Recherche fondamentale

3 macaques, deux rhésus et un macaque à longue queue, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés ou renvoyés en élevage. Chaque animal subit une IRM sous anesthésie, deux chirurgies d'implantation de matrices d'électrodes de douze heures, puis une mise en chaise de contention cinq jours par semaine pendant quatorze à quarante-huit mois, avec restriction hydrique partielle. Le porteur décrit une perte de poids, un stress répété lié à la contention de la tête et un risque d'infection lié aux implants cérébraux. Il précise que le cerveau peut être prélevé en fin de projet, mais que les animaux jugés inutiles à cette vérification sont gardés vivants pour un autre projet ou, pour les femelles, renvoyés en élevage.

Objectifs

Du fait de l’importante variabilité de nos comportements moteurs, nous produisons souvent des mouvements qui ne correspondent pas précisément à ce que nous avions anticipé. Un exemple frappant est notre incapacité à reproduire des mouvements identiques, même dans des conditions très contrôlées. Cette variabilité irréductible de nos comportements pose un défi fondamental au système nerveux : pour que les individus apprennent et s'épanouissent dans leur environnement, le cerveau doit être doté de la capacité de détecter, d'attribuer et, finalement, de corriger les erreurs qui génèrent des résultats négatifs. Cette fonction est au cœur de bon nombre de nos comportements quotidiens et se trouve au cœur de nos capacités d'apprentissage. Pourtant, sa base neuronale reste largement inconnue : quels mécanismes permettent au cerveau d’évaluer ses propres performances motrices ? Notre hypothèse est qu’une grande partie de la variabilité de nos mouvements et de ses ajustements provient de processus cérébraux en lien avec la planification du mouvement, c'est-à-dire avant même que l’exécution du mouvement n'ait commencé. Ces processus mettraient en jeu la capacité des sujets à auto-évaluer si le mouvement à venir est correctement planifié. Pour aborder cette problématique nous allons entraîner des singes macaques dans des tâches comportementales dans lesquelles les animaux devront planifier puis exécuter un mouvement, avant d’évaluer leur performance motrice. Pour étudier les bases cérébrales de ces comportements, nous utiliserons des techniques d’enregistrements électrophysiologiques permettant de mesurer localement l’activité de populations de neurones du cortex cérébral. Nous utiliserons pour cela des matrices d’électrodes implantées de manière durable dans différentes aires cérébrales des parties postérieures et antérieures du cerveau. Selon la qualité de ces enregistrements chroniques, nous opterons éventuellement pour une approche d’enregistrement complémentaire qui consistera en l’implantation d’une chambre d’enregistrement à travers laquelle des électrodes type laminaire seront introduites quotidiennement afin d’enregistrer l’activité neuronale.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu, à court et moyen terme, est l’élargissement des connaissances sur les réseaux fronto-pariétaux impliqués dans les comportements sensorimoteurs et métacognitifs. Le jeu de données récolté sera d’une précision spatiale et temporelle inédite et couvrira différents états cérébraux. Les objectifs sont de : (i) Caractériser les réseaux fronto-pariétaux fonctionnels. Cela comprend la dynamique des interactions corticales, et cela au travers de différents états cognitifs allant de l’anesthésie, à l’auto-évaluation motrice, en passant par la préparation et l’exécution de mouvements dans des tâches visuomotrices complexes. (ii) Quantifier la contribution des réseaux fronto-pariétaux à la communication neuronale ascendante et descendante. (iii) Caractériser la dynamique des activités neuronales unitaires dans et à travers différentes aires fronto-pariétales. Cela comprend les fréquences et la variabilité d’occurrence des potentiels d’action des neurones supposés excitateurs et inhibiteurs. Ces informations pourront être comparées à celles rapportées pour les aires sensorielles des primates et d'autres espèces de mammifères. (iv) Manipuler les états cérébraux durant des processus sensorimoteurs et métacognitifs via l’utilisation d’une interface cerveau machine. (v) Fournir ces jeux de données à la communauté scientifique pour contraindre/valider/étendre les modèles computationnels existants.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Déplacement au centre IRM pour acquisition d'images, sous anesthésie, 1 fois pour une durée d'environ 4h. - Chirurgies d'implantation de matrices d'électrodes, sous anesthésie, 2 chirurgies pour une durée d'environ 12h chacune. Si nécessaire, deux chirurgies supplémentaires seront réalisées pour l’implantation d’un plot de tête et d’une chambre d’enregistrement. - La prise quotidienne de l'animal en chaise pour entrainement et enregistrements électrophysiologiques, environ 1h30 (jusqu'à 3h), 5 jours par semaine, durant 14 à 48 mois. - La prise de l'animal en chaise pour microstimulations, 20 sessions d'environ 1h30 (jusqu'à 3h). - La prise de l'animal en chaise pour enregistrements électrophysiologiques sous anesthésie gazeuse ou pharmacologiques, 25 sessions (habituation + enregistrement) d'environ 2h (jusqu'à 3h).

Impact sur les animaux

Ce projet utilisera des macaques qui entreront dans une procédure avec une sévérité classée modérée. La plupart des étapes de la procédure utilisée seront susceptibles de créer une nuisance aux animaux. i) Les premières fois où les animaux seront mis en chaise pour leur venue dans le laboratoire pourront causer du stress lié à la prise de l’animal à l’aide d’une canne et à son déplacement depuis sa cage d’hébergement jusqu’à la chaise primate. ii) La restriction des mouvements de la tête des animaux à l’aide d’un masque de contention ou d’un plot, nécessaire pour l’enregistrement des mouvements oculaires et électrophysiologiques, sera également source de stress lors des premières mises en place du masque. Nous pouvons tout de même prévoir plusieurs semaines de stress liées à la mise en contention dans le masque. iii) La restriction hydrique partielle liée au besoin expérimental pourra engendrer une perte de poids partielle durant toute la durée de l’expérience. Les animaux seront donc pesés au minimum deux fois par semaine et surveillés quotidiennement afin de prévenir toute perte excessive de poids. iv) L’anesthésie et l’intubation de l’animal nécessaires aux procédures d’IRM et de chirurgie d’implantation du plot ou des matrices d’électrodes pourront créer de la douleur post-opératoire à l’animal durant plusieurs jours. v) L’animal pourrait ressentir de la douleur et développer une infection liée à l’implantation des matrices d’électrodes ou (le cas échéant) à la chambre d’enregistrement. vi) Afin de laisser l’animal cicatriser, il devra être isolé durant une semaine du contact physique de ses congénères après l’opération d’implantation des matrices d’électrodes pouvant potentiellement créer un stress supplémentaire. vii) Durant les enregistrements sous anesthésie partielle mais pendant lesquels l’état d’éveil sera maintenu, un masque délivrant le gaz anesthésique sera fixé à la tête de l’animal et cela pourrait augmenter le niveau de stress de l’animal. viii) Bien que la partie du protocole prévoyant des enregistrements électrophysiologiques sous anesthésie soit de courte durée, elle induira un effet cumulatif lié à la répétition des anesthésies dont les conséquences potentielles sur le bien–être des animaux devront être surveillées.

Devenir

Les animaux seront mis à mort ou gardés en vie. L’objectif est de prélever le cerveau de l'animal en fin de projet afin de préciser par une analyse post-mortem la localisation et l'état de préservation des zones corticales ayant fait l'objet des enregistrements électrophysiologiques. En particulier, deux scénarios peuvent nécessiter une analyse post-mortem de la localisation et l'état de préservation des zones enregistrées. 1) les données obtenues chez différents animaux sont très dissimilaires, mettent en question la bonne implantation dans les zones ciblées. 2) Une mauvaise qualité des signaux électrophysiologiques, ou une forte détérioration des signaux à travers le période d’enregistrement peut suggérer un dommage important de tissu cortical autour des matrices. Cela sera important à considérer pour l’analyse des données, et pour une future utilisation du même dispositif dans des autres animaux. Si chez certains animaux, après la fin de l'enregistrement des données, on estime qu'il n'est pas nécessaire de procéder à une vérification post-mortem, les animaux seront gardés en vie. Dans ce cas, le connecteur et les câbles pour les matrices seront coupés, laissant les matrices en place. Les connecteurs seront explantés du crâne et la peau sera fermée et suturée. Après une récupération complète de l’état de santé et de bien-être général, les animaux gardés en vie peuvent 1) si possible, être inclus dans un autre projet basé sur un dispositif expérimental similaire, permettant d’éviter l’utilisation des autres animaux naïfs (réduction). Les animaux réutilisés seront déjà habitués au contexte expérimental (interactions quotidiennes avec l’homme, mis en chaise, travail dans le dispositif comportemental). Sinon, 2) en particulier les femelles peuvent retourner dans un établissement d’élevage pour être inclues dans un programme de reproduction.

Remplacement

Le projet implique l’utilisation d’animaux car à ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives permettant de répondre à nos objectifs scientifiques. Aucune simulation informatique ou culture cellulaire ne peut remplacer le modèle animal vivant pour l'étude des substrats neuronaux de comportements visuomoteurs complexes. Les techniques électrophysiologiques utilisées dans le projet, permettant une mesure de l'activité de neurones unitaires, bien qu'utilisées en milieu clinique, restent trop invasives pour être utilisées chez l'homme pour des approches expérimentales.

Réduction

Les procédures chirurgicales prévues comportent un certain risque. En outre, la qualité des enregistrements à long terme est difficile à évaluer, car l’intégration de l’implant dans le cortex peut être variable d’un animal à l’autre. Nous prévoyons d'inclure un maximum de trois animaux dans cette étude. Si nous obtenons suffisamment de données (neurophysiologiques et comportementales) pour une analyse statistique satisfaisante chez deux animaux, nous n'utiliserons pas de troisième animal. L’entrainement dans la tâche comportementale visera à limiter au maximum la variabilité entre animaux pour homogénéiser les observations. L’enregistrement avec plusieurs matrices multi-électrodes permettra de mesurer l’activité de populations neuronales dans plusieurs structures corticales. Le nombre de neurones enregistrés peut varier d’une matrice à l’autre en fonction du succès de la procédure d’implantation. La richesse des enregistrements multi-électrodes offre la possibilité de réaliser de très nombreux types d’analyses portant sur les potentiels d’actions de neurones isolés (modulation de fréquence de décharges ou de synchronisation entre neurones dans différentes périodes de la tâche ou dans différentes structures), sur les populations de neurones (distribution spatiale de l’activité, moyennes de populations), sur les potentiels de champs locaux (LFP) et sur la synchronisation entre LFP et potentiels d’actions. La répétition des séances d’enregistrement sur une durée de 2 à 12 mois a pour objectif d’augmenter le nombre de neurones différents enregistrés dans chaque structure. Cette augmentation permet d’augmenter la puissance statistique de nos analyses, et d'évaluer la stabilité des modulations neuronales et comportementales détectées à travers plusieurs mois. La durée totale des enregistrements pour un animal est étroitement dépendante de la qualité du signal lors des premiers enregistrements et de sa stabilité sur le long terme. De fait, elle ne peut être définie à priori mais dans une situation optimale, elle peut se prolonger sur plusieurs années.

Raffinement

La cage et volière de l’animal sont enrichies de perchoirs, de cordes et de jeux suspendus et sont en contact visuel et sonore avec les cages de leurs congénères pour favoriser les comportements exploratoires et sociaux de l'animal et aussi le retour à une activité normale en période post-chirurgicale. Après un délai minimal d'une semaine et selon l'état de récupération, l'animal sera sorti en chaise afin de reprendre une routine qui lui est familière. Les méthodes de renforcement positif (training et habituation) seront utilisées afin de réduire le stress des sujets. L’IRM anatomique pre-chirurgicale permet de mieux planifier l’implantation des matrices chroniques, pour bien atteindre les aires corticales ciblées. L'utilisation du masque de contention au lieu d’un plot de tête fixé sur l’os est moins invasive et sera favorisée si elle permet d’atteindre les objectifs du projet. Les matrices multi-électrodes de nouvelle génération permettent des enregistrements simultanés de neurones dans différentes aires et couches corticales, ce qui implique une réduction d'études et de sujets utilisés, comparé aux recherches effectuées avec des électrodes simples. Le connecteur pour l’implant dans le deuxième hémisphère sera connecté sur la même base de connecteur, déjà fixée sur l’os.

Choix des espèces

Les singes macaque sont les primates non humains les plus couramment utilisés par les laboratoires de recherche étudiant les processus visuomoteurs. Ce choix s’appuie sur la proximité des systèmes visuel (vision diurne binoculaire et trichromatique) et moteur (utilisation du bras pour saisir et manipuler les objets) ainsi que celle de l’anatomie fonctionnelle du cerveau entre les macaques et l’homme. L’utilisation répandue des macaques en neuroscience a permis l’optimisation des procédures d’entraînement ainsi que celle de la gestion de leur alimentation, de leur hébergement et des soins vétérinaires. Les macaques s’adaptent rapidement aux protocoles de conditionnement comportemental et présentent des performances comportementales très similaires à celles observées chez l’homme. Dans ce projet, nous utiliserons indifféremment des macaques rhésus ou fascicularis pour la réalisation de l’étude, en fonction de la disponibilité des animaux. En effet ces deux espèces présentent des habiletés visuomotrices et une organisation cérébrale comparable. Les animaux seront utilisés au stade de jeune adulte/adulte. A ce stade du développement, les animaux ne sont plus en croissance et leurs besoins physiologiques sont stabilisés. Cela permet un contrôle plus précis des protocoles expérimentaux, que ce soit en termes de volume des récompenses utilisées pour l'apprentissage par renforcement, de contrôle du régime alimentaire dans la cage ou de localisation des structures cérébrales cibles pour les implants chirurgicaux. Par ailleurs, les animaux étant encore jeunes, ils présentent une meilleure tolérance aux procédures expérimentales et une meilleure récupération suite aux procédures nécessitant une anesthésie.

100 souris et 12 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris reçoivent des injections, portent une capsule fixée sur le dos et sont infestées par des tiques, les lapins étant utilisés pour produire du sérum, avant mise à mort pour prélever le sang et les organes. Le porteur indique que l'alimentation des tiques provoque un inconfort modéré et que la pose des capsules a été optimisée pour le limiter. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la réponse immunitaire de la souris à une vaccination anti-microbiote de tique.

Objectifs

L'implication du microbiote (bactéries symbiotique de la tique) de la tique dans la survie des tiques et dans la transmission des agents pathogènes transmis par ces dernières a déjà été signalée pour différentes espèces de tiques. Ces preuves renforcent le fort potentiel du microbiote des tiques en tant que cible pour le développement de stratégies de contrôle. Il est prouvé que la présence de certaines espèces de ces bactéries (symbiotes) favorise l'établissement d’agents pathogènes chez les tiques, alors que la présence d'autres espèces de bactéries a été associée à l'absence d’agents pathogènes chez la tique. Dans ce contexte, l'objectif principal de ce projet de recherche est de cibler deux types de bactéries symbiotiques pour évaluer les effets de la vaccination de souris par ces bactéries sur la composition du microbiote de la tique, sur l'limentation et la survie de tique et enfin sur l'acquisition d'un agent pathogène par la tique.

Bénéfices attendus

Les tiques transmettent des maladies graves à l'homme et aux animaux. Cependant, la lutte contre les tiques repose uniquement sur les acaricides, qui peuvent contaminer l'environnement et les produits d'origine animale (par exemple, le lait et la viande) consommés par l'homme. En outre, les acaricides peuvent sélectionner des populations de tiques résistantes. Malgré la gravité des maladies transmises par les tiques, la prévention repose uniquement sur l'évitement des piqûres de tiques. Les tiques abritent une communauté de microbes (microbiote) comme les autres animaux. Chez les tiques, le microbiote joue un rôle dans la survie et le développement des tiques ainsi que dans leur capacité à transmettre des agents pathogènes. Ce projet vise à développer une stratégie plus sûre de lutte contre les tiques, basée sur des vaccins anti-microbiote de tique utilisés chez la souris.

Procédures

Souris animaux vigiles : 2 injections et 3 prélèvements. Pose de capsule sur le dos des souris. Infestation avec tiques Lapins = Animaux vigiles : 2 injections et 2 prélèvements.

Impact sur les animaux

Chez les souris, l’alimentation des tiques induit un inconfort modéré. De plus, les souris peuvent simplement se sentir mal à l'aise lorsque la capsule est placée sur leur dos. Cependant, le placement des capsules sur le dos de l'animal a été optimisé pour minimiser l'inconfort chez l'animal et maximiser les résultats expérimentaux. Pas de symptômes attendus suite à l'inoculation des agents pathogènes mais surveillance quotidienne des animaux (souris et lapins).

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupération du sang total et des organes.

Remplacement

Ce projet vise à nourrir des tiques sur des souris préalablement immunisées avec des bactéries non pathogènes afin d'évaluer les effets sur la composition du microbiote de la tique, l'alimentation/survie de la tique et l'acquisition d'une bactérie pathogène (Rickettsia) par la tique. Il n'existe pas de modèle in vitro pour remplacer la réponse immunitaire des souris à une infection bactérienne afin d'analyser les effets sur le microbiote des tiques et la colonisation des pathogènes. Afin de disposer d'un plus grand volume de sérums pour des études supplémentaires in vitro, nous immuniserons également des lapins, évitant ainsi l'utilisation de souris supplémentaires. Dans le cadre de ce projet nous ne cherchons pas à simplement infecter des tiques par des bactéries, nous avons besoin d’évaluer l’efficacité d’une vaccination chez la souris avec deux bactéries sur le gorgement/survie et capacité à s’infecter des tiques. Il existe des systèmes de gorgement et d’infection artificielle des tiques mais ces systèmes ne permettent pas d’évaluer la réponse immunitaire des souris suite à une vaccination. La production/cultures des bactéries est par ailleurs réalisée par culture cellulaire in vitro.

Réduction

Chaque souris peut nourrir au maximum 30 tiques. Mais par souris entre 20-25 tiques vont se détacher sans faire un repas complet ou mourir donc nous obtiendrons 5-10 tiques gorgées par souris donc il faut prévoir 5 souris pour groupe pour obtenir 25-50 tiques gorgées par groupe au total, nombre nécessaire à nos analyses. Le nombre d'animaux a été comptabilisé pour être le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir le nombre de tiques gorgées nécessaires à nos analyses. Nous avons comptabilisé le nombre minimal de lapin nécessaire à l’obtention du volume necessaire de serum pour nos futures experimentations in vitro. Pour nos expérimentations futures in vitro, nous avons besoin durant les 5 années du projet d’un volume total de 60ml de sérums de lapins immunisé pour chaque bactérie (deux bactéries) et le même volume pour chaque lapin contrôle (deux contrôles). Nous avons donc estimé avoir besoin de 3 lapins par groupe (environ 20ml de sérum pouvant être récupéré par Lapin) soit un total de 12 lapins sur les 5 ans du projet.

Raffinement

Les souris seront hébergées par lot de 3 dans leurs conditions classiques avec l’enrichissement nécessaire à leur bien-être (carré de coton, maison en plastique pour les souris). Il n’y a aucune souffrance attendue suite à l’infection par les bactéries lors des immunisations, les infections sont asymptomatiques chez les souris et les lapins. Pas de points limites dans ces conditions. Cependant, après inoculation des agents pathogènes, l’état clinique des animaux (état général) sera contrôlé chaque jour, pour arrêter l'expérience si nécessaire par mise à mort des animaux. Les animaux seront mis à mort en cas de déshydratation ou signes neurologiques (début de paralysie notamment). Nous n'attendons donc pas de symptômes importants tels que des paralysies chez les souris, mais nous suivrons les animaux tous les jours afin de contrôler l'apparition de symptômes éventuels. Lorsque les souris auront des capsules sur le dos avec des tiques, elles devront être hébergées en cage individuelle, en effet les souris sont capables d'enlever les capsules du dos des autres souris et de manger les tiques. Mais ces souris seront hébergées dans les conditions classiques avec l'enrichissement nécessaire à leur bien être en augmentant le nombre de carré de coton et même si elles sont seules elles pourront voir les autres souris des cages d'à côté. Pour les lapins, à leur arrivée, les animaux seront hébergés dans des cages munies d’une plateforme de repos avec l’enrichissement nécessaire à leur bien-être (balles, branches en bois pour les dents et branches végétales). Les lapins seront observés quotidiennement pendant toute l'expérimentation. Comme les lapins sont des animaux très sensibles à la manipulation, ils seront quotidiennement contrôlés et manipulés par les animaliers et l’expérimentateur pour les habituer à leur présence et aux manipulations.

Choix des espèces

Les 3 lignées de souris ont été sélectionnées car elles sont les plus sensibles aux agents pathogènes (bactéries notamment) transmis par les tiques. Lapin blanc de Nouvelle-Zélande car ce sont les animaux les plus appropriés pour obtenir un grand volume de sérum vacciné en une seule expérience et permettra d'obtenir suffisamment d'anticorps spécifiques contre les bacteries à l'étude. De plus ils ne peuvent pas être utilisés pour infecter des souris car ils ne développement pas de bactériemie suffisante. Souris 7-8 semaines. Lapins = 4-5 semaines. Adaptation des animaux durant une semaine avant l'expérimentation. Souris gardées au plus 39 jours (entre 20 et 39 jours selon procédure). Lapins seront gardés au maximum 30 jours. Mise à mort de tous les animaux au maximum à J39.

199 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles sont soumises à des régimes carencés en vitamine D ou riches en graisses induisant une obésité, à un gavage et à des échocardiographies sous anesthésie, avant une mise à mort pour collecter les embryons. Le porteur étudie l'effet de l'alimentation parentale sur les malformations cardiaques de la descendance, en menant en parallèle un modèle d'organoïdes cardiaques encore à optimiser. Il présente le passage à l'animal comme une étape "indispensable" avant un essai chez l'humain.

Objectifs

Les cardiopathies congénitales sont des malformations cardiaques se développant au cours de la vie intra utérine. Elles surviennent assez fréquemment et touchent environ 10 naissances sur 1000. Il s’agit de pathologies ayant une cause multifactorielle. Les facteurs les plus souvent rencontrés sont les anomalies génétiques, les maladies métaboliques maternelles voire paternelles ou la consommation de drogues, de médicaments ou d’alcool. L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact de différents facteurs nutritionnels, seuls ou en combinaison, sur l’apparition de ces anomalies. (1) La carence en vitamine D : une alimentation maternelle carencée en vitamine D affecte le développement cardiaque de la progéniture par différents mécanismes dont les mécanismes non génétique (2) L’obésité maternelle : bien que fortement suspectée comme ayant un impact négatif sur le développement cardiaque, nous ne savons toujours pas si et comment l’obésité maternelle affecte les embryons. Nous ne savons pas du tout l 'impact du statut nutritionnel paternel. (3) Le sexe fœtal : la réponse métabolique du nouveau-né semble être spécifique au sexe de l’individu . Il est donc intéressant d’analyser les différences développement cardiaque en condition pathologique en fonction du sexe. (4) La flore intestinale : La flore intestinale est susceptible de jouer un rôle de médiateur dans au moins une partie de l’effet des régimes maternels déficients en vitamine D et riches en graisses et avoir un effet délétère sur la formation cardiaque de la progéniture. Cette flore est de plus différent eentre les deux sexes. Notre projet permettra une meilleure connaissance de l 'origine des pathologies cardiaques congénitales.

Bénéfices attendus

le projet devrait permettre de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaire de l impact des regimes maternel ou paternel sur les malformations cardiaques.

Procédures

Gavage 1 min un seul par souris. Echocardiographie sous anesthésie: 30 min 1 seule /souris. Le gavage implique une contention de 30 s de la souris. L’échocardiographie est la technique d’imagerie de choix pour le suivi longitudinal de la fonction cardiaque in vivo et une technique non invasive. Il s'agit d'une procédure indolore ne nécessitant pas d’analgésie. Elle se fait sous anesthésie générale gazeuse simplement pour maintenir la souris immobile sur le dos

Impact sur les animaux

L’obésité des souris en régime gras et le régime sans vitamine D peut leur apporter un inconfort qui néanmoins n'affecte pas leur mobilité ou leur agilité. Elles ne présentent pas non plus de signes de souffrance. Les souris seront observées chaque jour par l’expérimentateur pour contrôler leur état de santé. L’échocardiographie est réalisée sous anesthésie sur un matelas chauffant pour le maintien de leur température. Le gel nécessaire à l’échographie est préchauffé pour minimiser toute nuisance ou inconfort ou stress thermique. Le gavage est une nuisance bien que courte lorsque pratiqué par un expérimentateur très habitué. Le processus prend seulement 30 s et la souris est conditionnée deux jours avant le gavage à la contention de 30 s pour diminuer le stress. Le gavage sera fait une seule fois pour chaque souris pour induire la recombinase at avec une sonde trempée dans l’eau sucrée. L’expérimentateur visite les souris chaque jour de sorte de les habituer au contact humain. Une grille de score jointe au projet sera suivie quotidiennement.

Devenir

Les prélèvements de sang se feront une seule fois par ponction cardiaque au moment de la mise à mort pour la collecte des embryons. Les autres souris seront mises à mort avant reveil au terme de l 'echocardiographie

Remplacement

Notre projet se fera dans la continuité d’une étude in vitro. Le passage au modèle in vivo est une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’Homme. Nous etablissons un modèle cellulaire d'organoides cardiaques en 3D in vitro; Nous utilisons en effet en parallele des cellules souches embryonnaires humaines differenciées en different types de cellules cardiovasculaires au sein de cardioides en 3D. Ce modèle requiert encore une optimisation pour mimer la vraie formation et le fonctionnement d'un coeur.

Réduction

Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour mettre en évidence une apparition d’effets secondaires liés à l’utilisation de notre modèle avec une significativité statistique Les même souris et embryons serviront à de multiples analyses cardiaques. Nous avons donc d' ores et déjà reduit le nombre d animuax dans ce projet au statistiquement strict nécessaire ( test statistique de comparaison de la variance à 2 facteurs pour comparaison inter groupes à l aide du logiciel Graphpad selon les recommandations de "Analyses statistiques des données acquises lors d’analyses fonctionnelles chez la souris. Méthodologie [stat.ME]. 2012. ffdumas-00729021f" . Les données acquises sur cellules humaines validant des données acquises chez les souris permettront de diminuer les effectifs de souris par groupe.

Raffinement

Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). Des points limites clairs seront définis et les animaux seront euthanasiés lorsqu’ils atteindront les critères d’interruption. Dans la mesure du possible, les souris seront plusieurs par cage afin de respecter leur instinct grégaire. Leur milieu sera enrichi par du Sizzle Kraft et des buchettes chaque semaine pour leur permettre de se cacher de la lumière et de les occuper à confectionner leur nid, cela a pour but de réduire leur stress. Les animaux seront observés tous les jours de la semaine et les week-ends, de leur arrivée à leur mise à mort.

Choix des espèces

la souris est un bon modèle de developpement cardiaque comparé à l 'homme et a un microbiote semblable au microbiote humain. La souris permet une étude intégrée de la physiologie

320 chevesnes sauvages vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Capturés par pêche électrique et maintenus jusqu'à dix mois, ils subissent des endoscopies, une infestation contrôlée par des parasites intestinaux et une exposition à des polluants par ingestion, avant dissection. Le porteur reconnaît un stress de captivité, des lésions du tube digestif et des pathologies liées aux polluants. Il affirme que l'étude des interactions hôte-parasite ne peut se faire in vitro ou in silico.

Objectifs

La pollution des cours d'eau affecte les organismes et peut se répercuter sur les interactions biotiques. Certains parasites sont connus pour accumuler des polluants depuis leur hôte, ce qui pourrait aboutir à une atténuation de certains effets écotoxicologiques, comme cela a été montré chez un poisson d'eau douce, le chevesne Squalus cephalus infestés par des acanthocéphales. Ce projet vise à tester les effets de l'exposition aux polluants à des niveaux réalistes d'un point de vue environnemental, sur les relations hôtes-parasites. Tout d'abord il s'agira de tester les méthodes d'endoscopie pour surveiller la présence de parasites intestinaux dans le tractus digestif des poissons. Des manipulations expérimentales de la charge parasitaire et de l'exposition aux polluants seront menéeschez des chevesnes issus de populations sauvages, hébergés en conditions semi-naturelles, afin d'évaluer les réponses écophysiologiques. La règle des 3R a été prise en compte de la manière suivante : 1. remplacement : les questions de recherche portent sur les interactions biotiques, entre un poisson hôte et les parasites intestinaux en réponse à la pollution environnementale, il n'est pas possible de conduire des études in vitro, ex vivo, in silico pour y répondre. 2. réduction : les effectifs ont été réduits à 20 individus par groupe, effectif minimum suffisant pour tester avec robustesse les hypothèses, 3. raffinement : les conditions d'hébergement en mésocosmes ont été optimisées, plusieurs points limites ont été retenus, et les manipulations expérimentales se font dans la gamme de variation communément observée en milieu naturel, que ce soit pour la prévalence en parasites, ou pour l'exposition aux polluants.

Bénéfices attendus

Le projet développera une méthode pour un examen interne des parasites intestinaux. L’endoscopie est une technique maitrisée et courante en médecine humaine et vétérinaire, mais très peu utilisée en écologie. Le développement de la micro-endoscopie permettra d’améliorer les connaissances sur l’état de santé des animaux sauvages, à l’échelle des individus et des populations, sans recourir à des euthanasies. Cette technique permet d’acquérir de multiples donnéeset le suivi à moyen et long terme l’évolution de l’infestation et du développement des parasites. L'étude expérimentale répond également à des questions de recherche fondamentale en écotoxicologie à l'échelle des interactions biotiques, qui sont encore très peu étudiées, les effets étant principalement étudiés à l'échelle des organismes ou des populations.

Procédures

Les individus seront capturés en milieu naturel par pêche électrique, hébergés pour une durée de 10 mois maximum, dans des très grands mésocosmes avec enrichissement du milieu (radeaux flottants végétalisés). Chaque acte durera moins de 5 minutes, sur des poissons anesthésiés. Les interventions consisteront à 1) réaliser un examen par endoscopie (2 examens par individu), 2) manipuler expérimentalement la charge en parasites, via l'utilisation d'un anthelminthique suivie d'une infestation expérimentale par ingestion de cystacanthes (stade juvénile des acanthocéphales à raison de 0, 5 ou 10 parasites par individu, qui seront déposés dans le tractus digestif des chevesnes anesthésiés). Le développement des acanthocéphales nécessite 5 mois d'attente, les chevesnes ne seront pas manipulés pendant ce temps. 3) manipuler expérimentalement l'exposition à des polluants à des doses réalistes d’un point de vue environnemental afin de déterminer les conséquences sur les conditions hôtes-parasites. L'exposition aux polluants se fera par ingestion, à raison d'une fois par semaine pendant 4 semaines. Une prise de sang (sera réalisée sous anesthésie par ponction de la veine caudale afin d’évaluer les conséquences physiologiques, puis les poissons seront immédiatement euthanasiés et disséqués pour quantifier les niveaux de polluants dans les tissus, étudier les effets écophysiologiques et évaluer les conséquences de l’exposition pour les parasites.

Impact sur les animaux

Les nuisances sont : le stress de captivité, stress thermique (les mésocosmes sont à l’extérieur et sont influencés par les températures atmosphériques). L'endoscopie peut provoquer des lésions et irritation du tractus digestif après la phase de réveil post-anesthésie. L'anesthésie et la manipulation hors de l’eau peut engendrer de l'hypoxie, déshydratation, hyperthermie. Lors de l'infestation expérimentale, la fixation des parasites peut provoquer des irritations et lésions de la muqueuse du tractus digestif et limiter les apports nutritifs. L'exposition expérimentale aux polluants peut engendrer des pathologies.

Devenir

L'euthanasie se justifie par la nécessité de comparer le nombre réel de parasites intestinaux par dissection, par rapport au nombre estimé par endoscopie afin de valider la méthode et par le fait que les analyses écotoxicologiques doivent être réalisées sur certains tissus (foie, muscles, rein, tractus digestif) et sur les parasites intestinaux qui ne peuvent être prélevés que post-mortem.

Remplacement

Le projet consiste à tester les effets de l'exposition aux polluants à des niveaux réalistes d'un point de vue environnemental, sur les interactions biotiques, plus particulièrement sur les relations entre les chevesnes et les parasites acanthocéphales. Les acanthocéphales sont des parasites intestinaux présentant la remarquable capacité d'accumuler des polluants depuis leur hôte définitif, les chevesnes, pouvant aboutir à une atténuation de certains effets écotoxicologiques. Pour comprendre les effets à cette échelle biologique (relation entre deux organismes vivants), il est nécessaire d’étudier les effets sur ces organismes. Il n’est donc pas possible de le remplacer par des modèles in silico, in vitro ou ex vivo.

Réduction

320 animaux seront utilisés, soit 20 animaux par lot pour 16 lots au total. Cet effectif correspond au nombre minimum d'animaux calculé à partir de calcul de puissance en supposant une taille d’effet similaire à ce qui a été obtenu lors d’études précédentes. Les données obtenues feront l'objet de traitement statistique des données a posteriori

Raffinement

Les conditions d’hébergement ont été raffinées avec les mésocosmes extérieurs, de grande taille, équipés de radeaux végétalisés flottants permettant de diversifier l’habitat, d’offrir des caches, abris, ombrage et nourriture diversifiées et de contribuer à l’épuration de l’eau. Avant chaque manipulation, les poissons seront anesthésiés. Chaque acte durera moins de cinq minutes. Il seront ensuite surveillés pendant la phase de réveil. Un suivi journalier des poissons et des mésocosmes sera effectué. Lorsque les poissons seront manipulés, des points limites ont été établis afin de réagir rapidement à l’apparition de symptômes attestant d’une souffrance. Le franchissement d’un point limite (anomalie du comportement, altération du rythme operculaire, hypersécrétion de mucus, lésions, pathogènes) engendrera le retrait immédiat de l’individu du mésocosme et sa mise en surveillance. Un avis auprès du vétérinaire référent sera sollicité, un traitement adéquat sera administré ainsi qu’un soulagement de la douleur si nécessaire. Une détérioration plus sévère ou durable de l’état sanitaire conduira à envisager l’euthanasie, qui sera réalisée à l’écart, après anesthésie.

Choix des espèces

L'espèce a été choisie car 1. plusieurs études ont montré l'accumulation de divers polluants dans leurs parasites acanthocéphales, au point que les chevesnes sont devenus une espèce modèle, 2. cette espèce est ubiquiste et abondante dans les cours d'eau français, 3. de précédentes études (en parasitologie et en écotoxicologie) ont été menées avec succès sur des chevesnes en captivité. Les chevesnes seront adultes, d'une taille moyenne de 15 cm. Cette taille est nécessaire pour l'utilisation de l'endoscope.

346 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart subissent une chirurgie cérébrale d'une heure, un isolement en cage individuelle et une surconsommation forcée de sucre à l'adolescence, avant des analyses post-mortem. Le porteur cherche à montrer que l'activité physique protège le cerveau des effets du sucre, en présentant les retombées comme des arguments pour de futures campagnes de prévention. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'étudier un tel comportement.

Objectifs

Dans le présent projet, nous souhaitons tester l’hypothèse selon laquelle une activité physique qui favorise la production de nouveaux neurones, pourrait avoir des effets protecteurs et/ou thérapeutiques sur les effets délétères du sucre consommé en excès à l’adolescence et d’en demontrer le rôle de cause a effets par des manipulations neurobiologiques de cette neurogénèse.

Bénéfices attendus

La surconsommation de sucre au cours d’une période vulnérable de développement du cerveau qu’est l’adolescence, induit des effets délétères à l'âge adulte (dépression, perte de motivation, anxiété...). Ce projet combine approches environnementale (activité physique) et neurobiologique (cibler des populations de nouveaux neurones spécifiques) pouvant potentiellement remédier à ces pathologies. D'une part, la démonstration qu’une surconsommation de sucre à l’adolescence entraîne un déficit de nouveaux neurones, spécifiquement créés pendant cette periode, serait une donnée essentielle pour alimenter les campagnes luttant contre les mauvaises habitudes alimentaires chez les jeunes. D’autre part, la démonstration que l'augmentation de production ou d'activité de ces nouveaux neurones puisse remedier à ces déficits comportementaux à l’âge adulte, permettrait également de proposer des approches thérapeutiques et de remédiation naturelle. Une démonstration causale entre activité physique, stimulation de nouveaux neurones créés pendant l’adolescence et remédiation des déficits, serait une avancée majeure pour les neurosciences.

Procédures

Dans ce projet, 262 rats subiront une intervention chirurgicale pendant 1 heure. 134 rats recevront également un entraînement comportemental pendant 30 minutes pour toute la durée de l'apprentissage et le test (entre 20 et 40 jours). 20 rats vont passer pour les test GTT et ITT deux fois ; chaque fois, on va faire 7 prélèvements avec a chaque fois d’une goutte du sang prelevée pendant 1 seconde a fin de mesurer la glycémie. Tous les rats (346) seront isolés 16 jours pendant la surexposition au sucrose et 4 semaines pendant l’exercice physique (256). Tous les rats seront mis à mort pour des analyses post-mortem.

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir un stress du à l'isolement en cage individuelle ou en roue d'activité, ceci sur des périodes courtes allant de 16 jours à 4 semaines. Les étapes de chirurgie peuvent entraîner quant à elles des douleurs, et dans de rares cas des infections. Les prélévements du sang peuvent entraîner de douleur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

De plus en plus d’études utilisent le modèle animal pour modéliser certaines pathologies chez l’homme. Les nombreuses similitudes entre les humains et les animaux en termes de développement, de symptomatologie comportementale ainsi que certaines caractéristiques neuronales et hormonales permettent de justifier l’utilisation du modèle animal comme outil dans de nombreuses études. En effet, il est impossible de retrouver ces pathologies, ces caractéristiques ou la realisation d'activité physique chez un modèle in vitro ou informatique. Le modèle animal est pour cela le modèle le plus adapté.

Réduction

Dans le but de diminuer le nombre d’animaux, les expériences seront conduites uniquement chez des mâles. Un effectif maximum de 10 animaux par groupe est nécessaire pour nos analyses statistiques afin de s'abstenir de la variabilité interindividuelle. Un même groupe contrôle est utilisé pour 2 thématiques dès que cela est possible.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en cages collectives (2 rats par cage maximum) dans un milieu enrichi (litière cellulose, papier ouaté, bâton à ronger, nid compact) (sauf pendant les périodes d’accès aux roues, les roues étant en elle-même un enrichissement). La surveillance des animaux est réalisée de façon quotidienne. Toute anomalie ou souffrance évidente est signalée à l'expérimentateur et au responsable de projet qui décident de la conduite à tenir en fonction des points limites ci-dessous : - perte de poids de 15% sur trois jours - automutilation - développement de plaies ou d'infections - poil mal entretenu ou aspect général anormal - changement de comportement (particulièrement la prostration) - activité cardiorespiratoire ralentie ou accélérée En cas de blessure, les plaies seront nettoyées et désinfectées. En cas de perte de poids, l'animal peut être réhydraté si besoin par injection sous-cutanée de saline ou saline-glucose. On peut également déposer des miettes humides issues de la nourriture habituelle directement dans la cage. En cas de douleur évidente, une injection d'analgesic est réalisée et peut être renouvelée 1 fois par jour pendant 3 jours maximum. En cas de non amélioration de l'état général de l'animal, le responsable du projet sera averti et prendra la décision de la nécessité de mise à mort de l'animal. En post-opératoire, les animaux sont gardés sur tapis chauffant jusqu’à leur réveil avant de retourner dans leur pièce de stabulation. Ils reçoivent une injection d'analgesic toutes les jours pendant 3 jours. Les sutures sont désinfectées et surveillées. Pour éviter la douleur pendant le prélèvement, un anesthésique local va être administrée avant le procédure.

Choix des espèces

Notre projet de recherche implique une expérimentation chez le rat, qui constitue pour les neurobiologistes un support indispensable à l'étude de l'organisation et du fonctionnement du système nerveux central en situation normale mais également, et surtout, en situations expérimentales ou pathologiques. L'ensemble de nos travaux considère l'animal in vivo, et met à profit différents protocoles comportementaux développés et codifiés depuis de nombreuses années chez ces espèces, et irréalisables matériellement et/ou scientifiquement sur d'autres espèces. L'organisation du cerveau des rongeurs est proche de celle du cerveau humain. Les résultats obtenus dans ces conditions permettent de proposer des hypothèses de fonctionnement du cerveau humain dans le cadre de surconsommation de récompenses. Les animaux débuteront les expérimentations à l'âge de 28 jours, ce qui correspond à l'entrée dans la phase d'adolescence.