Recherche fondamentale

880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles sont isolées socialement pendant 24 heures ou six semaines, reçoivent des injections de cocaïne et subissent des chirurgies, des tests comportementaux et des prélèvements sanguins submandibulaires que le porteur reconnaît pouvoir provoquer des hémorragies et des lésions de l'os maxillaire. L'objectif est d'étudier l'effet de l'isolement sur la rechute à la cocaïne, les retombées thérapeutiques et sociales restant énoncées comme des perspectives. Le porteur qualifie le modèle murin d'"incontournable" en neurosciences et juge "indispensable" de travailler sur un animal "entier".

Objectifs

En Europe, les troubles d’usage de substances psychoactives représentent un problème majeur de santé publique, avec environ 83,4 millions d’adultes, soit 29% de la population européenne, ayant consommé une ou des substances psychoactives au cours de l’année écoulée. Parmi ces substances, l’usage de cocaïne est en constante augmentation, notamment en raison d’une importante production massivement importée (64.000 saisies représentant 213 tonnes pour l’année 2019), qui conduit à la banalisation de son usage et le développement de comportement d’addiction. Un aspect important de cette pathologie est le risque élevé de rechute lorsque les usagers essayent d’arrêter ou simplement de contrôler leur consommation. En effet, parmi les patients pris en charge pour troubles d’usage de cocaïne, 50% ont déjà été pris en charge antérieurement pour le même trouble. Bien que les travaux de recherche fondamentale et clinique aient apporté de solides connaissances sur les mécanismes mis en jeu lors de la transition entre un usage récréatif et les troubles de l’usage, la compréhension des phénomènes de rechute reste limitée. Entre autre, l’environnement social des consommateurs semble pouvoir à lui seul participer au phénomène de rechute. Notamment, une majorité de consommateur indique souffrir d’un isolement social et d’un sentiment de solitude qui pourraient être, en partie, à l’origine des comportements de rechute. Dans ce contexte, ce projet vise à évaluer, dans un modèle murin, l’impact de l’isolement social aigu (24 heures) et chronique (6 semaines) sur les comportements liés à la cocaïne et en particulier le comportement de rechute.

Bénéfices attendus

Ce projet a le potentiel d'apporter de nouvelles connaissances fondamentales sur la manière dont notre système nerveux fait face et s'adapte à l'isolement social et sur la manière dont les conditions sociales peuvent participer aux troubles liés à l'utilisation de substances psychoactives, notamment la cocaïne. Cet aspect fondamental aidera à développer de nouvelles approches thérapeutiques. Par exemple, au niveau préclinique, notre étude apportera de nouvelles cibles neuroanatomiques pour les protocoles de stimulation magnétique transcrânienne afin de traiter certaines des conséquences de l'isolement social. En ce qui concerne les applications sociales, ces travaux aideront également les acteurs sociaux à mieux communiquer avec les personnes souffrant de troubles liés à l'usage de substances et leur famille en expliquant comment les conditions sociales peuvent aider ou aggraver leur(s) trouble(s). Ainsi, à terme, ces travaux pourraient avoir un impact positif direct sur la vie quotidienne des personnes souffrant d’isolement social et/ou de troubles de l’usage de substances et un impact économique indirect en réduisant les troubles associés à l’isolement social et en améliorant la qualité de vie de patients atteints de troubles de l’usage de substances.

Procédures

Le but de ce projet est d’étudier l’effet de l’isolement social sur les comportements d’addiction. Ainsi trois groupes de de souris seront utilisés : le premier restera groupé, le second sera isolé pendant 24h et le troisième sera isolé pendant 6 semaines. De plus, des injections aigues (1 injection unique; 30 secondes) ou chroniques [5 injections au total (1/jour) ; 30 secondes par injection] ainsi que des tests comportementaux (durée maximum 10 min) seront réalisés sur animaux vigiles. Les différentes procédures expérimentales mettront en jeu des prélèvements sanguins (maximum de 6 prélèvements par souris ; 2 prélèvements/jour au maximum avec au moins 1h entre chaque prélèvement; chaque prélèvement durera au maximum 30 sec) ainsi que des chirurgies (durée maximum 1h). L'ensemble de ces nuisances possibles sera évalué et traité afin de réduire la souffrance animale.

Impact sur les animaux

L’ensemble des procédures nécessitent un isolement social (objet de ce projet) d’une partie des animaux. Cet isolement sera soit aigu (24h) soit chronique (6 semaines) et peut créer un stress important aux animaux. Certaines des procédures de ce projet nécessitent des chirurgies pouvant induire une douleur modérée, une inflammation transitoire et/ou un inconfort pour les animaux. Les injections aigues ou répétées de cocaine peuvent induire un état de dépendance physique. De plus, la répétition des injections peut provoquer une douleur aigue transitoire, une inflammation locale au niveau du site d’injection, voire une induration. Les stimulations aversives induisent un stress transitoire aux animaux. Les prélèvements sanguins par voie submandibulaire peuvent induire une hémorragie ou encore des dommages à l’os maxillaire.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure pour analyse post-mortem.

Remplacement

Au vu de notre objectif d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l’évaluation de comportement de type addictifs nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vigile.

Réduction

Au regard des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique individuelle, nous avons réalisé une analyse statistique de puissance qui a déterminé que les données sont statistiquement exploitables et publiables avec des cohortes de 20 animaux/groupe pour le comportement, 10 pour les analyses immunohistologiques et d’analyse d’activité calcique. Bien que de nombreux groupes contrôles soient nécessaires pour ce projet (animaux groupés vs isolés, saline vs cocaïne, contrôle des virus utilisés) et que les deux sexes seront utilisés les expériences seront toujours réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, nous composerons donc toujours nos groupes dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Notamment, l’utilisation d’enregistrement longitudinaux permettra de réduire grandement le nombre d’animaux nécessaire pour cette partie du projet. De même, la combinaison de procédures comportementales avec des procédures de prélèvement sanguins permettra de ne générer qu’une cohorte de souris pour répondre à deux questions scientifiques.

Raffinement

Avant isolement et tout au long des expériences pour les animaux témoins, les souris sont hébergées en cage collective, dans un milieu enrichi (matériel de nidification et bâton)), et observés quotidiennement par l’expérimentateur, ou une personne compétente de façon à maximiser leur confort et limiter une quelconque souffrance. Les souris sont habituées à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. A l'exception du milieu enrichi (matériel de nidification et bâton), aucune condition spécifique ne sera mise en place pour les animaux isolés. L'objectif de cette étude étant d'évaluer l'effet de l'isolement social sur les comportements d'addiction, nous ne souhaitons pas ajouter d'éléments d'enrichissement qui pourraient être des éléments confondants, perturbant les interprétations des résultats. Ainsi, les animaux isolés seront hébergés dans des conditions identiques à celles des animaux groupés à l'exception de la présence de congénère. Pour chacune des procédures, des points limites adaptés ont été définis. Le bien-être animal sera évalué tout au long de l’isolement en prenant notamment en compte l’état général de l’animal, son poids et sa réactivité à la manipulation, permettant d’objectiver des points limites définis selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur et la vétérinaire désignée pourra être sollicitée pour émettre un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées si nécessaire de façon à limiter la souffrance animale. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie per et post opératoire. De plus, après chaque chirurgie, l’état de santé des animaux sera évalué plus spécifiquement afin de rapidement pouvoir émettre un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées si nécessaire de façon à limiter la souffrance animale Enfin, le bien être animal sera également évalué lors des protocoles expérimentaux, nécessitant des injections intrapéritonéale répétée, afin d’objectiver des points limites définis selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur et la vétérinaire désignée pourra être sollicitée pour émettre un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées si nécessaire de façon à limiter la souffrance animale.

Choix des espèces

Il nous est indispensable de travailler sur un modèle animal, social, entier et complexe afin d’être dans les conditions les plus proches de la complexité humaine. Le modèle murin présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences. La souris est également une espèce sociale, permettant ainsi l’étude des effets de l’isolement social sur les comportements. Enfin, les outils viraux nécessaires à ce projet ont été développés et validés chez la souris, qui apparait encore donc comme le modèle le plus adapté à ce projet. Des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g) car l’étude des comportements dans nos différents modèles nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures.

592 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles sont infectées par gavage avec des selles humaines porteuses de la microsporidie E. bieneusi, une partie recevant en plus un immunosuppresseur par injections répétées et des ponctions sanguines rétro-orbitales jusqu'à six fois en six semaines. Le porteur décrit des diarrhées, des douleurs abdominales et une perte de poids pouvant atteindre le point limite de 20 %, au-delà duquel les souris sont mises à mort. Il affirme que le parasite n'est pas cultivable in vitro et juge l'animal vivant "indispensable", tout en reconnaissant que plusieurs bénéfices cliniques avancés restent à démontrer.

Objectifs

Les microsporidies constituent un vaste ensemble d’eucaryotes intracellulaires pouvant infecter de nombreux hôtes. Chez l’Homme, les espèces les plus fréquemment isolées sont responsables de diarrhées profuses, particulièrement graves chez les immunodéprimés car sans traitement elles évoluent vers la chronicité et peuvent aboutir au décès du patient. Enterocytozoon bieneusi est l’espèce isolée dans plus de 90% des cas. De nombreuses interrogations concernant cette espèce sont encore sans réponse, notamment au sujet (i) de la physiopathologie concernant par ex. la dose infectieuse, les sites de persistance chez l’hôte, les cellules recrutées au site d’infection, la réponse immunitaire, (ii) de la thérapeutique concernant les molécules efficaces (le seul traitement dont l’efficacité a été démontrée, la fumagilline, n’est plus commercialisé depuis 2019), la durée de traitement, ... Les travaux expérimentaux sur cette espèce sont difficiles car elle n’est pas cultivable in vitro et les modèles animaux sont réduits. En effet, seuls les essais sur singes immunodéprimés ou sur cochons gnotobiotiques ont permis l’établissement d’une infection, tandis que des infections uniquement transitoires ont pu être obtenues chez des souris immunodéprimées et des rats athymiques ou chimiquement immunodéprimés. Au sein de l’espèce E. bieneusi, de nombreux génotypes existent, dont la plupart possède des spécificités d’hôtes. Les rongeurs étant naturellement infectés par certains de ces génotypes, nous émettons l’hypothèse que les échecs précédemment décrits dans la littérature concernant l’établissement d’un modèle souris sont liés à l’utilisation de génotypes non adaptés à cet animal. Du fait de nos travaux, nous possédons une très large collection de selles positives pour E. bieneusi de différents génotypes. Les objectifs du projet sont de mettre au point et de caractériser un modèle de souris infectées par E. bieneusi afin de répondre aux interrogations énoncées plus haut. Pour cela, des souris seront infectées par voie orale avec des selles humaines positives pour E. bieneusi. Nous disposons de données préliminaires démontrant le succès de notre protocole d’infection.

Bénéfices attendus

Comme développé dans le paragraphe 5.5.1, bien que responsable de plus de 90% des cas de microsporidiose intestinale, de nombreuses interrogations concernant E. bieneusi sont sans réponse, en grande partie du fait de la difficulté à travailler sur ce pathogène non cultivable et sans modèle animal. Les résultats issus de ce projet permettront de répondre à certaines de ces interrogations. En effet, ce projet devrait permettre de faire progresser les connaissances scientifiques fondamentales sur cette espèce en apportant des données sur les points suivants: dose infectieuse, barrière d’espèce, site de multiplication et de dormance chez l’hôte infecté, réponse immunitaire et identification de protéines immunogènes. Ce projet devrait également permettre de faire progresser la prise en charge des microsporidioses humaines en démontrant l’efficacité ou l’inefficacité des molécules actuellement utilisées, notamment le nitazoxanide dont l’indication a été donnée du fait de son efficacité sur d’autres parasitoses, sans preuve scientifique. Si seule la fumagilline démontre son efficacité, cela permettra d’obtenir des arguments forts pour la reprise de production du médicament par l’industrie pharmaceutique. La fumagilline étant responsable d’une thrombopénie, le patient doit être hospitalisé pendant toute la durée du traitement, soit 15 jours. Cette durée a été validée historiquement chez le patient infecté par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH). Il est suspecté qu’une telle durée de traitement pourrait être réduite avec une efficacité équivalente, réduisant ainsi les durées d’hospitalisation et donc les frais de santé. Ce projet pourrait permettre de valider ou non la réduction de la durée de traitement. L’intérêt du screening dans les selles d’un patient pour valider l’efficacité d’un tel traitement n’est pas non plus démontré mais pourra être évalué dans ce projet chez la souris (par exemple si recherche sur selles négative au bout de 7 jours, alors le traitement pourrait être arrêté, si résultat positif on pourrait conseiller de poursuivre le traitement jusqu’à 15 jours), et ainsi apporter des arguments pour proposer une étude chez l’Homme (type protocole de recherche clinique).

Procédures

-gavage avec le pathogène (ou un liquide neutre pour les groupes contrôle) sur animal vigile, 1 seule fois pour tous les animaux: 592 souris, soit quelques secondes par souris -ponction sanguine au niveau du sinus rétro-orbital sous anesthésie générale, les ponctions seront répétées 6 fois en 6 semaines : 12 animaux, ponction d'une durée inférieure à 10 secondes -injection molécule immunosuppressive (dexaméthasone) sur animal vigile, en intra-péritonéal, à raison de 6 injections en 6 jours: 288 animaux, soit quelques secondes par souris -gavage par des molécules à visée thérapeutique (ou un liquide neutre pour les groupes contrôle), une fois par jour pendant 14 jours : 192 souris, soit quelques secondes par souris

Impact sur les animaux

Les effets attendus sur les souris sont ceux associés à une infection intestinale (extrapolation sur la base des symptômes observés chez les humains) : douleurs abdominales, ballonnements, diarrhées aqueuses, perte de poids. Ces douleurs pourraient se traduire chez l’animal par la prostration, le hérissement du poil, des expressions faciales (gonflement du museau et des joues, oreilles et vibrisses vers l'arrière, plis visibles autour des yeux). Chez l’Homme immunocompétent, ces symptômes durent entre 3 et 4 semaines ; chez l’immunodéprimé, ils persisteront jusqu’à rétablissement de l’immunité ou prise d’un traitement spécifique anti-microsporidien. Concernant les effets indésirables associés au traitement spécifique : - une diminution du nombre de plaquettes est décrite chez l’Homme lors de la prise de fumagilline. D’après le résumé des caractéristiques du produit, la dose que nous utiliserons sur la durée prévue n’est pas associée à la survenue d’effets indésirables graves. Ainsi des saignements pourraient avoir lieu (par exemple en cas de blessures). - le nitazoxanide est associé à une toxicité hépatique. Cela pourrait se traduire par un ictère (coloration jaune des muqueuses), visible au niveau oculaire. - concernant la molécule test, il n’y a pas de données chez l’animal.

Devenir

Les souris seront toutes sacrifiées à la fin du projet pour récupérer les tissus et le sang, en vue d’analyses complémentaires.

Remplacement

Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle in vitro permettant le développement d’E. bieneusi. Il y a peu de publications à ce sujet probablement car beaucoup de tentatives se sont soldées par des échecs. Il semble que le cycle de multiplication ait déjà pu être initié in vitro mais que rapidement celui-ci avorte. L’utilisation d’animaux vivants apparait indispensable pour étudier à l’échelle globale d’un individu l’impact d’une infection par E. bieneusi et permettre d’identifier des sites de multiplication et de dormance dans un organisme infecté, ainsi que de caractériser sa réponse immunitaire. L’efficacité du traitement et la durée d’excrétion des parasites sous traitement ne peuvent également être validés qu’à l’échelle d’un individu.

Réduction

Nous utiliserons les souris sur-numéraires issues de reproductions de souris (reproductions visant à l’obtention de génotypes spécifiques au sein du laboratoire). Cela permettra donc de ne pas sacrifier ces animaux par ailleurs en bonne santé alors qu’ils pourraient être utiles pour d’autres recherches. Le nombre d'animaux utilisés pour cette manipulation a été réduit au minimum dans la mesure où cela ne compromet pas les objectifs du projet. Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Les expérimentations seront couplées afin de permettre de limiter le nombre d’animaux nécessaires. Par exemple, les souris infectées pour tester la charge infectieuse limite seront aussi utilisées pour évaluer l’item sur l’efficacité de la thérapeutique. Les révisions d’articles (reviewing) se durcissant, il est maintenant nécessaire de réaliser les expérimentations sur mâles et femelles, raison qui nous contraint à augmenter le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés selon les standards prévus par la règlementation, en groupes sociaux (compte tenu du fait que les souris sont des animaux grégaires), dans un environnement adapté et enrichi. Les animaux auront libre accès à l'eau et à la nourriture. Afin d'éviter les comportements agressifs, les animaux d'une même cage seront tous du même sexe, ne seront jamais plus de 6 et un enrichissement sera proposé avec des maisons en plastique. Les animaux étant nés dans notre animalerie, les groupes par cage seront les mêmes que ceux constitués lors du sevrage. Une période d’acclimatation sera réalisée avant le début de la procédure (une semaine). Les animaux d’une même cage auront subi la même infection. Nous utiliserons un système de score de manière à limiter au maximum la souffrance et à définir des points limites. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour évaluer tout changement de comportement et/ou de motricité et perte de poids. Si des signes de douleur sont observés, une injection sous-cutanée d'analgésique sera réalisée. Si un animal remplit des critères préalablement définis associés à une souffrance, ainsi qu’une perte de poids supérieure à 20% (points limites), le responsable du projet décidera de la mise à mort.

Choix des espèces

Le fond génétique des souris a été choisi car le laboratoire pratique, dans le cadre d’autres expérimentations, des reproductions sur le même fond génétique pour l’obtention de génotypes spécifiques, et certaines souris issues de ces reproductions ne sont pas conservées. Différents âges d’infection seront utilisés, entre 7 et 18 semaines, afin de mimer la situation en vie réelle (jeunes enfants rarement atteints, population adulte) et s’affranchir de l’effet « âge ».