Recherche fondamentale

126 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une irradiation, une injection de lymphocytes et une vaccination, puis des prélèvements de sang, pour étudier une enzyme qui freine la réponse immunitaire contre les cancers. Le porteur indique une perte de poids transitoire, puis les souris sont mises à mort au huitième jour pour prélever les organes lymphoïdes. Il affirme qu'il est "impossible" de modéliser in vitro l'activation d'un répertoire de lymphocytes du fait de leur rareté.

Objectifs

La molécule que nous étudions est une enzyme immunosuppressive, c’est-à-dire qu’elle freine la réponse immunitaire. La production de cette molécule au cours du cancer rend donc la réponse immunitaire moins efficace à éliminer les cellules cancéreuses, ce qui accélère la croissance des tumeurs de souris. Chez l’homme, la production de cette molécule dans les tumeurs réduit la survie. Nous savons déjà que sa production par des cellules immunitaires appelées « cellules présentatrices » limite l’activation des « lymphocytes T », qui sont les acteurs de la défense de l’organisme contre les infections et les cancers. La rencontre avec la cellule présentatrice est l’étape essentielle qui permet au lymphocyte de reconnaitre la cible à attaquer, sous forme d’un fragment moléculaire appelé antigène. Lors du développement d’un cancer, les lymphocytes T activés par la reconnaissance des antigènes des cellules cancéreuses ont pour fonction de les tuer. Nous cherchons à comprendre comment la molécule que nous étudions freine l’activation des lymphocytes T. Nous pensons que la force de l’interaction entre l’antigène et le lymphocyte joue un rôle important. En effet, dans le vaste répertoire de lymphocytes T d’un individu, certains lymphocytes T peuvent reconnaitre un antigène particulier, mais très peu ont la capacité de le reconnaitre fortement tandis que beaucoup plus le reconnaissent plus faiblement. Il est important de déterminer quel type d’interactions la molécule que nous étudions peut freiner, car les conséquences sur la qualité de la réponse immunitaire (et donc la capacité à éliminer les cellules cancéreuses) ne sont pas les mêmes. Ce projet est donc important pour comprendre le rôle de la molécule que nous étudions dans l’échappement des cellules du cancer à la réponse immunitaire. Du fait de la rareté de chaque lymphocyte T spécifique d’antigène dans la population lymphocytaire T totale (1/100 000 à 1/1 000 000), il est impossible de modéliser correctement in vitro les conditions d’activation d’un répertoire physiologique de lymphocytes T

Bénéfices attendus

Nous souhaitons démontrer que la molécule que nous étudions restreint le répertoire des lymphocytes T capables de répondre à une stimulation par une cellule présentatrice d’antigène. En présence de cette molécule (souris qui l’expriement), seuls les lymphocytes T reconnaissant fortement l’antigène sont probablement capables de s’activer et donc secondairement tuer des cellules malades, par exemple cancéreuses. Bien que cela puisse être suffisant pour faire cesser une infection aigue, au cours de laquelle la réponse est de brève durée, cela n’est pas souhaitable dans le cas du cancer. En effet, du fait de la grande rareté dans l’organisme des lymphocytes de forte affinité pour les antigènes du cancer, cette restriction est contre-productive au maintien à long terme d’une réponse anticancéreuse active. L’immunothérapie connait un développement fulgurant dans le traitement du cancer, car elle permet de réactiver la réponse du système immunitaire contre les antigènes du cancer. Néanmoins l’efficacité des immunothérapies actuelles reste limitée à certains types de cancer et un pourcentage restreint de patients. La molécule que nous étudions représente une cible potentielle pour de nouvelles stratégies d’immunothérapie. Afin de permettre le développement de traitements visant cette molécule, il est nécessaire de comprendre ses mécanismes d’action sur l’activation des lymphocytes T, acteurs clés de l’élimination des cellules tumorales.

Procédures

Irradiation en 1 séquence de 5,8 minutes. Le lendemain, injection d’une suspension lymphocytaire et vaccination (moins de 30 secondes chacun). Les animaux sont endormis à l’isoflurane lorsque les deux injections sont couplées. Trois jours après les deux injections, ponction de sang (animaux vigiles, anesthésie locale, moins de 20 secondes). Avant mise à mort (jour 8) : prélèvement de sang dans les mêmes conditions.

Impact sur les animaux

Concernant l’axe peur/détresse : il existe un stress lié aux manipulations. En effet, l’irradiation nécessite de regrouper les souris dans une boite pendant quelques minutes. Concernant l’axe de stress physique/thermique : pas de stress spécifique à l’expérimentation car l’irradiation est indolore. Concernant l’axe douleur, lésions et maladie : on s’attend à observer une perte de poids transitoire et modérée (

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour prélever les organes lymphoïdes utiles à l’analyse.

Remplacement

Du fait de la rareté de chaque lymphocyte T spécifique d’antigène dans la population lymphocytaire T totale d’un individu (1/100 000 à 1/1 000 000), il est impossible de modéliser correctement in vitro notre hypothèse. En effet, les outils de détection dont nous disposons ne permettent pas d’analyser de façon robuste un très faible nombre de cellules. De plus, les conditions expérimentales in vitro sont très éloignées de la physiologie.

Réduction

Pour chaque expérience, 3 tests indépendants devront être effectués pour assurer la validité des observations. Chaque test devra indépendamment permettre d’observer une différence statistiquement significative entre les lymphocytes des souris exprimant ou non notre molécule pour une même condition expérimentale. En effet, les résultats varieront très probablement trop d’une expérience à l’autre pour qu’ils puissent être accumulés dans une même analyse statistique. Du fait de la variabilité individuelle accentuée par les différentes étapes de la manipulation, il est souhaitable d’inclure plusieurs animaux par groupe de souris exprimant ou non notre molécule. Trois animaux par groupe seront inclus dans les expérimentations sans vaccination, et 5 animaux par groupe lorsqu’une étape de vaccination est ajoutée. Dans les expérimentations sans vaccination, deux types de transfert de lymphocytes T seront effectués (lymphocytes monoclonaux et polyclonaux). Il y aura donc 6 souris par expérience (3 souris exprimant notre molécule et 3 souris ne l’exprimant pas) au cours de trois expériences indépendantes, effectuées avec deux types de transfert lymphocytaire, soit 36 animaux. Dans les expérimentations avec vaccination, trois conditions de transfert des lymphocytes T seront testées. Il y aura donc 10 souris par expérience (5 souris exprimant notre molécule et 5 souris ne l’exprimant pas) au cours de trois expériences indépendantes effectuées avec trois types de transfert lymphocytaire, soit 90 animaux. Au total pour les deux types d’expérimentation, il y aura donc 126 animaux.

Raffinement

L’hébergement se fait dans les conditions habituelles de l’animalerie locale : cinq souris sont hébergées par cage et le milieu est enrichi par des carrés de coton et fibres végétales permettant la formation de nids et des maisonnettes pouvant servir de refuge aux animaux. L’irradiation (une seule séquence de 5,8 minutes sur animaux vigils) est effectuée dans une boite de contention adaptée pouvant contenir 11 souris au maximum, isolées les unes des autres. Pour limiter le stress qui accompagne la manipulation au moment de l’irradiation, l’injection de lymphocytes sera réalisée le lendemain. Lorsque cette injection sera couplée à une vaccination, les souris seront endormies avec de l’isoflurane sur une plaque préchauffée à 37°C. Les prélèvements de sang seront précédés d’une anesthésie locale. Les animaux seront manipulés par du personnel expert de l’équipe de recherche. Les souris élevées dans notre animalerie seront transférées en zone d’expérimentation au minimum 48h avant d’être manipulées. Les souris achetées dans un élevage extérieur seront installées en zone d’expérimentation au minimum une semaine avant d’être manipulées.

Choix des espèces

Nous disposons de trois modèles de souris : 1. Transgéniques : tous les lymphocytes T de ces animaux reconnaissent le même antigène. Elles seront mises à mort sans manipulation et leurs lymphocytes T seront extraits de la rate afin de préparer une suspension injectable aux souris des deux modèles décrits ci-dessous. 2. Génétiquement déficientes pour la production de notre molécule. 3. Exprimant naturellement notre molécule. Souris âgées de plus de 6 semaines. Le travail s’intéresse à l’activation des lymphocytes T dans un organisme adulte

72 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit une injection intra-péritonéale d'un marqueur des cellules en division, puis est mis à mort pour prélever du tissu cérébral profond. Le porteur cherche à savoir si des astrocytes d'une région du cerveau liée au sommeil se divisent, en travaillant sur des souris de 4, 30 et 80 jours. Il affirme qu'aucune modélisation ne simule un cerveau et que le modèle murin est "la seule approche possible".

Objectifs

Ce projet vise à étudier un type d'astrocyte (les cellules non neuronales du système nerveux les plus abondantes chez les mammifères) décrit dans une région du cerveau importante dans la régulation du sommeil. Nous voulons tester l'hypothèse selon laquelle ces cellules correspondent à des cellules en cours de division, ce qui ferait de cette zone une zone de prolifération astrocytaire importante compte tenu de la densité observée de ces cellules. La mise en oeuvre de ce projet permettrait de caractériser le taux de division des astrocytes au cours de la période post-natale En effet, les astrocytes de notre région d'intérêt n'ont encore jamais été caractérisés malgré leur rôle dans la régulation du sommeil lent.

Bénéfices attendus

Ce projet servira à mieux caractériser le noyau préoptique ventrolatéral de l'hypothalamus, notre région d'intérêt impliquée dans le déclenchement et le maintien du sommeil lent ainsi que dans la thermorégulation, et s'inscrit dans le cadre d'un projet visant à étudier le rôle des astrocytes de cette région. Des études récentes soulignent l'importance des astrocytes de cette région dans la régulation du sommeil lent. Or les troubles du sommeil concernent 30% de la population générale et sont associés à de nombreuses pathologies telles que l'hypertension artérielle, le diabète, la dépression ou encore les accidents vasculaires cérébraux. Une meilleure compréhension du rôle des astrocytes et des interactions neurone-astrocyte dans la régulation du sommeil est donc nécessaire pour faire face à cet enjeu de santé publique.

Procédures

Notre projet consiste à injecter un produit qui permettra de suivre les cellules en prolifération. Nous réaliserons donc une injection intrapéritonéale sur animal vigil (1min par animal). Les animaux seront enuite replacés dans leur cages jusqu'à leur mise à mort pour l'analyse.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont ceux liés à l'injection en elle-même. Le produit utilisé n'est cependant pas nocif et dilué dans du PBS, donc pas irritant non plus. La contention peut, elle, induire un stress léger.

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour notre projet car nos expériences demandent que nous puissions prélever du tissu cérébral profond fixé afin de visualiser au microscope les cellules en prolifération marquées par le produit injecté.

Remplacement

Un modèle animal est nécessaire pour étudier le comportement de ces cellules tout en prenant en compte l'ensemble des variables intervenants au cours du développement de l'animal. La visualisation des astrocytes, qui permettra de confirmer que les cellules marquées sont bien des astrocytes, est rendue possible par l’utilisation d’une lignée de souris transgénique. Le fait d’utiliser des souris transgéniques qui nous permettent de visualiser l’ensemble de leur anatomie est crucial. Aucune modélisation ne permet de parfaitement simuler un cerveau, ses cellules et les différentes interactions entre elles. Toutefois, le modèle souris a été choisi pour les raisons évoquées plus haut.

Réduction

Afin de mesurer le taux de division des astrocytes de notre région d'intérêt, nous devons réaliser ces mesures dans une région contrôle. Le cortex moteur primaire (une aire du cortex cérébral qui participe à la planification, au contrôle et à l'exécution des mouvements volontaires des muscles du corps) n'a jamais été décrit comme une zone où les astrocytes se divisent, et servira donc de région contrôle dans notre étude. De plus, le cortex moteur primaire et notre région d'intérêt sont colocalisés sur les coupes de cerveau sur lesquelles nous travaillerons, ce qui permet de minimiser le nombre de coupes nécessaires. De même, nous travaillerons sur les deux hémisphères de chaque coupe réalisée de sorte à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés dans ce projet.

Raffinement

Les injections seront réalisées par du personnel habitué, réduisant ainsi le temps de manipulation et donc le stress éventuel des animaux.Des points limites ont été prévus. Si malgré la prise en charge par des analgésiques, le niveau de douleur de l’animal, évalué par des critères quantifiables adaptés, reste trop élevé, nous procèderons à l’euthanasie de l’animal. Une attention particulière sera portée aux souris les plus jeunes de manière à diminuer l'impact de leur manipulation.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux de petite taille, à développement rapide, modifiables génétiquement et qui montrent de grandes similarités avec l'homme en terme de mécanismes moléculaires et cellulaires. De plus, toutes les études que nous avons réalisées jusqu’à présent sur ces morphologies astrocytaires ont été effectuées chez la souris. Nous devons à présent démontrer que l’origine de ces doubles, mis en évidence chez la souris, viennent de divisions cellulaires récentes. Il n’y a donc aucun intérêt à changer de modèle à ce niveau. Pour notre projet, l'utilisation d'un modèle murin est la seule approche possible. Les trois groupes d'animaux correspondent à des animaux utilisés 4, 30 et 80 jours après leur naissance. L'objet de notre étude étant de caractériser la fonction des astrocytes "en doublets" du noyau préoptique ventrolatéral, en testant l'hypothèse selon laquelle il s'agirait d'astrocytes en division ou récemment divisés, nous travaillerons 4 jour après la naissance des animaux (mise en place du réseau astrocytaire), à 30 jours post-natal (stade de référence pour l'étude du sommeil), et à 80 jour post-natal (stade mature chez la souris, auquel nous avons réalisé d'autres études complémentaires de celle-ci). L'intérêt de travailler avec des souris à ce dernier stade est de pouvoir comparer les données obtenues à ce stade avec celles obtenues chez les souris à 4 et 30 jours post-natal, et ainsi étudier la mise en place du réseau astrocytaire au cours du développement post-natal et son impact sur le comportement de sommeil.

628 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles sont infectées par des trypanosomes, exposées à des ondes radiofréquences huit heures par jour pendant cinq jours et prélevées au sang à la queue, pour tester un effet immunostimulant des ondes contre cette parasitose. Toutes les souris étant infectées, elles sont mises à mort avant que leur parasitémie n'atteigne un seuil jugé irréversible. Le porteur affirme qu'il "n'y a pas de substitution possible au modèle animal" pour étudier l'évolution d'une parasitose.

Objectifs

Les maladies parasitaires ou parasitoses représentent un lourd fardeau pour les populations des pays en émergence. Elles constituent des affections multifactorielles dépendant de la constitution génétique de l’hôte, de son alimentation et de son environnement physique et chimique. Toute modification d’un des facteurs peut avoir des répercussions sur la charge parasitaire. Les études des relations hôte-parasite ont mis en évidence le rôle essentiel du système immunitaire de l'hôte dans la protection contre ces maladies. Ce système peut être stimulé par des molécules chimiques ou des moyens physiques dont certains ont montré leur efficacité. Cette deuxième possibilité considérée comme moins toxiques pour l'organisme que l'introduction de molécules étrangères doit être privilégiée, non seulement pour son intérêt éventuellement thérapeutique, mais également pour approfondir nos connaissances sur le système immunitaire. Les ondes électromagnétiques ont déjà montré un effet immunostimulant dans différentes situations. De plus, leur innocuité vis-à-vis des mammifères aux doses proposées a également été démontrée. Le projet présenté vise à identifier et optimiser les caractéristiques d’ondes électromagnétiques susceptibles d'avoir un effet protecteur dans un modèle de parasitose appelée trypanosomose expérimentale .Pour cela, des souris infestées par des trypanosomes seront exposées à des ondes électromagnétiques et le suivi de leur parasitémie (nombre de parasites circulants dans le sang) sera considéré comme un indicateur de la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Une réponse positive aux ondes avec diminution de la charge parasitaire sera étudiée au niveau immunitaire. Cet effet peut permettre de mettre en évidence un moyen de défense encore mal connu dans les maladies infectieuses. De plus, de nombreuses stimulations physiques se sont révélées intéressantes et dénuées de toxicité dans différentes conditions pathologiques chez l’homme, en particulier en cancérologie.

Procédures

Les souris seront exposées, libres de leurs mouvements, 8 h/ jour, 5 jours consécutifs pendant 1 semaine à différents signaux radiofréquences. Trois prélèvements de sang seront réalisés pour évaluer la parasitémie. Pour cela, une goutte de sang d'un animal parasité est prélevée à la queue, après section fine à l'extrémité, avec un capillaire (5 µl) pour comptage des parasites .

Impact sur les animaux

L’exposition aux ondes ne sera pas elle-même source de souffrance des animaux et de leur mort. Aucun effet biologique négatif de l’exposition aux radiofréquences n’a été confirmé sur la souris pour des niveaux de puissance reçus inférieurs ou égaux à 4 W/kg. A ce niveau de puissance, le potentiel échauffement des tissus induit par l'exposition aux radiofréquences est compensé par la thermorégulation physiologique et n'implique aucune souffrance chez les souris. La charge parasitaire des souris trypanosomées est très bien supportée, et les animaux ne présentent pas de signes cliniques. L’animal est euthanasié lorsqu’il présente des signes de souffrance ou lorsque la parasitémie atteint un seuil jugé irréversible (200 000 parasites par μl) antérieur à l’apparition des signes cliniques. Chaque souris subit 3 prises de sang réparties sur 2 jours. Elles sont réalisées très rapidement par une personne expérimentée et représentent un stress léger.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. Toutes les souris sont infestées par des trypanosomes ce qui impose leur mise à mort avant l’atteinte du seuil jugé irréversible de la parasitémie.

Remplacement

Remplacer le modèle animal n’est pas possible pour ce projet qui étudie des processus dynamiques du système immunitaire qui ne peuvent pas être recréés sur des modèles in vitro. Ainsi, l’évolution d’une parasitose ne peut être étudiée que sur un modèle animal et ne peut être remplacée en aucun cas par d’autres méthodes alternatives expérimentales : in vitro, peu de parasites survivent, et les conditions de culture des parasites, modifiant la majorité de leurs propriétés, ne sont pas satisfaisantes pour atteindre les objectifs requis. Il n’y a pas de substitution possible au modèle animal

Réduction

Nous utiliserons le nombre d'animaux qui nous permettra de réaliser tous les tests, soit des groupes de 10 souris (7 exposées et 3 non exposées) par niveau d'exposition pour l'identification de la dose la plus active (24 testées) soit 24 X10 = 240 souris en duplicata soit 240 X2 =480 souris , plus 148 souris pour entretenir la souche parasitaire (260 semaines d’expérimentations , relance de la souche toutes les 7 semaines avec 2 souris en duplicata) et donc un total maximal de 628 souris. Si une condition s’avère efficace statistiquement, nous mettrons l’accent sur sa duplication. En l’absence d’effet, la condition d’exposition ne sera pas répliquée.

Raffinement

Les souris seront placées dans des cages en plexiglass utilisées dans l’animalerie, avec 7 souris par cage maximum. Les souris seront exposées aux ondes dans ces mêmes cages, ce qui supprimera la manipulation et évitera donc de les stresser. Elles bénéficieront d’un enrichissement avec une hutte en polycarbonate rouge, ainsi que du matériel de nidification et du matériel à ronger. Les conditions d'hébergement dans l’animalerie et dans la salle dans laquelle seront exposés les animaux présentent une ambiance contrôlée. Une surveillance quotidienne sera assurée par le personnel de l’équipe. Une fiche de suivi des animaux permettra d’évaluer l’atteinte de points limites et la mise en place de mesures adaptées (observation, analgésie conseillée pour score signe de douleur légère, observation accrue et analgésie obligatoire pour score correspond à une souffrance avérée et un score signe de douleur sévère entrainera la mise à mort de l’animal). Les points suivants seront vérifiés : - l’apparence physique externe, par exemple l'absence de signes d'agression (sang, morsure, lésions de la peau), les caractéristiques de la fourrure, qui doit être lisse et propre (blanche) - les changements du comportement et de l'interaction avec les partenaires, par exemple l'agitation, la prostration, etc. - les réponses comportementales aux stimuli externes, par exemple, la réaction au bruit, l'émission de cris anormaux - De plus, la variation du poids de l'animal sera surveillée avec une pesée quotidienne si les souris présentent des signes de souffrance. Des femelles seront utilisées, permettant ainsi d’éviter l’agressivité entre des groupes de mâles.

Choix des espèces

La souris est couramment utilisée dans ce type d’étude, ce qui a permis de constituer une base importante d’informations permettant de guider la conception de nos protocoles. De plus, il existe des analogies entre le système immunitaire des souris et celui des autres mammifères, rendant ces études pertinentes. Nous utiliserons les femelles pour s’affranchir des risques de blessures dans les groupes mâles. Nous commanderons des animaux âgés de 6 semaines afin d’avoir une habituation à l’animalerie de 2 semaines avant le début des expérimentations. Ils entreront ensuite dans les protocoles d’étude, à l’âge de 8 semaines, qui correspond à leur maturité immunitaire.

208 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit une injection dans la veine de la queue, suivie de séances d'imagerie sous anesthésie, avant d'être mis à mort pour prélever le foie et le cœur. Le projet étudie une voie de contrôle des protéines mitochondriales sur des souris génétiquement modifiées. Le porteur affirme qu'il "n'existe pas de méthode alternative" et que la souris est le seul modèle porteur d'une déficience pour sa protéine d'intérêt.

Objectifs

La mitochondrie est un organite intracellulaire semi-autonome qui est impliquée dans de nombreuses fonctions biologiques essentielles comprenant entre autres, la production d'énergie, la régulation du stress oxydatif et la mort cellulaire programmée. Les dysfonctions mitochondriales sont responsables de plus de 120 syndromes. Ces pathologies sévères sont classées dans les maladies rares. Les fonctions mitochondriales reposent sur un protéome de 1500 protéines environ. Chez les mammifères, plus de 99 % des protéines mitochondriales sont synthétisées dans le cytosol sous forme de précurseurs qui sont ensuite importés dans l'organite. La qualité de ces protéines néosynthétisées représente un enjeu crucial permettant d’éviter l'accumulation de protéines défectueuses dans l'organite et ainsi prévenir les dysfonctions mitochondriale. A ce jour, on ignore encore comment le contrôle qualité de ces précurseurs protéiques mitochondriaux est assuré avant leur import dans l'organite. Récemment, en utilisant des modèles cellulaires nous avons mis en évidence qu'une E3 ubiquitin ligase, FBXL6, est indispensable pour ce processus de contrôle qualité des protéines nouvellement synthétisées ou naissantes. L'objectif de notre projet est d'étudier les conséquences physiopathologiques de l’invalidation de cette voie sur contrôle qualité des protéines mitochondriales dans deux tissues, le foie et le coeur. Pour cela nous utiliserons un modèle de souris KO pour la E3 ubiquitine ligase.

Bénéfices attendus

La mitochondrie est une organelle intracellulaire jouant un rôle central dans plusieurs fonctions cellulaires et tissulaires. Entre autres, ces organelles produisent l’essentiel de l’énergie nécessaire au bon fonctionnement des différents organes chez l’homme. Cette activité énergétique mitochondriale est donc cruciale et son altération entraine des maladies rares sévères caractérisés par des perturbations généralisées du métabolisme (acidose lactique, obésité, déficits énergétique ...), encéphalopathie, cardiomyopathie etc... A l’heure actuelle, plus de 120 syndromes mitochondriaux ont été décrits pour lesquels aucun traitement n’existe. Notre projet vise à améliorer les connaissances concernant ces pathologies et réveler des nouvelles cibles therapeutiques pour ces pathologies.

Procédures

Pour chaque animal, une injection sera réalisée dans la veine de la queue grâce à une seringue. Cette étape durera moins d’une minute. Un premier groupe d’animaux sera analysé en imagerie à 1, 4 et 8 semaines après l’injection intraveineuse. Ces animaux seront anesthésiés par voies respiratoires, puis soumis à une injection par voie intrapéritonéale et enfin placé dans une chambre d’imagerie. La durée totale de cette approche est d’environ 15 min par animal et répétée, donc, à 1, 4 et 8 semaines post injection. En parallèle, deux groupes seront sacrifiés successivement, à 4 et 8 semaines après l’injection intraveineuse. Nous prélèverons les tissus d’intérêt et cette étape durera moins d’une minute.

Impact sur les animaux

Notre procédure nécessite une l’injection intraveineuse dans la veine de la queue susceptible d’entrainer une douleur transitoire. Cette procédure est très rapide (

Devenir

Tous les animaux, incluant les animaux atteignant les points limites seront mis à mort, à des fins d’ analyses, conformément à l'annexe IV de la directive 2010/63/CE.

Remplacement

Il n'existe pas de méthode alternative à ce projet car seul un modèle murin récapitulant les éléments de la physiopathologie observée chez l'homme. Nos recherches préalables menées sur des modèles alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo, ont permis d’obtenir un certain nombre de résultats et nous permettent de cibler/restreindre précisément les recherches à mener sur l’animal. En revanche, ces modèles ne peuvent pas reconstituer la complexité de la régulation des fonctions mitochondriales et de leurs conséquences physiopathologiques.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales a été déterminé pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes. Le nombre d’animaux nécessaires par lot pour détecter 50% de différence inter-lots avec 40% d’écart type intra lot est de 10 et les expériences seront répétées à deux reprises. Les tests statistiques afin de comparer les groupes d’animaux seront non paramétriques. Dans un premier temps, un test statistique nous permettra de vérifier les différences significatives entre les groupes d’animaux. Il sera ensuite suivi d’un test post-hoc de comparaisons multiples. Nous utilisons les souris males et femelles pour notre projet. De plus, nos études préliminaires réalisées sur des modèles complémentaires ont permis de réduire notre étude in vivo à une partie congrue.

Raffinement

1-Hebergement : Les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect du bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Nos animaux sont hébergés en présence de raffinement spécifique: - coton dentaire, que les souris dépiautent pour se faire un nid. -des tunnels en carton, qui leur servent à se cacher et à jouer. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. 2. Contention: les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maitrise les méthodes de préhensions douces. Les animaux sont attrapés par la peau du dos afin de ne pas les manipuler par la queue. 3. Formation: une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal. 4. Minimiser la douleur: les injections intraveineuses sont réalisées sur des animaux par un personnel dument formé. Un suivi quotidien des animaux est réalisés post injection afin d’anticiper des éventuels inconforts et douleurs. En cas d’inflammation lors des 24h après la procédure, nous injecterons une dose d’anti-inflammatoire non-steroidien en sous-cutanée. 5. Les points limites : Nous avons également établi des points limites objectifs et précoces permettant de mettre fin à toute procédure le cas échéant. Les animaux présentant des signes moteurs anormaux après les injections, au réveil après l’anesthésie et l’imagerie seront observés de près et si aucune amélioration observée après 24h, ils seront euthanasiés. Les animaux ayant une perte de poids de plus de 20 % ou présentant des signes tels que piloérection, déshydratation, dos voûté, prostration, isolement pendant plus de 24h jour, seront euthanasiés.

Choix des espèces

Nous utiliserons les souris adultes pour cette expérimentation. L’âge adulte correspond au stade durant lequel les effets biologiques que nous analysons sont modifiés. Par ailleurs, nous utilisons la souris car il s’agit de l’unique modèle animal existant présentant une déficience pour notre protéine d’intérêt.

2 805 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. De jeunes femelles reçoivent des injections hormonales pour provoquer une superovulation, sont accouplées, puis mises à mort au 15e jour de gestation pour prélever les embryons, eux aussi tués pour cultiver leurs neurones. Les mâles reproducteurs sont tués à 35 semaines, jugés "trop âgés" pour les accouplements. Le porteur affirme que la culture de neurones à partir d'embryons reste une approche "indispensable" et "inévitable" pour le projet.

Objectifs

Le projet que nous menons utilise le modèle animal souris, et fait partie intégrante de la thématique du laboratoire. Il vise à améliorer les connaissances sur les fonctions neuronales de la sumoylation. Ce projet correspond également à une demande de renouvellement d’autorisation de projet utilisant des animaux à des fins scientifiques.

Bénéfices attendus

La superovulation (SOP) fait intervenir les procédures appropriées pour l'amorçage hormonal des souris femelles. L'amorçage hormonal est utilisé pour induire une superovulation, augmentant ainsi le nombre et la probabilité d'embryons fécondés dans les accouplements programmés. Ces travaux fournissent des incations sur le role de la SUMOylation dans des modeles animaux de maladies caracterisées par un dysfonctionnement synaptique. Ces données forniront des informations sur les stratégies susceptibles de déboucher sur des cibles ayant des objectifs thérapeutiques.

Procédures

De jeunes souris femelles, âgées de 4 à 6 semaines, sont traitées avec des hormones afin d'induire un développement folliculaire et une ovulation accrue. Deux hormones sont injectées par voie intrapéritonéale (IP) à intervalles réguliers avant l'accouplement de la femelle avec un mâle reproducteur éprouvé. Le but est la mise en accouplement des animaux en vue de produire des embryons nécessaires à des cultures de neurones dissociés pour des études in vitro.

Impact sur les animaux

Pourcentage approximatif de morbidité et de mortalité possibles en raison de la procédure décrite, y compris les causes probables et la façon dont elles seront traitées. La procédure d’injection intrapéritonéale utilisée pour l’amorçage hormonal des femelles donneuses d’embryons est bien documentée avec très peu de problèmes cliniques signalés. Nous prévoyons une très bonne tolérance des femelles donneuses à l’amorçage hormonal, avec moins de 1% de morbidité et de mortalité.

Devenir

Toutes les femelles gestantes seront mise à mort afin de prélever les embryons à E15 qui seront mis à mort afin de prélever les cerveaux. La mise à mort des géniteurs sera réalisée au bout de 35 semaines, car ils seront trop agés pour les accouplements.

Remplacement

Les neurones sont des cellules différenciées et complexes et qui ne se divisent pas, ceci leur donne une particularité physiologique unique. En l’absence de lignée cellulaire permettant d’adopter la complexité neuronale, l’utilisation de cultures primaires de neurones reste à ce jour inévitable. Le système de culture primaire de neurones que nous utilisons est standard et utilisé par tous les groupes de recherche à travers le monde. Ainsi, la culture primaire de neurones (réalisée à partir d’embryons de souris à 15 jours embryonnaires) reste une approche protocolaire indispensable pour la réalisation de notre projet. Elle constitue le meilleur système pour permettre la visualisation en temps réel des mouvements des protéines le long des prolongements du neurone, pour enregistrer électrophysiologiquement leur activité ce qui ne peut être réalisé dans des cultures de cellules immortalisées.

Réduction

En utilisant la technique SOP, nous pouvons réduire le nombre d’animaux lors de l’accouplement, il est necessqire de mettre en accouplememt uniquemt 1 femelle avec 1 male. La technique garantit 95% de probabilité de gestation sur 24h d’accouplement. La SOP nous permet de garantir une gestation sur une même durée d’accouplement et sur moins de femelles. Ce qui conduit a une reduction du nombre danimaux utilise.

Raffinement

Le bien-être animal est une préoccupation majeure lors de la réalisation de nos expérimentations. Dans ce projet, nous veillerons à ce que l'hébergement des animaux leur permettent d'avoir un enrichissement (paille, bois et coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les animaux seront hébergés dans un local à température contrôlée. Les souris auront libre accès à l'eau et à la nourriture. Nous serons aussi particulièrement vigilants à l'apparition de tout signe évocateur d'une souffrance animale. Les animaux seront scorés sur 3 critères, le changement de poids corporel, l'apparence physique, et le comportement. Les injections intrapéritonéales seront réalisées par un expérimentateur maîtrisant la technique, en prenant soin d’alterner chaque jour le site d’injection (cadran inférieur gauche et droit de l’abdomen). Les femelles en gestation seront également surveillés quotidiennement, afin de détecter tout signe de souffrance inopinée.

Choix des espèces

Les modèles murins sont des modèles d'expérimentation animale de choix pour l’étude du système nerveux en conditions normale et pathologique. En effet, la souris partage environ 99% de ses gènes avec l'homme. De plus, l’homologue murin du gène FMR1 Humain a été manipulé pour générer des modèles animaux présentant des phénotypes très similaires à ceux observés chez les patients X-fragiles notamment au niveau de la morphologie neuronale et du comportement ce qui en font des modèles de choix de la maladie, mais aussi des modèles indispensables pour étudier et mieux comprendre les mécanismes moléculaires de cette pathologie. Les femelles gestantes souris (entre 3 et 6 mois) seront mise à mort au début du le 3ème tiers de la gestation (E15 pour la souris ). Les mâles reproducteurs maintenus pour générer des femelles gestantes, seront mis à mort à 12 mois. Les embryons seront mis à mort à 15 jours embryonnaires, afin de pouvoir faire des cultures primaires de neurones d’hippocampe et de cortex pouvant répondre au mieux aux exigences et aux contraintes de l’expérimentation. Ces protocoles de culture sont bien établis dans notre Centre de Recherche et sont les plus adaptés pour ce type de projet, ils font également objet de publication.