Recherche fondamentale

324 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie pour poser un cathéter dans une veine, parfois des fibres optiques dans le cerveau, et une restriction d'eau destinée à renforcer leur motivation, pour s'auto-administrer de la cocaïne et étudier le choix sous influence de la drogue. Le porteur écarte l'humain en invoquant l'"éthique spéciste actuelle" qui interdit ces approches invasives, et retient le rat comme un "compromis phylogénétique" jugé éthiquement moins sensible que le primate. Il annonce des retombées surtout théoriques, une redéfinition de l'addiction et des modèles pour la recherche future.

Objectifs

L’objectif majeur de notre projet de recherche est premièrement de mieux caractériser le comportement de choix sous influence (durée, persistance à long terme du phénomène, modulation de ce phénomène par certains paramètres altérant normalement le choix tels que le coût, le prix de la récompense ou la punition…). Ensuite, notre projet aura pour but d’étudier le rôle causal des interneurones du cortex orbitofrontal dans la consommation compulsive de cocaïne chez les individus sous influence de drogue. Notre hypothèse générale est que la perte de contrôle chez les individus ayant développé une addiction ne serait pas un trait constitutif ou inconditionnel des sujets mais plutôt une caractéristique comportementale dépendante de la drogue. Si tel est le cas, la perte de contrôle devrait exister mais principalement lorsque ces individus sont intoxiqués par la drogue et donc sous son influence. Ce projet est par essence mécanistique et nécessite une approche invasive qui n’est pas envisageable chez le sujet humain. Sa bonne réalisation repose donc sur le développement et l’utilisation d’un modèle animal - le rat de laboratoire – qui permet de reproduire de façon valide la distinction établie chez l’homme entre individus vulnérables et individus non-vulnérables face à l’addiction. Il s’agira de placer une population de rats face à un choix entre prendre de la cocaïne ou s’engager dans une activité alternative (boire une boisson édulcorée avec de la saccharine) et, ensuite, de tester l’influence d’une administration passive de cocaïne sur le choix des individus.

Bénéfices attendus

Ces recherches devraient permettre de résoudre un long débat théorique sur la nature de l’addiction en redéfinissant la perte de contrôle en tant qu’état induit par l’influence de la drogue et non en tant que trait constitutif. Sur le plan pratique, ce changement conceptuel devrait contribuer à réorienter les efforts de recherche vers des interventions permettant d’isoler et de protéger la prise de décision de cette influence de la drogue. Notre paradigme de recherche servira également de base aux recherches futures sur la neurobiologie et la neuropharmacologie de la prise compulsive de cocaïne. Enfin, les données générées par ce programme de recherche pourraient être utilisées pour affiner ou redéfinir les modèles théoriques ou computationnels actuels de l’addiction à la cocaïne.

Procédures

Tous les rats seront soumis à une chirurgie intraveineuse de courte durée (30 min en moyenne) pour la pose d'un cathéter intraveineux à demeure. Certains animaux seront aussi soumis à une chrirugie intracérébrale (60 min en moyenne) pour la pose de fibres optiques. Ces chirurgies sont effectuées sur couverture chauffante en conditions aseptiques alors que les animaux sont sous anesthésie chimique ou gaseuze et sous analgésie. Certains rats seront soumis à une restriction hydrique avec un accès à l'eau de 5h30 par jour. Cette restriction hydrique aura pour effet d’augmenter le besoin physiologique et donc la motivation pour la récompense hydrique pendant le choix tout en couvrant le besoin quotidien en eau pour s’hydrater normalement. La restriction hydrique sera introduite graduellement.

Impact sur les animaux

Les animaux seront testés dans des procédures dont le degré de gravité principal est léger et qui ne dépassera pas le degré modéré. Bien que toutes les précautions soient prises afin de prévenir ou de minimiser les nuisances au maximum (anesthésie, analgésie anti-inflammatoire, conditions aseptiques, suivi post-opératoire…), il est possible que certaines nuisances ou effets indésirables puissent survenir suite à la chirurgie ou pendant l’auto-administration de cocaïne. Les nuisances attendues après la chirurgie comprennent : un possible risque d'inflammation ou d'infection ; une apparition de plaies dues à un toilettage excessif de la zone opérée ; une perte des points de suture cicatrisation complète. Nous n’anticipons pas de nuisances particulières pendant l’auto-administration de cocaïne, hormis un possible risque d’infection lié à l’utilisation chronique de la voie d’administration intraveineuse.

Devenir

Les animaux seront mis à mort parce qu'ils auront complété les expériences programmées et pour prélever leurs cerveaux afin de procéder à des vérifications histologiques post-mortem.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du rat de laboratoire (Rattus Norvegicus, jeunes adultes, mâles), vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’animal peut se justifier pour plusieurs raisons éthiques : 1) l’éthique « spéciste » actuelle interdit l’utilisation d’approches neurobiologiques invasives chez l’homme, rendant ainsi inaccessible l’étude directe des processus de causalité neurobiologique dans notre espèce (sauf, bien sûr, lorsque ceux-ci sont non-invasifs) ; 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux ; 3) l’addiction, contrairement à la dépendance physique, est un trouble du comportement et, en tant que telle, ne peut pas être récapitulée sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire.

Réduction

Notre projet nécessite au total l'utilisation de 324 rats mâles sur une période de 5 ans. Le nombre d'animaux nécessaire au projet est réduit au minimum. Ce nombre représente un compromis rationnel, compte tenu de l’exigence éthique de réduction du nombre d’animaux et des contraintes expérimentales propres au projet scientifique proposé.

Raffinement

Les animaux seront logés par groupe de 2 dans des cages munies d’un environnement enrichi afin de limiter le stress et l’ennui. Toutes les chirurgies (30 min en moyenne par animal) seront réalisées sous analgésie (anti-inflammatoire non-stéroïdien), sous anesthésie chimique (mélange de kétamine et de xylazine) et en conditions aseptiques sur couverture chauffante. En fin de chirurgie, l’animal recevra une injection sous-cutanée de sérum physiologique (NaCl) pour favoriser la réhydratation. L’animal sera ensuite placé dans une cage de réveil sur une couverture chauffante jusqu’au réveil avec libre accès à l'eau et à la nourriture. Après le réveil complet, l'animal sera relogé dans sa cage de stabulation avec son congénère. Les animaux seront sous surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter d’éventuels signes d'inconfort, de stress ou de douleur et y remédier rapidement (voir la grille des différents signes en annexe). Nos méthodes d’interventions pour réduire ou supprimer l’inconfort ou la douleur seront gradées. Quand nous constaterons les premiers signes d'inconfort chez un animal, nous mettrons en place des mesures de nursing avec un accès facilité à l’aliment (nourriture posée sur le sol de la cage). Si cela ne suffit pas, l’animal recevra plusieurs doses d’analgésique (anti-inflammatoire non-stéroïdien). L'animal sera aussi réhydraté par injection sous-cutanée de sérum physiologique (NaCl). Enfin, si cela ne suffit pas au bon rétablissement de l'animal, celui-ci sera mis à mort sans souffrance.

Choix des espèces

Le choix du rat de laboratoire constitue une sorte de compromis phylogénétique. Cette espèce est suffisamment proche de l’homme d’un point de vue phylogénétique (même classe [Mammalia], divergence de leur ancêtre commun il y a environ 100 millions d'années) pour servir de modèle animal valide des phénomènes d’addiction par rapport à d’autres espèces moins sensibles éthiquement (e.g., invertébrés) et en même temps suffisamment éloignée par rapport à d’autres espèces plus sensibles (e.g., primates non-humains). Les espèces invertébrées (e.g., C. Elegans, D. Melanogaster, A. Californica) peuvent être utilisées pour élucider les mécanismes neuronaux ou génétiques de certains effets comportementaux de la cocaïne mais l’organisation nerveuse et comportementale de ces espèces est beaucoup trop éloignée de celle de l’homme pour constituer des modèles animaux valides dans le domaine des addictions. Les animaux utilisés sont tous de jeunes adultes en fin d’adolescence en début d’expérience (i.e., âge moyen 2 mois et demi). Cette période du développement correspond à la période de plus grande vulnérabilité face à l’addiction.

7 520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un régime gras pendant douze semaines, des injections, des périodes de jeûne, une chirurgie abdominale et une perfusion dans le cœur, pour étudier des cellules immunitaires des îlots du pancréas. Le porteur indique que 3 630 souris sont tuées d'emblée parce que leur génotype est inutilisable, avant toute procédure. Il affirme que les modèles animaux sont "nécessaires" et rattache l'étude au diabète, sans bénéfice thérapeutique précis annoncé.

Objectifs

Dans le pancreas, les ilots de Langherans sont centraux dans la régulation de la glycémie. Ces micro-organes ont pour fonction de produire les hormones permettant de réguler la glycémie. Les macrophages jouent une rôle important dans la fonction des ilots. Comme tous les tissus, les ilots sont reliés au cerveau par le système nerveux périphériques. Cependant, leur rôle dans la fonction des ilots pancréatiques n’est pas bien connu. En particulier, l’interaction entre les macrophages et le réseau nerveux n’a jamais été étudié. Dans ce projet nous proposons d’étudier les mécanismes d’interaction entre les macrophages et le réseau nerveux des ilots pancréatiques ainsi que le rôle de ces interactions dans la fonction des ilots en condition normal, ainsi que dans trois contextes de stress glycémique: le jeun, l’altération des ilots et le diabète, une maladie caractérisée par une dérégulation de la glycémie. Ce projet se déroulera dans deux établissement utilisateurs.

Bénéfices attendus

Il est aujourd'hui admis que les macrophages jouent un rôle primordial dans la régulation de la glycémie par le gras et le foie. Les macrophages résidant dans les ilots pancréatiques n'ont eux été décrits que tardivement et les contraintes liées à leurs techniques d'analyse font qu'ils restent encore largement ignorés. L'interaction entre les macrophages et le système nerveux a été montré comme primordiale dans la fonction de multiples organes. Cependant de part la difficulté d'étudier les macrophages des ilots pancréatiques, cette interaction n'est pas encore décrit dans les ilots. Ce projet permettra de mieux comprendre les interaction macrophage/réseau nerveux dans la fonction ilots pancréatiques et leurs implication dans le stress glycémique.

Procédures

Etablissement utilisateur 1: 1 biopsie de queue, 1 prélèvement de sang à la joue (10s), 1 régime riche en gras (12 semaines), 9 injection intra-péritonéale (20s), 1 injection sous-cutanée, 1 jeun (6h ou 16h) , 1 injection intra-veineuse, 12 prélèvement de sang à la queue (3s), 1 anesthésies gazeuses (10min), 1 perfusion intra-cardiaque. Etablissement utilisateur 2: 1 anesthésie gazeuse (2h), 1 chirurgie abdominale (2h).

Impact sur les animaux

-Injections intrapéritonéale (ip) : douleur légère due à la piqure. -Injection iv rétro-orbitale (iv) : gêne, douleur légère au point de prélèvement. Les animaux sont sous anesthésie gazeuse au moment du prélèvement. -Injection sous-cutanée (sc) : douleur légère due à la piqure. -Diabète : prise de poids progressive. Les souris peuvent devenir moins actives. Le souris urinent plus souvent. -Chirurgie abdominale : Douleur modérée. Les souris recevront un analgésique opioïde 15min avant la procédure. - Perfusion intra-cardiaque : Douleur modérée. Les souris recevront un analgésique opioïde 15min avant la procédure. - Mise à jeun : gêne due à la sensation de faim. - Micro-coupure à la queue : douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure. -Prélèvement de sang à la joue : douleur légère. -Biopsie de queue : douleur modérée.

Devenir

Procédure 1 : 3630 souris seront mises à mort car leur génotype ne sera pas utilisable. 2280 souris auront le génpotype requis et seront utlisées dans les procédures 2 à 5. Procédure 2 à 5 : Toutes les souris seront mises à mort pour permettre le prélèvement des organes d'intérêts.

Remplacement

Cette étude a pour but d'étudier l'interaction des macrophages avec le système nerveux des ilots pancréatiques en condition normale et de stress glycémique, tels que le diabète. Les ilots pancréatiques répondent à la prise de poids et au dialogue entre différents organes. Cela implique donc d’étudier différents paramètres dans différents organes. Ainsi les modèles animaux sont nécessaires pour mener à bien ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé pour permettre l’analyse des résultats selon des tests statistiques adaptés. Des tests in vitro ainsi que des études pilotes avec des petits nombres d’animaux ont été inclues pour mettre en place des protocole adaptés et réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Dans les cages les souris bénéficient de coton et de « maisons » afin d’augmenter la diversité de leurs activités et qu’elles puissent se construire un nid. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum). Lorsque nécessaire, la douleur et la gêne des souris sont réduites à un niveau modéré par l’administration d’opioïdes et par l’anesthésie. Les souris sont surveillées régulièrement et lors des procédures, les paramètres de santé qui peuvent être affectés sont évalués et notés régulièrement

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de référence dans l'étude de l'obésité. De nombreux outils sont disponibles chez la souris. Les souris sont utilisées entre l’âge de 10 jours et 22 semaines.

1 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ou deux chirurgies du cerveau pour implanter des électrodes et injecter des virus, puis des enregistrements de leurs neurones pendant l'éveil et le sommeil, pour étudier un récepteur au glutamate. Le porteur indique que les souris implantées sont maintenues isolées, une autre souris pouvant endommager les électrodes, et signale une douleur post-opératoire de 48 heures et des risques liés à l'anesthésie. Il renvoie au long terme les retombées, des traitements des troubles anxieux liés au sommeil, et affirme qu'aucune alternative au rongeur ne préserve un réseau neuronal intact.

Objectifs

La présente demande concerne un projet préalablement autorisé pour lequel nous devons effectuer une étape nécessitant une expertise spécifique non disponible en interne. Aucun animal supplémentaire n'est ajouté à ce projet par rapport au projet principal déjà autorisé. Le projet a pour but d’étudier des récepteurs activés par le glutamate et fortement présents dans le système nerveux central des vertébrés. Ces récepteurs jouent un rôle central dans la communication et le fonctionnement de nos neurones, ainsi que dans les mécanismes associés à l’apprentissage et la mémoire. Ces récepteurs étant également impliqués dans de nombreuses pathologies neurologiques et psychiatriques (épilepsie, neurodégénérescence, troubles cognitifs), ils constituent des cibles thérapeutiques à fort potentiel. L’objectif de ce projet est d’évaluer et comprendre le rôle et l’importance de la régulation d’un des récepteurs au glutamate dans le fonctionnement des circuits neuronaux, à la fois dans un cadre physiologique et pathologique. Nous voulons comprendre si et comment ces récepteurs participent à l’activation et au dialogue de différentes structures du cerveau durant la veille et le sommeil. Pour cela, nous réaliserons des enregistrements de l’activités des neurones chez des souris libres de leurs mouvements et endormies.

Bénéfices attendus

Les troubles anxieux sont des troubles psychiatriques très répandus et constituent une préoccupation croissante pour la santé publique mondiale. Ils sont aussi systématiquement associés à des troubles du sommeil, considérés soit comme une cause, soit comme une conséquence des symptômes. Ce projet de recherche fondamentale utilisera des modèles animaux pour développer nos connaissances sur les mécanismes neurophysiologiques précis potentiellement affectés chez les patients humains. A long terme, il permettra ainsi de développer et de mettre en œuvre des stratégies thérapeutiques précises de prévention et de guérison axées sur le sommeil dans les troubles anxieux.

Procédures

Selon la procédure considérée, les animaux seront soumis à un ou deux types de chirurgie au niveau du cerveau (implantation d’électrodes (2-6h) et/ou injection de virus (1h30)) avec ou sans enregistrement de l’activité des neurones pendant l’éveil et le sommeil sur animal vigile (2 à 8 h, 1x/jr). Ainsi, 3 options peuvent se présenter : 1) implantation d’électrodes + enregistrement de l’activité des neurones ; 2) injection de virus ; 3) injection de virus + implantation d’électrodes + enregistrement de l’activité des neurones. A la fin de chaque procédure, il sera réalisé sur chaque individu une euthanasie selon une méthode réglementaire qui permet les prélèvements et analyses ultérieurs (10min). L’ensemble des actes est réalisés sous anesthésie et analgésie.

Impact sur les animaux

Nous détaillons ci-dessous l’ensemble des dommages prévus dans ce projet. Nuisances induites par les actes effectués : Chirurgie du cerveau : implantation d’électrodes et injection de virus (légère perte de poids, problème de cicatrisation et douleur post-chirurgicale pendant 48h) ; risques anesthésiques (hypothermie, détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, etc) ; isolement (stress modéré) ; 2 transports entre les établissements utilisateurs (source de stress)

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de réaliser des analyses histologiques (prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem). Elle sera pratiquée au sein de l'établissement d'origine des animaux. Il s'agit d'un projet déjà autorisé, réalisé sur deux établissements et n'ajoutant aucun animal supplémentaire.

Remplacement

Un impératif concernant les études sur récepteurs natifs est de conserver l’intégrité d’un réseau neuronal afin de préserver les connections synaptiques. A ces fins, il n’existe, à ce jour, aucune méthode alternative à l’utilisation de modèle rongeurs. Les techniques d'enregistrement chroniques sont invasives et ne peuvent être effectuées chez l'homme chez le sujet sain. Elles sont utilisées chez des patients épileptiques dont l'activité cérébrale est par conséquent anormale. Ceci ne permet pas d'effectuer des études systématiques car le placement des électrodes est dicté par l'impératif médical. D'autre part, l'état des connaissances actuelles et la puissance requise d'un point de vue technologique ne permettent pas de modéliser le fonctionnement de ces réseaux sur ordinateur.

Réduction

Les enregistrements électrophysiologiques de grande ampleur in vivo permettent d'enregistrer un grand nombre de neurones simultanément, ce qui augmente la puissance statistique des analyses et permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Pour les tests comportementaux, le nombre d'animaux proposé reste standard par rapport à la littérature existante. Le couplage entre électrophysiologie in vivo et comportement permet également de corréler les résultats comportementaux des individus avec leur activité neurale. Ceci permet de s'affranchir partiellement du problème de variabilité individuelle et de réduire le nombre d'animaux. Le calcul du nombre d’animaux a également été réalisé en fonction des travaux précédents. Au total, sur 5 ans, ce projet de recherche impliquera 1360 animaux : dont 1120 impliqués sur ce site.

Raffinement

Après leur réception, les animaux sont habitués à l’animalerie de l’Institut pendant une semaine avant de débuter toute procédure. Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les enregistrements en soi ne sont pas douloureux. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux sont stabulés dans les conditions d'hébergements standards (enrichissement de nidification) comme défini dans l'agrément de notre établissement. Les animaux implantés seront maintenus en isolation: la présence d'une autre souris pourrait ralentir la cicatrisation et endommager les électrodes implantées chroniquement (grattage, rognage) entraînant l’euthanasie de l’animal et ne permettant pas de récolter des données. Le maintien en isolation permet donc de maximiser la quantité de données récoltées sur chaque animal et ainsi de minimiser le nombre total d'animaux pour le projet. Les animaux non-implantés servent de groupe contrôle et doivent donc être logés dans les mêmes conditions que les animaux implantés. Cependant, pour diminuer le stress lié à l’isolement les animaux sont maintenus dans des cages contenant 2 compartiments séparés par une cloison transparente percée de trous permettant ainsi à l’animal d’avoir des interactions avec l’animal isolé dans le second compartiment (contiguïté visuelle, olfactive, auditive). Afin de garantir la taille minimale réglementaire au sein d'un compartiment une fois la cloison installée, les cages utilisées sont des cages prévues pour des rats. Pour éviter toutes blessures et d’endommager les électrodes, la nourriture sera directement dispersée dans la sciure. Cette démarche aura pour avantage d’enrichir l’environnement de l’animal puisqu’il sera obligé de fouiller la sciure pour trouver les croquettes et facilitera l’accès à la nourriture. Cet enrichissement sera également complété par le dépôt de morceaux de bois dans la cage de l’animal. Une construction de lego sera mise en-dessous du biberon d’eau pour réduire la hauteur et faciliter l’accès à l’eau. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur (utilisation de l’échelle de grimace), les animaux seront exclus du protocole.

Choix des espèces

Le choix de la souris est scientifique : il s’agit d’un mammifère de petite taille, au cycle de vie reproductif rapide et qui possède un système nerveux central ‘développé’. La souris est un modèle classique pour l'étude de la physiologie des réseaux neuronaux en lien avec le comportement. Seules des souris au stade adulte seront utilisées pour ce projet (à partir de 6 semaines), plus alertes et plus prompts à explorer leur environnement que les animaux âgés.

28 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On immobilise une patte avant de vingt d'entre eux dans un gilet pendant sept à quatorze jours, avec des tests de motricité et des échographies sous anesthésie, pour mesurer comment le muscle se raidit après une immobilisation de type post-AVC. Le porteur indique que le gilet entrave le toilettage et gêne l'accès à la nourriture, et qu'une perte de plus de 20 % du poids entraîne la mise à mort. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico n'existe et conclut que les rats sont "essentiels".

Objectifs

L’immobilisation du muscle squelettique en position courte à la suite d’un AVC est la facteur qui entraine le plus de dommages et provoque l’atrophie du tissu contractile, l’épaississement du tissu conjonctif et une altération du comportement mécanique passif avec une augmentation de la raideur du muscle squelettique. C’est dans ce contexte que ce projet vise à mesurer l’évolution des propriétés mécaniques et structurelles du muscle squelettique, au fil du temps, à la suite d'une immobilisation chez le rat.

Bénéfices attendus

In fine, ce projet permettra d’apporter des informations sur l’évolution des propriétés du muscle squelettique après une immobilisation post-AVC aux personnels soignants et ainsi de donner une possibilité d’amélioration de la prise en charge des patients.

Procédures

La première étape du protocole consiste à mesurer le niveau d’asymétrie des deux pattes avant à travers un test de motricité indolore. La seconde étape consiste à mesurer la rigidité du muscle squelettique à l’aide d’un échographe, sous anesthésie gazeuse, pendant 20 minutes. Toujours sous anesthésie, les pattes avant gauche des rats des groupes « immobilisation pendant 7 et 14 jours » (20 au total) sont ensuite immobilisées à l’aide d’un gilet confectionné à partir des bandes auto-adhésives et de bandes velcro. Les animaux seront sous surveillance lors de leur réveil et la tenue du gilet d’immobilisation ainsi que leur état de santé seront surveillés tous les jours (prise/perte de poids, état général). Les tests de motricité (d'une durée de 2 minutes) et les mesures par imagerie échographique seront effectuées à Jour 0, Jour 7 et Jour 14.

Impact sur les animaux

L'immobilisation de la patte avant entrave le toilettage normal de l'animal. Ceux-ci seront brossés et nettoyés deux fois par jours avec une lingette humide. De plus, des difficultés à se déplacer et à se nourrir pourraient intervenir. Par conséquent, une gamelle de granulés humidifiés ou des gels nutritifs pourront être déposés quotidiennement au sol de sorte que les animaux puissent se nourrir plus facilement, si ils n'arrivent pas à atteindre les granulés des mangeoires.

Devenir

Tous les animaux du projet sont mis à mort afin de prélever les muscles des pattes avant. Ces muscles seront soumis à des tests mécaniques in vitro permettant de déterminer l'évolution de leurs propriétés mécaniques après 7 et 14 jours d'immobilisation. Des coupes histologiques seront par la suite réalisées pour évaluer la quantité de tissu conjonctif, la taille des fibres musculaires et, entre autres, le type de fibre.

Remplacement

Il n’existe actuellement pas de modèle in vitro ou in silico permettant de déterminer l’évolution des propriétés mécaniques et structurelles du muscle squelettique immobilisé. Les modèles animaux sont donc essentiels et ne peuvent donc être remplacés.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé afin de garantir une quantité suffisante de matériel biologique pour les analyses post-mortem, tout en tenant compte de la variabilité individuelle observées dans d’autres études. De plus, le protocole d’immobilisation a été adapté pour assurer son efficacité sur le plus grand nombre d’animaux possible.

Raffinement

Il existe un moyen d'immobilisation plus rapide à mettre en place et moins encombrant pour l'animal. En effet, les bandes auto-cohésives couplées à des bandes de velcro permettront d'immobiliser la patte de l'animal tout en étant plus souple et plus léger que le plâtre. L'ajout de velcro permettra de protéger temporairement les bandes cohésives du grignotage par les congénères. Les bandes de velcro pourront être remplacées si besoin. Ce dispositif permettra aussi de maintenir les animaux par groupe et non plus individuellement comme c'est le cas pour le plâtre. Un surplus d'enrichissement à ronger sera ajouter dans chaque cage et la nourriture sera humidifiée et déposée dans une gamelle afin d'aider les animaux à se nourrir plus facilement. L'immobilisation et les échographies seront effectuées sous anesthésie gazeuse et les animaux seront positionnés sur un plateau chauffant à 37±0.5°C afin d'éviter une hypothermie. Si les animaux présentent des signes de douleurs, celles-ci seront prises en charge par des analgésiques. Si les animaux perdent moins de 20% de leur masse initiale, des aliments appétents seront distribués. En revanche, si la perte de masse est supérieure à 20%, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Le modèle de rat est approprié à notre étude pour plusieurs raisons: - Il partage de nombreuses similitudes anatomiques, physiologiques et génétiques avec les êtres humains, notamment sur l'aspect des propriétés biomécaniques du muscle squelettique. - Sa petite taille permet de mesurer facilement les paramètres physiologiques (notamment moteurs) et dans le cas de notre étude d'immobiliser facilement un membre. - Il y a une bonne homogénéité entre les différentes souches de rats et donc la possibilité de comparer les résultats collectés à ceux d'autres études - Les dimensions limites pour réaliser les tests de traction-relaxation font que le modèle de rat permet de tester mécaniquement plus de muscle que le modèle de souris. - Il est souvent utilisé dans des études sur les effets de l'immobilisation du muscle squelettique. Des jeune adultes de 10 semaines sont choisis pour ce projet. Leur prise massique est réduite de l’ordre de 15% de prise de masse en 14 jours, ce qui permet de réaliser le protocole d’immobilisation sans avoir à modifier les gilets d’immobilisation à plusieurs reprises.

32 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur colorectale leur est implantée par chirurgie au niveau du côlon, suivie de traitements et de séances d'IRM sous anesthésie, pour valider cette imagerie comme outil de suivi tumoral. Le porteur présente le projet comme la création d'une expertise destinée à "offrir à l'industrie pharmaceutique" un service d'évaluation de molécules. Les bénéfices pour la santé humaine sont annoncés à long terme.

Objectifs

Le projet présenté se déroulera dans deux établissements utilisateurs et vise à démontrer l'intérêt et la valeur ajoutée de l'utilisation de l'imagerie par résonance magnétique (IRM) pour étudier l'efficacité de nouveaux composés en cancérologie sur des souris porteuses de cancer. L'IRM est une technique d'analyse de tumeurs implantées chez l'animal qui est non invasive, précise et utilisée chez le patient. Il est attendu de l'IRM qu'elle permette à terme d'améliorer et d'optimiser les études en cancérologie sur animaux, en travaillant avec des modèles de cancers implantés directement dans l'organe d'origine du cancer pour mimer au plus proche ce qu'il se passe chez le patient. Ce projet porte sur le suivi par IRM d'un modèle de cancer colorectal implanté directement au niveau du colon chez la souris. Ce modèle de cancer présente un intérêt fort pour évaluer l’efficacité thérapeutique de potentiels traitements anticancéreux, mais ne peut pas être étudié avec des techniques de suivi de volumes tumoraux classiques : mesures à la main quand les tumeurs sont implantées directement sous la peau. En effet, après l'implantation de la tumeur directement au niveau du colon, il est impossible de mesurer et de suivre l’évolution de la tumeur celle-ci se développant au niveau de l’organe et donc d’observer l’effet d’un traitement. Ce projet vise donc à créer une expertise en oncologie centrée sur l’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) pour la recherche biomédicale. Cette collaboration permettra d’offrir à l’industrie pharmaceutique le service requis pour l’évaluation in vivo chez l’animal de l’efficacité des molécules anticancéreuses développées avant leurs tests en phases cliniques chez le patient.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. Ce projet permettra de mettre en place un protocole de suivi tumoral capable d'étudier l’efficacité de potentiels traitements anticancéreux dans des modèles implantés directement dans l'organe, qui sont non mesurables avec les techniques classiques. Ceci permettra de simplifier l’utilisation de ces modèles de cancer qui miment la pathologie chez les patients et donc d’ouvrir potentiellement l’accès à de nouveaux traitements pour ces types de cancer. Il permettra aussi d'obtenir des données scientifiques afin de promouvoir l'utilisation d'une technique non invasive (l'IRM), technique dont la précision permettra à terme de réduire et raffiner nos études utilisant des animaux.

Procédures

- implantation par chirurgie et sous anesthésie de tumeurs au niveau de la couche extérieure du colon, 20 minutes maximum - anesthésie fixe durant l’IRM maximum 30 minutes - traitement par voie intrapéritonéale 30 secondes 10 injections pour les animaux traités au composé expérimental et 2 pour les contrôles et ceux traités avec l'immunothérapie- traitement par voie intraveineuse 30 secondes durant 6 séances. Une entreprise réalisera l'implantation chirurgicale des cellules tumorales dans l'Etablissement utilisateur 1, l'Etablissement utilisateur 2 hébergera les souris et effectuera les gestes techniques concernant les traitements, et enfin une entité présente dans l'Etablissement utilisateur 2 gérera la partie imagerie.

Impact sur les animaux

Potentielle perte de poids, une douleur sur plusieurs heures liée à l'implantation par chirurgie de tumeurs par ouverture de la cavité abdominale au niveau du côlon, contrôlée par de l'analgésie et réalisée sous anesthésie gazeuse. Une gêne dûe à une croissance de tumeurs au niveau du colon, du stress dû aux contentions pour les traitements, une douleur de quelques secondes dûe à l'aiguille suite aux injections à la seringue en intrapéritonéal pour les traitements, une douleur de quelques secondes dûe à l'aiguille suite à l'injection à la seringue à la queue en intraveineuse pour l'agent de contraste et un stress dûe à l'anesthésie gazeuse pour l'IRM.

Devenir

Suite à la procédure, les animaux seront mis à mort deux semaines après début du traitement pour les prélèvements de tumeurs fraîches.

Remplacement

Les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes (la rate, les ganglions etc), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). L’étude par IRM du développement d’une tumeur ne peut se faire qu’au niveau de la tumeur dans son micro-environnement et avec ses interactions avec l’organisme entier.

Réduction

Le projet sera fait sur le nombre d’animaux nécessaires afin de conclure de façon fiable statistiquement avec le test approprié (comparaison de moyennes et analyse de courbes d’espérance de vie) à l’efficacité du traitement tout en ayant une bonne prise tumorale. 32 souris seront utilisées et réparties en quatre groupes de 8 souris. Pour cette étude d’efficacité de nouvelles molécules sur un modèle de cancer colorectal complexe de part son implantation directement au niveau de l'organe, un effectif de 8 souris par groupe sera utilisé afin de pouvoir être capable d'observer une efficacité d'inhibition du volume tumoral de 25% du composé si cela vient à se passer. Pour chaque groupe, les volumes de tumeurs prélevées à la fin de la procédure seront analysées afin de confirmer les données obtenues par IRM et limiter les anomalies d’analyses pour des études futures utilisant l’IRM. Le recours à l’imagerie pour le suivi tumoral évite l’ouverture ou la mise à mort de l’animal pour visualisation direct de la tumeur, et donc une diminution du nombre d’animaux expérimentés.

Raffinement

Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Toutes les précautions seront prises pour détecter et minimiser la souffrance, la douleur et le stress des animaux (observation quotidienne, pesée des animaux, traitement antalgique si besoin). Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas d'amaigrissement. Des prélèvements de tumeurs en point final seront réalisés pour pouvoir obtenir le maximum d’informations des animaux utilisés. Concernant l’acte de chirurgie, les animaux seront traités avec un antidouleur avant la chirurgie qui se fera sous anesthésie gazeuse moins invasif et pour un réveil moins difficile. Le personnel est formé à la chirurgie quant à la mise en place du modèle et notre partenaire quant à la réalisation de l’IRM et l’administration des traitements. Afin d’éviter des transports réguliers tous les deux jours minimum des souris, les animaux seront transportés une fois avoir récupérés de la chirurgie pour une période d’acclimatation.

Choix des espèces

La souris immunocompétente est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs murines représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. Les souris seront âgées de 6 semaines, car la prise tumorale est meilleure sur les individus jeunes, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux à utiliser.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe un mélanome par injection de cellules sous anesthésie, puis on administre un anesthésique testé comme agent anti-tumoral et on réalise des prélèvements de sang. Le porteur affirme que l'étude des interactions entre traitements et système immunitaire rend "indispensable" le recours à un "organisme vivant entier". Les retombées annoncées, un possible usage en chirurgie du cancer chez l'humain, restent au conditionnel.

Objectifs

Des études rétrospectives ont suggéré un possible rôle anti tumoral des anesthésiques après observation d’une diminution de récidives métastasiques et une meilleure survie chez les patients ayant reçu ces produits. Le but du projet est donc d'étudier si un anesthésique utilisable en chirurgie oncologique induit une réponse anti-tumorale in vivo en diminuant la croissance tumorale. C'est aussi de démontrer si les effets antitumoraux de cet anesthésique peuvent être potentialisés par les traitements anti-cancéreux conventionnels et en fin de démontrer si cet anesthésique diminue le stress glucocorticoïde. Le dernier objectif est de démontrer si les effets anti-tumoraux médiés par cet anesthésique, s'ils existent, impliquent une réponse du système immunitaire.

Bénéfices attendus

Démontrer si l'anesthésique étudié pourrait être un nouvel agent anti-tumoral in vivo. Ce résultat pourrait amener à des essais cliniques randomisés contrôlés chez l'homme car actuellement cet agent est utilisé comme complément analgésique per-opératoire et n'a aucune recommandation spécifique en chirurgie oncologique

Procédures

Génération de tumeurs après injection de cellules sous anesthésie générale (1 fois, durée 5 minutes) -traitement par injection (1 fois, durée 1 minute) -prélèvements sanguins sous anesthésie (2 fois, durée 3 minutes) -

Impact sur les animaux

Greffe et croissance de tumeurs : gêne physique légère à modérée. Injections: stress et contrainte temporaire et légère.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour des analyses en cytométrie, biologiques ou histologiques.

Remplacement

Les effets des traitements anticancéreux seuls ou en association impliquent des processus multiparamétriques avec des sécrétions humorales et des répercussions immunitaires non modélisables ailleurs que dans un être vivant entier (échnge de cellules et d'information (humorales) entre les différents organes et tissus de l'organisme). On ne peut donc se contenter de l'étudier uniquement in vitro, il est indispensable d'avoir recours à un organisme vivant entier. Notre hypothèse est que l'association de la dexmedetomidine aux traitements anticancéreux conventionnels potentialiserait la réponse anti-tumorale. L'utilisation d'animaux vivants est donc indispensable pour étudier l'immunité et l'efficacité des traitements combinés sur la réponse anti-tumorale. La compréhension de cette potentialisation et sa reproduction in vivo ouvriraient la possibilité d'associer systématiquement ces agents au cours des chirurgies oncologiques chez l'homme afin de diminuer le risque de récidives grâce à une destruction potentialisée des cellules tumorales résiduelles.

Réduction

Pour la réalisation de ce projet, nous utiliserons des groupes de souris déterminés en nombres par calcul de puissance et pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés. Nous regrouperons les expériences dans le but de réduire le nombre d'animaux contrôles. Les résultats seront analysés selon des méthodes de statistiques non paramétriques.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début des expériences puis suivis quotidiennement. Le poids des souris et les tumeurs seront mesurés plusieurs fois par semaine lors de l'expérience de croissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux disposeront de nids (sizzlenests), de tunnels en carton. Le stress des animaux sera évalué quotidiennement par des échelles d'hétéroévaluation. Des mesures seront prises pour limiter le stress: plusieurs souris par cage pour un hébergement en groupes sociaux, animaux hébergés au calme. Les interventions seront réaliséés sous anesthésie générale à l'écart des animaux hébergés et par des personnes expérimentées. Des points limites ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Nous souhaitons prouver l'efficacité d'une association de traitements anti-cancéreux afin d'augmenter la réponse antitumorale chez l'homme qui est un mammifère. Avant de passer à des études cliniques, il est absolument nécessaire de réaliser des études pré-cliniques sur le modèle mammifère afin de tester notre hypothèse mais également afin de vérifier l'absence de toxicité qui pourrait être majorée par l'association de traitements. Le modèle souris est le modèle mammifère de choix en oncologie préclinique. Souris adultes de 6-8 semaines. Les tumeurs murines générées sont des tumeurs survenant chez l'adulte, mimant la population de patients.

8 032 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, celles destinées aux prélèvements étant tuées et les reproducteurs gardés pour l'élevage. On leur inflige deux modèles de colite chimique provoquant perte de poids, diarrhée et présence de sang dans les selles, avec des gavages quotidiens et des administrations intra-rectales sous anesthésie, pour tester des bactéries et composés anti-inflammatoires. Le porteur indique que ces composés sont d'abord criblés in vitro, mais que la complexité immunitaire rend les modèles cellulaires "pas suffisants". Les retombées annoncées pour les patients atteints de maladies inflammatoires de l'intestin sont placées à court et long terme.

Objectifs

L’objectif final de ce projet est de pouvoir proposer des alternatives ou des compléments aux traitements actuels de pathologies du tube digestif : maladie de Crohn et rectocolite ulcéreuse, qui forment le groupe des MICI (Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin). Les traitements actuels sont encore imparfaits puisqu’ils ne permettent pas une guérison complète. L'un des axes possibles pour améliorer la qualité des traitements est l'utilisation d'éléments capables de moduler la réponse inflammatoire de l'hôte en lien avec son microbiote. Nous cherchons à explorer la piste d'utilisation de bactéries entières, de composés bactériens ou de composés autres (type prébiotique, de natures plus diverses et souvent dérivés de plantes) capables de moduler la composition du microbiote en ce sens. Cette étude nécessite de reproduire l’inflammation liée aux MICI et pour ce faire, nous utiliserons deux modèles d’inflammation intestinale induite par des composés chimiques chez la souris. Le premier génère une inflammation très localisée au niveau du colon. Nous utilisons un protocole que nous déclinons sous forme classique « aigue » ou sous forme chronique (avec une alternance de phases inflammatoires et de phases de rémissions). Le second modèle possède la capacité d’altérer l’intégralité du tractus digestif. Ces deux modèles sont complémentaires vis-à-vis de la diversité des symptômes retrouvés dans les MICI. Les objectifs de ce projet sont de : - Evaluer la capacité anti-inflammatoire de bactéries ou composés bactériens ou de substances anti-inflammatoires dans ces deux modèles d’inflammation. Cette évaluation passera par le suivi de la reprise de poids et par la mesure de plusieurs paramètres. Les substances testées auront toutes été criblées au préalable via des tests in vitro sur cellules, qui auront mis en avant leurs capacités anti-inflammatoires. - Affiner nos connaissances sur les interactions entre hôte/micro-organismes ou composés et plus précisément sur les mécanismes d’actions de potentiels probiotiques ou prébiotiques sur des inflammations intestinales. Le cœur des projets de recherche de notre équipe est l’évaluation des propriétés anti-inflammatoires de composés, à des visées de complémentation pour des patients atteints de MICI. Les procédures décrites ici sont très utilisées au sein de notre équipe et servent pour plusieurs projets scientifiques. Les composés testés sont systématiquement validés in vitro avant d’être testés in vivo.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet seront à court terme de permettre une validation des propriétés anti-inflammatoires de composés dans des modèles murins pré-cliniques. Des études cliniques humaines pourront ainsi être menées par la suite sur ces composés, en cas de résultats probants. A long terme, ces composés pourront ainsi être proposés aux patients atteints de MICI en tant que compléments aux traitements actuels, pour soulager les patients de symptômes liés aux pathologies du tube digestif et améliorer ainsi leur qualité de vie. Un autre bénéfice de ce projet sera une meilleure compréhension des mécanismes d’action des bactéries ou composés bactériens sur l’inflammation intestinale. Cela peut passer par exemple par la mise en évidence de molécules produites par les bactéries testées qui pourront être purifiées et étudiées plus en détail par la suite. Les interactions de ces composés avec l’hôte et plus particulièrement avec le microbiote intestinal pourront également être étudiées, ce qui permettra d’avancer dans la compréhension de mécanismes plus globaux, à l’échelle de l’hôte. Des approches par imagerie sur des animaux vivants seront également mises en œuvre afin de disposer de données supplémentaires.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions/prélèvements suivants : - Prélèvements de fécès fraiches : sur animal vigile, 7 392 animaux concernés. Un prélèvement = maximum 10 minutes. Pour 2 496 animaux, il y aura des prélèvements quotidiennement sur 14 jours consécutifs (donc 14 collectes pour 2 496 animaux); pour les autres animaux (4 896) ce sera 3 ou 4 collectes en tout. - Gavages : sur animal vigile, 7 392 animaux concernés. Un gavage par jour prévu pour chaque souris sur la durée des procédures. Leurs durées varient entre 4 et 22 jours. Un gavage = 5-10 secondes. - Anesthésies générales: sur animal vigile, 4 896 animaux concernés (une ou deux fois selon le modèle). Une anesthésie = une piqûre réalisée en 15-20 secondes environ. - Administrations intra-rectale : sur animal anesthésié, 4 896 animaux concernés (une ou deux fois selon le modèle). Une administration = 20 secondes. - Anesthésies gazeuses: sur animal vigile, 7 440 animaux concernés (tous les deux jours pendant 5 ou 14 jours, selon le modèle). Une anesthésie = 5 minutes. - Injections sur animal anesthésié : 4 896 animaux concernés 3 fois et 2 496 concernés 8 fois. Une administration = 15 secondes. - Prélèvements de sang : sur animal vigile, 7 392 animaux concernés (concerne une seule fois chaque animal). Un prélèvement = une durée totale de 1 minute environ. - Biopsies à la queue sous anesthésie locale pour génotypage: 640 animaux. Une biopsie = quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les nuisances de ce protocole proviennent majoritairement des colites. En effet, les deux produits chimiques induisent une inflammation de l’intestin. Les principaux symptômes attendus sont pour les deux modèles : une perte de poids et des signes cliniques tels que pelage hérissé, posture voûtée, yeux mi-clos. Spécifiquement pour le second modèle : une diarrhée transitoire (2 à 3 jours) et présence éventuelle de sang dans les fécès.

Devenir

Tous les animaux qui doivent subir des prélèvements d'organes/tissus seront mis à mort. Les animaux reproducteurs seront gardés en vie.

Remplacement

A l’heure actuelle, l’étude in vitro des effets de bactéries, de composés bactériens ou d’autres substances sur l’inflammation intestinale comporte encore des limites. Des modèles cellulaires existent et sont bien décrits : ils seront d’ailleurs utilisés en amont de notre projet pour effectuer un premier criblage de composés candidats (lignée cellulaire en monocouche et/ou organoïdes intestinaux). Cependant, ces modèles in vitro ne reflètent pas de manière idéale la complexité des interactions entre le microbiote intestinal et les bactéries ou composés candidats. L’intérêt d’un modèle in vivo est également d’étudier la réponse du système immunitaire de l’hôte à l’administration de ces bactéries ou composés bactériens. Malgré le fait que certains paramètres peuvent être évalués à partir de modèles in vitro, la complexité des mécanismes immunitaires chez l’hôte fait que ces modèles in vitro ne sont pas suffisants pour permettre de valider des composés ayant pour visée une complémentation chez l’humain.

Réduction

Les bactéries ou composés bactériens testés seront issus d’un programme de criblage in vitro au préalable. Ces criblages auront pour but d’identifier des composés potentiellement intéressants. Ainsi seuls les composés les plus prometteurs sont envisagés pour un test in vivo. Par ailleurs, nous utilisons toujours une approche statistique pour déterminer la taille de nos groupes en fonction de l’intensité des effets que nous souhaitons mettre en évidence et des données déjà disponibles. Pour les analyses, nous effectuerons des tests statistiques de comparaison adaptés à nos effectifs et à nos questions. D’autres types de tests pourront également être menés, notamment pour les analyses de microbiotes où des procédures dédiées existent.

Raffinement

Les animaux sont hébergés à plusieurs afin de ne pas les exposer à un stress lié à l’isolement. Les quelques fois où les animaux seront séparés pour être manipulés ne représentent qu’un temps très court (10 minutes maximum), pour la récupération de fécès dans des pots. Nous incluons des enrichissements dans les cages : cellulose à déchiqueter et permettant la nidification, bâtons à ronger, maisonnettes en carton (sans encre). Les sondes de gavages sont en plastique souple et fin, à bords arrondis et de taille adaptée pour empêcher les blessures et réduire l’éventuelle douleur. Les manipulateurs maitrisant les gestes, le temps d’intervention et donc le stress seront réduits. Nous utiliserons des anesthésies adaptées en temps et aux besoins des essais. Lors des anesthésies impliquant un temps d’endormissement supérieur à 15 mn, un gel oculaire sera appliqué pour prévenir le dessèchement des yeux des animaux. Des pads chauffants seront également placés sous les cages pour maintenir la température corporelle des animaux pendant l’anesthésie. Des tapis chauffants électriques pourront aussi être utilisés. Des points limites adaptés sont définis afin de réduire au maximum la douleur ressentie par les animaux.

Choix des espèces

La souris est une espèce de référence en nutrition, toxicologie, cancérologie et immunologie. Elle est par ailleurs un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies inflammatoires intestinales, notamment car il est possible d’induire une colite chez la souris dont les réponses cliniques, tissulaires et immunitaires générées sont comparables à celles observées chez l’humain. Les animaux sont utilisés à un âge de 6 à 12 semaines. Cet âge constitue un point d’ancrage pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature et nos propres données. De plus, les souris adultes possèdent un système immunitaire mature, ce qui est essentiel pour étudier les effets anti-inflammatoires de nos produits.