Recherche fondamentale

336 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier l'apparition de seconds cancers après radiothérapie. Placées en marge d'une zone irradiée cinq jours par semaine pendant sept semaines, elles sont suivies par bioluminescence sous anesthésie répétée, reçoivent un sénolytique par gavage et un examen PET-scan avant mise à mort jusqu'à dix-huit mois plus tard. Le porteur prévoit d'emblée le double des animaux nécessaires pour pouvoir refaire la procédure en cas de problème. Il indique avoir déjà publié des résultats in vitro mais affirme devoir vérifier ces mécanismes dans un organisme doté d'un système immunitaire.

Objectifs

Plus de la moitié des cancers sont traités par radiothérapie, seule ou en combinaison avec de la chimiothérapie ou de la chirurgie. Les radiations utilisées pour le traitement créent des cassures sur les deux brins de la double hélice d’ADN qui sont létales pour les cellules cancéreuses. Bien que les techniques de radiothérapie soient de plus en plus précises, les rayonnements touchent toujours des cellules saines à proximité de la zone traitée ce qui induit des effets secondaires. Certains sont immédiats, comme une réaction inflammatoire, d’autres sont beaucoup plus tardifs, avec un risque de développement d’un second cancer. Les seconds cancers sont extrêmement rares mais souvent sévères, avec un taux de survie à 5 ans compris entre 10 et 40%. Comme ils se développent de nombreuses années après la radiothérapie initiale, ils concernent principalement des personnes ayant souffert d’un cancer durant leur enfance ou leur vie de jeune adulte. Il est donc important et urgent de comprendre les mécanismes responsables du développement de ces cancers afin de pouvoir mieux prévenir leur formation. Lors d’études précédentes réalisées sur des cultures de cellules, nous avons montré que les cellules saines en bordure de zone traitée, recevant uniquement de très faibles doses de rayonnements, subissent aussi des cassures de l’ADN mais seulement sur un brin, ce qui n’est pas létal pour les cellules, mais induit leur sénescence prématurément ce qui se traduit entre autres par un arrêt de prolifération. Puis, quelques rares de ces cellules sénescentes évoluent vers un état pré-tumoral. L’objectif de ce projet est de vérifier les résultats obtenus in vitro dans un organisme complexe, la souris. Il s’agit d’un projet multi-site qui se déroulera au sein de deux établissements utilisateurs identifiés comme EU 1/2 et EU 2/2.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à une meilleure compréhension des mécanismes responsables du développement des seconds cancers post-radiothérapie. Les résultats seront publiés dans une revue scientifique internationale à comité de lecture. La compréhension de ces mécanismes pourrait doter la clinique de marqueurs prédictifs de risque d’apparition des seconds cancers que pourraient être les marqueurs de sénescence et de cassures simple-brin l’ADN. Des traitements préventifs ciblant les cellules sénescentes pourraient ensuite faire l’objet d’essais cliniques.

Procédures

Ce projet se déroule en une procédure multi-étapes et multi-sites. Après acclimatation d’au moins 1 semaine, l’ensemble des animaux (168 souris) seront endormies par anesthésie gazeuse (2min) afin de tondre une partie de leur pelage au niveau du dos (10 sec) et seront mises en contact via l’application d’un gel d’échographie sur leur peau avec un fantôme qui sera irradié (84 souris) ou non irradié (84 souris) (durée de l’irradiation 68 sec). Les irradiations seront réalisées 5 jours par semaine pendant 7 semaines dans l’EU 2/2. Au cours de et après les irradiations, les souris seront suivies par bioluminescence à raison de 1 fois par semaine les 3 premiers mois puis 1 fois par mois. Pour cela, les 168 souris seront transportées vers l’EU 1/2 où elles recevront une injection d’anesthésiques (30 sec) puis, une fois endormies, une injection de luciférine (30 sec). Après la lecture, les animaux seront réveillés par une injection d’un agoniste des anesthésiques (30 sec ; durée totale de l’anesthésie : 30 min) puis seront retransportées vers l’EU 2/2. Après la fin des irradiations, l’ensemble des souris seront transférées définitivement vers l’EU 1/2, 84 souris recevront un traitement sénolytique et 84 souris recevront un placebo par gavage (durée 30 sec ; 5 jours de traitement / placebo puis 2 semaines de repos puis 5 jours de traitement / placebo). Les souris seront ensuite hébergées sans autre manipulation que les contrôles de leur état et de la bioluminescence (1 fois par mois) jusqu’à 18 mois après les irradiations. En fin de procédure, les souris seront étudiées via une analyse par PET-Scan (anesthésie gazeuse, durée 15min) dans l’EU 1/2 puis seront mises à mort. Pour résumer : Seules les anesthésies gazeuses pour la tonte et les irradiations seront réalisées dans l’EU 2/2. Pendant la période d’irradiation, les souris seront hébergées dans l’EU 2/2. Les actes réalisés dans l’EU 1/2 sont les suivants : anesthésies gazeuses pour la tonte (après la période d’irradiation, anesthésie par injection pour la lecture de bioluminescence (avec injection de luciférine) + injection d’antisedan pour le réveil des animaux, gavage avec le sénolytique (2x5 jours avec une pause intermédiaire de 2 semaines) et anesthésie gazeuse pour la réalisation du PET-Scan avant mise à mort des animaux. Nous prévoyons le double d’animaux, pour pouvoir refaire tout ou partie la procédure et ce, uniquement en cas de problème.

Impact sur les animaux

Les souris n’étant pas directement irradiées (elles seront placées en marge de la zone irradiée), les effets potentiels liés à une irradiation directe (comme les brûlures) ne s’appliquent donc pas aux animaux. Le transport de l’EU 2/2 vers l’EU 1/2 peut engendrer un stress chez les animaux. Pour la lecture de la bioluminescence, les animaux subiront une anesthésie par injection. Le gavage des animaux étant un geste maitrisé par les expérimentateurs, seul un stress au moment de la contention pourra éventuellement être ressenti par les souris. Cependant, le sénolytique utilisé lors du gavage est connu pour avoir un effet toxique sur les mégacaryocytes (Souers et al., 2013). Pour remédier à ce problème, le traitement sera délivré par intermittence, 5 jours de traitement, une pause de deux semaines puis de nouveau 5 jours de traitement.

Devenir

A la fin de la procédure, en raison des traitements qui auront été réalisés sur les animaux et de la nécessité de prélever et d’analyser les organes, l’ensemble des souris seront mises à mort.

Remplacement

Nous avons déjà répondu à l’injonction de remplacement en réalisant des études préalables utilisant des cellules en culture. Nous avons ainsi pu montrer que les radiations touchant les cellules saines situées en bordure d’une zone irradiée induisent des dommages à l’ADN (des cassures simple-brin) qui s’accumulent et de la sénescence cellulaire. Ces résultats ont été publiés dans une revue scientifique internationale à comité de lecture. Cependant, nous ne pouvons pas affirmer que ces évènements (cassures simple-brin de l’ADN, sénescence et cellules sénescentes qui entrent de nouveau dans le cycle cellulaire) auront lieu dans des cellules incluses dans un organisme, avec notamment un système immunitaire qui pourrait éliminer les cellules sénescentes. C’est pourquoi, même si nous avons commencé par remplacer l’expérimentation animale par des études in vitro, nous devons maintenant procéder à des études chez l’animal.

Réduction

Pour déterminer le nombre de souris nécessaires, nous nous sommes tout d’abord basés sur les données de la littérature pour connaitre la fréquence de développement de cancers spontanés et de cancers radio-induits (dans la zone d’irradiation) chez les souris. Ces données montrent une différence très nette entre fréquences des cancers spontanés et des cancers induits par la radiothérapie. Par ailleurs, nous nous sommes basés dans un second temps sur les expériences préliminaires réalisées par le laboratoire concernant l’apparition et le suivi de sénescence également sur les souris p16-Luc. Les analyses montrent qu’il nous faudrait 42 souris par lot (avec au total 4 lots), soit un total de 168 souris. En cas de problème, nous prévoyons le double pour pouvoir refaire les manipulations (uniquement si nécessaire), soit un total de 336 souris.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages d’une animalerie thermiquement et hygrométriquement régulée, avec un éclairage alternant jour/nuit. Elles auront accès à l’eau et à l’alimentation à volonté. Leurs cages seront équipées d’une litière et de produits d’enrichissement. Pour les manipulations liées à la tonte, à l’irradiation et au suivi de la bioluminescence, les animaux seront anesthésiés afin de réduire leur stress (anesthésie gazeuse ou chimique). Les manipulations des animaux (mise en cage, anesthésie, irradiation, mise à mort) seront réalisées par un personnel qualifié. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé de manière à s’assurer qu’ils ne présentent pas de signes de souffrance nécessitant l’arrêt des procédures et leur mise à mort. La souffrance sera évaluée par l’observation de paramètres de poids, de comportement et d’apparence reportés dans une grille standard permettant d’établir un score à ne pas dépasser. Tout animal dépassant ce score sera exclu du protocole d’irradiation et mis à mort.

Choix des espèces

La souris est une espèce classiquement utilisée en radiobiologie et cancérologie dont la génétique et la manipulation sont bien maitrisées en laboratoire. De plus, nous utiliserons une souche de souris transgénique (p16-Luc : insertion de la luciférase dans le gène p16) qui permet d’analyser facilement les cellules sénescentes sur animaux vivants par bioluminescence permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Le sénolytique qui va être utilisé a déjà été testé avec succès chez la souris. Enfin, en lien avec notre problématique, la souris est connue pour développer des cancers lorsqu’elle est soumise à des irradiations. Nous utiliserons des souris adultes jeunes ayant atteint leur taille maximale, soit âgées de 10 semaines. L’acquisition de la taille adulte permettra de placer toujours la souris de la même manière en contact avec le fantôme irradié. La sénescence cellulaire survient avec l’âge. C’est la raison pour laquelle nous utiliserons des souris jeunes pour être le moins possible parasité par la sénescence survenant spontanément avec l’âge.

1 774 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier le rôle d'une protéine dans un modèle de cancer du foie. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis de multiples injections, jusqu'à dix-huit par voie intraveineuse, avec suivi de la croissance de la tumeur au pied à coulisse. Le porteur mentionne aussi le prélèvement d'un bout de queue pour le génotypage, sans détailler les atteintes liées à la tumeur au-delà de sa croissance. Sur le remplacement, il affirme que la transition d'une cellule endothéliale vers un soutien tumoral "n'est réalisable que sur le modèle animal".

Objectifs

Le cancer primitif du foie est le sixième cancer le plus fréquemment diagnostiqué dans le monde et la troisième cause de mortalité liée au cancer. Le carcinome hépatocellulaire (CHC) représente 75 à 85 % des cancers du foie. Le taux de survie à 5 ans est inférieur à 10 % dans plusieurs pays européens et le nombre de cas et de décès devrait augmenter au cours des 20 prochaines années. Notre laboratoire s’intéresse au rôle d'une protéine durant le développement des organismes et dans des conditions pathologiques, notamment le cancer. Il a été démontré que l’expression de cette protéine est gagnée dans de nombreux cancers. Récemment, nous avons démontré que cette protéine favorise un processus cellulaire favorisant le déplacement des cellules tumorales. Il permet notamment la formation de métastases. Par conséquent, ce mécanisme cellulaire rend les cellules tumorales agressives. Des données préliminaires sur des cellules en culture suggèrent que cette protéine pourrait également moduler un processus cellulaire permettant aux cellules endothéliales qui tapissent l’intérieur du système circulatoire (veines et artères) de migrer et d’acquérir de nouvelles caractéristiques cellulaires (différenciation) qui vont aider la croissance des cellules tumorales. De manière intéressante, cette protéine est connue pour favoriser la croissance tumorale des CHC. Dans ce projet, nous aimerions tester la contribution cette protéine sur la différenciation des cellules endothéliale et son rôle au cours de la progression tumorale des CHC.

Bénéfices attendus

Le cancer primitif du foie est le sixième cancer le plus fréquemment diagnostiqué dans le monde et la troisième cause de mortalité liée au cancer. Le taux de survie à 5 ans est inférieur à 10 % dans plusieurs pays européens et le nombre de cas et de décès devrait augmenter au cours des 20 prochaines années. L’identification de nouvelles thérapies est donc essentielle. Dans ce projet, nous vouons tester la contribution d’une protéine qui pourrait favoriser la production de cellules non-tumorales qui sont connues pour soutenir la prolifération des cellules tumorales. De plus, l’utilisation d’une molécule interférente entre cette protéine et ses récepteurs pourrait ouvrir des nouvelles perspectives thérapeutiques ciblant ces cellules de soutien plutôt que les cellules tumorales qui développent de nombreuses résistances au traitement dans le cas des cancers du foie.

Procédures

Les animaux recevront 3 injections intrapéritonéales, 1 injection sous-cutanée et 3 injections intraveineuses hebdomadaire pour le traitement durant au maximum 6 semaines (maximum 18 injection i.v.). Ces injections durent 5 secondes.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, plusieurs nuisances ou effets indésirables sur les animaux sont attendus: - douleur lors du prélevement d'un bout de queue pour le génotypage - Injection sous cutanée de cellules tumorales et croissance d'une tumeur sous cutanée - injection intrapéritonéale - Injections intraveineuses des traitements – contentions lors du suivi de la croissance tumorale avec le pied à coulisse.

Devenir

Ils seront tous mis à mort pour analyse des tissus.

Remplacement

Les expérimentations in vitro sur cellules nous permettent de réaliser beaucoup d'études de mise au point de nouveaux traitements. Cependant, l’étude de la transition d’une cellule endothéliale vers une cellule de soutien à la croissance tumorale n’est réalisable que sur le modèle animal, puisque ce sont les interactions entre les sous-populations cellulaires de la tumeur qui modulent cette transition.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utiliserons chaque tumeur pour 2 analyses distinctes. Le nombre d’animaux a été défini à l’aide d’un logiciel de calcul de puissance statistique. Par ailleurs, nous réaliserons des expériences pilotes avec peu de souris permettant de tester notre hypothèse. Si elle s’avère négative, nous ne réaliserons pas le reste de la procédure et par conséquent, nous réduirons considérablement les effectifs de souris utilisés.

Raffinement

Toute manipulation susceptible d’entraîner du stress sera réalisée par un expérimentateur formé aux techniques de contention et de manipulation des animaux. Les animaux seront hébergés en groupe (5 par cage) avec dômes et boules de coton dans les cages. Les injections des traitements et des lignées tumorales seront réalisées par un expérimentateur habitué à réaliser ces gestes.Dans le cadre de cette demande de projet, nous avons déterminé des points limittes qui permettent d'éviter toutes souffrances animales.

Choix des espèces

La souris est un organisme modèle qui partage 98% son patrimoine génétique avec l’homme. Ce modèle permet donc d’étudier les mécanismes biologiques que l’on retrouve chez l’homme. Le mécanisme étudié dans cette demande de projet fait intervenir des processus intégrés à l'organisme entier (interaction entre différentes sous-populations cellulaires). Nous réaliserons les procédures sur des animaux jeunes adultes qui est le meilleur age pour la prise de greffe (8 semaines).

394 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour rechercher l'existence de cellules productrices de sang dans l'aorte adulte. Une partie est irradiée, ce qui provoque une aplasie médullaire et une immunosuppression, puis greffée avec de la moelle et soumise à des injections répétées, les animaux dont le greffon échoue étant tués par dislocation cervicale. Lorsque la maladie du sang apparaît vers six mois, le porteur prévoit un prélèvement sanguin maximal auquel les souris ne peuvent survivre, suivi de la mise à mort. Il indique que des essais in vitro sur cellules humaines n'ont pas reproduit le phénomène et affirme que "seules des expériences chez l'animal" le permettront.

Objectifs

A l'âge adulte, les cellules sanguines sont produites dans la moelle osseuse, au cours du processus appelé « hématopoièse ». Les cellules souches hématopoïétiques sont donc un réservoir de cellules sanguines et pouvoir contrôler leur nombre ou leur fonction pourrait permettre des avancées thérapeutiques pour les greffes notamment. Il est actuellement établi que les cellules souches hématopoïétiques présentes à l'âge adulte ont été produites très tôt, pendant un laps de temps très court, au cours de la vie embryonnaire ; de façon étonnante, les cellules qui produisent les cellule souches hématopoïétiques sont des cellules de la paroi de l'aorte, appelées cellules endothéliales "hémogéniques". Il semble que ces cellules endothéliales hémogéniques n’existent pas uniquement chez le jeune embryon mais aussi chez le jeune animal. Cependant, à l'heure actuelle, aucune équipe n'a rapporté l'existence de telles cellules à l'âge adulte. Ces dernières années, notre équipe a étudié le rôle des cellules endothéliales adultes dans la formation de caillots sanguins. Nous nous sommes notamment intéressés aux cellules endothéliales mutées pour la protéine d'intéret. Cette protéïne activatrice de la mutation est très fréquemment retrouvée dans des maladies hématologiques, les néoplasies myéloprolifératives; nous avons créé deux modèles de souris au sein desquels, théoriquement, uniquement les cellules endothéliales adultes portent la mutation. Nous avons eu la surprise d'observer que certaines de ces souris développaient une maladie du sang, avec des cellules souches hématopoïétiques avec la présence de cette protéïne. Ces résultats suggèrent donc qu'il existerait, dans ces modèles murins, des cellules endothéliales hémogéniques. Notre projet de recherche vise à démontrer formellement l’existence de cellules endothéliales hémogéniques dans ces souris adultes. Si nous confirmons la présence de cellules endothéliales hémogéniques avec cette protéïne dans ces souris, nous chercherons à les isoler et les caractériser (marqueurs, profil d'expression génique).

Bénéfices attendus

La recherche sur les cellules souches hématopoïétiques est très active car non seulement elle est utile pour mieux comprendre (et traiter) des maladies hématologiques comme les leucémies, mais elle est aussi très utile pour envisager la production de cellules sanguines matures, qui pourraient servir pour des transfusions et ainsi s’affranchir des besoins réguliers en dons du sang (avec les risques inhérents aux transfusions sanguines). Mieux comprendre d’où viennent les cellules souches hématopoïétiques est donc un enjeu scientifique majeur, comme en attestent les fréquentes publications dans des journaux renommés. De nombreux efforts ont été faits ces dernières années pour tenter d’amplifier les cellules souches, sans qu’elles ne se différencient (car une fois qu’elles se différencient, elles perdent leur capacité à produire toutes les lignées sanguines et ne s’auto-renouvellent plus). L’avènement des IPS (Induced Pluripotent Stem cell) a susicté des espoirs pour arriver à reprogrammer des cellules matures en IPS et les faire ensuite se différencier en cellules souches hématopoïétiques. Mais malgré des efforts colossaux, aucun laboratoire n’a réussi à obtenir, à partir des IPS, de réelles cellules souches hématopoïétiques. Il n’y a donc à l’heure actuelle, aucune stratégie disponible pour produire de nouvelles cellules souches hématopoïétiques adultes. Ici, nous avons pour objectif de mettre en évidence des cellules endothéliales adultes, capables de fabriquer de nouvelles cellules souches hématopoïétiques. Les cellules souches hématopoïétiques étant un réservoir de cellules sanguines, pouvoir contrôler leur nombre ou leur fonction pourrait permettre des avancées thérapeutiques pour les greffes notamment.

Procédures

Lot 1 : 6 souris donneuses avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 2 x 5 jours (10jours), soit 10 interventions d'une durée de 20s par souris, plus 40 souris receveuses avec 1 seule injection intraveineuse (durée de l'intervention 1min30 par souris). Lot 2 : 6 souris donneuses avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 5 jours soit 5 interventions d'une durée de 20s par souris, plus 6 donneuses avec administration par gavage en une seule dose (durée de l'intervention 20s par souris), plus 80 souris receveuses avec 1 seule injection intraveineuse (durée de l'intervention 20s par souris). Lot 3 : 40 souris receveuses avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 5 jours soit 5 interventions d'une durée de 20s par souris, plus une seule injection intraveineuse (durée de l'intervention 1min30 par souris). Lot 4 : 40 souris receveuses avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 5 jours soit 5 interventions d'une durée de 20s par souris, plus une seule injection intraveineuse (durée de l'intervention 1min30 par souris). Lot 5 : 40 souris receveuses avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 2 x 5 jours (10jours), soit 10 interventions d'une durée de 20s par souris, plus 1 seule injection intraveineuse (durée de l'intervention 1min30 par souris). Lot 6 : 40 souris receveuses avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 2 x 5 jours (10jours), soit 10 interventions d'une durée de 20s par souris, plus une seule injection intraveineuse (durée de l'intervention 1min30 par souris). Lot 7 : 20 souris receveuses avec une seule injection intraveineuse (durée de l'intervention 1min30 par souris). Lot 8 : 20 souris avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 5 jours soit 5 interventions d'une durée de 20s par souris, plus une seule injection intraveineuse (durée de l'intervention 1min30 par souris). Lot 9 : 20 souris avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 5 jours soit 5 interventions d'une durée de 20s par souris, plus une seule injection intraveineuse (durée de l'intervention 1min30 par souris). Lot 10 : 10 souris avec une seule injection intraveineuse (durée de l'intervention 1min30 par souris).

Impact sur les animaux

L’aplasie médullaire et l’immunosuppression induites par l’irradiation constituent des effets dommageables sur l’animal. Nous resterons donc très vigilent les jours qui suivent l'irradaition. 24h après, les souris receveuses recevront en IV des cellules de moelle de souris donneuses. Pour les souris dont le greffon prendra bien, nous observerons dans la première semaine une perte de poids ne dépassant pas les 10%. Dans la deuxième semaine ces souris retrouveront un poids normal puis poursuivront leurs croissances pour le restant de l’étude. Pour les souris dont le greffon ne prendra pas, nous observerons une perte de poids d’environ 10% dans la première semaine qui se poursuivra dans la deuxième. Ces animaux seront alors mise à mort par dislocation cervicale.

Devenir

Lorsque que la maladie hématologique apparaitra vers 6 mois, un maximum de sang sera prélevé sur les animaux pour analyses. Les animaux ne pouvant survivre à un tel prélèvement, ils seront ensuite tous mis à mort.

Remplacement

Nous avons réalisé des études in vitro, à partir de cellules endothéliales humaines (HUVEC) exprimant la mutation. Nous n’avons pas observé de phénotype hémogénique dans ces cellules, ni d’expression de facteurs de transcription laissant penser qu’elles devenaient hémogéniques. Ces résultats ne sont pas surprenants car il était peu probable que Ia seule présence que la mutation dans n’importe quelle cellule endothéliale la rende hémogénique. Les HUVEC sont des cellules endothéliales provenant de cordon ombilical et donc pourtant assez jeunes et les plus « proches » possibles des cellules endothéliales embryonnaires. Il est probable que ce phénotype hémogénique ne soit conféré qu’à de très rares cellules endothéliales. Seules des experiences chez l’animal, permettant, l’expression de la mutation dans toutes les cellules endothéliales, nous permettra de voir quelle sous population de cellules endothéliales portant cette mutation est devenue hémogénique.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux nécessaire à cette étude a été calculé à 394. 20 animaux dans chaque groupe expérimental et par expérience seront utilisés afin d'obtenir un résultat statistique cohérent. Les analyses statistiques des résultats seront réalisées avec le test adéquats. Ce nombre peut paraitre elevé, mais est necessaire compte tenu du fait que nous cherchons à greffer des cellules souches qui sont très rares dans les moelles qui servent de greffon. Ainsi, si nous voulons avoir des résultats scientifiquement valides, reproductibles et qui nous permettent d’estimer une fréquence de cellules souches, nous avons besoin de 20 animaux par lot.

Raffinement

L'hébergement des animaux permet de reduire le stress et l'inconfort : animalerie agrée, personnels formés, cages de 6 animaux maximum en portoirs ventilés avec libre accès à l'eau et la nourriture ainsi qu'un environnement enrichi avec igloo cortonné de carré de cellulose. Les animaux recevront systématiquement un antalgique 30 min avant l'anesthésie lors des administrations intraveineuse et des prélèvements sanguins et seront placé sur un tapis chauffant. Les anesthésies seront réalisées à l'aide d'un poste automatisé distrubuant un gaz anestésiant. Les animaux seront tout d'abord placés dans la boite pour induire l'anesthésie jusqu'à un endormissement profond puis seront transférés sous masque individuel pour réaliser administrations et prélèvements. Pour éviter les risques d'infection suite à l'irradiation, des précautions seront mise en place. Tout d'abord, nous transporterons (3 minutes) la boite d'irradiation avec les souris dans un sac isotherme décontaminé. De retour au laboratoire, elles seront transférées dans leurs cages d’hébergements pour portoirs ventilés qui auront été préalablement stérilisées par autoclavage avec litière et enrichissement. Les biberons et l’eau de boisson seront également stérilisés par autoclavage. Nous distribuerons à ces souris un aliment stérilisé par le fournisseur. Ces transferts seront réalisés sous une hotte perméttant de maintenir la stérilité de l’environnement des souris. Notre animalerie est de statut conventionnel, une attention toute particulaire sera apportée à ces cages. Durant la première semaine après la greffe une visite quotidienne sera nécessaire pour évaluer le bien-être des animaux à l'aide d'une grille d'Observations/Actions qui nous permettra d'identifier les points limites et d'apporter dans les plus brefs délais la mesure adaptée à l'animal.

Choix des espèces

La souris a été choisie comme modèle d'étude en raison de l'existence de souris transgéniques dont les gènes d'intérêt ont été mutés. Nous disposons dans notre laboratoire de différentes lignées de souris transgéniques mutées au niveau d'une ou plusieurs lignées de cellules hématopoïétiques. C'est un modèle de mammifère à sang chaud dont l'organisation structurale du réseau vasculaire et sanguin à de forte ressemblance avec l'homme. Pour toutes ces manip, les souris auront entre 16 et 18 semaines, qui est l'âge de l'apparition de la maladie. Les C57Bl6 seront entre 10 et 12 semaines, âge adulte de la souris où la formule sanguine et les composants du sang sont bien équilibrés et stables.

72 rates gestantes ou allaitantes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un cocktail de polyphénols par gavage puis subissent quatre prélèvements de lait sous anesthésie, afin de mesurer le passage des composés dans le sang, le cerveau, le foie et les urines. L'objectif, présenté comme une étape vers un complément alimentaire destiné à la femme enceinte, prolonge des travaux antérieurs sur la neuroprotection de ratons soumis à une hypoxie-ischémie. Le porteur affirme que l'évaluation du métabolisme "nécessite une approche intégrative" sans remplacement disponible.

Objectifs

Les précédents travaux de l'équipe ont montré un rôle neuroprotecteur d'une supplémentation maternelle en polyphénols, dans le cadre de l'hypoxie-ischémie néonatale. L'administration orale de polyphénols chez des femelles Wistar gestantes ou allaitantes a induit une neuroprotection des ratons ayant subi une hypoxie-ischémie néonatale (modèle Rice-Vannucci). L'effet préventif des polyphénols s'est illustré par (i) une diminution des volumes lésionnels cérébraux, mesurée par IRM ainsi que par une préservation des aptitudes sensori-motrices des ratons mise en évidence par des tests comportementaux. Les doses utilisées étaient nutritionnelles, rendant impossible le suivi des polyphénols chez les mères de même que chez les ratons (doses inférieures au seuil de détectabilité). Afin d'attribuer les effets bénéfiques à un composé phénolique ou à un de ses métabolites et d'évaluer la capacité des polyphénols/métabolites à franchir les différentes barrières biologiques (placenta, barrière hémato-encéphalique), l'objectif du projet sera de mesurer dans différents tissus (urines, sang, cerveau, foie), les concentrations de polyphénols ainsi que de leurs métabolites, chez les mères ainsi que chez les ratons.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont une compréhension de la biodisponibilité et du métabolisme d'un cocktail naturel de polyphénols (extraits à partir du fruit de la passion), tant chez la rate gestante allaitante que chez les ratons (fœtus et nouveau-nés). Cela pourrait faire la lumière sur les effets bioactifs de ces molécules, ainsi que sur certains mécanismes d’action potentiels. Ce travail pourra participer à la mise sur le marché d'un complément alimentaire à destination de la femme enceinte.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - un gavage. Fréquence : 1 fois. Durée : quelques secondes – prélèvements de lait. Fréquence : 4 fois. Durée : 10 min. - prélèvement d'organes après mise à mort. Fréquence : 1 fois.

Impact sur les animaux

Le gavage nécessaire à l'administration du cocktail polyphénolique pourra entraîner un stress des femelles. Les prélèvements de lait pourraient entraîner un inconfort et un stress. Ces prélèvements seront réalisés sur des animaux anesthésiés. L'anesthésie pourrait entraîner un changement du rythme cardiaque et/ou respiratoire, mesurés grâce à un capteur placé sous l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin d'effectuer les prélèvements d'organes nécessaires aux dosages permettant de quantifier les polyphénols ainsi que leurs métabolites.

Remplacement

Le but final du projet est d'évaluer la biodisponibilité d'un cocktail polyphénolique ayant montré, in vivo, une neuroprotection d'une supplémentation maternelle dans le cadre d'une hypoxie-ischémie néonatale. L'évaluation du devenir du cocktail et de son métabolisme nécessite une approche intégrative, il n'existe pas de remplacement disponible à notre modèle expérimental.

Réduction

Les dosages polyphénoliques seront réalisés sur un nombre minimum d'animaux permettant de réduire les erreurs standard à la moyenne intergroupe sous les 5%..

Raffinement

Pour le gavage, les rates seront conditionnées à la contention un à deux jours avant la procédure. Le gavage est une procédure délicate, il sera réalisé par un expérimentateur expérimenté. Une canule à bout rond en plastique à usage unique sera utilisée afin de limiter les risques de blessure pour l'animal (perforation du tube digestif). Le volume administré, à température ambiante sera inférieur à 10 ml/kg. En l'absence de détresse respiratoire et de reflux, l'animal sera remis à sa cage. Dans l'heure qui suit, les signes cliniques de l’animal suite à l’exécution d’un gavage seront surveillés (détresse respiratoire, muqueuse pâle, isolement). Au niveau de l'hébergement, les animaux seront en cage (mère + portée), sur une litière de peuplier, caractérisée par un fort pouvoir absorbant et une granulométrie adaptée. L'hébergement sera enrichi avec un nid végétal, du coton et un tunnel en carton. Les animaux seront observés de façon journalière par le zootechnicien et/ou la personne en charge de l'expérimentation. Lors de ces observations, la capacité de l'animal à s'alimenter, le comportement et sa vivacité, la couleur de la peau ou l'état du pelage seront vérifiés. Un échange quotidien avec le zootechnicien et l'expérimentateur permettra une intervention et une prise de décision rapide en cas de souffrance constatée.

Choix des espèces

Le rat présente des avantages par rapport à la souris qui rendent le choix de l'espèce pertinent : la physiologie du rat est plus proche de celle de l'homme que ne l'est la physiologie de la souris. Ce point est important puisque ce projet devrait, en partie, mener au développement d'un complément alimentaire destiné à la femme enceinte. Les animaux seront utilisés aux stades de développement : - adulte, afin de définir la biodisponibilité chez les femelles gestantes ou allaitantes - fœtal, afin de définir la biodisponibilité chez les fœtus ainsi que la capacité des polyphénols et métabolites à traverser la barrière placentaire - nouveau-né, âgés de 8 jours, afin de définir la biodisponibilité chez les nouveau-nés et de déterminer la part de l'allaitement dans la neuroprotection.

Opérés jusqu'à six heures pour recevoir un équipement d'enregistrement fixé sur le crâne et sous la peau, puis rendus parkinsoniens par des injections de neurotoxine pendant quatre mois, jusqu'à 6 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour l'étude de leur cerveau. Trois seulement devraient l'être, les trois autres n'étant commandés qu'en cas de problème. Après chaque injection de toxine, le singe est isolé 72 heures, et sa ration d'eau peut être restreinte pour le motiver lors des tests de mémoire et d'attention, en plus d'une tâche de vigilance jusqu'à deux heures par jour, trois jours sur sept, en cage ou sur une chaise pour primates. Le projet teste l'effet d'une lumière proche de l'infrarouge sur les troubles du sommeil, avec au moins dix tests de latence d'endormissement de trois heures dans chaque condition. Le porteur qualifie la chirurgie de "peu invasive" et prévoit une douleur post-opératoire qui peut durer jusqu'à une semaine.

Objectifs

Les troubles du sommeil sont très fréquents dans la population et leur fréquence augmente considérablement chez les patients atteints de la maladie de Parkinson. Ce projet vise à évaluer l’effet de la lumière proche de l’infrarouge appliquée de façon non invasive sur les troubles du sommeil et leur répercutions sur la qualité de l’éveil dans la maladie de Parkinson. Les expérimentations seront réalisées chez l’animal sain puis rendu parkinsonien. La lumière sera appliquée de deux façon différente : en aigue (effet thérapeutique) et en semi-chronique (effet préventif). Dans ces 2 cas, le protocole sera identique, seul le mode d’administration de la lumière sera différent.

Bénéfices attendus

Environ 70 pourcents des patients atteints de la maladie de Parkinson souffrent aussi de troubles du sommeil. Dans la population 1 français sur 3 souffrent d’un mauvais sommeil. Un trouble du sommeil retentit sur la qualité de l’éveil, la physiologie et l’activité des structures cérébrales, ainsi un meilleur sommeil contribuerait à considérablement améliorer la qualité de vie et la santé des sujets sains ou atteints de maladies neurologiques. Ce projet propose d’évaluer l’effet de la luminothérapie, appliquée de façon non invasive, sur les troubles du sommeil. Le contrôle des troubles du sommeil permettrait une meilleure prise en charge des patients atteints de la maladie de Parkinson et contribuerait à améliorer leur qualité de vie. Enfin, il apparait que les troubles du sommeil sont des facteurs aggravants dans les maladies neurodégénératives, ce projet permettrait aussi d’envisager la dimension neuroprotectrice du sommeil.

Procédures

Tout au long du projet, les animaux réaliseront une tâche comportementale de vigilance qui prendra au maximum 2h par jour, à heure fixe et 3j sur7. Elle se déroulera à l’état conscient dans la cage à laquelle ils sont habitués et sur une chaise pour primates, sur laquelle ils sont entrainés à aller. La chirurgie d’implantation sera peu invasive, et durera au maximum 6h. De l’équipement, pour des enregistrements de sommeil, sera placé sur le crâne et sous la peau. Des enregistrements de sommeil, sans fil, se feront dans la cage d’hébergement de l’animal sans manipulation. Un maximum de 10 nuits et de 10 jours de 12h pourra être enregistré dans chaque condition : animal sain, animal sain avec illumination la nuit, animal parkinsonien, animal parkinsonien avec illumination la nuit. Des tests de latence d’endormissement seront réalisés dans une cage de sieste, à laquelle ils sont habitués. Le test dure 3h et sera effectué au moins 10 fois dans chaque condition. Les animaux seront rendus parkinsoniens par des injections de neurotoxine. Après chaque injection les animaux seront isolés pendant 72h jusqu’à l’élimination de la toxine. Les injections permettent l’obtention d’un syndrome parkinsonien modéré et stable. Cette phase dure 4 mois. Les prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien seront réalisés sous une légère anesthésie et espacés de un mois pour le premier et deux mois pour le deuxième.

Impact sur les animaux

Si nécessaire, afin d’obtenir une motivation maximale de l’animal pour réaliser des tests de memoire et d'attention, un contrôle partiel de la ration d'eau pourra être mis en place selon un protocole adapté à chaque animal et développé à partir de « Avis et recommandations sur le contrôle d'eau pour les protocoles scientifiques chez les primates non-humains », Comité national de réflexion éthique sur l’expérimentation animale, 2021. Cela permettra un maximum de motivation sans impact sur l'état de santé de l'animal. La chirurgie d’implantation peut engendrer une douleur post-opératoire suite à l’implantation du matériel d’enregistrement télémétrique. L’état de santé des animaux sera suivi avec attention et des traitements adaptés seront donnés en cas de douleur. Cet effet indésirable peut durer jusqu’à 1 semaine après l’implantation. Le test de la latence d’endormissement ne devrait pas induire d’effet indésirable chez les animaux car il se fera dans une cage de comportement à laquelle l’animal aura été habitué. Les expériences sur les rongeurs montrent que la luminothérapie ne crée pas de nuisances. Une évaluation de l’impact de la luminothérapie chez l’animal sain sera réalisée en début de projet et les paramètres de son application seront réglés à ce moment. Des injections de toxine engendreront un syndrome parkinsonien modéré présent jusqu’à la fin de l’étude . Lors de la période d’intoxication, les injections de toxine nécessiteront un isolement de 72h toutes les deux semaines pour ne pas contaminer ses congénères ainsi que le personnel. Ce syndrome sera surveillé et des traitements adaptés seront donnés en cas de détection de mal être de l’animal.

Devenir

A la fin du projet il est nécessaire de mettre à mort les animaux afin d’effectuer une étude post-mortem du cerveau pour constater l’effet de l’illumination sur le cerveau. Le nombre utilisé espéré d'animaux est de 3, les 3 autres seront commandés uniquement en cas de problème.

Remplacement

Le singe Macaque fascicularis, utilisé dans cette étude, est un animal qui présente une des structures cérébrales qui contrôlent le sommeil (le cortex, l’hypothalamus et le tronc cérébral) similaire à celles connues chez l'humain, ce qui sous-entend que les mêmes mécanismes se mettent en place au cours du sommeil chez ces 2 espèces. D’ailleurs, il présente un comportement de veille/sommeil similaire à celui des humains, avec un éveil diurne et une nuit organisée en au moins 7 cycles de sommeil. C’est aussi un modèle de choix dans cette étude car une intoxication avec une toxine permet de développer des troubles du mouvement et du sommeil similaires à ceux présents dans la maladie de Parkinson. Des résultats de la luminothérapie ont été publiés chez la souris et le rat, des essais cliniques très ciblés, pour une application invasive de la luminothérapie sont en cours, mais l’étude exhaustive des effets de la luminothérapie non invasive chez le primate non humain rendu parkinsonien sont nécessaires avant la mise sur le marché d’un tel dispositif pour les patients. A ce stade des avancées sur la luminothérapie, cette étude ne peut se faire qu’au niveau préclinique, donc chez le primate non humain, il nous est donc impossible de remplacer cet animal par un modèle rongeur, un modèle cellulaire ou de simulation informatique. Le recours à ces animaux est donc nécessaire dans cette étude qui constitue une étape vers la validation d’un dispositif thérapeutique utilisable par l’humain.

Réduction

C’est une étude longitudinale et préclinique dans laquelle l’animal est son propre contrôle, peu d’animaux seront donc nécessaires. La répétition des mesures dans les différents états (sain avec ou sans luminothérapie, parkinsonien avec ou sans luminothérapie) permettra d’évaluer l’impact de la luminothérapie avec un test statistique non paramétrique. Le nombre utilisé espéré d'animaux est de 3, les 3 autres sont prévus et seront commandés uniquement en cas de problème.

Raffinement

Durant et pendant la chirurgie, des analgésiques, des anesthésiques et des antibiotiques seront administrés aux animaux afin de supprimer les douleurs et de diminuer les risques d’infections. En post-opératoire il sera aussi administré des analgésiques et des antibiotiques afin de réduire au maximum les douleurs et les risques d’infections. Lors de la phase d’intoxication à la toxine les animaux serons isolé pendant 72h toutes les deux semaines. Afin de diminuer le stress des animaux, un programme d’habituation aux conditions expérimentales est mis en place dans l’animalerie. Ces habituations consistent en des entrainements et se feront selon un protocole progressif, dans lequel chaque étape est apprise progressivement et est récompensée. Un tableau de progression est utilisé pour suivre les progrès des animaux. Les techniciens de l’animalerie et les membres de la cellule bien-être animal s’assureront par des visites régulières qu’aucune souffrance ou mal être n’est ressenti par l’animal au cours de l’expérimentation. Le personnel impliqué sur le projet est formé au bien-être animal. Des points limites suffisamment précoces et adaptés à la procédure expérimentale ainsi qu'un arbre décisionnel pour intervenir le plus rapidement possible pour limiter la souffrance animal sont mis en places.

Choix des espèces

Le primate non-humain fait partie des mammifères les plus proches de l’espèce humaine. Son anatomie cérébrale est très proche de celle du cerveau humain. Les Macaques fascicularis, qui ne constituent pas une espèce de primates menacée d’extinction, possèdent des circuits neuronaux proches de ceux de l’humain et permettent ainsi la compréhension des circuits neuronaux impliqués dans les mécanismes du comportement de veille/sommeil, ce qui n’est pas le cas des rongeurs qui ont un rythme inversé avec des cycles plus courts. Il est possible de reproduire chez cet animal un syndrome parkinsonien similaire à celui observé chez les patients s'accompagnant de plus d'un trouble de sommeil comme chez le patient parkinsonien. Des adultes seront utilisés dans cette étude car les traitements à développer à la suite visent des patients adultes.

739 poissons médakas vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des mâles passent cinq semaines dans une eau à 32 °C, une température qui réduit fortement la mobilité de leurs spermatozoïdes, puis subissent sous anesthésie un prélèvement de sperme par pression sur le ventre, et leurs descendants sont étudiés sur une ou deux générations. Les poissons élevés à 32 °C et leurs descendants sont tués, comme une partie des témoins dont on prélève les testicules, tandis que 157 témoins élevés à 25 °C pourront être réutilisés. Les retombées annoncées visent l'aquaculture, où selon le porteur le coût de la réfrigération impose de connaître les températures qui permettent de "maintenir le bien-être et les performances des animaux". Sa réponse sur le remplacement tient en une phrase : il n'existe "pas d'alternative", puisque l'équipe étudie précisément la spermatogenèse à température élevée.

Objectifs

Les poissons présentent une importante plasticité phénotypique (grande capacité d'adaptation) face aux variations environnementales. A l’interface entre l’environnement et l’ensemble des gènes, des molécules dites «méthyle » (groupements CH3), constituent un code dit « épigénétique » ou méthylation de l'ADN. Elles sont capables d’interagir avec l’ADN sous l’influence de l’environnement et permettre par exemple, la mise en place d'un métabolisme adapté à un changement de température. On appelle méthylome l'ensemble des groupes méthyle pour une cellule ou pour un tissu donné. Chez la truite arc-en-ciel, une augmentation de 4°C de la température d’élevage durant la spermatogénèse entraîne des modifications de la méthylation de l’ADN des spermatozoïdes produits. Ces spermatozoïdes sont cependant fonctionnels, et donc susceptibles de transmettre leurs modifications épigénétiques à la descendance, et d’en impacter leurs performances, ou au contraire, favoriser leur adaptation à un environnement changeant. Les gènes impactés concernent la spermiogénèse (fonction de reproduction) et de métabolisme lipidique (fonction de croissance). Dans un contexte de réchauffement climatique, ces résultats soulignent la nécessité de tester comment des variations épigénétiques du spermatozoïde induites par une augmentations de température peuvent impacter les performances des descendants de première (F1), voire puis seconde (F2) génération. L'objectif de ce projet est donc d'aborder le rôle de la méthylation de l'ADN dans la transmission paternelle inter et transgénérationnelle des effets de température chez le poisson. Pour ce type d'étude, l'espèce modèle médaka (Oryzias latipes) est parfaitement adaptée, du fait de son court temps de génération, et de l'importance des ressources génétiques disponibles. Notre première hypothèse de travail : le méthylome de l'ADN du sperme de médaka est sensible à la température d'élevage au cours de de la spermatogenèse. La deuxième hypothèse : le méthylome de l'ADN du sperme contribue au développement embryonnaire et adulte et module les phénotypes. La troisième hypothèse : les altérations du méthylome de l'ADN sont transmises de génération en génération à travers la ligné germinale mâle et persistent même lorsque les individus ne sont plus exposés à la température élevée.

Bénéfices attendus

Nous nous intéressons au gamète mâle, comme vecteur intergénérationnel d'information sur les conditions de vie des individus (potentiellement changeantes). L'objectif du projet est de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la réponse des poissons à une augmentation de température, à l'échelle inter- puis trans-générationnelle, dans un contexte de changement climatique. Il s'agit donc d'évaluer leur aptitude à s'adapter au fil des générations, ou au contraire, mettre en évidence les possibles challenges de performances auxquels ils font face en étudiant plus particulièrement les effets sur les capacités reproductives. Pour les espèces d'aquaculture ces connaissances pourront influencer les pratiques d'élevages. En effet, la température de l’eau est une composante particulièrement difficile à moduler en élevage ouvert classique, et la période estivale coïncide avec des étapes clefs de la gamétogénèse chez de nombreuses espèces domestiques, dont les salmonidés. L’augmentation des températures estivales ces dernières années pose la question de la plasticité de ce processus gamétogénétique et de la façon dont les dernières étapes de la spermatogénèse peuvent être affectées. Le développement récent des élevages en système clos (eau recirculée) permet dans une certaine mesure de contrôler ce paramètre, mais les coûts de réfrigération de l’eau imposent de bien connaître les limites de température qui permettent de maintenir le bien-être et les performances des animaux. Aborder l’impact des températures d’élevage pendant la gamétogénèse est donc un enjeu important pour l’aquaculture à la fois continentale et marine.

Procédures

Les interventions prévues sont des prélèvements de sperme. Ils seront réalisés sous anesthésie et durent moins d'une minute. Pour cela,après anesthésie, les poissons sont sortis de l'eau et placés sous loupe binoculaire. Grâce à une légère pression exercée sur la partie ventrale, environ 1 à 2 µL de sperme sont émis et collectés dans une pipette. Les poissons sont alors placés en bac de réveil. Pour cette procédure, les expérimentateurs sont munis de gants en latex et les animaux sont pêchés délicatement à l'aide d'une petite épuisette.

Impact sur les animaux

Une première expérience a permis de déterminer la température et la durée d’exposition. La température d’exposition à 32°C pendant 5 semaines a été validée : les poissons médaka élevés à 32°C pendant un cycle de spermatogénèse présentent une forte diminution de la motilité des spermatozoïdes, mais néanmoins, les mâles testés étaient toujours capables de féconder des œufs et de produire une progéniture, (embryons éclos). D'après la littérature et nos premières observations, l'exposition à 32 °C pendant 5 semaines pendant la spermatogenèse ne produit pas de phénotype dommageable chez la descendance. De plus, aucun comportement de type pathologique n'a été observé après exposition à 32°C lors de notre expérience précédente. Les risques potentiels attendus : stress thermique ; modifications de la prise alimentaire et métabolisme énergétique ; altération de la spermatogénèse ; stress de capture.

Devenir

Les animaux élevés à 32°C et leurs descendants ne pourront être réutilisés. En effet nous suspectons que ce dispositif expérimental affecte un certain nombre de paramètres biologiques, dont l'épigénétique des poissons. Ils seront euthanasiés. Parmis les animaux contrôles issus de contrôles (élevés à 25°C), certains devront être euthanasiés afin de prélever leurs testicules pour des analayses moléculaires ou cellulaires. En revanche, 157 animaux contrôles issus de contrôles (élevés à 25°C) pourront être réutilisé après avoir participé au test de fécondance ou à la génération suivante.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative à cette expérimentation animale car nous recherchons précisément les mécanismes intervenant pendant une spermatogénèse à température augmentée.

Réduction

Le nombre d’animaux est adapté au plus juste pour permettre des analyses statistiques fiables malgré les fortes variabilités entre les individus. En outre, nous organisons l'emploi des animaux et les méthodes de manière à réutiliser les animaux pour plusieurs approches : les femelles utilisées pour les tests de motilité du sperme seront également utilisées pour la génération des F1, les mâles analysés en motilité du sperme permettront également de réaliser les analyses moléculaires (méthylation ADN et transcriptomique), et les mâles étudiés au niveau histologique seront également testés pour la qualité mitochondriale de leur sperme.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans les conditions optimales pour l'espèce (photopériode, qualité d'eau, densité, conditions sanitaires) à l'exception du lot de mâles exposés à 32°C. Il s'agit cependant précisément de l'objet de l'étude (effet du réchauffement) et la littérature ne montre pas de mortalité chez des médakas élevés à cette température. Les bacs seront enrichis (ajout de plantes artificielles), les animaux toujours manipulés délicatement, avec des gants en latex et pêchés avec une petite épuisette. Les mesures de taille et de poids, ainsi que les prélèvements d’oeufs et de spermes sont des gestes doux, très rapides et non invasifs. Les prélèvements de sperme, nécessitant un geste précis, seront réalisés sous anesthésie pour limiter le stress des animaux. Les mesures de taille et poids seront réalisées lors de la même anesthésie et très rapidement (moins de deux minutes par animal, mesures poids, taille, et prélèvement du sperme compris).

Choix des espèces

Choix de l'espèce medaka Oryzias latipes : - court temps de génération en prévision d'étude d'effets inter- et transgénérationnels - spermatogénèse continue (et non saisonnière) - techniques édition génome et épigénome accessibles - ressource importante pour intégration de données bio-informatiques, bibliographie, outils moléculaires (anticorps par exemple) - spermatozoïde à histones (contrairement au zebrafish), plus proche des modèles mammifères Nous travaillerons avec des adultes de 4.5 mois car nous souhaitons étudier la spermatogénèse qui a lieu chez les mâles adultes, et la capacité des spermatozoïdes à féconder des oeufs (émis par des femelles adultes de 4.5 mois).

4 644 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour cribler des candidats médicaments anticancéreux de type anticorps-médicament. Elles reçoivent une greffe de tumeur humaine sous la peau sur animal vigile, puis des injections intraveineuses répétées, et sont mises à mort à l'atteinte de points limites ou en fin d'étude. Le porteur précise que les souris non entrées en protocole seront "réformées" pour l'entraînement aux gestes techniques avant d'être tuées. Il affirme que les preuves in vitro sont déjà faites et qu'"aucune alternative" ne peut se substituer au modèle souris pour une greffe de tumeur humaine.

Objectifs

Ce projet dans son ensemble vise à développer de nouvelle thérapie ciblée à visée thérapeutique humaine de type conjugué-drogue-anticorps (ADC). Ces thérapies de rupture permettent de cibler spécifiquement les cancers habituellement de très mauvais pronostiques (poumon, tète et cou, colorectal, utérus, ovaire, pancréas…), tout en minimisant les effets secondaires et représente l’un des meilleurs espoirs depuis l’avènement des immunothérapies anticancéreuses. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats d’efficacité permettront de désigner le meilleur candidat ainsi que sa dose minimale efficace et les meilleures fréquences d’administration. Ce projet est articulé en trois procédures consécutives et dépendantes les unes des autres : La Procédure-1 permettra de déterminer les meilleurs modèles de tumeurs humaines greffées dans des souris démunies de système immunitaire par rapport à des cibles thérapeutiques choisies (CDX). La procédure-2 consiste en une étude Pilote d’efficacité antitumorale en utilisant un/des médicament/s de référence. La Procédure-3 permettra de déterminer quels sont les meilleurs candidats médicaments, ainsi que leur dose et fréquences d’injections optimales en utilisant le/les modèles sélectionnés (CDX) dans les Procédures 1 et 2.

Bénéfices attendus

Ce projet dans son ensemble vise à développer de nouvelle thérapie ciblée à visée thérapeutique humaine de type conjugué-drogue-anticorps (ADC). Ces thérapies de rupture permettent de cibler spécifiquement les cancers habituellement de très mauvais pronostiques (poumon, tète et cou, colorectal, utérus, ovaire, pancréas…), tout en minimisant les effets secondaires et représente l’un des meilleurs espoirs depuis l’avènement des immunothérapies anticancéreuses. Les données d’efficacité sont les données les plus importantes avec les données de tolérance afin de pouvoir choisir les candidat médicaments ayant la meilleur fenêtre thérapeutique (c'est à dire la meilleur efficacité pour le moins d'effets indésirables), chez les patients. ainsi, ces études permettront de définir quels seront les meilleurs candidats médicaments contre les cancers ciblés et de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser lors des premières études cliniques chez l’Homme. La première et la seconde procédure permettront de sélectionner et caractériser le/les meilleurs modèles tumoraux. La troisième procédure permettra de déterminer quels sont les meilleurs candidats médicaments, ainsi que leur dose et fréquences d’injections optimales (en vue d’une phase clinique chez l’Homme), en utilisant le/les modèles sélectionnés dans les procédures précédentes.

Procédures

# Après une semaine d'adaptation à l'environement, les souris seront identifiées: - Soit par poinçonnage auriculaire sur souris vigiles (2-3 minutes si moins de 100 souris). - Soit par puçage électronique (injection sous-cutanée sous-scapulaire du transpondeur), sous anesthésie gazeuse (4-6 minutes). # Greffe tumorale sur souris vigile en sous-cutané (2-3 minutes). # Les prises de mesure seront effectuées trois fois par semaine et quotidiennement en cas d'approche des points limites. # Traitement des animaux par les differents médicaments par voie intraveineuse sur souris vigiles (2-3 minutes). # Les animaux atteignant les points limites ou en fin d’expérience seront mis à mort.

Impact sur les animaux

# Les animaux subiront un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : change, pesée, contention et anesthésie. # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (1) de la numérotation sur animal vigile par poinçonnage auriculaire, (2) de la greffe tumorale sur animal vigile par injection sous-cutanée ainsi que lors (3) de l’injection par intraveineuse dans le veine de la queue sur souris vigiles des candidats médicaments. # Pour les groupes traités, une diminution de la croissance tumorale est attendue.

Devenir

Pour chacune des trois procédures: - Tous les animaux ayant atteint les points limites ou en fin d’étude seront euthanasiés. - De même, les souris non entrées en protocole seront réformés pour l’entrainement aux gestes techniques avant d’etre mises à mort. La SBEA assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.

Remplacement

Les preuves de concept d’efficacité de ces candidats médicaments anticancéreux hors organisme vivant (dits in-vitro et ex-vivo), ont déjà été effectuées avec succès. A présent, seul un modèle physiologique complexe (organisme vivant) est nécessaire pour permettre de poser les bases d’une étude clinique afin d’obtenir des résultats représentatifs en terme de doses et de fréquences. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet étant cross-réactif (cible anticancéreuse comparables entre l’Homme et la Souris), aucune alternative ne peux se substituer à un modèle Souris.

Réduction

La procédure-1 et 2 permettent de mettre au point les modèles, de les caractériser au mieux et de diminuer les nombres d'animaux utilisés en procédure-3. Elles sont toutes deux effectuées sur un nombre limité d’animaux (sans toutefois mettre en péril l’interprétation des résultats). En effet, seul(s) le(s) modèle(s) ayant donné satisfaction lors des procédures 1 et 2 seront utilisés pour la procédure-3 avec un nombre d'animaux optimisé par rapport à chaque modèle. Par ailleurs dans les procédures 2 et 3, le fait de tester une dose en injection unique ou répétée une à deux fois en fonction des résultats obtenus au fil de l’eau, permet de diminuer drastiquement le nombre de groupes utilisés.

Raffinement

Les animaux, démunis de système immunitaire, seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels, bâtons à ronger), dans des conditions sanitaires permettant de ne pas etre infectées. Il est à noter que les enrichissements de type nid ou rouleaux en cartons seront proscris à partir de la greffe tumorale afin d'éviter toute plaie sur les tumeurs et seront compensés par une augmentation des quantités de balles de coton et de bâtons à ronger. Avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées (période de stabulation) pendant une période d’une semaine afin de limiter leur stress. Une surveillance comportementale et physiologique poussée des animaux ainsi que la définition d’une grille de score adaptée et suffisamment prédictive permettra d’anticiper et éviter au mieux toute souffrance animale. La surveillance des animaux sera quotidienne et les prises de mesure effectuées trois fois par semaine avec une analyse scorée des critères physiques et comportementaux, du poids corporel et du volume tumoral et de la qualité de la tumeur (homogénéité, permettant la mobilité de l’animal…). Le point limite du volume tumoral sera de 1500mm3. La nécrose ou la gêne à la mobilité due à la tumeur constitueront également des points limites. Un système de surveillance est mis en place au sein de l'EU pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue le week-end et les jours fériés. Les animaux inclus dans la grille de score mais n’atteignant pas les critères éthiques de mise à mort recevront des soins conservateurs adaptés (alimentation et abreuvement facilités, réchauffement, isolement...). Les souris atteignant les points limites ou en fin d’expérience seront mises à mort. Les souris non entrées en protocole seront réformées pour entraiment des gestes techniques avant d’être mises à mort. La SBEA assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.

Choix des espèces

S’agissant d’analyses d’efficacité par voie intraveineuse, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. Afin d’étudier les effets de candidats médicaments sur des greffes de tumeurs humaines, , des animaux immunodéprimés (démunis de système immunitaire), sont nécessaires afin d’éviter tout rejet des cellules humaines par le système immunitaire. La souris est une espèce animale à la fois petite et parfaitement caractérisée pour ces études (avec des données permettant de transposer ces données chez l’Homme). En plus, les données de tolérances et de pharmacocinétique seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux la fenêtre thérapeutique de ces candidats médicaments. Enfin, les candidats médicaments étudiés dans ce projet étant cross-réactif entre la souris et l’humain (cibles exprimées de façon identique entre la Souris et l’Homme), aucune alternative ne peux se substituer à un modèle Souris. Les animaux immunodéprimés (démunis de système immunitaire), seront livrés entre 7 et 8 semaines de développement et inclus en expérience entre 8 et 9 semaines (après 7 jours d’acclimatation dans l’EU). A cet âge-là, les animaux sont adultes avec des organes matures permettant une allométrie pertinente par rapport aux thérapies médiées par des anticorps. Il est à noter que le phénotype « immunodéprimé » ne sera pas un phénotype dommageable dans nos condition d’hébergement et d’expérimentation (animalerie SPF) et expérimentation sous PSM (les souris ne pouront pas contracter d'infections).