Recherche fondamentale

107 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une intervention neurochirurgicale sous anesthésie de 30 à 45 minutes, avec un risque de douleur, d'infection et de perte de poids, pour cartographier l'organisation des fibres de matière blanche du cerveau. Les retombées annoncées pour l'humain, une meilleure compréhension du cerveau normal et pathologique, sont renvoyées au conditionnel et au long terme. Le porteur affirme que seuls les modèles mammifères conviennent et conclut que le recours à la souris est "nécessaire".

Objectifs

L'objectif global de notre projet est de faire progresser nos connaissances anatomiques sur la manière dont le cerveau est connecté. Pour ce faire, nous étudierons l'organisation de la matière blanche (qui contient les voies qui relient les différentes régions du cerveau) dans le cerveau de la souris. Les techniques non invasives actuellement disponibles pour étudier ces voies sont incapables de révéler de manière fiable l'organisation des structures complexes telles que les faisceaux de fibres et manquent de la précision par rapport à la neuroanatomie de référence. Par conséquent, nous visons à améliorer la précision avec laquelle nous pouvons étudier l'anatomie de ces voies en utilisant une approche multimodale avancée. En fin de compte, les connaissances et la méthodologie développées dans ce projet serviront de d'étape clé pour une approche similaire appliquée à d'autres espèces, y compris le cerveau humain, et contribueront à une meilleure compréhension de l'organisation structurelle et fonctionnelle du cerveau humain, qu'elle soit normale ou pathologique. A termes, notre étude conduira également au développement des modèles informatiques et algorithmes prédictifs qui permet d'éventuellement remplacer certaines études impliquant les animaux.

Bénéfices attendus

La matière blanche du cerveau est impliquée dans un certain nombre de maladies humaines. Une meilleure compréhension de son organisation structurelle et fonctionnelle dans des conditions normales est nécessaire pour identifier et comprendre les différences qui peuvent survenir dans des conditions "anormales" ou pathologiques. En améliorant la précision de nos connaissances sur la neuroanatomie de la matière blanche du cerveau, notre projet permettra de mieux comprendre l'organisation structurelle et fonctionnelle du cerveau. En outre, les méthodes et approches techniques que nous innoverons dans notre projet d'étude du cerveau de la souris contribueront au développement d'une nouvelle approche qui permettra une étude fiable de la neuroanatomie de la matière blanche dans le cerveau humain.

Procédures

Les animaux subiront une seule intervention neurochirurgicale sous anesthésie d'une durée de 30 à 45 minutes, qui n'aura lieu qu'une seule fois dans la vie de la souris.

Impact sur les animaux

Les animaux subissent une brève intervention chirurgicale sous anesthésie. Cet acte comporte un faible risque de douleur, d'infection, d'inconfort et de perte de poids.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et leurs tissus récupérés pour les analyses post-hoc.

Remplacement

Nous utiliserons la souris parce qu'elle possède les structures cérébrales que nous étudions et qui existent également chez l'homme. Comme nos recherches visent à fournir un aperçu et des bases pour des études plus approfondies sur les cerveaux humains, un modèle mammifère est préférable en raison de la plus grande similitude de l'organisation des structures neuronales. En accord avec la Directive Européenne et le principe des 3Rs, nous avons réfléchi à nos expériences afin d'intégrer les approches alternatives si possible. A notre connaissance, seuls les modèles mammifères, et plus particulièrement la souris (grâce à sa petite taille permettant la visualisation de son cerveau entier lors des approches de microscopie à lumière), répondent à l'ensemble de ces critères. Les études humaines ne sont pas adaptées à notre projet car des procédures invasives sur le tissu vivant soient nécessaires pour effectuer le marquage par vecteurs viraux. Cela empêche l'utilisation des tissus port mortem humains. Pour toutes ces raisons, et malgré notre réflexion, le recours à l'animal est malheureusement nécessaire.

Réduction

Le projet vise à contribuer à la validation et au développement d'outils de prédiction et de modèles cérébraux in silico. Il contribuera au développement d'une ressource réutilisable à la disposition de la communauté scientifique qui pourra à terme réduire et même remplacer les études sur les animaux. De par sa nature même, il contribuera directement aux objectifs de réduction prévus par les principes des 3Rs et la législation européenne. Le succès de notre projet repose sur des aspects techniques : la capacité de cibler des zones cérébrales de faible volume et nécessitant une grande précision, la capacité de réaliser un marquage intense des neurones nécessitant une optimisation de notre approche expérimentale. Plusieurs facteurs sont susceptibles d'influencer les résultats obtenus. Pour ces raisons, il est très difficile d'estimer a priori le nombre d'animaux nécessaires. Cependant, nous sommes et resterons très attentifs à l'objectif de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. C'est pourquoi nous proposons d'adopter une stratégie expérimentale qui nous permettra d'analyser nos données au fur et à mesure (c'est-à-dire des expériences réalisées sur de petits lots de 2 à 5 animaux). Cela nous permettra de modifier notre stratégie expérimentale et d'arrêter les expériences dès que le résultat obtenu sera satisfaisant. Comme notre stratégie expérimentale dépend de ces facteurs techniques, nous ne sommes pas en mesure de proposer des tests statistiques pour estimer la taille de l'échantillon nécessaire.

Raffinement

i) Surveillance quotidienne. ii) Vérification de l'état de l'animal pendant la période précédent l'intervention chirurgicale conformément aux critères généraux. iii) Intervention immédiate et appropriée (si nécessaire) - les mesures conservatrices doivent être privilégiées. iv) Perfectionnement des procédures chirurgicales afin de réduire le risque de douleur ou de souffrance v) Lors de la chirurgie : utilisation d'une crème pour les yeux et d'un tapis chauffant pour maintenir la température de l'animal. Utilisation des produits anti-douleurs adaptés. Respect des principes d’hygiène et d'asepsie. Surveillance continue, application d'une procédure de "nursing" si nécessaire. vi) Formation appropriée et actualisée des expérimentateurs aux techniques chirurgicales pertinentes. vi) Adaptation des conditions d'hébergement : animaux maintenus dans des cages collectives.

Choix des espèces

Nous utiliserons la souris parce qu'elle possède les structures cérébrales que nous étudions et qui existent également chez l'homme. Etant donné que nos recherches visent à fournir un aperçu et des bases pour des études plus approfondies sur le cerveau humain, un modèle mammifère est préférable puisque l'organisation des structures neuronales est grandement similaire. Bien que nos recherches initiales utilisent des animaux sains, nous avons l'intention d'effectuer des recherches semblables sur des modèles de pathologie humaine. À ce jour, la souris est la seule espèce de mammifère pour laquelle il est possible de modifier le génome de manière routinière et constitue donc le modèle idéal pour nos recherches. La petite taille du cerveau de la souris permet de l'adapter à la fois à l'appareil d'IRM et au microscope optique, qui sont tous deux des dispositifs essentiels à notre étude. Nous utiliserons de jeunes souris adultes (âgés de 4 à 6 semaines), premièrement car les circuits neuronaux concernés sont stables à cet âge par rapport à des souris plus jeunes, mais aussi car il sera plus facile de nettoyer le cerveau pour l'imagerie. En effet, ce processus d'élimination des lipides du cerveau de la souris devient techniquement plus difficile chez les adultes plus âgés. Il s'agit d'une étape cruciale pour préparer le cerveau à la visualisation de structures spécifiques et, par conséquent, un jeune adulte est l'âge optimal pour faciliter une procédure réussie. Le choix de la souris est également motivé par nos données antérieures et la disponibilité de paradigmes expérimentaux déjà développés, qui garantissent le succès de notre étude.

21 macaques rhésus vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, ce volet couvrant l'essentiel du protocole d'un projet mené sur deux établissements. Ils reçoivent un entraînement cognitif tête fixée sur une chaise de contention, jusqu'à cinquante injections d'un ligand, des neurochirurgies et un contrôle de leur accès à l'eau, pour enregistrer l'activité de leur cortex préfrontal. Le porteur reconnaît une soif possible entre les sessions et un inconfort à l'apprentissage de la contention, et prévoit la mise à mort de chaque singe pour valider l'expérience par l'histologie du cerveau. Il conclut que le remplacement des primates est impossible, les alternatives in vitro et in silico ne reproduisant pas ce réseau.

Objectifs

Le cortex préfrontal est une région cérébrale très développée chez les primates. Il gère des fonctions qui permettent la flexibilité comportementale. La perte de ces fonctions caractérise plusieurs maladies psychiatriques. Les mécanismes du cortex préfrontal dans ces fonctions et de ces maladies sont peu connus – il semble notamment important de comprendre comment le cortex préfrontal fonctionne en interaction avec d’autres régions du cerveau. Nous étudierons ces interactions dans ce projet qui se déroule dans deux établissements utilisateurs – EU1/2 pour la majorité du protocole, et EU2/2 pour l'imagerie cérébrale. Tout d'abord, nous étudierons le dynamique de ces interactions par enregistrement électrophysiologique des neurones du cortex pendant des comportements adaptatifs. Puis nous caractériserons l’impact de perturbations des interactions du cortex préfrontal sur l’activité neuronal et sur les comportements adaptatifs. Nous utiliserons la technique émergente de pharmacogénétique qui permet de modifier l’activité des neurones impliqués dans les interactions, tandis que nous enregistrons cette même activité pour comprendre ce qui change dans le cerveau. Ces techniques invasives nécessitent des sujets animaux, ici des macaques - contrairement à d’autres espèces modèles les macaques partagent plusieurs des zones préfrontales ciblées avec l’espèce humaine. Les connaissances fondamentales acquises par ce projet contribueront à notre compréhension du fonctionnement cérébral et, à long terme, à élucider les mécanismes pathologiques des dysfonctions exécutives.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu sera donc la connaissance scientifique qui résultera de ces études, comme le projet nous permettra de mieux décrire les mécanismes physiologiques du cortex préfrontal et les mécanismes dans le cerveau des comportements adaptifs. En plus le projet nous permettra de comprendre comment le perturbation des interactions du cortex préfrontal modifient son fonctionnement. Plus largement la compréhension de ces perturbations nous approche à des mécanismes spécifiques des maladies qui en sont liées. Le projet avancera notre compréhension des approches pharmacogénétiques chez les primates, étape essentielle au développement du pharmacogénétique comme traitement médicale chez l’humain.

Procédures

Tous les animaux recevront un entrainement cognitif avec renforcement positif, dans leur hébergement et dans une salle de test. Les sessions sont de 1–5 heures, 5 jours par semaine, pour la durée du protocole. Après chirurgie, les singes fourniront des enregistrements intracérébraux pendant ses sessions d’entrainement cognitif. Les singes passeront également l’imagerie cérébrale - des IRM, des TEP et des CT sous anesthésie. Chaque séance dur 1-3 heures. Tous les singes passeront une ou deux neurochirurgies - pour l'implantation de dispositifs d'enregistrement neurophysiologique et pour l'injection de vecteurs viraux pour la pharmacogénétique. Les singes recevront des injections intramusculaires d'un ligand pour la pharmacogénétique ou d'une substance de contrôle. Jusqu’à 50 injections par animal, pendant le session de travail. À la fin du protocole, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera extrait pour analyse histologique.

Impact sur les animaux

Au cours du projet, les animaux auront plusieurs anesthésies générales, dont au moins une pour une neurochirurgie. Les anesthésies sont réalisées pour les différentes formes d'imagerie cérébrale nécessaires au projet, et pour la chirurgie destinée à l'implantation d'électrodes, de chambres d'enregistrement, et/ou à l'injection de vecteurs viraux. La chirurgie pourra susciter un inconfort post-opératoire temporaire, normalement maitrisé par l'administration d'analgésique et un suivi rapproché par les expérimentateurs et les zootechniciens. L'anesthésie générale provoquera également en elle-même un inconfort au réveil. Les animaux du groupe 5 travailleront dans un environnement d'entraînement en accès libre. Ils seront brièvement maintenus en contention légère, de manière à équiper les implants de carte mémoire et à effectuer les inspections et les soins pour les implants. Les animaux des groupes 1-4 et 6 travailleront dans le cadre traditionnel d'un box expérimental. Ils seront assis dans une chaise à primate, la tête fixée par le plot implanté. Les animaux seront formés à cette procédure par renforcement positif, la procédure étant bien établie et bien tolérée, mais les animaux éprouveront un léger inconfort lors de l’apprentissage de la procédure. Les animaux seront formés dans le cadre d'un protocole de contrôle hydrique. Ce protocole est progressivement mis en œuvre et, dans la grande majorité des cas, les animaux reçoivent leur dose normale de liquide. Cependant il est possible pendant l'adaptation au processus, une certaine sensation de soif puisse se manifester entre les sessions.

Devenir

À la fin du protocole les animaux, ayant reçu des injections pour le pharmacogénétique, seront euthanasiés et leur cerveau sera extrait pour analyse histologique, afin d'analyser et de confirmer l'expression des récepteurs pharmacogénétique dans leur cerveau. La validation de l'expression de ces récepteurs dans le tissu post mortem est une étape critique dans la justification des résultats de l'expérience. Le travail histologique, et donc l'euthanasie des animaux, fait donc partie intégrante de l'expérience.

Remplacement

La nécessité scientifique de ce programme de recherche est décrite dans les objectifs de ce projet et est soutenue par les financements accordé. Le projet est spécifiquement axé sur la dynamique neuronale du cortex préfrontal et ses interactions. Cette spécificité rend les alternatives non animales impossibles à mettre en œuvre pour atteindre les objectifs du projet. Les modèles in silico du cortex préfrontal restent rudimentaires pour les questions de dynamique neuronale - en effet, un résultat de ce projet pourrait être l'amélioration de ces modèles. En outre, le projet se concentre sur les interactions du cortex préfrontal avec d'autres régions du cerveau. Non seulement les modèles in silico du cortex préfrontal sont rudimentaires pour l'étude de la dynamique neuronale, mais ils sont rarement connectés à des versions modélisées d'autres régions du cerveau, et jamais avec toute la complexité des connexions dans le cerveau parce que nous ne connaissons ni ne comprenons la forme et la nature de ces connexions. Les assemblages de cellules in vitro peuvent être utilisés pour étudier la dynamique neuronale de base, mais jamais avec les interactions cortico-corticales, cortico-sous-corticales et neuromodulatrices que nous examinerons ici - les préparations in vitro manquent de ces éléments, et l'objectif de ce projet est de rendre compte de l'ensemble des systèmes du cortex préfrontal, ce qui n'est pas possible in vitro. L'étude ex-vivo est impossible pour ce projet car la dynamique neuronale n'est produite que par un cerveau vivant. Pour atteindre les objectifs scientifiques décrits, les primates non humains sont le seul choix possible de modèle animal, sur la base de critères anatomiques et cognitifs. Seules les espèces de primates possèdent la région du cortex préfrontal latéral granulaire qui est la cible de notre étude. Parmi les animaux de laboratoire acceptés, seules certaines espèces de primates sont capables d'accomplir les tâches cognitives que nous étudions ici. En conséquence de ce qui précède, il n'y a aucune forme de progrès scientifique ou technique dans un avenir prévisible qui permette d'obtenir les informations que nous recherchons ici à partir d'expériences n'impliquant pas d'animaux, et donc nous ne pouvons pas aborder la question du remplacement de ces expériences.

Réduction

La taille estimée de la cohorte pour cette étude a été définie en prenant en compte l'impératif éthique d'utiliser le moins d'animaux possible et l’impératif scientifique et éthique d’utiliser le nombre suffisant pour obtenir des données scientifiques robustes, des résultats significatifs et généralisables. Le nombre d’animaux est réduit à la valeur minimale permettant d’atteindre une significativité et une reproductibilité des observations. En général, l'approche consiste à concevoir toutes les expériences pour les contrastes et les tests statistiques intra-individuel, puis à tester un deuxième animal pour confirmer les résultats du premier. Cela signifie qu’un singe sert comme son propre contrôle et que le "n" de l'expérience est constitué de sessions ou de neurones. C'est le minimum absolu pour une expérience scientifique correctement réalisée, et notre travail pour réaliser ces expériences de cette manière représente un effort maximal de réduction. Pour toutes les procédures, l’utilisation des interventions pharmacogénétique DREADD pour modifier l’activité des neurones relèvent du raffinement ce qui porte la réduction à son maximum. C’est une intervention réversible qui ne nécessitent pas de lésion et n’impliquent pas de perturbation à long terme. La procédure étant réversible, l'animal peut également agir comme son propre contrôle. Dans chaque groupe principal, deux animaux seront utilisés si les deux fournissent la puissance statistique requise pour l'étude. Un troisième animal a été noté, mais il ne sera inclus que si l'un des deux premiers n'est pas en mesure de fournir des données répondant à ces critères. Nous souhaitons souligner ici que le critère important est, une fois que nous commençons l'expérimentation sur des sujets macaques, de s'assurer que des résultats scientifiques solides et fiables découlent du projet.

Raffinement

Nos approches expérimentales font l'objet de raffinements constants. Nous appliquons depuis plusieurs années des protocoles de surveillance accrue de nos animaux, à la fois dans les protocoles et autour des procédures chirurgicales ; nous fournissons des soins péri-opératoires au niveau qui serait attendu en chirurgie humaine dans la mesure du possible ; nous suivons la douleur post-opératoire avec notation et points limites; et tous nos animaux sont entrainés avec un renforcement positif pour chaque élément du protocole. Chaque élément du protocole est suivi avec des points limites gradés adaptés à chaque animal et le protocole et les interventions sont effectués en fonction des discussions régulières avec les vétérinaires et le personnel chargé des soins aux animaux. Notamment, le contrôle hydrique est opéré ici avec un suivi renforcé et un ensemble gradué de points d'intervention et de points d'arrêt, comme décrit par les recommandations nationales du CNREEA. Les techniques et les matériaux d'implantation font l'objet de raffinements réguliers, tout comme le soin des implants et leur suivi à long terme. Les interventions pharmacogénétiques permettent une intervention neuronale directe plus ciblée que les approches précédentes et ne nécessite pas d'injection intra-cérébrale à chaque séance. À terme la validation des injections pharmacogénétiques par TEP et IRM devrait permettre de valider les expériences sans sacrifier les animaux pour une validation histologique. Le travail réalisé ici contribuera à cet objectif, mais une validation post mortem reste nécessaire pour le moment. Le travail des singes testés en "libre accès" représente un raffinement significatif pour l'acquisition de données neurophysiologiques et pour les conditions de travail pour l’animal. Plus précisément, il s'agit d’un raffinement majeur de l'hébergement conformément au protocole, car les animaux sont beaucoup moins fréquemment contraints ou retirés de leur hébergement pour les besoins de l'expérience. Le projet entre autres fournira une base de données pour indiquer dans quels cas ce raffinement spécifique est approprié dans l’avenir.

Choix des espèces

Les expériences chez les primates non-humains sont directement pertinentes pour la compréhension de la cognition humaine, en raison des capacités cognitives du macaque, et des similarités de cerveau. Nos questions scientifiques nécessitent des études chez le singe en raison des proximités anatomiques et biochimiques entre les espèces primates, et de la capacité unique des primates à réaliser des tâches cognitives complexes qui permettent de manipuler, comme chez l'Homme, les capacités comportementales complexes. Nos études sont centrées sur le cortex préfrontal, un cortex granulaire qui parmi les espèces modèles n’a été identifié que chez les primates. L'utilisation du modèle primate permet un transfert direct vers la compréhension du cerveau chez l'Homme. Ceci est renforcé par les connaissances que nous avons acquises, et par nos études comparatives Humain-Macaque. Les animaux sont adultes – les procédures d'implantation sont réalisées à 5-6 ans lorsque le développement crânien se stabilise pour éviter de fortes modifications morphologiques après implantation et des problèmes de localisation stéréotaxique.

1 060 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines portent une maladie du saignement, avec hémorragies et malformations des vaisseaux, et subissent une coupure de la queue pour mesurer le temps de saignement, une ponction cardiaque ou la pose puis le retrait chirurgical d'implants aux flancs, pour tester des peptides contre une maladie génétique rare. Le porteur indique que des tests sur plaquettes humaines et une optimisation par ordinateur ont précédé ces expériences. Il présente la mise au point d'un traitement local comme "essentielle", les patients n'ayant aujourd'hui aucune solution sans risque.

Objectifs

Ce projet porte sur l’étude de peptides (séquence d’acides aminés), dérivés d’une protéine des vaisseaux sanguins. L’absence de cette protéine entraîne chez l’homme une maladie génétique rare, responsable de malformations des vaisseaux sanguins et de saignements de nez spontanés et récurrents. Au cours des 15 dernières années, plusieurs traitements ont été proposés mais aucun n’a été totalement efficace, entraînant soit des risques de formation de caillots dans le sang, soit une résistance ou une rechute de la maladie. Développer une nouvelle solution thérapeutique visant l’hémostase (le mécanisme permettant d’arrêter un saignement), et notamment les plaquettes serait essentiel pour traiter la maladie. Dans ce contexte, nous avons récemment démontré qu’un peptide dérivé de cette protéine est capable d’agir sur les plaquettes sanguines et de les agréger, permettant l’arrêt du saignement. Lors d’une étude préliminaire, nous avons montré que ce peptide est également efficace sur un modèle de souris mimant cette maladie, faisant de ce peptide une potentielle cible thérapeutique. Nous cherchons à optimiser ce peptide et avons identifié trois variants de sa séquence semblant améliorer son efficacité. Le but de ce projet est donc de tester sur différents modèles de souris l’efficacité des variants sur le temps de saignement, l’effet sur l’agrégation plaquettaire et l’effet sur la formation des vaisseaux sanguins.

Bénéfices attendus

Cette étude pourrait permettre de proposer une nouvelle solution thérapeutique au traitement d’une maladie génétique rare. En effet, à terme, le but est de développer un traitement local, qui non seulement arrêterait le saignement mais apporterait également un effet préventif. Les patients n’ayant à l’heure actuelle pas de traitement sans risque de complication, de résistance ou de rechute, le développement de nouvelles thérapeutiques améliorerait leur prise en charge.

Procédures

Une injection sous-cutanée d’analgésique (15 secondes /souris), une injection intra-péritonéale d’anesthésique (15 secondes /souris) puis une coupure de l’extrémité de la queue, sous anesthésie (10 min). Après un mois de repos, de nouveau une injection sous-cutanée d’analgésique (15 secondes /souris), une injection intra-péritonéale d’anesthésique (15 secondes /souris) puis un prélèvement sanguin au niveau du cœur, sous anesthésie générale (30 secondes /souris). Ou : Une injection sous-cutanée d’analgésique (15 secondes /souris) puis, sous anesthésie gazeuse, une injection d’implant gélifié au niveau des flancs (2 fois 15 secondes /souris). Une à deux semaines plus tard, une injection sous-cutanée d’analgésique (15 secondes /souris), puis sous anesthésie gazeuse, une incision de la peau au niveau des flancs pour récupération des implants (2 fois 1min/souris).

Impact sur les animaux

Les souris modèles de pathologies du saignement peuvent présenter des nuisances dues à leur phénotype : hémorragies en cas de blessures, saignements de nez, malformation des vaisseaux sanguins. Les manipulations peuvent entraîner un stress à l’animal après réveil, avec un risque de reprise de saignement dans les jours suivants. Elles peuvent également entraîner un stress et une légère douleur au moment de l’anesthésie et de la prémédication (contention, piqure). Les implants gélifiés peuvent entraîner une légère gêne.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort sous anesthésie générale afin d’effectuer des prélèvements et réaliser des études ex vivo.

Remplacement

Des études fonctionnelles in vitro ont été réalisées avec des plaquettes humaines de volontaires sains afin de démontrer l’efficacité du peptide sur la coagulation du sang. L’optimisation de la structure des variants a été réalisée par ordinateur, 3 variants sur les nombreux identifiés ont été sélectionnés pour être testés dans nos différents modèles murins. Ces expériences chez l’animal interviennent donc au terme d’un long processus et s’inscrivent dans le cadre d’une validation in vivo de l’effet de notre peptide dans l’optique du développement d’une nouvelle thérapie.

Réduction

Les modèles de souris que nous allons utiliser existent déjà, ces souris nous sont rendues disponibles via des collaborations du responsable du projet. Seul le nombre de souris nécessaire aux procédures nous seront envoyées, permettant d’éviter la création d’un nouveau noyau d’élevage. Les mêmes souris seront utilisées pour le test de temps de saignement et les tests ex vivo d’étude des fonctions plaquettaires, réduisant ainsi le nombre de souris totales utilisées dans l’étude.

Raffinement

Les souris seront hébergées par cage de 2 à 5 afin d’éviter l’isolement et la surpopulation, en présence d’enrichissement (matériel de nidification, igloos). Elles recevront une alimentation standard et de l’eau à volonté. Les souris issues de modèles de pathologie de saignement feront l’objet d’une surveillance accrue afin de prévenir tout signe de souffrance. Des points limites ont été établis afin d’anticiper la mise à mort de l’animal si nécessaire. Les procédures seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie, qui sera contrôlée régulièrement au cours de la procédure. D’autre part, des souris immunodéficientes seront utilisées pour l’injection d’implant gélifié, afin d’éviter le phénomène de rejet.

Choix des espèces

La souris est le seul modèle permettant de réaliser à la fois des tests d’hémostase in vivo et d’obtenir suffisamment de sang nécessaire aux études ex vivo. Par ailleurs, le modèle souris nous permet d’utiliser des modèles transgéniques mimant les pathologies de saignement faisant l’objet de notre étude. Le stade de développement des souris, de 8 à 12 semaines, a été choisi par analogie avec la littérature pour l’étude des pathologies de saignement.

21 macaques rhésus vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, ce volet couvrant l'imagerie cérébrale d'un projet mené sur deux établissements. Ils subissent une ou deux neurochirurgies pour implanter des électrodes et injecter des virus, des séances d'imagerie sous anesthésie et un contrôle de leur accès à l'eau qui peut provoquer la soif, pour étudier le cortex préfrontal. Le porteur décrit un entraînement par renforcement positif et un suivi de la douleur, tout en prévoyant la mise à mort de chaque singe pour analyser son cerveau. Il affirme que le primate est le "seul choix possible" et que les modèles informatiques restent "rudimentaires".

Objectifs

Le cortex préfrontal est une région cérébrale très développée chez les primates. Il gère des fonctions qui permettent la flexibilité comportementale. La perte de ces fonctions caractérise plusieurs maladies psychiatriques. Les mécanismes du cortex préfrontal dans ces fonctions et de ces maladies sont peu connus – il semble notamment important de comprendre comment le cortex préfrontal fonctionne en interaction avec d’autres régions du cerveau. Nous étudierons ces interactions dans ce projet qui se déroule dans deux établissements utilisateurs – EU1/2 pour la majorité du protocole, et EU2/2 pour l'imagerie cérébrale. Tout d'abord, nous étudierons le dynamique de ces interactions par enregistrement électrophysiologique des neurones du cortex pendant des comportements adaptatifs. Puis nous caractériserons l’impact de perturbations des interactions du cortex préfrontal sur l’activité neuronal et sur les comportements adaptatifs. Nous utiliserons la technique émergente de pharmacogénétique qui permet de modifier l’activité des neurones impliqués dans les interactions, tandis que nous enregistrons cette même activité pour comprendre ce qui change dans le cerveau. Ces techniques invasives nécessitent des sujets animaux, ici des macaques - contrairement à d’autres espèces modèles les macaques partagent plusieurs des zones préfrontales ciblées avec l’espèce humaine. Les connaissances fondamentales acquises par ce projet contribueront à notre compréhension du fonctionnement cérébral et, à long terme, à élucider les mécanismes pathologiques des dysfonctions exécutives.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu sera donc la connaissance scientifique qui résultera de ces études, comme le projet nous permettra de mieux décrire les mécanismes physiologiques du cortex préfrontal et les mécanismes dans le cerveau des comportements adaptifs. En plus le projet nous permettra de comprendre comment le perturbation des interactions du cortex préfrontal modifient son fonctionnement. Plus largement la compréhension de ces perturbations nous approche à des mécanismes spécifiques des maladies qui en sont liées. Le projet avancera notre compréhension des approches pharmacogénétiques chez les primates, étape essentielle au développement du pharmacogénétique comme traitement médicale chez l’humain.

Procédures

Tous les animaux recevront un entrainement cognitif avec renforcement positif, dans leur hébergement et dans une salle de test. Les sessions sont de 1–5 heures, 5 jours par semaine, pour la durée du protocole. Après chirurgie, les singes fourniront des enregistrements intracérébraux pendant ses sessions d’entrainement cognitif. Les singes passeront également l’imagerie cérébrale - des IRM, des TEP et des CT sous anesthésie. Chaque séance dur 1-3 heures. Tous les singes passeront une ou deux neurochirurgies - pour l'implantation de dispositifs d'enregistrement neurophysiologique et pour l'injection de vecteurs viraux pour la pharmacogénétique. Les singes recevront des injections intramusculaires d'un ligand pour la pharmacogénétique ou d'une substance de contrôle. Jusqu’à 50 injections par animal, pendant le session de travail. À la fin du protocole, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera extrait pour analyse histologique.

Impact sur les animaux

Au cours du projet, les animaux auront plusieurs anesthésies générales, dont au moins une pour une neurochirurgie. Les anesthésies sont réalisées pour les différentes formes d'imagerie cérébrale nécessaires au projet, et pour la chirurgie destinée à l'implantation d'électrodes, de chambres d'enregistrement, et/ou à l'injection de vecteurs viraux. La chirurgie pourra susciter un inconfort post-opératoire temporaire, normalement maitrisé par l'administration d'analgésique et un suivi rapproché par les expérimentateurs et les zootechniciens. L'anesthésie générale provoquera également en elle-même un inconfort au réveil. Les animaux du groupe 5 travailleront dans un environnement d'entraînement en accès libre. Ils seront brièvement maintenus en contention légère, de manière à équiper les implants de carte mémoire et à effectuer les inspections et les soins pour les implants. Les animaux des groupes 1-4 et 6 travailleront dans le cadre traditionnel d'un box expérimental. Ils seront assis dans une chaise à primate, la tête fixée par le plot implanté. Les animaux seront formés à cette procédure par renforcement positif, la procédure étant bien établie et bien tolérée, mais les animaux éprouveront un léger inconfort lors de l’apprentissage de la procédure. Les animaux seront formés dans le cadre d'un protocole de contrôle hydrique. Ce protocole est progressivement mis en œuvre et, dans la grande majorité des cas, les animaux reçoivent leur dose normale de liquide. Cependant il est possible pendant l'adaptation au processus, une certaine sensation de soif puisse se manifester entre les sessions.

Devenir

À la fin du protocole les animaux, ayant reçu des injections pour le pharmacogénétique, seront euthanasiés et leur cerveau sera extrait pour analyse histologique, afin d'analyser et de confirmer l'expression des récepteurs pharmacogénétique dans leur cerveau. La validation de l'expression de ces récepteurs dans le tissu post mortem est une étape critique dans la justification des résultats de l'expérience. Le travail histologique, et donc l'euthanasie des animaux, fait donc partie intégrante de l'expérience.

Remplacement

La nécessité scientifique de ce programme de recherche est décrite dans les objectifs de ce projet et est soutenue par les financements accordé. Le projet est spécifiquement axé sur la dynamique neuronale du cortex préfrontal et ses interactions. Cette spécificité rend les alternatives non animales impossibles à mettre en œuvre pour atteindre les objectifs du projet. Les modèles in silico du cortex préfrontal restent rudimentaires pour les questions de dynamique neuronale - en effet, un résultat de ce projet pourrait être l'amélioration de ces modèles. En outre, le projet se concentre sur les interactions du cortex préfrontal avec d'autres régions du cerveau. Non seulement les modèles in silico du cortex préfrontal sont rudimentaires pour l'étude de la dynamique neuronale, mais ils sont rarement connectés à des versions modélisées d'autres régions du cerveau, et jamais avec toute la complexité des connexions dans le cerveau parce que nous ne connaissons ni ne comprenons la forme et la nature de ces connexions. Les assemblages de cellules in vitro peuvent être utilisés pour étudier la dynamique neuronale de base, mais jamais avec les interactions cortico-corticales, cortico-sous-corticales et neuromodulatrices que nous examinerons ici - les préparations in vitro manquent de ces éléments, et l'objectif de ce projet est de rendre compte de l'ensemble des systèmes du cortex préfrontal, ce qui n'est pas possible in vitro. L'étude ex-vivo est impossible pour ce projet car la dynamique neuronale n'est produite que par un cerveau vivant. Pour atteindre les objectifs scientifiques décrits, les primates non humains sont le seul choix possible de modèle animal, sur la base de critères anatomiques et cognitifs. Seules les espèces de primates possèdent la région du cortex préfrontal latéral granulaire qui est la cible de notre étude. Parmi les animaux de laboratoire acceptés, seules certaines espèces de primates sont capables d'accomplir les tâches cognitives que nous étudions ici. En conséquence de ce qui précède, il n'y a aucune forme de progrès scientifique ou technique dans un avenir prévisible qui permette d'obtenir les informations que nous recherchons ici à partir d'expériences n'impliquant pas d'animaux, et donc nous ne pouvons pas aborder la question du remplacement de ces expériences.

Réduction

La taille estimée de la cohorte pour cette étude a été définie en prenant en compte l'impératif éthique d'utiliser le moins d'animaux possible et l’impératif scientifique et éthique d’utiliser le nombre suffisant pour obtenir des données scientifiques robustes, des résultats significatifs et généralisables. Le nombre d’animaux est réduit à la valeur minimale permettant d’atteindre une significativité et une reproductibilité des observations. En général, l'approche consiste à concevoir toutes les expériences pour les contrastes et les tests statistiques intra-individuel, puis à tester un deuxième animal pour confirmer les résultats du premier. Cela signifie qu’un singe sert comme son propre contrôle et que le "n" de l'expérience est constitué de sessions ou de neurones. C'est le minimum absolu pour une expérience scientifique correctement réalisée, et notre travail pour réaliser ces expériences de cette manière représente un effort maximal de réduction. Pour toutes les procédures, l’utilisation des interventions pharmacogénétique DREADD pour modifier l’activité des neurones relèvent du raffinement ce qui porte la réduction à son maximum. C’est une intervention réversible qui ne nécessitent pas de lésion et n’impliquent pas de perturbation à long terme. La procédure étant réversible, l'animal peut également agir comme son propre contrôle. Dans chaque groupe principal, deux animaux seront utilisés si les deux fournissent la puissance statistique requise pour l'étude. Un troisième animal a été noté, mais il ne sera inclus que si l'un des deux premiers n'est pas en mesure de fournir des données répondant à ces critères. Nous souhaitons souligner ici que le critère important est, une fois que nous commençons l'expérimentation sur des sujets macaques, de s'assurer que des résultats scientifiques solides et fiables découlent du projet.

Raffinement

Nos approches expérimentales font l'objet de raffinements constants. Nous appliquons depuis plusieurs années des protocoles de surveillance accrue de nos animaux, à la fois dans les protocoles et autour des procédures chirurgicales ; nous fournissons des soins péri-opératoires au niveau qui serait attendu en chirurgie humaine dans la mesure du possible ; nous suivons la douleur post-opératoire avec notation et points limites; et tous nos animaux sont entrainés avec un renforcement positif pour chaque élément du protocole. Chaque élément du protocole est suivi avec des points limites gradés adaptés à chaque animal et le protocole et les interventions sont effectués en fonction des discussions régulières avec les vétérinaires et le personnel chargé des soins aux animaux. Notamment, le contrôle hydrique est opéré ici avec un suivi renforcé et un ensemble gradué de points d'intervention et de points d'arrêt, comme décrit par les recommandations nationales du CNREEA. Les techniques et les matériaux d'implantation font l'objet de raffinements réguliers, tout comme le soin des implants et leur suivi à long terme. Les interventions pharmacogénétiques permettent une intervention neuronale directe plus ciblée que les approches précédentes et ne nécessite pas d'injection intra-cérébrale à chaque séance. À terme la validation des injections pharmacogénétiques par TEP et IRM devrait permettre de valider les expériences sans sacrifier les animaux pour une validation histologique. Le travail réalisé ici contribuera à cet objectif, mais une validation post mortem reste nécessaire pour le moment. Le travail des singes testés en "libre accès" représente un raffinement significatif pour l'acquisition de données neurophysiologiques et pour les conditions de travail pour l’animal. Plus précisément, il s'agit d’un raffinement majeur de l'hébergement conformément au protocole, car les animaux sont beaucoup moins fréquemment contraints ou retirés de leur hébergement pour les besoins de l'expérience. Le projet entre autres fournira une base de données pour indiquer dans quels cas ce raffinement spécifique est approprié dans l’avenir.

Choix des espèces

Les expériences chez les primates non-humains sont directement pertinentes pour la compréhension de la cognition humaine, en raison des capacités cognitives du macaque, et des similarités de cerveau. Nos questions scientifiques nécessitent des études chez le singe en raison des proximités anatomiques et biochimiques entre les espèces primates, et de la capacité unique des primates à réaliser des tâches cognitives complexes qui permettent de manipuler, comme chez l'Homme, les capacités comportementales complexes. Nos études sont centrées sur le cortex préfrontal, un cortex granulaire qui parmi les espèces modèles n’a été identifié que chez les primates. L'utilisation du modèle primate permet un transfert direct vers la compréhension du cerveau chez l'Homme. Ceci est renforcé par les connaissances que nous avons acquises, et par nos études comparatives Humain-Macaque. Les animaux sont adultes – les procédures d'implantation sont réalisées à 5-6 ans lorsque le développement crânien se stabilise pour éviter de fortes modifications morphologiques après implantation et des problèmes de localisation stéréotaxique.