Recherche fondamentale

5 000 rats vont être utilisé·es dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour entretenir une lignée de rats rendus diabétiques et la mettre à disposition d'autres projets. Les animaux subissent une mesure de glycémie par prélèvement d'une goutte de sang à la queue, parfois un prélèvement sanguin plus important selon les projets qui les recevront. Le champ structuré sur le devenir est vide et la narration indique que femelles et mâles sont utilisés pour les accouplements et transférés vers des recherches autorisées, sans mise à mort à l'issue de ce projet. Le porteur travaille sur un "organisme entier" que les approches in vitro ne remplaceraient pas, et présente le maintien de cet élevage comme "indispensable".

Objectifs

Ce projet va permettre la mise à disposition de notre équipe de rats diabétiques nécessaires à la mise en place de différents projets. Ce modèle de diabète constitue un outil de choix pour l’étude des mécanismes impliqués dans les défauts métaboliques dans un contexte d’hyperglycémie et/ou d’inflammation chronique. Par ailleurs lee rat GK peut également être utilisé pour évaluer le potentiel thérapeutique de nouvelles molécules.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la mise à disposition de notre équipe d'un modèle animal de diabète de type 2 présentant de grandes similitudes avec le diabète humain nécessaire aux différents projets de l'équipe et des collaborateurs portant sur l'étude de la régulation du métabolisme glucidique et son implication dans d'autres pathologies. Le maintien de cet élevage au sein de la plateforme est donc indispensable pour la pursuite des activités de recherche ménées au sein de l'équipe et dans le cadre des collaborations avec d'autres laboratoires publics et privés.

Procédures

A l’âge de 7-8 semaines, lors que leur état diabétique sera stable, une mesure de la glycémie des animaux sera réalisée en vue de leur sélection. Une goutte de sang (environ 5µl) sera prélevée à la queue après piqûre avec une aiguille 26G. Ce prélèvement ne dure que quelques secondes. Uniquement les animaux présentant les valeurs de glycémie souhaitées (150-170 mg/dl pour les femelles et 240/280 mg/dl pour les mâles) seront sélectionnés pour l'entretien de l'élevage et inclus dans des projets de recherche. Un prélèvement de sang sera réalisé uniquement si le projet de recherche auxquels les animaux seront destinés le nécessite. Ce prélèvement, qui n'est donc pas systématique sur tous les animaux de la colonie, sera réalisé au bout de la queue et le volume de sang prélevé sera d'environ 250 µl (volume négligeable par rapport au volume sanguin qui est de 17 ml pour un rat de 250 g). La durée du prélèvement à la queue est de 20-30 secondes.

Impact sur les animaux

Du fait de leur diabète, ces rats presentent une polyuro-polydipsie, caractérisée par une augmentation de la prise de boisson et de l'émission d'urine. Celle-ci est très légère chez les femelles et modérée chez les mâles. Les animaux diabétiques présentent la même durée de vie que leurs contrôles non-diabétiques et ne nécessitent d'aucun traitement pour leur survie.

Devenir

Les femelles et les mâles seront utilisés pour les accouplements futurs et mis à disposition des chercheurs dans le cadre de projets de recherche autorisés.

Remplacement

Le métabolisme glucidique dont nous cherchons à mettre en évidence la régulation nous conduit à devoir travailler sur un organisme vivant dans son intégralité. Des approches in vitro, notamment sur des lignées de cellules immortalisées, ou ex vivo, sur des îlots isolés nous permettraient uniquement de mettre en évidence des mécanismes spécifiques, mais pas d’étudier la réponse physiologique globale de l’organisme aux traitements. Ainsi pour atteindre les objectifs spécifiques de notre projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable.

Réduction

Le nombre d’animaux générés est réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins des différents projets de l'équipe. . Nous connaissons bien cette lignée de rat (nombre et taille des portées), ce qui permet de gérer les élevages de façon raisonnée.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes pour respecter leur comportement naturel. En raison de leur polyuro-polydipsie modérée, une litière adaptée sera utilisée dans les cages d'hébergement des mâles et renouvelée 2 fois par semaine pour éviter l'inconfort des animaux. Pour les femelles, leur polyuro-polydipsie étant très légère, une litière standard sera utilisée, sans nécessité d'effectuer un change hebdomadaire supplémentaire. Les biberons seront renouvellés 3 fois par semaine. Les rats seront surveillés quotidiennement afin de détecter des signes de souffrance portant sur l'apparence physique (manque de toilettage, poils ébouriffés, dos arrondi), le comportement (modification de la prise alimentaire, prostration) et les modifications de poids. Une perte de poids de plus de 15% entraînera la mise à mort de l'animal concerné.

Choix des espèces

Le modèle animal sur lequel nous conduisons nos recherches sur le diabète dans l'équipe est le rat. Le rat est une espèce animale pertinente dans le cas de nos projets d'étude parce que du point de vue comportement, le rat est un apprenant rapide et intelligent, et les processus physiologiques sont similaires chez le rat et chez l’Homme. De plus, le rat est suffisamment grand pour des mesures physiologiques pratiques et pour des manipulations neurochirurgicales/stéréotaxiques. Les femelles seront mises en accouplement à partir de l'âge de 8 semaines (maturité sexuelle) et jusqu'à l'age de 12 semaines. Les mâles seront utilisés à partir de l'age de 10 semaines et jusqu'à 6 mois.

150 souris domestiques sauvages vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis relâchées sur place. Elles sont piégées vivantes et gardées une nuit, soumises à trois tests comportementaux, la latence à quitter un tube sombre, un test de champ libre et un test de mobilité dans un sac sombre, puis marquées à l'oreille avec prélèvement d'un échantillon de peau. Le porteur indique un stress lié à la capture et à la manipulation et un risque de prédation lié aux pièges, limités par un temps court dans le piège. Le projet compare des populations urbaines, rurales et sauvages pour étudier leur adaptation à l'urbanisation.

Objectifs

Tous les êtres vivants existent dans un monde qui change. Alors que certains organismes s’adaptent facilement ou même prospèrent dans des environnements nouveaux ou difficiles, d’autres succombent même à de légers changements dans leurs conditions environnementales. Pourquoi certains animaux réussissent-ils là où d’autres ne réussissent pas ? Pour répondre à cette question, il faut comprendre les mécanismes phénotypiques, génétiques et épigénétiques qui aident une population à s’adapter à de nouveaux environnements. Ce domaine de recherche a longtemps été au cœur de l’écologie évolutive, mais il est maintenant encore plus important que jamais étant donné la menace urgente du changement climatique induit par l’homme. Les contrastes entre les populations urbaines et rurales sont un moyen puissant d’aborder la façon dont différents traits phénotypiques et (épi)génétiques influencent l’adaptation des organismes : les populations vivant en milieu urbain font face à une variété de conditions environnementales que les populations rurales ne subissent pas, ex. pollution et fragmentation de l’habitat. L’objectif de ce projet est de déterminer comment les traits comportementaux, génétiques et épigénétiques diffèrent entre les populations sauvages, rurales et urbaines de la souris domestique (Mus musculus domesticus). La souris domestique sauvage est un modèle d’étude particulièrement intéressant pour aborder ces questions: espèce commensale avec une forte capacité d’adaptation, elle est aussi un organisme très étudié sur le plan comportemental et génomique: on sait que les souris présentent une variation comportementale quantifiable répétable et héréditaire de la proactivité, et nous disposons d’une variété d’outils génomiques, y compris un génome bien annoté, chez cette espèce modèle. Nous faisons l’hypothèse que les environnements urbains induisent des réponses comportementales adaptatives, répétables et quantifiables. Deuxièmement, nous faisons l’hypothèse que les phénotypes comportementaux adaptatifs reposent à la fois sur des adaptations génétiques et épigénétiques (méthodes non décrites ici).

Bénéfices attendus

Ces travaux fourniront un aperçu des mécanismes sous-jacents à la capacité de tolérer et de s’adapter à de nouveaux environnements. Ils nous permettront de mieux comprendre les capacités d’adaptation des espèces envahissantes, mais aussi de mieux comprendre et prédire la vulnérabilité des espèces à l’extinction face aux changements environnementaux induits par l’homme. Parce que ce travail concerne la souris domestique, une espèce hautement commensale — à la fois un vecteur de maladie et un ravageur agricole — les données de ce projet pourront être utilisées pour éclairer les programmes de lutte contre les rongeurs qui ont une incidence directe sur la santé publique et l’économie. Enfin, les résultats de cette étude aideront à relever les défis en suspens dans les domaines de l’écologie comportementale et de la biologie évolutive.

Procédures

Capture-vivant (N=150). Les souris seront piégées et maintenues toute la nuit pendant la phase nocturne de pose du piège dans la nature et relâchées au lever du jour. Nous passerons jusqu'à 14 nuits consécutives sur un site de piégeage et y retournerons après un mois. Ainsi, il est possible que chaque souris subisse plusieurs piégeages. Tests comportementaux (N=150). Chaque souris sera équipée à trois tests comportementaux consécutifs : latence pour quitter un tube sombre, champ libre et test de mobilité dans un sac sombre. Marquage auriculaire et prélèvement d'échantillons auriculaires (N=150). Chaque souris recevra une étiquette auriculaire sur l'oreille droite et aura un échantillon de peau prélevé sur l'oreille gauche. Ces procédures durent moins de 2 minutes et sont réalisées avec des outils sanitaires appropriés.

Impact sur les animaux

Les pièges peuvent attirer les animaux sauvages (comme les sangliers) ou les prédateurs domestiques (comme les chiens ou les chats) et ainsi augmenter le risque de prédation. La capture et la manipulation des animaux peuvent également engendrer un stress. Toutefois notre protocole a pour objectif de réduire au maximum ces nuisances potentielles : en réduisant la durée de séjour dans le piège d’un animal, en ajoutant dans le piège du coton permettant la construction d’un nid, en manipulant l’animal le plus rapidement possible et en utilisant des objets sombres (tunnel, sac) lors du passage d’un test à un autre.

Devenir

À la fin de l’échantillonnage comportemental et tissulaire, les souris seront relâchées sur place (souris en milieu naturel).

Remplacement

Ce projet de recherche s’intéresse au comportement de la souris et à la variation génétique des animaux sauvages. Les questions précises que nous posons au sujet de l’adaptation aux environnements urbains n’ont pas d’analogie directe dans les modèles de culture cellulaire ni dans les modèles non vertébrés. De plus, il s’agit de questions empiriques auxquelles on ne peut répondre en utilisant des approches théoriques.

Réduction

Nous aimerions avoir un échantillon uniforme de souris dans nos différentes catégories environnementales. Notre but est d’étudier 10 souris adultes par site de piégeage et d’avoir 5 sites de piégeage par type d’environnement. Cette stratégie assurera une représentation égale pour chaque type d’environnement et une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Ce projet se limite à la capture, à l’observation comportementale, aux mesures morphologiques et à l’échantillonnage de tissus. Le temps passé dans les pièges sera aussi réduit que possible car les pièges seront placés juste avant le coucher du soleil et relevés au lever du soleil. Les pièges comprennent de la nourriture, un abri, et un morceau de coton, permettant une protection du froid et de la chaleur ainsi que la construction d'un nid. S’il y a beaucoup de souris à traiter en même temps, les souris resteront dans leurs pièges avec une tranche de pomme pour prévenir la faim et la déshydratation. Être dans un piège ne nuit pas aux animaux capturés lorsque le piégeage est fait de façon responsable, par exemple, si les pièges ne sont pas exposés à des températures extrêmes. Ici, nous ne prévoyons pas de piéger en hiver, et tous les pièges contiendront du coton, qui fournit une bonne isolation. Nous limiterons l’exposition des pièges aux températures trop chaudes en installant des pièges au coucher du soleil et en les vérifiant au lever du soleil. La mortalité dans les pièges devrait donc être très faible. L’observation comportementale et les mesures morphologiques ne nécessitent pas des gestes invasifs et n’induisent pas des dommages aux animaux. Les tests comportementaux ne durent pas plus de 15 minutes. L’échantillonnage des tissus se fera au moyen de poinçons auriculaires, une procédure courante qui ne nécessite pas de sédation. Au total, les souris seront manipulées et testées pendant au plus 30 minutes, ce qui minimisera le stress sur les animaux. Nos critères de mauvaise santé pour l’euthanasie seront une fourrure mate et/ou une posture voûtée.

Choix des espèces

La souris domestique (M. m. domesticus) est le seul mammifère non domestique qui a récemment été introduit dans un large éventail d’habitats (rural, urbain, feral), c’est donc une espèce de choix pour les travaux proposés. De plus, la souris domestique dispose d’une abondance inégalée d’outils génomiques disponibles, y compris des bases de données génétiques nombreuses et un génome bien annoté qui seront utiles pour nos études génétiques à partir des prélèvements réalisés ici. Enfin, des nombreuses études indiquent que les souris présentent des variations quantifiables et héréditaires dans les traits comportementaux que nous étudions ici dans le contexte particulier d’un gradient d’urbanisation. Toutes les souris utilisées dans ce projet sont des adultes car nous nous intéressons uniquement au comportement des animaux sexuellement matures. Les souris juvéniles, gravides ou allaitantes seront libérées immédiatement sur le lieu de capture.

1572 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections intramusculaires répétées de vecteurs synthétiques et des prélèvements de sang hebdomadaires, avant euthanasie et autopsie pour doser les vecteurs et évaluer leur toxicité. Le projet vise à mettre au point des vecteurs transportant des fragments d'anticorps, notamment pour la reproduction et une alternative à la contraception hormonale. Le porteur affirme que le passage chez l'animal reste "indispensable" car aucune méthode in vitro ne reproduit l'organisme entier.

Objectifs

Le traitement des troubles de la reproduction ainsi que le développement d’alternatives à la contraception hormonale pourraient potentiellement voir le jour sur la base de la modulation réalisée par des petits fragments d’anticorps communément appelés nanobodies, qui grâce à leur taille inférieure aux anticorps classiques peuvent pénétrer plus facilement au sein des tissus ciblés. Afin de permettre leur délivrance, nous souhaitons évaluer l’utilisation de vecteurs synthétiques facilitant l’adressage des « gènes » codant pour ces nanobodies et induisant leur production par le tissu ciblé. Dans ce contexte, nous cherchons à améliorer le ciblage de la thérapie à l’aide de vecteurs synthétiques. En effet, les acides nucléiques ne traversant pas spontanément les membranes biologiques, l’objectif de notre projet est d’inventer et d’optimiser de nouvelles classes de vecteurs synthétiques pour faciliter l’entrée des gènes dans les cellules. C’est pourquoi, nous voulons injecter nos vecteurs synthétiques chez la souris adulte pour observer la réponse globale de l’animal. L’analyse des résultats, des différents prélèvements des sites d’injections, du sang, ou de différents d’organes permettra d’ajuster la composition des vecteurs que nous développons et de trouver le meilleur vecteur pour les thérapies futures. Le projet proposé ici a pour objet (1) de déterminer les meilleures voies d’administration de ces fragments d’anticorps, d’étudier leur comportement in vivo, (2) d’optimiser leur séquences et formulation pour leur utilisation in vivo ; et (3) de confirmer leurs effets fonctionnels sur la reproduction.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - Court terme : chaque protocole inclus dans ce projet, permettra à son échelle d’informer sur la potentielle toxicité des composés étudiés. De plus, l’efficacité des vecteurs synthétiques administrés dans différents organes sera caractérisée. - Long terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’évaluation, la détection, le contrôle ou les modifications des conditions physiologiques de reproduction chez les animaux après application du composé. De plus, ce projet doit permettre d’établir des plans de prévention et de traitement des troubles de la reproduction ainsi que le développement d’alternatives à la contraception hormonale, chez l'homme et/ou les animaux.

Procédures

Selon la procédure, les animaux subiront soit : - Procédure 1 : Des injections intramusculaires des vecteurs sous anesthésie et après analgésie de l'animal. La procédure durera moins de 5 min et sera répétée 7 fois. Des prélèvements de sang seront également effectués en submandibulaire sur animal vigile pour alléger au maximum la sévérité des actes effectués. Des prélèvements sanguins sont prévus 1x/semaine sur animal vigile pendant toute la durée de l’étude. Chaque prélèvement durera moins de 5 min. - Procédure 2 : Des injections intramusculaires (dans les deux muscles tibiaux) des vecteurs sous anesthésie et après analgésie de l'animal. La procédure durera moins de 5 min sera répétée 1 fois. Des prélèvements de sang seront également effectués en submandibulaire sur animal vigile pour alléger au maximum la sévérité des actes effectués. Cinq prélèvements sanguins sont prévus sur animal vigile sur toute la durée de l’étude. Chaque prélèvement durera moins de 5 min.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables susceptibles d’être observés ont été anticipés avant la mise en œuvre du projet. Les vecteurs synthétiques testés possèdent des caractéristiques très précises et un degré de pureté élevé. Des études préliminaires de toxicologie et de biodistribution réglementaires ont déjà démontré la parfaite innocuité et absence de mortalité de ces nouvelles classes de vecteurs synthétiques pour le transport intracellulaire de gènes thérapeutiques. Plus précisément, nous surveillerons quotidiennement l’apparition d’effets délétères qui pourraient survenir, comme un comportement anormal de l’animal, une perte de poids, un gonflement ou une formation de nodules au site d’injection… Les nuisances attendues sur les animaux sont : - Traumatisme et inflammation transitoire au niveau du site d’injection (intra-musculaire) du vecteur. - Traumatisme et douleur transitoire au niveau du site de prélèvement de sang.

Devenir

A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront humainement euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour doser le vecteur et/ou évaluer sa toxicité et/ou évaluer les modifications induites par son administration. Les organes seront également utilisés pour doser les vecteurs, évaluer leur efficacité, et / ou réaliser des analyses histologiques.

Remplacement

De manière systématique, les vecteurs que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des vecteurs testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet donc actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, les vecteurs utilisés dans notre étude sont de nature polymérique et ne sont pas capables de délivrer des « gènes thérapeutiques » dans des cellules en culture. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet. C’est d’ailleurs par cette approche que cette nouvelle classe de vecteur a été récemment validée et est actuellement en phase de développement clinique chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Un premier tri in vitro a été réalisé afin de ne sélectionner que les vecteurs ayant démontré la meilleure efficacité de transfection. Etant donné la variabilité probable des réponses aux principes actifs, 10 animaux par groupe au maximum ont été prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique (calcul de puissance), sur nos données historiques et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif sera revu à la baisse après analyse des résultats des études préliminaires d’efficacité, afin de donner des résultats reproductibles et similaires d’un animal à l’autre.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un analgésique local lors des prélèvements sanguins, et des traitements antalgiques sont prévus en cas d’apparition de signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux fois par semaine. Les observations permettront d'effectuer une estimation de la douleur générée et, le cas échéant, de mettre en place des moyens adaptés pour la soulager de façon appropriée, efficacement et sans interférence avec le protocole (grâce à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées à ce projet). Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur (lors du traitement expérimental et lors des prises de sang).

Choix des espèces

Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents vecteurs seront utilisés.