rétine fait partie du système nerveux central, composé de neurones et de cellules gliales, qui soutiennent les neurones. La perte de ces neurones peut entraîner une cécité irréversible. Le glaucome et la rétinopathie diabétique, qui sont les principales causes de cécité dans le monde, surviennent lorsque les neurones meurent à la suite d'une augmentation de la pression ou de l'obstruction d'un vaisseau. Les traitements actuels atténuent les symptômes sans se concentrer sur la protection des neurones. Des études montrent que certains composés dérivés du cannabis peuvent contribuer à sauver ces cellules en agissant sur des récepteurs spécifiques de l'organisme. Ce projet vise à comprendre comment cela fonctionne, offrant ainsi un espoir pour le traitement des maladies oculaires.

Bénéfices attendus

L'ischémie oculaire, présente dans des maladies rétiniennes telles que le glaucome et le diabète rétinopathique, provoque la mort des cellules responsables de la transmission visuelle au cerveau, entraînant une cécité incurable. Actuellement, le glaucome est la principale cause de cécité irréversible, touchant 3,5% des personnes de 40 à 80 ans. Un défi majeur est que la perte de vision commence en périphérie du champ visuel, souvent imperceptible, d'où son surnom de "maladie silencieuse". Lorsqu'elle est détectée, environ la moitié des neurones sont déjà perdus, irrécupérables comme dans la maladie d'Alzheimer. Les cellules de Müller, abondantes dans la rétine, jouent un rôle clé. Normalement, elles sécrètent des facteurs protégeant les neurones rétiniens, mais en cas de dommages, ces facteurs altérés déclenchent la mort des cellules ganglionnaires de la rétine, induisant la cécité glaucomateuse. Ce projet vise à élucider le rôle neuroprotecteur des cannabinoïdes dans la rétine pour développer des traitements sauvant les cellules ganglionnaires de la rétine de la mort en cas de dommages rétiniens, notamment l'ischémie oculaire. Avec de nombreux patients affectés, des traitements efficaces auront un impact social et économique majeur, améliorant la qualité de vie et économisant des ressources. À court terme, le projet permettra d'explorer le système endocannabinoïde rétinien. Le récepteur cannabinoïde, crucial dans divers processus physiologiques et pathologiques, reste peu étudié dans l'organe visuel. Bien que la fonction neuroprotectrice des cannabinoïdes dans la rétine soit établie, le mécanisme précis reste inconnu. Comprendre cette neuroprotection permettrait le développement de traitements spécifiques pour les maladies cellules ganglionnaires de la rétine-induites, offrant un espoir crucial pour ceux confrontés à une cécité irréversible.

Procédures

Ischémie oculaire (90min). Tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale visant à provoquer une ischémie oculaire. La moitié d'entre eux appartiendra au groupe sham (seul l'œil sera canulé mais la pression ne sera pas augmentée) et l'autre moitié appartiendra au groupe ischémie oculaire (la pression sera augmentée). Cette procédure ne sera réalisée qu'une seule fois sur chaque animal et l'opération durera 90 minutes. Injection virale intravitréenne. A réaliser sur certains génotype d´animaux. Elle sera réalisée une seule fois et la procédure durera moins de 15 minutes. Test comportemental visuel (40min) et électrorétinogramme (25min). À effectuer sur tous les animaux à deux reprises : en préopératoire et en postopératoire. Traitement local aux cannabinoïdes (7jours) . À effectuer sur tous les animaux une fois par jour pendant 7 jours après l'opération. Traitement pharmacologique (8jours). À administrer à certains animaux, une fois par jour pendant 8 jours.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales prévues sont généralement douces, à l'exception de l'ischémie oculaire, et ne devraient pas causer d'inconfort ou d'effets indésirables significatifs. Les procédures peuvent être regroupées en fonction de la similitude des effets indésirables. L'ischémie oculaire aiguë et l'injection intravitréenne sont des procédures chirurgicales au cours desquelles la chambre antérieure et la chambre postérieure de l'œil seront manipulées, respectivement. Les deux procédures ainsi que l'électrorétinogramme seront effectués sous anesthésie, ce qui pourrait entraîner une hypothermie. En outre, la manipulation de l'œil peut provoquer des douleurs, des cataractes et une baisse de l'acuité visuelle. Le traitement intrapéritonéal peut provoquer un stress aigu chez les animaux injectés. Enfin, les tests comportementaux visuels peuvent être stressants pour les animaux, même s'ils ont été habitués à ces tests. Afin de minimiser les effets négatifs des tests effectués, toutes les précautions possibles doivent être prises pour assurer le bien-être des animaux tout au long de l'expérience.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort et les yeux seront récupérés.

Remplacement

D'un point de vue méthodologique, nous nous sommes engagés à respecter les règles de remplacement, de réduction et de raffinement. Par conséquent, nous avons effectué une première caractérisation du système in vitro, où l'expression du récepteur CB1 dans les cellules d'intérêt : les cellules de Müller et les cellules ganglionnaires de la rétine a été testée. En outre, la littérature et l'expérience antérieure des deux groupes démontrent le rôle neuroprotecteur des cannabinoïdes dans un modèle de lésions. Cependant, le mécanisme détaillé par lequel les cannabinoïdes sauvent les cellules ganglionnaires de la rétine de la mort n'a jamais été étudié. Malheureusement, cette question ne peut être résolue qu'avec un modèle de dommage in vivo, car il n'est pas possible de reproduire in vitro la complexité des interactions rétiniennes d'une part et, d'autre part, l'ischémie oculaire due à l'augmentation de la pression intraoculaire.

Réduction

Afin de respecter le principe de réduction, nous nous engageons à utiliser le nombre minimum d'animaux strictement nécessaire pour tirer une conclusion statistiquement valable de cette population. Le laboratoire collabore avec des experts des pathologies oculaires et en particulier des maladies de la rétine, et possède donc une grande expérience dans leur étude et dans la création de modèles animaux de pathologies oculaires telles que l'ischémie. Lors d'une expérience pilote réalisée dans son laboratoire, le protocole d'ischémie oculaire a été affiné, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux à utiliser. Les groupes expérimentaux ne doivent pas dépasser 12 animaux. Ce nombre de souris est le minimum requis pour obtenir une signification statistique et est cohérent avec les études précédentes utilisant des méthodologies similaires. Toutefois, si nos premières expériences démontrent qu'il est possible de réduire le nombre de souris, ce nombre sera réduit en conséquence. Ce nombre d'animaux/groupe a été fixé (i) par des calculs de puissance qui nous permettraient d'obtenir une différence significative pour les différentes variables d'intérêt à évaluer dans l'étude et de rejeter une hypothèse nulle, et (ii) en se référant à des publications dans le domaine (iii) en tenant compte de la variabilité que nous trouvons habituellement dans le comportement d'intérêt. En outre, nous essaierons de minimiser le nombre d'animaux en étudiant le comportement visuel avant et après le dommage et après le traitement. Le traitement statistique des données suit les conventions traditionnelles dans ce domaine. Les méthodes d'analyse statistique sont choisies de manière à minimiser le nombre d'animaux par groupe.

Raffinement

Les animaux de cette étude bénéficient d'une surveillance constante par un personnel qualifié et l'expérimentateur. Hébergées dans des cages collectives, elles ont accès à la nourriture et à l'eau, assurant leur bien-être physique. À leur arrivée à l'animalerie, elles ont une semaine pour s'acclimater au cycle jour/nuit.Tous les animaux seront opérés soit dans le groupe sham, soit dans le groupe ischémie oculaire. À cette fin, une anesthésie générale est appliquée. La température corporelle est surveillée, évitant l'hypothermie avec une couverture thermique. Avant l'opération, de l´analgésique est injectée aux animaux pour atténuer la douleur causée par l'opération. Pendant la chirurgie, l'œil opéré est maintenu humide avec du sérum physiologique. Après, une anesthésie locale est appliquée et elles sont logées dans des cages collectives enrichies. Une injection intrapéritonéale de médicament anti-inflammatoire est administrée pour prévenir la douleur et répétée pendant deux jours. Le suivi quotidien rigoureux par du personnel qualifié et l'expérimentateur permet de détecter toute douleur ou détresse. Le poids est enregistré à l'arrivée et une fois par semaine, avec des mesures quotidiennes les trois jours suivant l'opération. Une perte de poids excessive sur deux jours ou des signes graves déclenchent des mesures appropriées. Les animaux sont habitués aux procédures pour minimiser la souffrance. Des précautions sont prises pour assurer le respect maximal des procédures, garantissant le bien-être et la santé des animaux tout au long de l'expérimentation. Pour toutes les procédures, des seuils ont été fixés pour arrêter la procédure si le bien-être de l'animal ne peut être assuré.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal privilégié en raison de ses nombreux avantages. Les circuits neuronaux de la rétine sont conservés entre les rongeurs et les humains, assurant la pertinence des résultats obtenus. De plus, le système visuel est bien caractérisé fonctionnellement et histologiquement, facilitant l'affinement des procédures et la comparaison des résultats avec la littérature existante. La disponibilité de souris transgéniques CB1 permettra d'explorer en détail le mécanisme d'action des cannabinoïdes dans la neuroprotection rétinienne, en identifiant les cellules cruciales pour cette protection. Enfin, les installations sont équipées pour l'étude systématique des souris, garantissant leur bien-être conforme aux normes requises. Les souris utilisées seront des souris adultes âgées de 7 à 16 semaines. Le modèle d'ischémie et son traitement seront réalisés sur des animaux adultes car l'organe visuel est entièrement développé pour l'étude.

615 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par différentes souches de trypanosomes puis suivies par des prises de sang quotidiennes, pour comparer le pouvoir pathogène du parasite responsable de la trypanosomose animale africaine. Le porteur indique que l'infection peut provoquer perte de poids, poil hirsute, prostration et parfois la mort de l'animal. Il affirme que la culture in vitro ne permet pas d'étudier le comportement du parasite dans le sang circulant et que le passage par la souris est donc "indispensable".

Objectifs

L’élimination de la trypanosomose animale africaine (TAA) reste encore aujourd’hui un challenge, et ce à plusieurs titres. Effectivement, ces maladies parasitaires représentent un véritable fléau en termes de santé pour le bétail et constituent une forte contrainte au développement de l’élevage et de l’agriculture en Afrique. Dans le but d’enrayer l’infection due aux trypanosomes, nos recherches visent à étudier le pouvoir pathogène du parasite en identifiant quels sont les gènes responsables de la mise en place et du développement de la maladie chez son hôte. Ces découvertes pourraient permettre d’améliorer le diagnostic, de développer de nouveaux traitements et d’envisager une stratégie vaccinale. L’objectif de ce projet est d’étudier la fonction des gènes identifiés en comparant le comportement de plusieurs souches de trypanosomes chez la souris.

Bénéfices attendus

Dans un contexte d’amélioration des outils de diagnostic actuels et l’identification de molécules à visée thérapeutique et vaccinale, une meilleure connaissance de la biologie du parasite est nécessaire et passe par l’étude de gènes impliqués dans le processus d’infection chez son hôte. L’étude de ces gènes nous renseigne sur leur rôle dans les mécanismes de l’infection ainsi que sur leur implication dans les phénomènes mis en place par le trypanosome pour échapper au système de défense de l’hôte. Le suivi des infections sur souris nous permettra d’étudier le rôle que peuvent avoir ces gènes cibles dans le pouvoir pathogène du parasite et orientera nos recherches vers l’étude de nouvelles cibles diagnostiques, thérapeutiques et vaccinales.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections de parasites une fois en début d’expérimentation (1 min/ injection). Chaque jour pendant la durée de l’essai, une prise de sang d’un volume de maximum de 5 µl sera réalisée (30 sec /prélèvement) pour déterminer la parasitémie. De la même façon, un volume de sang de 70 µL sera prélevé avant infection et deux fois au cours de l’expérimentation (3 min / prélèvement) pour mesurer l’hématocrite. Les animaux seront également pesés quotidiennement avant chaque prélèvement de sang (1 min / pesée). En fin d’expérimentation, les animaux seront anesthésiés pour pouvoir prélever un plus grand volume de sang (~ 1,5 mL) (7 min / prélevement).

Impact sur les animaux

Les infections par les trypanosomes animaux peuvent induire chez la souris des effets indésirables de part le développement des parasites dans le sang. Ces effets sont variables d’une souche de trypanosomes à l’autre. Cela peut être par exemple une perte de poids, un poil hirsute, une prostration ou une légère perte de mobilité. Ils ne sont pas systématiques mais peuvent parfois entrainer la mort de l’animal.

Devenir

Les animaux ne pouvant pas être réutilisés pour d’autres projets ou procédures, ils seront euthanasiés sous anesthésie gazeuse à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Pour avoir une vue d’ensemble des mécanismes mis en place par le parasite lors d’une infection et afin de tester son pouvoir pathogène, le remplacement des animaux est impossible. Même si la culture in vitro de trypanosomes existe, elle ne nous permet pas d’étudier le comportement d’un tel parasite dans le sang circulant. Le passage sur la souris est donc indispensable pour réaliser ces études.

Réduction

Le modèle souris/trypanosomes est déjà utilisé dans de nombreuses études avec un niveau de reproductibilité suffisant pour réduire le nombre d’animaux tout en permettant l’exploitation statistique des données générées.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une observation quotidienne afin d’évaluer un changement de comportement anormal. Ils seront maintenus en groupe d’au moins 2 individus et des mesures d’enrichissement du milieu telles que l’utilisation de tunnels et/ou carrés de cellulose destinées à améliorer les conditions de vie et à réduire le stress des souris seront mises en place. De plus, un tapis chauffant sera utilisé lors des anesthésies afin de compenser la chute de température interne des animaux

Choix des espèces

La souris est une espèce classiquement utilisée pour la multiplication des souches de trypanosomes. Elles développent une infection comprise entre 3 et 10 jours post-infection en moyenne en fonction de la souche parasitaire utilisée. Les souris en expérimentation sont des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines pour permettre une récolte suffisante de parasites à partir de prélèvements sanguins.

108 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une mutation qui reproduit le syndrome de Stormorken et subissent des sections répétées du bout de la queue pour mesurer le temps de saignement, ainsi que des prélèvements sanguins à la veine cave, pour comprendre le phénotype hémorragique de la maladie. Le porteur précise que la lignée développe un déficit musculaire et hématologique mortel vers 32 semaines, mais fixe les procédures avant 20 semaines. Il qualifie le modèle murin d'"irremplaçable" au motif que l'hémostase ne serait pas modélisable in vitro.

Objectifs

Les plaquettes sont des acteurs essentiels du maintien de l’intégrité vasculaire. Elles sont les premiers éléments cellulaires à intervenir dans l’arrêt du saignement lors d’une blessure vasculaire en participant à la formation d’un thrombus, ceci constituant l’hémostase physiologique dite primaire. Des problèmes de saignements plus ou moins graves peuvent être dus à des défauts de production et de fonctions plaquettaire. La mutation gain de fonction de la protéine STIM1 R304W/+est associée à une anomalie de l'homeostasie calcique intra-cellulaire dont les conséquences sont une modification de la production et de la fonctionalité des plaquettes. Notre étude vise à décrypter les mécanismes moléculaires et cellulaires permettant de comprendre le phénotype hémorragique dû à cette mutation de STIM1.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'un point de vue fondamental de caractériser les mécanismes moléculaires et cellulaires du role de STIM1 dans la production et la fonction plaquettaire. D'un point de vue clinique, ce projet permettra de comprendre l'évolution de la maladie hémorragique chez l'homme.

Procédures

Une coupure (de 3 secondes) de 3 mm du bout de la queue de la souris anesthésiée par injection IP (intra-péritonéale) est réalisée. Le temps d'arrêt de saignement (évalué à 50μl maximum de sang avant l’arrêt du saignement) sera évalué jusqu’à 20 minutes maximum. 10 jours après, un prélèvement sanguin est réalisé au niveau de la veine cave inférieure après anesthésie par injection IP . La prise de sang dure 1-2 minutes et un volume de sang de 800 à 1000 μl est prélevé. La souris est anesthésiée par anesthésie gazeuse et injectée en IP avec un anti-douleur pour un prélèvement sanguin à la queue (environ 30μl, durée de 1 minute) suite à une coupure de 1 mm (de 3 secondes). Nous réalisons ensuite une injection IP du composé d’intérêt inoffensif et non irritant. Six prélèvements sanguins à la queue (environ 30μl, durée de 1 minute), suite à une coupure de 1 mm (durée de 3 secondes) est réalisé après anesthésie gazeuse et injection d’un anti-douleur sur une durée de 280h. 10 jours après, un prélèvement sanguin est réalisé comme décrit plus haut. Une injection d’un composé inoffensif et non-irritant est réalisée en intra-veineux pendant 10 secondes sur souris anesthésiée par anesthésie gazeuse. 1 heure après l’injection, puis toutes les 24 heures pendant 4 jours, un prélèvement sanguin à la queue (environ 30μl, durée de 1 minute) par coupure de 1 mm (durée de 3 secondes), est réalisé sur l’animal sous anesthésie gazeuse et injecté en intra-péritonéal avec un anti-douleur. 10 jours après, un prélèvement sanguin est réalisé comme décrit plus haut.

Impact sur les animaux

Le modèle murin génétiquement modifié STIM1 R304W/+ qui mime la pathologie humaine présente un déficit musculaire et hématologique qui entraine la mort à partir de 32 semaines de vie. Cependant toutes les procédures expérimentales seront réalisées avant 20 semaines. Pour les procédures expérimentales sur animaux vivants, les composés injectés ne sont pas irritables ou/et délétères (anesthésiques, anti-douleurs et anticorps). Les produits injectés ont déjà été utilisés par différents laboratoires, dont le nôtre, et n'ont montré aucun effet indésirable. Ces injections n'induisent qu'une légère douleur au moment de la piqûre et un stress qui ne durent que 5 à 10 secondes.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort car toutes les procédures nécessitent des prélèvements de sang et/ou d'organes.

Remplacement

Le recours au modèle murin est irremplaçable pour le déroulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexicité des mécanismes mis en jeu dans un contexte physiopathologique intégré d’hémostase et thrombose non modélisable par des approches in vitro et (ii) l'utilisation de modèles murins génétiquement modifiés.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum : en suivant des protocoles expérimentaux déjà établis dans le laboratoire, en tenant compte d’expériences déjà réalisées dans l’équipe qui nous ont montré que nous pouvons obtenir des résultats statistiquement corrects en faisant des groupes de 12 souris pour chaque procédure réalisée. Nous nous limiterons aux seules expériences considérées comme absolument indispensables en évitant la répétition d’études antérieures déjà réalisées et/ou publiées et en fonction des résultats obtenus au cours des différentes procédures expérimentales. Nous obtiendrons dans un premier temps des résultats préliminaires sur 1 lot de 4 animaux nous permettant de définir s'il peut exister des différences statistiquement quantifiables entre les différents groupes, qui si elles existent, seront statistiquement affinées avec des groupes de 12 souris par procédure. L'approche statistique permettra d'analyser les différences obtenues entre groupes.

Raffinement

Les souris ont un accès illimité à la nourriture et boisson avec du papier sopalin, du carton et/ou des cubes de bois dans la cage. Une observation quotidienne des souris est réalisée par les zootechniciens ou les responsables du projet en terme de comportement général (prostration, activité anormale, isolement) et d'apparence (poils hérissés, plaies/blessures, amaigrissement anormal). Toutes les personnes impliquées dans ce projet (zootechniciens et les responsables de projet) sont formées et qualifiées au respect des conditions du bien-etre animal et diplômées en expérimentation animale. Toutes les procédures expérimentales se font sur souris anesthésiées et analgésiées sauf pour les injections intrapéritonéales qui sont des gestes rapides de moins de 10 secondes sur animaux vigiles. Un contrôle permanent de l'état d'anesthésie des souris sera réalisé par les expérimentateurs tout au long de la procédure. Tout au long des procédures, les animaux seront surveillés par les zootechniciens et les expérimentateurs. En cas de blessure, l'animal sera isolé et la blessure sera nettoyée 2 fois par jour pour favoriser une cicatrisation propre. Une mise à mort rapide de la naissance à la mort ou lors d'une procédure expérimentale sera effectuée conformément à une grille de score définie.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris car les mécanismes d’hémostase et thrombose sont transposables à l'homme mais aussi car nous disposons de modèles murins génétiquement modifiés invalidés pour nos protéines d'intérêt car il n'existe pas à ce jour d'inhibiteurs pharmacologiques. Stade adulte de 8 à 20 semaines car de part et d'autre de cette fourchette d'âge les réponses fonctionelles en hémostase et thrombose peuvent être modifiées.

1 344 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des distensions colorectales par ballonnet répétées et, dans cet établissement, des séances d'imagerie IRMf pour mesurer la réponse cérébrale à la distension, dans un modèle de stress reproduisant l'hypersensibilité viscérale du syndrome de l'intestin irritable. Le porteur signale que la distension peut provoquer une diarrhée et parfois une perforation du colon. Il conclut, après des essais sur organoïdes humains, que le recours à l'animal reste "incontournable" au motif que la nociception mobiliserait l'"organisme entier".

Objectifs

La douleur viscérale chronique atteignant le tractus intestinal est communément retrouvée chez les patients SII (atteints de syndrome de l’intestin irritable). Comprendre les mécanismes de régulation de la nociception (douleur) est indispensable au développement de nouvelles cibles thérapeutiques pour soulager la douleur nociceptive. A ce jour, il a été mis en évidence le rôle de médiateurs présents au niveau du tissu intestinal modulant l’hyperexcitabilité des entéro-neurones et responsables de douleur nociceptive. Comprendre comment ces médiateurs sont modulés au niveau de la barrière intestinale est essentiel pour palier l’hypersensibilité viscérale. Le stress est un facteur important prédisposant à une hypersensibilité viscérale, incluant chez les patients SII. Notre projet vise (1) à évaluer l’effet du stress sur la production et l’activation de médiateurs d'intérêt au niveau de l’intestin et de leur contribution au développement d’une hypersensibilité viscérale ; et (2) à moduler leur activité par l’utilisation de molécules pharmacologiques afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour la douleur viscérale. Un modèle rat est choisi dans cette étude car c’est le modèle animal de référence pour étudier le stress psychologique et ses effets, notamment sur la douleur viscérale. Ce projet se déroulera dans trois établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouvelles molécules pharmacologiques afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques contre la douleur viscérale

Procédures

Dans l'EU 1/3 et 3/3: Un minimum de 3-4 séries de distensions colorectales sera réalisé (2-3 séries de distensions «basales» et 1 série post traitement) par animal et espacées de minimum 3 jours pour les basales. Si les séries de distensions colorectales «basales» (sans traitement) présentent une variabilité importante, nous pourrons décider d’augmenter leur nombre. Nous pourrons aussi décider d’évaluer la reproductibilité des séries de distensions colorectales au cours du temps (sans traitement) sur le même animal ainsi que l’effet de la distension sur les paramètres protéolytiques (mesurés dans les lavages coliques et selles). Ainsi, au maximum, nous pourrons faire jusqu’à 6 séries de distensions colorectales par animal (la durée d'une série de distensions est de 1h15 et inclue 30 min d'habituation au ballon, c'est à dire que le ballon n'est pas gonflé). Des administrations de molécules pourront être effectuées (par voie intrapéritonéale, intra colique, orale, sous cutanée) avant la dernière série de distensions colorectales. Administrations intrapéritonéales et intra coliques de molécules (2 par animaux). Lavages colique (maximum 3 par rat). Dans l'EU 2/3: Nous pourrons évaluer la réponse du système nerveux central (cerveau) en réponse à la distension colorectale par imagerie IRMf (30 min-1h par animal)

Impact sur les animaux

Le modèle de stress n'induit pas de douleur spontanée mais une hypersensibilité viscérale lors de la distension colorectale, ainsi qu’une diarrhée dès 15 min post traitement. La motilité et la perméabilité intestinales sont modifiées dès 15 min, mais elles sont toutes deux restaurées entre 1h à 2h post-traitement. La distension colorectale ne cause pas de dommages tissulaires et donc peut être reproduite sur les animaux au cours du temps. Cependant, un effet indésirable suite à la distension peut être une perforation du colon mis en évidence par la présence de sang sur le ballonnet et/ou au niveau anal.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de chaque procédure car des prélèvements de tissus et d'organes doivent être réalisés

Remplacement

La douleur chronique intestinale, dont souffrent les patients atteints de syndrome de l'intestin irritable (SII), peut affecter fortement leur condition de vie. Cependant, les causes de cette douleur chronique sont encore mal comprises, notamment si c'est la perception de la douleur en centrale qui est altérée, et/ou bien si c'est la sensibilisation des neurones en périphérique et/ou en central qui est perturbée. Comprendre les mécanismes de régulation de la nociception est ainsi indispensable au développement de nouvelles cibles thérapeutiques pour soulager la douleur nociceptive chronique. In vitro, il est possible d’étudier des échantillons coliques provenant de patients SII (biopsies, selles, organoïdes en culture...), nous avons par exemple montré dans des études préliminaires que le traitement d’organoïdes intestinaux par des hormones de stress modifiait la balance protéolytique. Suite à la preuve de concept in vitro d’un effet des hormones de stress sur les médiateurs d’intérêt au niveau de l’intestin (techniques de culture d’organoïdes intestinaux), l'expérimentation animale est nécessaire pour valider ces résultats, c’est a dire pour évaluer la conséquence de l’altération de ces facteurs sur la douleur viscérale (en condition de stimulation nociceptive c'est à dire par exemple en réponse à la distension colorectale). L’étude des mécanismes de nociception requiert une réaction intégrée de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans son intégralité. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l'expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour les douleurs viscérales.

Réduction

La technique de mesure de la douleur utilisée ici peut être reproduite sur un même animal au cours du temps et peut être couplée à l’utilisation d’autres méthodes de suivi clinique non-invasives (suivi de poids, consistance des selles …) ce qui permet d’observer et de suivre au cours du temps un seul animal, (par opposition à d’autres méthodes d’évaluation de la douleur viscérale comme par exemple l’implantation d’électrodes au niveau des muscles abdominaux par chirurgie) permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux. De plus, les résultats de distension obtenus peuvent être utilisés pour comparer plusieurs groupes entre eux (exemple: groupe contrôle versus traité) ainsi que pour comparer le même animal au cours du temps (exemple: série de distensions avant traitement versus série de distensions après traitement). Cependant, il existe de la variabilité de la réponse à la distension au sein du même animal au cours du temps et entre les animaux entre eux. Cette variabilité peut être associée notamment au stress dû à la distension, ainsi, pour réduire cette variabilité au maximum, nous habituons les animaux avant la première série de distensions et nous reproduisons les distensions au sein du même animal plusieurs fois afin de réduire le stress et donc la variabilité intra et inter-individus et en conséquence le nombre d’animaux requis pour une étude. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale.

Raffinement

Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, un enrichissement sera rajouté aux animaux. A savoir, des tunnels et des carrés de coton pur ou du papier absorbant permettant aux animaux de faire une nidation. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Par exemple nous avons mis en place une période d’habituation des animaux pendant 1h durant les 3 jours précédant la première série de distensions (habituation au manipulateur et habituation aux tubes de contention) afin de réduire le stress. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par semaine en plus de la surveillance quotidienne réalisée par les zootechniciens. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. De plus, les personnes responsables du projet et expérimentateurs ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; et en particulier aux techniques spécifiquement utilisées ici (distension colorectale, injections intra coliques). L’apprentissage et la maitrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences des personnes concernées. Transport de moins de 50 km. Nous nous assurerons que les animaux sont protégés en permanence des intempéries, des rayons du soleil, des températures extrêmes (climatisation du véhicule 19-21 degrés), conduite souple, limitation au bruit

Choix des espèces

Le rat est un modèle communément utilisé dans les études de stress psychologique et de mesure de douleur viscérale, il a ete choisi par rapport a une publication de reference du modele cortagine Les rats seront ages d'au moins 7 semaines car nous souhaitons utiliser des animaux adultes et matures et pesant minimum 200g.

1 344 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent jusqu'à six séries de distensions colorectales par ballonnet, des administrations de molécules et des lavages coliques, dans un modèle de stress destiné à provoquer une hypersensibilité viscérale imitant le syndrome de l'intestin irritable. Le porteur indique que la distension peut entraîner une diarrhée et, comme effet indésirable, une perforation du colon repérée au sang sur le ballonnet. Après une preuve de concept sur organoïdes intestinaux humains, il conclut que le recours à l'animal reste "incontournable" parce que la nociception exigerait une réaction de l'"organisme entier".

Objectifs

La douleur viscérale chronique atteignant le tractus intestinal est communément retrouvée chez les patients SII (atteints de syndrome de l’intestin irritable). Comprendre les mécanismes de régulation de la nociception (douleur) est indispensable au développement de nouvelles cibles thérapeutiques pour soulager la douleur nociceptive. A ce jour, il a été mis en évidence le rôle de médiateurs présents au niveau du tissu intestinal modulant l’hyperexcitabilité des entéro-neurones et responsables de douleur nociceptive. Comprendre comment ces médiateurs sont modulés au niveau de la barrière intestinale est essentiel pour palier l’hypersensibilité viscérale. Le stress est un facteur important prédisposant à une hypersensibilité viscérale, incluant chez les patients SII. Notre projet vise (1) à évaluer l’effet du stress sur la production et l’activation de médiateurs d'intérêt au niveau de l’intestin et de leur contribution au développement d’une hypersensibilité viscérale ; et (2) à moduler leur activité par l’utilisation de molécules pharmacologiques afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour la douleur viscérale. Un modèle rat est choisi dans cette étude car c’est le modèle animal de référence pour étudier le stress psychologique et ses effets, notamment sur la douleur viscérale. Ce projet se déroulera dans trois établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouvelles molécules pharmacologiques afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques contre la douleur viscérale

Procédures

Dans l'EU 1/3 et 3/3: Un minimum de 3-4 séries de distensions colorectales sera réalisé (2-3 séries de distensions «basales» et 1 série post traitement) par animal et espacées de minimum 3 jours pour les basales. Si les séries de distensions colorectales «basales» (sans traitement) présentent une variabilité importante, nous pourrons décider d’augmenter leur nombre. Nous pourrons aussi décider d’évaluer la reproductibilité des séries de distensions colorectales au cours du temps (sans traitement) sur le même animal ainsi que l’effet de la distension sur les paramètres protéolytiques (mesurés dans les lavages coliques et selles). Ainsi, au maximum, nous pourrons faire jusqu’à 6 séries de distensions colorectales par animal (la durée d'une série de distensions est de 1h15 et inclue 30 min d'habituation au ballon, c'est à dire que le ballon n'est pas gonflé). Des administrations de molécules pourront être effectuées (par voie intrapéritonéale, intra colique, orale, sous cutanée) avant la dernière série de distensions colorectales. Administrations intrapéritonéales et intra coliques de molécules (2 par animaux). Lavages colique (maximum 3 par rat). Dans l'EU 2/3: Nous pourrons évaluer la réponse du système nerveux central (cerveau) en réponse à la distension colorectale par imagerie IRMf (30 min-1h par animal)

Impact sur les animaux

Le modèle de stress n'induit pas de douleur spontanée mais une hypersensibilité viscérale lors de la distension colorectale, ainsi qu’une diarrhée dès 15 min post traitement. La motilité et la perméabilité intestinales sont modifiées dès 15 min, mais elles sont toutes deux restaurées entre 1h à 2h post-traitement. La distension colorectale ne cause pas de dommages tissulaires et donc peut être reproduite sur les animaux au cours du temps. Cependant, un effet indésirable suite à la distension peut être une perforation du colon mis en évidence par la présence de sang sur le ballonnet et/ou au niveau anal.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de chaque procédure car des prélèvements de tissus et d'organes doivent être réalisés

Remplacement

La douleur chronique intestinale, dont souffrent les patients atteints de syndrome de l'intestin irritable (SII), peut affecter fortement leur condition de vie. Cependant, les causes de cette douleur chronique sont encore mal comprises, notamment si c'est la perception de la douleur en centrale qui est altérée, et/ou bien si c'est la sensibilisation des neurones en périphérique et/ou en central qui est perturbée. Comprendre les mécanismes de régulation de la nociception est ainsi indispensable au développement de nouvelles cibles thérapeutiques pour soulager la douleur nociceptive chronique. In vitro, il est possible d’étudier des échantillons coliques provenant de patients SII (biopsies, selles, organoïdes en culture...), nous avons par exemple montré dans des études préliminaires que le traitement d’organoïdes intestinaux par des hormones de stress modifiait la balance protéolytique. Suite à la preuve de concept in vitro d’un effet des hormones de stress sur les médiateurs d’intérêt au niveau de l’intestin (techniques de culture d’organoïdes intestinaux), l'expérimentation animale est nécessaire pour valider ces résultats, c’est a dire pour évaluer la conséquence de l’altération de ces facteurs sur la douleur viscérale (en condition de stimulation nociceptive c'est à dire par exemple en réponse à la distension colorectale). L’étude des mécanismes de nociception requiert une réaction intégrée de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans son intégralité. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l'expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour les douleurs viscérales.

Réduction

La technique de mesure de la douleur utilisée ici peut être reproduite sur un même animal au cours du temps et peut être couplée à l’utilisation d’autres méthodes de suivi clinique non-invasives (suivi de poids, consistance des selles …) ce qui permet d’observer et de suivre au cours du temps un seul animal, (par opposition à d’autres méthodes d’évaluation de la douleur viscérale comme par exemple l’implantation d’électrodes au niveau des muscles abdominaux par chirurgie) permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux. De plus, les résultats de distension obtenus peuvent être utilisés pour comparer plusieurs groupes entre eux (exemple: groupe contrôle versus traité) ainsi que pour comparer le même animal au cours du temps (exemple: série de distensions avant traitement versus série de distensions après traitement). Cependant, il existe de la variabilité de la réponse à la distension au sein du même animal au cours du temps et entre les animaux entre eux. Cette variabilité peut être associée notamment au stress dû à la distension, ainsi, pour réduire cette variabilité au maximum, nous habituons les animaux avant la première série de distensions et nous reproduisons les distensions au sein du même animal plusieurs fois afin de réduire le stress et donc la variabilité intra et inter-individus et en conséquence le nombre d’animaux requis pour une étude. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale.

Raffinement

Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, un enrichissement sera rajouté aux animaux. A savoir, des tunnels et des carrés de coton pur ou du papier absorbant permettant aux animaux de faire une nidation. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Par exemple nous avons mis en place une période d’habituation des animaux pendant 1h durant les 3 jours précédant la première série de distensions (habituation au manipulateur et habituation aux tubes de contention) afin de réduire le stress. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par semaine en plus de la surveillance quotidienne réalisée par les zootechniciens. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. De plus, les personnes responsables du projet et expérimentateurs ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; et en particulier aux techniques spécifiquement utilisées ici (distension colorectale, injections intra coliques). L’apprentissage et la maitrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences des personnes concernées. Transport de moins de 50 km. Nous nous assurerons que les animaux sont protégés en permanence des intempéries, des rayons du soleil, des températures extrêmes (climatisation du véhicule 19-21 degrés), conduite souple, limitation au bruit

Choix des espèces

Le rat est un modèle communément utilisé dans les études de stress psychologique et de mesure de douleur viscérale, il a ete choisi par rapport a une publication de reference du modele cortagine Les rats seront ages d'au moins 7 semaines car nous souhaitons utiliser des animaux adultes et matures et pesant minimum 200g.

1 320 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections d'adjuvant dans les coussinets plantaires, à la base de la queue et dans les flancs, injection qui peut provoquer une douleur modérée à la marche, ainsi que des injections de toxine pertussis, des gavages et des injections intrapéritonéales, pour tester la stimulation de lymphocytes T régulateurs contre les myosites auto-immunes. Le porteur euthanasie les souris pour prélever muscles et rate. Le projet, entièrement financé par une entreprise pharmaceutique, renvoie ses retombées pour les patients au conditionnel et au futur, et le porteur affirme qu'il faut recourir à la souris parce que seule l'expérimentation animale permettrait une approche intégrée.

Objectifs

Les myosites auto-immunes sont responsables d’inflammations musculaires chroniques conduisant à une altération dégénérative des muscles. Ces maladies fortement invalidantes se caractérisent par une faiblesse musculaire symétrique, des douleurs occasionnelles pouvant entrainer de la fibrose et une atrophie des muscles des membres. Leur diagnostic repose sur la clinique et des examens complémentaires. Les traitements actuels visent à induire une rémission de la maladie en utilisant de fortes doses de corticoïdes puis à maintenir cette rémission par de faibles doses de corticoïdes en combinaison avec des immunosuppresseurs. Le but étant de restaurer une masse musculaire et des fonctions motrices normales. Malheureusement ces traitements sont souvent peu efficaces et exposent les patients à des effets indésirables fréquents et parfois graves. Il est donc nécessaire de trouver de nouveaux traitements. La stimulation d’une population cellulaire du système immunitaire, appelée lymphocytes T régulateurs représente une approche thérapeutique intéressante que nous allons tester dans ce projet. Les lymphocytes T régulateurs ont un rôle bénéfique dans les myosites en inhibant les réponses immunes et inflammatoires. L'objectif de ce projet est de proposer une nouvelle approche thérapeutique dans ces maladies consistant à stimuler spécifiquement ces cellules. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées pour tester l’efficacité de ce traitement. L’objectif de ce projet est donc de pouvoir proposer une nouvelle approche thérapeutique des myosites réfractaires aux traitements classiques. Du fait de la complexité des mécanismes physiopathologiques impliqués dans les myosites auto-immunes, nous devons avoir recours à l'animal pour tester de nouvelles approches thérapeutiques. Il est important de rappeler ici que la plupart des avancées récentes en immunothérapie proviennent directement de données obtenues d'abord chez la souris. On voit donc l'intérêt de pouvoir tester ces approches chez la souris avant de pouvoir les appliquer à l'homme.

Bénéfices attendus

Grâce à ce travail, nous espérons avoir une meilleure connaissance du rôle des lymphocytes T régulateurs dans le contrôle des myosites auto-immunes et nous allons tester un nouveau traitement de ces maladies en stimulant ces cellules. Ce projet, entièrement financé par une entreprise pharmaceutique, pourrait se traduire par de nouvelles approches thérapeutiques chez l’homme dans le futur.

Procédures

On effectuera des immunisations des souris par voie sous-cutanée qui dureront moins de 30 secondes et des injections par voie intraveineuse de toxine pertussis qui dureront moins de 60 secondes. Dans les 2 cas, les animaux seront anesthésiés. On fera également des gavages et des injections par voie intrapéritonéale qui dureront moins de 30 secondes chacun par souris dont on fera une contention par le cou. On effectuera un suivi au moins 4 fois par semaine des souris pour mesurer le bienêtre animal et le poids des animaux. Le tout prendra moins de 30 secondes par souris. Enfin, ces souris, seront euthanasiés quand 3 à 4 semaines après le début de la procédure (compter 5 à 10 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Aucun phénotype dommageable n'a été rapporté ou observé au laboratoire chez les souris génétiquement modifiées qui seront utilisées dans ce projet. Les différents traitements réalisés dans ce projet n’entraineront pas d’effet indésirable en soi. Il pourrait y avoir un stress bref lors de la contention des souris par la peau du cou et lors du gavage. Pour les injections par voie intraveineuse, les animaux seront anesthésiés. Les effets indésirables attendus dérivent surtout de l’injection par voie sous-cutanée d’un adjuvant dans les coussinets plantaires, à la base de la queue et dans les flancs. L’injection de cet adjuvant peut entrainer une gêne qui sera plus ou moins forte en fonction du lieu d’injection. A la base de la queue et dans les flancs, son injection génère une induration localisée pouvant entrainer une gêne pendant quelques jours sans provoquer de douleur. Injecté dans les coussinets plantaires, l’adjuvant peut entrainer une gêne à la marche et une douleur modérée au moment où la souris pose le pied au sol. Pour limiter ce problème, l’injection ne sera effectuée que dans un seul membre postérieur. La myosite ne devrait pas entrainer d’effet indésirable notable. En effet, dans ce modèle il est décrit que les muscles ne sont que faiblement enflammés, n’entrainant pas de paralysie ou de faiblesses musculaires majeurs. Les symptômes cliniques sont absents ou très difficiles à détecter.

Devenir

Les souris seront euthanasiées pour pouvoir prélevez de nombreux tissus biologiques (muscle, rate) sur lesquels on effectuera des analyses cellulaires et immunologiques multiples.

Remplacement

Etant donnée la complexité du développement des myosites auto-immunes, seule l'expérimentation animale permettra une approche intégrée de la compréhension des mécanismes impliqués. Nous utiliserons la souris dans la mesure où c’est un modèle de référence d’étude des myosites auto-immunes et que nous avons développé au laboratoire des modèles de souris génétiquement modifiées uniques qui permettent de répondre aux questions soulevées par ce projet. Dès que possible, on effectuera un remplacement partiel de la souris par des expériences de culture cellulaire et par des analyses bio-informatiques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Du fait de la variabilité de maladie interindividuelle entre souris, nous utiliserons des lots de 15 souris par groupe. Les expériences seront répétées 2 à 3 fois en fonction du type de question. Le nombre de souris par expérience et le nombre d’expériences ont été établis en tenant compte de l’expertise que nous avons développée depuis plus de 20 ans. Nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Pour objectiver au maximum l’interprétation des résultats, les expériences seront faites en aveugle, c’est-à-dire que la personne qui induira la maladie ne sera pas la même que celle qui fera l’évaluation des scores de la maladie. Ainsi, les scores seront évalués à l’aveugle, sans savoir à quel groupe la souris analysée appartient. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, nous prélèverons les différents muscles enflammés et la rate de chaque animal afin de collecter le plus de données possibles.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont optimisées pour réduire douleur, souffrance ou stress. Les souris seront hébergées selon les conditions de la règlementation européenne avec accès ad libitum à la nourriture et à la boisson. Le change de la litière sera réalisé 1 fois toutes les 2 semaines et les biberons chaque semaine. Les souris resteront toujours en groupes sociaux (de 2 à 5 souris) en milieu enrichi. Les animaux sont vérifiés tous les jours par le personnel du service de zootechnie. L’état général des animaux (apparence physique, changement de comportement) sera suivi quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en œuvre (euthanasie ou arrêt du protocole). Toute observation de souffrance animale (blessure, prostration, poil hérissé, modification majeure du comportement, expression faciale particulière indiquant des signes de souffrance) fera l’objet d’un avis au responsable de l'animalerie et sera suivi de l’application de ses conseils en tant qu’expert. En pratique si on trouvait un animal qui présente des signes de souffrance, nous l’euthanasierons. La dentition de chaque souris sera vérifiée régulièrement.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier les maladies inflammatoires chroniques de l’Homme et les lymphocytes T régulateurs en particulier. De nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et Homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. L’utilisation de souris génétiquement modifiées nous permet de répondre aux questions posées dans ce projet. Ces modèles expérimentaux sont également des outils précieux pour étudier les mécanismes d'action d'agents pharmacologiques in vivo et pour envisager leur validation dans des études précliniques chez l'Homme. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche. Pour l’ensemble des expériences, celles-ci seront initiées chez des jeunes adultes de 8 à 10 semaines d’âge, à un moment où le système immunitaire est mature.