Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Suivi de la biodistribution et de la toxicité de liposomes chez la souris gestante
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
78 souris femelles gestantes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 60 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections, parfois par chirurgie de la veine jugulaire, six séances d'imagerie sous anesthésie et une ponction cardiaque terminale, pour suivre la distribution de liposomes destinés à traiter des femmes enceintes. Le porteur indique que les procédures peuvent provoquer des avortements spontanés, et que les fœtus sont tués par décapitation pour analyse. Le recours à un "organisme entier" est présenté comme nécessaire pour étudier la mère et les fœtus.
Objectifs
Le développement de médicaments lors de la grossesse est complexe, car il faut à la fois éviter le passage des médicaments du côté du bébé et les concentrer au niveau du placenta pour limiter les effets secondaires chez la mère. Ainsi ce projet s’articule autour du développement de médicaments de tailles nanométriques, qui sont fabriqués pour aller spécifiquement dans le placenta.
Bénéfices attendus
Développement de nouvelles stratégies thérapeutiques disponibles pour la femme enceinte.
Procédures
Tous les animaux vont être soumis à des interventions suivantes : une seule injection dans la veine de la queue (30 secondes), la souris étant maintenue dans une cage de contention sur une durée totale de 3 minutes, ou injection dans la veine jugulaire qui nécessite une chirurgie (durée 30min), 6 séances d’imageries sous anesthésie générale d'une durée totale de 10 minutes au maximum par séance, une anesthésie profonde avant de procéder au prélèvement sanguin sur les animaux endormis par ponction cardiaque (geste d’une durée d’une minute environ). Les animaux seront ensuite mis à mort dans la même anesthésie. La durée de l'anesthésie et du prélèvement sanguin est d'environ 3-4 minutes par animal. Les embryons seront mis à mort par décaptitation pour l'analyse de ceux-ci.
Impact sur les animaux
La pose de cathéter au niveau de la veine jugulaire nécessite une chirurgie sous anesthésie. Ce projet utilise des femelles gestantes, les procédures pourraient induire des avortements spontanés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour collecter des tissus qui seront analysés pour déterminer la distribution et la toxicité éventuelle des molécules utilisées sur ceux-ci. Les foetus sont euthanasiés pour évaluer la toxicité des molécules utilisées et s’il y a présence de ces molécules dans les tissus fœtaux ou non pour évaluer un potentiel passage des molécules à travers du placenta.
Remplacement
Nous avons préalablement évalué plusieurs formulations par des expériences réalisées en laboratoire pour ne tester chez l’animal, que les formulations optimales. Il nous est nécessaire de disposer d’un organisme entier, car nous souhaitons étudier les effets de l’administration de nos molécules lors la grossesse sur la mère et les bébés. Nous ne disposons pas de méthode alternative permettant de répondre à ces questions.
Réduction
Ce projet a été mis en place en réduisant autant que possible la taille des groupes expérimentaux. Nous utiliserons des tests statistiques afin de définir le nombre minimum d'animaux à étudier pour mettre en évidence les effets de l’administration de nos molécules lors la grossesse. Ainsi, pour l’étude pilote 3 femelles non gestantes par condition seront utilisées. Nous utilisons une technique d’imagerie optique, non invasive, pour évaluer le profil de distribution en fonction du temps. Cela permet de faire plusieurs mesures sur un même animal et donc in fine de réduire le nombre d’animaux utilisés. En effet, il ne sera plus nécessaire d'euthanasier l’animal pour localiser les molécules fluorescentes puisque leur localisation peut être évaluée en fonction du temps, grâce à l’utilisation de l’imagerie. Pour la deuxième partie des groupes de 15 souris gestantes par conditions seront suffisants.
Raffinement
Les animaux seront placés dans les conditions optimales d’hébergement et auront accès illimité à l’eau et à la nourriture. Les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale. La souris est placée sur un tapis thermostaté pendant l’imagerie. De plus, elle sera placée dans une cage thermostatée le temps du réveil et de la récupération post examen d’imagerie. Des points limites généraux avec l’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être tout le long de l’étude ont été établis, surveiller l’état général de l’animal, son apparence, son comportement, révélateurs du niveau de douleur. Des antalgiques sont prévus en cas de nécessité et un niveau de douleur trop élevé entraînerait l'euthanasie anticipée de l'animal.
Choix des espèces
Nous souhaitons évaluer, la distribution des molécules de tailles nanométriques, dans les différents tissus de l'organisme, après injection. La souris est le modèle le plus approprié de par sa physiologie proche de l’homme ainsi que la grande quantité de données disponibles dans la littérature et au sein du laboratoire. Nous analyserons des souris femelles adultes âgés de 10 semaines au moment de l’injection. Les souris femelles gestantes seront en deuxième semaine de gestation. Cette chronologie de gestation est choisie, car c’est le moment où le placenta est le mieux développé et c’est un moment encore assez éloigné pour ne pas risquer un accouchement prématuré.
Evaluation du potentiel thérapeutique de différentes Nanoparticules en cancérologie
- Recherche fondamentale
- Oncologie
10 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 9 600 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur greffe des tumeurs du sein ou du mélanome et des métastases pulmonaires, avec des injections répétées de nanoparticules et des séances d'imagerie sous anesthésie, pour sélectionner les particules les plus prometteuses. Le porteur décrit des signes comme la prostration, la détresse respiratoire et des réactions du greffon, et annonce des souris tuées "immédiatement" aux premiers signes. Il expose ses objectifs et bénéfices en quelques lignes, pour un projet portant sur plus de dix mille souris.
Objectifs
L’objectif du projet est de sélectionner les meilleures Nano-Particules (assemblage chimique de très petite taille, inférieur à 1/10 de mm) pour une possible utilisation thérapeutique dans les cancers du sein et du mélanome.
Bénéfices attendus
Il s'agit d'améliorer les traitement des cancers du sein et du mélanome. L'utilisation des meilleures Nano-Particules devrait permettre de réduire les effets secondaires des chimiothérapies actuelles.
Procédures
Injections des Nano-Particules sur des souris anesthésiés, durée 1mn/souris. Imagerie en fluorescence sur des souris anesthésiées, quelques minutes, fréquence 5 fois. Injection de cellules, durée 1mn/souris, 1 fois seulement. Injections des Nano-Particules, sur des souris anesthésiées, durée 1mn/souris, 1 fois seulement. Imagerie en fluorescence sur des souris anesthésiées, quelques minutes, fréquence 5 fois. Injection de cellules, durée 1mn/souris, 1 fois seulement. Injections des Nano-Particules, sur des souris anesthésiées, durée 1mn/souris, fréquence 10 fois. Imagerie en bioluminescence sur des souris anesthésiées, durée quelques minutes, fréquence 7 fois. Injection de cellules, durée 1mn/souris, 1 fois seulement. Injections des Nano-Particules, sur des souris anesthésiées, durée 1mn/souris, fréquence 10 fois. Imagerie en bioluminescence sur des souris anesthésiées, durée quelques minutes, fréquence 7 fois. Injection de cellules, durée 1mn/souris, 1 fois seulement. Prélèvement de sang, sur des souris anesthésiées, 100µl, une seule fois. Injections des Nano-Particules, sur des souris anesthésiées, durée 1mn/souris une seule fois.
Impact sur les animaux
La majorité des effets délétères attendus seront dû à la formation de tumeurs mammaire, de mélanome et de métastases pulmonaires donc avec des signes cliniques comme prostration, troubles du comportement, agressivité, détresse respiratoire, troubles métaboliques. Pour certains modèles, il pourrait y avoir une réaction du greffon contre l'hôte, avec perte de poids, de possible lésions cutanés (irritations, sècheresse localisée). Les effets indésirables potentiels de l'anesthésie sont une irritation des voies respiratoires et une légère tendance au spasme laryngé dû à l’âcreté du produit employé. Les injections répétées pourraient entrainer localement une inflammation.
Devenir
Les animaux ayant subi ces interventions ne pourront pas servir pour d'autres expérimentations et seront mis à mort pour prélèvements.
Remplacement
Il n'existe pas de méthodes alternatives pour remplacer le présent projet. Les études in silico et in vitro ne permettant pas de reproduire la complexité d'un environnement tumoral. Le modèle animal est donc nécessaire pour récapituler les étapes complexes de la progression tumorale.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire a été déterminé au minimum mais néanmoins suffisant pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente en tenant compte de la puissance du test statistique qui sera utilisé. De plus l'emploie d'un système d'imagerie en fluorescence et bioluminescence du petit animal permettant un suivi dans le temps pour chaque animal, réduit le nombre d'animal requis et renforce la fiabilité des résultats.
Raffinement
Les protocoles expérimentaux prennent en compte les conséquences l’impact sur la souffrance animale et différents critères ont été établis pour éviter toute souffrance animale. Les animaux ne rentrent en phase d'expérimentation qu'au minimum 15 jours après leurs arrivés. Les animaux sont pratiquement systématiquement manipulés sous anesthésie gazeuse. Quand des procédures d'injections ou de chirurgies sont mise en place, des analgésiques sont administrés. Les souris sont maintenues au minimum de 2 par cage pour maintenir une interaction entre individus. L’environnement d’élevage est enrichi à l’aide de nids et de carrés de cellulose pour garnir ces nids. Si une souris présentait des symptômes traduisant l’apparition d'inconforts (réduction de la réactivité, difficulté de locomotion, fourrure non entretenue, tendance à l'isolement) elle serait euthanasiée immédiatement. Des points limites ont été établis pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animal la plus propice pour ce type d’étude pour les raisons suivantes : • nombreux protocoles bien établis pour cette espèce • possibilité d'avoir accès à des animaux génétiquement modifiés • modèles mimant très bien les cancers mammaires et de mélanomes humain et récapitulent toute la cascade métastatique en peu de temps et ont déjà fait l'objet de nombreuses publications dans le domaine. Ce seront des souris adultes entre 8 et 12 semaines, car les traitements envisagés s'adressent à ce type de population. Des animaux de 5 semaines seront employées pour l'analyse de l'impact des Nano-Particules sur le système immunitaire.
Approche pharmacologique pour la maladie Charcot-Marie-Tooth de type 2A
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une forme de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, elles reçoivent des injections dans le péritoine six jours sur sept pendant deux mois, subissent des tests de locomotion, de démarche et de sensibilité à un filament appliqué sur la patte, puis une chirurgie terminale. Le porteur indique que ses données in vitro montrent déjà un effet du composé testé, mais qu'un passage in vivo reste une étape "indispensable" avant un essai chez l'humain. Les retombées annoncées pour d'autres formes de la maladie sont renvoyées au long terme.
Objectifs
La maladie de Charcot Marie Tooth (CMT) est une maladie génétique touchant le système nerveux périphérique (SNP). Les patients souffrant de CMT présentent une faiblesse et atrophie musculaire prédominante aux membres inférieurs, des déformations squelettiques des extrémités, ce qui entraine une difficulté pour se mouvoir et pour les formes de CMT les plus sévères, la nécessité d'un fauteuil roulant. Contrairement à la maladie de Charcot (ou sclérose latérale amyotrophique), la CMT ne réduit pas l’espérance de vie des patients, mais affecte fortement leur qualité de vie. Une des formes les plus fréquente de CMT est la forme CMT2A. Les motoneurones des souris modèles de la CMT2A présentent des défauts dans les interactions entre la mitochondrie et le réticulum endoplasmique (RE) ainsi que dans la dynamique et le transport des mitochondries. Le composé Pre-084 promeut les interactions entre le RE et les mitochondries en favorisant notamment le transfert de calcium. Le Pre-084 a déjà montré un effet thérapeutique dans de nombreuses maladies neurologiques liées à des défauts de contacts RE-mitochondries, telle que la maladie d’Alzheimer, la Sclérose latérale amyotrophique ou encore le syndrome Wolfram. Ce projet a pour but de tester une approche thérapeutique basée sur l'administration du composé Pre-084 dans un modèle murin modélisant de la maladie de Charcot-Marie-Tooth de type 2A (CMT2A).
Bénéfices attendus
L'ensemble de ce projet nous permettra de déterminer si le traitement Pre-084 représente une possibilité thérapeutique pertinente pour la CMT2A. A plus long terme ces approches pourront être mise en place pour d'autres formes de CMT et déboucher sur des essais cliniques pour la CMT.
Procédures
160 animaux subiront un traitement par injection dans le péritoine 6 jours sur 7. Les animaux seront contentionnés quelques secondes pour permettre ces injections. 320 animaux seront évalués par des tests de comportement pour mesurer la locomotion, démarche et réponse sensitive. Chaque test sera réalisé sur deux jours (entrainement et test) en incluant des moments de récupération pour les animaux entre chaque essais et entre chaque test (au moins deux jours). 160 animaux subiront une chirurgie terminale ayant pour objectif de réaliser une perfusion de paraformalédhyde.
Impact sur les animaux
Dans le cas de l'approche par voie intrapéritonée, les animaux subiront à l’âge adulte (soit avant soit après apparition des premiers symptômes) des injections dans le péritoine 6 jours par semaine pendant deux mois. Ces injections seront réalisées en quelques secondes (contention et piqûre compris) au moyen de fines seringues à insuline . Ces injections répétées sont généralement bien tolérées, néanmoins il peut apparaitre de petites inflammations locales ou légères irritations. Dans la suite de l'étude, le traitement dans l'eau de boisson ne devrait pas générer d’inconfort. Ce traitement a déjà été utilisé dans plusieurs études et ne provoquent pas d’effets indésirables chez l’animal. Au cours du traitement, les animaux subiront trois tests comportementaux à trois temps (avant, pendant et à la fin du traitement) qui permettent d'analyser la locomotion, la démarche et la réponse sensitive des souris. Seule la mesure de la réponse sensitive entraîne un inconfort de courte durée suite à l’exposition à un filament de 0.5 mm qui vient exercer des forces croissantes sur la patte de la souris.
Devenir
A l'issu des études comportementales l'ensemble des animaux seront euthanasiés afin de déterminer l'effet bénéfique des thérapies proposés au niveau cellulaire sur les tisssus atteints dans la pathologie de Charcot Marie Tooth (CMT)
Remplacement
Il est difficile d'accéder aux cellules de patients du système nerveux périphériques (neurones moteurs et sensitifs et cellules de Schwann). Les neurones moteurs et sensitifs de patients peuvent être différentiés à partir de cellules pluripotentes humaines induites et constituer ainsi un modèle humain de la pathologie CMT pour les formes axonales. Nos données préliminaires ont déjà montré un effet bénéfique du Pre-084 sur un modèle in vitro de la CMT2A. Néanmoins le passage in vivo est une étape indispensable pour établir la preuve de concept et la mise au point de la dose du traitement, sa biodisponibilité, afin d'envisager par la suite un essai thérapeutique chez l'homme.
Réduction
Le nombre d'animaux a été limité au minimum nécessaire (= 20 animaux par groupe) pour mettre en évidence un effet significatif sur des paramètres de locomotion et de sensibilité en se basant sur nos travaux précédents et en prenant en compte un risque alpha inférieur ou égal à 0.05, une puissance de test de 80% et un effet modéré de 30%. Afin de réduire le nombre d'animaux, nous privilégions une étude longitudinale c'est-à-dire que les mêmes groupes d'animaux seront suivis à différents stades (3,4 et 5 mois ou 6,7 et 8 mois selon le début du traitement) afin de suivre à long terme l'effet bénéfique des thérapies. Au total nous utiliserons 320 animaux répartis de la manière suivante selon deux études: Pour l'approche 1 (traitement par injections intra-péritonéale), qui sera réalisée à deux temps: début du traitement (en pré-symptomatique de 3 mois à 5 mois) et début du traitement (en symptomatique de 6 mois à 8 mois). Il y aura (20 animauxX4groupes)X2temps=160 animaux. Le même nombre d’animaux (160) sera utilisé pour l’approche 2. A noter que l’étude 2 (traitement per os) ne sera mise en place que si on obtient un effet bénéfique du traitement dans l’étude 1
Raffinement
Afin d’améliorer le bienêtre animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture à volonté, enrichissement, stabulation en petit groupe). L’environnement est enrichi à l’aide de maisonnettes en carton. Nous nous assurerons de diminuer le stress des souris en les manipulant en coupe ou en tunnel. Dans le cas du maintien de la lignée, les gestes de biopsies (perçage d’oreille) seront couplés à l’identification afin de limiter leur manipulation et gestes invasifs. Dans le cas d'apparition des petites inflammations locales ou légères irritations suite aux injections intra-péritonéales répétées, nous privilégierons soit une injection du côté opposé de l’abdomen, soit nous laisserons l’animal sans traitement quelques jours le temps de récupérer ou d’être soigné au besoin (Povidone Iodée- Vétédine®). Au cours des tests, nous mettons en place des temps de repos entre chaque essai pour limiter l’inconfort de l’animal. Des points limites seront définis et les animaux seront mis à mort lorsqu’ils atteindront les critères d’interruption.
Choix des espèces
La souris reste un des modèles les plus aisés à modifier génétiquement et proche de l'homme (99% des gènes sont homologues). Elle est l'espèce la plus utilisée pour modéliser des maladies neurodégénératives ou neuromusculaires telles que la CMT. Elles développent la plupart du temps des anomalies observées chez l'homme et ont permis de mieux comprendre les mécanismes cellulaires sous-jacents à ces pathologies. Dans notre cas, la lignée utilisée pour la CMT2A reproduit une partie des anomalies histologiques et comportementales observés chez les patients souffrant de CMT2A telles qu'une dénervation musculaire et des défauts locomoteurs et sensitifs modérés. Pour les deux études, les traitements seront réalisés à deux temps: avant (3mois) et après le déclenchement de la maladie (5mois) afin de déterminer si l'effet du traitement permettra d'empêcher le développement de la maladie et/ou de la ralentir une fois celle-ci déclarée. L'ensemble des groupes de souris de ces études seront suivis pendant les deux mois de traitement (soit de 3 à 5 mois ou de 6 à 8 mois).
Nouveau modèle non-Invasif d’infarctus du myocarde et d’ischémie reperfusion chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur provoque un infarctus du myocarde par deux techniques présentées comme moins invasives, puis on suit leur cœur par échographie, pour réduire la variabilité des modèles chirurgicaux existants. Le porteur indique que la douleur liée à l'infarctus est maximale pendant vingt-quatre heures et qu'un analgésique est alors administré. Les bénéfices annoncés, des thérapies plus efficaces contre l'infarctus chez l'humain, restent à démontrer.
Objectifs
Malgré les progrès des traitements interventionnels et pharmacologiques des infarctus du myocarde (lorsqu’une artère coronaire irriguant la paroi cardiaque se bouche), les cardiopathies qui en résultent restent la principale cause de décès dans le monde. Il y a donc nécessité à continuer la recherche dans ce domaine pour optimiser les traitements et sauver des vies. Étant donné la complexité du cœur qui assure une fonction de pompe pour le système circulatoire qui s’adapte à la demande de l’organismes et la pression artérielle et dont la régulation du rythme est contrôlée par un système neuro-hormonal complexe, les modèles animaux sont indispensables pour cette recherche, aucun système in vitro ne pouvant reproduire cette complexité. Le modèle rongeur est le plus utilisé. Le modèle actuel est basé sur la technique chirurgicale sous anesthésie qui induit un infarctus du myocarde. De multiples variables affaiblissent le pouvoir translationnel de la méthode. Bien que de nombreuses tentatives aient été faites pour améliorer cette technique en réduisant au minimum la taille de l'incision, la variabilité dans un même groupe d'animaux et entre différents groupes est restée significativement élevée. Cette incohérence est probablement attribuée aux détails techniques de la procédure chirurgicale, ce qui entraîne une diminution de l'efficacité et un manque de reproductibilité des résultats. L'étude présente vise à produire deux modèles non invasifs. Ces deux méthodes utiliseront des souris de type sauvage.
Bénéfices attendus
L'objectif principal de ce projet est de développer des techniques innovantes et transposables à l’homme pour étudier le remodelage indésirable du tissu du cœur après infarctus. Ce projet améliorera les méthodes conventionnelles en améliorant la qualité de la chirurgie effectuée pour induire un infarctus en limitant l'intubation, les saignements, la taille de la plaie, l’inflammation et d'autres facteurs. Les techniques proposées réduiront considérablement la variabilité dans un seul groupe d'animaux et favoriseront des résultats plus applicable à la situation clinique chez l’homme ou la femme. Ces techniques moins invasives aideront les scientifiques à développer des thérapies efficaces pour l'infarctus du myocarde.
Procédures
L'électraucotérisation : 22 souris SHAM et 22 opérées; durée de l'opération 10 minutes. La magnétisation de nanoparticules: 34 SHAM et 34 opéréés; durée de l'opération 30 minutes. Procédure d’échocardiographie: pour tous les animaux; analyses réalisées en 30 minutes en moyenne.
Impact sur les animaux
L’infarctus du myocarde peut entrainer plusieurs effets indésirables chez la souris. La douleur attribuable à l'infarctus du myocarde est maximale jusqu'à 24 h chez la souris. De plus du fait de l’opération les souris peuvent avoir une difficulté à l’accès à la nourriture ce qui pourrait entrainer une perte de poids. Au moment de l’échographie les yeux des souris peuvent subir une légère déshydratation.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure afin récupérer les différents tissus pour des analyses de biologie moléculaire et biochimiques ultérieures.
Remplacement
Le recours à des animaux se justifie par la nécessité d'étudier la fonction cardiaque dans un contexte physiopathologique complexe et multifactoriel impliquant une circulation sanguine. L'utilisation d'animaux se justifie également par l'incapacité d'obtenir une lignée cellulaire stable de cardiomyocytes.
Réduction
Afin de limiter au maximum le nombre d'animaux par groupe une analyse statistique poussée a été réalisée. Le calcul du nombre d'animaux nécessaires pour pouvoir conclure définitivement sur les résultats, est très important car il serait aussi grave de limiter de façon excessive le nombre d'animaux à inclure que d'en inclure un trop grand nombre. Utiliser des animaux pour une expérience qui ne sera pas conclusive par manque d'animaux et donc par manque de puissance statistique est aussi grave qu'en utiliser trop. Pour rentabiliser l’utilisation des animaux à des fins expérimentales, les organes sont prélevés, partagés et congelés pour des expériences de biochimie et de biologie moléculaire ultérieures.
Raffinement
L'opération chirurgicale est induite en respectant au maximum les procédures du bien-être animal et en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques et analgésiques. Après l’échographie l’animal est placé dans une cage propre sous lampe chauffante. Après son réveil complet (environ 10 minutes), il est remis dans sa cage. La douleur propre à l’infarctus étant observé 24 h après opération les souris seront traitées avec un analgésique au cours de cette période. Les yeux sont protégés du dessèchement par un onguent ophtalmique et de la lumière par une compresse humidifiée. Pour faciliter l’accès à la nourriture des boites de gels ou une litière surélevée seront mises en place afin que les souris ne perdent pas trop de poids.
Choix des espèces
Le protocole d'éléctrocoagulation de l'artère coronaire a été publié originalement sur la souris et requiert en effet une sonde ultrasonore de haute fréquence pour la visualisation qui est adaptée à la souris plutôt qu'au rat. Les souris seront opérées à l'âge de 1 ou 2 mois pour avoir la taille minimum pour procéder à la ligature de la coronaire.
Identification et caractérisation préclinique de conopeptides antalgiques (CONIDOL)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3 986 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 400 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 3 020 un niveau modéré. On leur induit des douleurs inflammatoires, post-opératoires, arthrosiques et neuropathiques pour mesurer leur seuil de douleur et tester des peptides tirés de venins de cônes marins. Le porteur indique que la nécessité d'évaluer la douleur empêche de mettre en place un traitement antalgique, les souris atteignant une perte de poids de 20 % ou d'autres points limites étant alors tuées. Les retombées annoncées, de nouveaux médicaments contre la douleur chronique, sont formulées comme une perspective.
Objectifs
La dernière Classification Internationale des Maladies (CIM-11) réalisée par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) reconnait enfin la douleur chronique. C’est une avancée importante pour des millions de personnes : on estime en effet à l’échelle mondiale qu’une personne sur 5 souffre de douleurs chroniques, et que 2 personnes sur 3 ne sont pas satisfaites par leur traitement. Les coûts directs et indirects résultant sont importants pour nos sociétés. Face à ce constat, le nombre réduit de molécules antalgiques à la disposition des praticiens et leur ratio bénéfice/risque insuffisant motivent la recherche de nouveaux candidats médicaments. Dans cette quête, les substances d’origine naturelle ont démontré leur potentiel. En particulier, la diversité et l’efficacité des toxines contenues dans les venins de cône marin représentent une opportunité. Le ziconotide, un analogue synthétique de conotoxine bénéficie d'ailleurs d'une autorisation de mise sur le marché en 2004 pour le traitement des douleurs réfractaires à la morphine, mais son utilisation est restreinte en raison d’un mode d’administration contraignant. L'objectif de ce projet est donc d'identifier de nouveaux conopeptides ou d'améliorer des conopeptides connus (optimisation chimique, formulation, mode d'administration) pour le développement d'antalgiques innovants, efficaces et bien tolérés.
Bénéfices attendus
Notre objectif est l'identification et la caractérisation de conopeptides naturels ou modifiés ayant de bonnes propriétés antalgiques tout en étant bien toléré par les animaux. Ces composés pourront devenir des candidats-médicaments et faire l'objet d'études précliniques ultérieures plus approfondies. De plus, le mode d'administration actuel du ziconotide (intrarachidien), seul conopeptide antalgique sur le marché, est risquée et contraignante. Nous nous intéressons particulièrement à cette problématique et évaluerons des modes d'administrations plus sûrs et confortables.
Procédures
486 souris feront l'objet d'une euthanasie (anesthésie sans réveil) pour prélèvement de tissus post-mortem. 120 souris feront l'objet d'enregistrements électrophysiologiques in vivo sous anesthésie générale et terminale. Une inflammation plantaire sera induite chez 1600 souris (injection carragénine) pendant 6h30. Un peptide sera administré chez ces animaux par voie intrapéritonéale, intrathécale, intraplantaire, intra-articulaire ou topique. Une mesure de seuils de douleur sera réalisée chez ces animaux pendant 3h après traitement. 200 souris seront soumises à des tests de locomotion après administration de peptide. Un modèle de douleur sera induit chez 1400 souris (post-opératoire : 24h, arthrose : 7 jours, neuropathique : 14 jours). Le peptide sera administré chez ces animaux le dernier jour et les seuils de douleur des animaux seront suivis pendant 3h. 300 souris seront incluses dans un protocole de pharmacocinétique impliquant des prélèvement de sang, cerveau et peau, qui seront réalisés après euthanasie.
Impact sur les animaux
Les conopeptides n'ont pas de toxicité centrale dû à leur incapacité à passer la barrière hémato-encéphalique. Ils peuvent cependant induire une toxicité périphérique, notamment musculaire ou cardiaque. La toxicité cardiaque sera évaluée chez l'animal anesthésié avant toute administration à un animal vigil. Des échelles de doses seront réalisées pour observer d'éventuelles modifications du comportement et déterminer la tolérance aux produits. Ce projet nécessite l'induction de modèles de douleur neuropathique et inflammatoire. Ces procédures, de fait, constituent une nuisance pour les animaux. Les animaux seront donc euthanasiés immédiatement après l'expérience, dont la durée sera réduite au minimum (fonction du temps nécessaire à l'induction). Seuls des tests comportementaux visant à atteindre le seuil de douleur de l'animal sans le dépasser seront utilisés. Les animaux seront surveillés quotidiennement par l'expérimentateur et si un animal présente une trop forte douleur, un comportement stéréotypé ou anormal, une posture anormale ou une réduction de poids de 20%, celui-ci sera euthanasié.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés à l'issue des expérimentations car les traitements réalisés ne permettent pas leur réutilisation. De plus, les procédures impliquent l'induction d'un modèle de douleur, ce qui rend leur euthanasie obligatoire en fin d'expérience.
Remplacement
Les peptides seront sélectionnés par une approche in vitro, favorisant l'utilisation de lignées cellulaires et les cellules souches différenciées. Nous utiliserons également des cultures primaires de neurones pour confirmer les résultats obtenus sur les lignées. Ces cultures nécessitent l'euthanasie d'animaux, mais permettent d'obtenir une grande quantité de résultats par animal (42 peptides ou concentrations différentes peuvent-être testés grâce aux neurones obtenus d'une souris).
Réduction
Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Certaines procédures sont adaptées pour obtenir plus d'information à partir des mêmes animaux (par exemple test de nociception, puis test de sédation et enfin mesure de la température rectale).
Raffinement
Les premiers tests in vivo seront réalisés sous anesthésie (enregistrement de l'activité nerveuse sensorielle périphérique sous anesthésie kétamine/xylazine, 1 mg/kg intrapéritonéal), et couplés à un monitoring cardiaque. Cela permettra de ne tester chez l'animal vigil que les toxines ayant un effet avéré sur l'hyperexcitabilité neuronale et n'ayant pas de toxicité cardiaque. En raison de la nécessité d'évaluer la douleur chez les animaux, nous ne pouvons pas mettre en place de traitement pharmacologique de la douleur. Cependant, afin de prévenir une éventuelle souffrance qui irait au delà du modèle de douleur utilisé, les animaux seront surveillés quotidiennement (Week-end et jours fériés compris) par l'expérimentateur et le personnel de l'animalerie, et euthanasiés si un point limite est franchi. En effet, si un animal présente une trop forte douleur, un comportement stéréotypé ou anormal, une posture anormale ou une réduction de poids de 20%, celui-ci sera euthanasié. Les animaux seront au maximum 6 par cage en respect de la réglementation en vigueur concernant la superficie au sol par souris. De plus, ces cages contiendront un enrichissement de type maisonnette ainsi que du coton pour la constitution d'un nid.
Choix des espèces
Nous avons choisi de travailler sur le modèle souris car c'est sur ce modèle qu'ont été mis au point au laboratoire toutes les techniques d'investigation comportementale et électrophysiologique ainsi que les différents modèles de douleur utilisés. C'est également le modèle pour lequel nous disposons du plus de données dans la littérature. Enfin, notre animalerie est une animalerie petit rongeur concue pour l'hébergement des souris, modèle sur lequel notre personnel a le plus d'expertise. Les animaux utilisés seront des jeunes adultes (8-12 semaines). Si la douleur touche essentiellement des personnes âgées, travailler sur la souris âgée représenterait un risque et surcoût extrêmement important qui mettrait en péril le projet dans son ensemble (coût d'achat d'animaux âgés et surmortalité de ces animaux). L'animalerie et son personnel ne sont pas en mesure d'accueillir à grande échelle des animaux âgés demandant une surveillance et des soins accrus et adaptés. Enfin, les tests et modèles utilisés, comme les données disponibles dans la littérature, concernent sauf cas très spécifiques des animaux jeunes.
Évaluation des propriétés antiépileptiques de composés nouvellement identifiés dans un modèle murin du syndrome de Dravet
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
636 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 576 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant le syndrome de Dravet, elles reçoivent des injections, subissent des crises d'épilepsie déclenchées par hyperthermie et des tests comportementaux d'exploration et de nage, pour évaluer trois composés antiépileptiques. Le porteur indique que le modèle entraîne des crises spontanées et une mort subite chez 40 % des souris, qu'il décrit comme survenant "sans aucune souffrance". Il justifie la souris par le fait qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les crises d'un "organisme entier", et annonce une transposition possible à l'humain au conditionnel.
Objectifs
Le syndrome de Dravet est une épilepsie génétique sévère qui se développe avant l'âge de 1 an. Outre les crises d'épilepsie, ce trouble se caractérise par des comorbidités comportementales, telles qu'un déficit cognitif et une déficience motrice. Dans 80% des cas, ce syndrome est causé par une mutation d'un gène codant pour un canal sélectif au sodium. Ces canaux sont principalement localisés dans les neurones inhibiteurs du cortex et de l'hippocampe et jouent un rôle clé dans la régulation de leur excitabilité. Plusieurs équipes ont montré que les mutations de ces canaux identifiées chez des patients atteints du syndrome de Dravet provoquaient une hypoexcitabilité des neurones inhibiteurs induisant un déséquilibre excitation/inhibition qui conduit à des crises d'épilepsie. Une grande partie des patients atteints du syndrome de Dravet n'ont pas d'amélioration de la fréquence et de la sévérité des crises avec les traitements pharmacologiques actuels. Les souris reproduisant la mutation humaine ont un phénotype qui récapitule les symptômes observés chez les patients atteints du syndrome de Dravet. Nous allons tester 3 composés qui ont montré un potentiel antiépileptique, réduisant efficacement la fréquence des crises dans un modèle d'épilepsie chez le poisson zèbre. Notre projet de recherche vise à évaluer l'efficacité d'un traitement pharmacologique précoce avec les 3 composés sur le développement de différents symptômes dans un modèle de souris du syndrome de Dravet, confirmant, espérons-le, les résultats prometteurs obtenus à partir d'un modèle de poisson zèbre.
Bénéfices attendus
Nous présentons une nouvelle approche expérimentale, ainsi qu'une nouvelle version de la ligne de traitement existante, l'une ou l'autre pouvant améliorer la résistance aux médicaments observée chez les patients atteints du syndrome de Dravet. La majorité des traitements pharmacologiques actuellement disponibles se sont avérés peu ou pas efficaces dans le syndrome de Dravet. Nos traitements proposés ont déjà montré des résultats prometteurs dans un modèle de poisson zèbre du syndrome de Dravet, réduisant efficacement la fréquence et la gravité des crises. Nous nous attendons à observer un effet similaire dans notre modèle de souris, en testant en outre l'effet du traitement sur les anomalies comportementales, ce qui, dans l'état actuel, n'est pas possible chez les poissons. De plus, si les résultats sont confirmés chez un mammifère comme la souris, le potentiel thérapeutique a plus de chance d'être transférable à l'homme.
Procédures
A 6 jours les animaux sont biopsiés pour analyse du génotype, puis les souris entrent en procédure à l'age de 15 jours. La totalité des souris recevra une injection en intrapéritonéal ou intranasal (durée 3 à 5 s) qui peut provoquer une inflammation locale. 6 groupes de 23 souris mutantes subiront une induction de crise induite par l'hyperthermie. Il s'agit d'une procédure unique qui dure environ 20 minutes et se termine lors d'une crise tonico-clonique généralisée ou lorsqu'elle atteint 43 degrés. La majorité des tests comportementaux, qui seront utilisés sur 363 souris, sont basés sur la tendance naturelle des rongeurs à explorer un nouvel environnement et se feront en une seule séance (5 à 30 min). Un test d'apprentissage qui consiste à faire nager les souris pendant au maximum 1 minute est réalisé sur 5 jours.
Impact sur les animaux
Nous utiliserons une lignée de souris avec une modification génétique du gène codant pour un canal sodium qui provoque des crises tonico-cloniques spontanées à partir de l'âge de 3 semaines environ. Ces crises peuvent provoquer une mort subite chez 40% des animaux sans aucune souffrance (cette mortalité est également observée chez les enfants atteints du syndrome de Dravet). Les crises durent peu de temps (entre 20 et 30 s) et les souris récupèrent rapidement (2 à 5 min). En d'autres termes, les souris reprennent lentement conscience et recommencent à bouger sans aucun signe de douleur (pas de posture, de cri ou d'expression faciale de douleur). La fréquence moyenne des crises spontanées dans ce modèle de souris est de 1 crise tous les 2 jours.
Devenir
Toutes les souris prévues pour les procédures seront euthanasiées car elles ne peuvent pas être réutilisées dans une autre procédure à cause des effets possibles des molécules injectées .
Remplacement
L'utilisation d'un modèle animal in vivo mimant le phénotype clinique observé chez les patients atteints du syndrome de Dravet est cruciale pour l'objectif de notre projet qui est de tester l'efficacité de nouveaux traitements pharmacologiques sur l'ensemble des symptômes (épileptiques et non épileptiques) qui surviennent dans ce syndrome. Aucun modèle in vitro ne peut récapituler les réponses d'un organisme entier en terme de crises d'épilepsie et leurs conséquences sur le comportement.
Réduction
Nous avons minimisé le nombre d'animaux nécessaires dans chacune des procédures tout en nous assurant d'en avoir suffisamment pour faire l'analyse statistique de nos expériences (analyse de puissance a priori). Dans toutes les procédures, nous comparerons les souris mutantes avec les souris controles des mêmes portées. Dans toutes les procédures, nous utiliserons des femelles et des mâles issus des mêmes portées.
Raffinement
Nous prendrons toutes les mesures d'affinement appropriées pour éviter toute souffrance ou inconfort pour l'animal (anesthésie pendant les procédures et analgésie post procédure si nécessaire). Une grille de score permettra le suivi et la mise en place d'actions correctives en cas d'anomalie et les points limites. Ainsi, toutes les souris seront élevées dans un environnement enrichi (social et physique) et nous manipulerons les animaux régulièrement pour réduire leur stress. L'induction des crises spar hyperthermie e fera une fois que les animaux se seront habitués à l'équipement et ils seront refroidis à la fin de l'expérience. Enfin, les souris mutantes ayant des crises tonico-cloniques spontanées, nous porterons une attention particulière aux critères de poids, de stress et d'hyper-réactivité comme le suggèrent les NC3Rs pour les modèles d'épilepsie avec crises spontanées.
Choix des espèces
Le modèle de souris portant une mutation humaine est très informatif car 1) les animaux présentent des symptômes quasiment identiques à ceux des humains et dans la même gamme d'âge, nous utiliserons les animaux à l'âge de développement de l'épilepsie et d'apparition des symptômes (entre 21 et 30 jours), 2) les animaux issus de la même portée mais sans la mutation sont d'excellents controles. La souris est une espèce très intéressante pour les expériences de comportement car ce sont des mammifères qui ont des capacités d'apprentissage, et pour l'observation des crises d'épilepsie car elles sont courtes et indolores comme chez les humains.
Caractérisation du rôle de ALPK1 et du microbiote intestinal dans le traitement des dérèglements métaboliques et des maladies inflammatoires chroniques intestinales dans des modèles murins de prédiabète ou de colites induites.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des gavages quotidiens pendant deux à treize semaines, des prélèvements de sang à la queue et une colite déclenchée par un agent chimique, qui provoque perte de poids et lésions du côlon, pour tester des bactéries censées protéger contre le diabète et l'inflammation intestinale. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne simule le système digestif et son microbiote, et conclut que le recours aux souris est "nécessaire". Les bénéfices annoncés, de nouveaux traitements des maladies inflammatoires de l'intestin, restent à l'état d'objectif.
Objectifs
Le tube digestif est un milieu complexe dans lequel coexistent des cellules de l’hôte, une grande diversité de microorganismes et des antigènes alimentaires. Les bactéries y jouent un rôle crucial pour le développement et le maintien d’un système immunitaire sain. Un déséquilibre du microbiote a été montré chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI) ou de maladie métabolique comme l’obésité ou le diabète. Les MICI sont des maladies très invalidantes dont l’incidence est particulièrement importante dans les pays industrialisés. Ces dernières années la prévalence du diabète a été multipliée par quatre et les dépenses de santé liées au diabète dépassent les 850 trillions de dollars au niveau mondial. Il est donc essentiel de poursuivre les recherches qui pourront permettre le développement de nouveaux traitements. Notre travail vise à mieux comprendre les interactions entre l’hôte et les bactéries intestinales et leurs rôles dans ces maladies. Nos travaux montrent l’impact de certaines souches bactériennes sur une voie de l’immunité innée associée à l’obésité. Nous émettons l’hypothèse que l’activation de cette voie par des bactéries intestinales pourrait impacter la santé, notamment la mise en place du diabète et le développement des MICI. L’objectif de notre projet est donc d’explorer les propriétés protectrices de souches bactériennes qui activent cette voie immunitaire sur: i) l’intolérance au glucose et l’insulino-résistance dans un modèle in vivo de prédiabète induit par un régime riche en graisse, ii) l’inflammation intestinale dans un modèle de colite induite et dans ce même modèle de colite induite après un régime riche en graisse. Ces expérimentations seront réalisées à chaque fois sur deux lignées de souris : des souris transgéniques chez lesquelles la voie imunitaire étudiée a été inactivée (et des souris ne présentant aucune mutation qui seront utilisées comme contrôles. Sur 5 ans, nous testerons 6 bactéries sur des souris contrôle et modifiées pour la voie immunitaire d’intérêt, recevant un régime riche en graisses ou/et soumises à une colite.
Bénéfices attendus
Notre travail vise à mieux comprendre les interactions entre l’hôte et les bactéries intestinales et leurs rôles dans le développement de maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI) ou de maladie métabolique comme l’obésité ou le diabète. Il est essentiel de poursuivre les recherches qui pourront permettre le développement de nouveaux traitements.
Procédures
Pour mesurer la glycémie des 360 animaux, 6 goutes maximum de sang seront prélevées sur une durée de quelques secondes. Un prélèvement de sang sera effectué une seule fois au moment de la mise à mort sur une durée de 10 à 15 secondes. L’intégralité des animaux est soumise à ce prélèvement. La récolte de fèces sera réalisée lors de l’émission naturelle de fèces par la souris (avant traitement puis en fin de procédure) pour une durée de quelques minutes. L’intégralité des animaux est soumise à ce prélèvement. Les gavages, effectués quotidiennement sur une période de 2 à 13 semaines, nécessitent une contention pendant moins de 10 secondes et seront également réalisés sur l’ensemble des animaux.
Impact sur les animaux
Lors des gavages aucune nuisance n’est attendue hormis le stress dû à la contention (10 secondes maximum). Les animaux soumis aux tests glycémiques subirons un stress léger de très courte durée lors de l’incision au bout de la queue pour les prélèvements de sang (1 seconde). Le prélèvement de sang final sera réalisé juste avant la mise à mort en causant un stress modéré sur 10 à 20 secondes. Les effets indésirables dû à l’agent inducteur des la colite sont perte de poids, lésions coliques.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de realiser les prelevements d'organes et de tissus necessaires.
Remplacement
Il n’existe aujourd’hui pas de modèle ou de technique in vitro permettant de simuler un système digestif en lien avec le microbiote, l’inflammation intestinale, et la réponse immunitaire. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données sur les bactéries du microbiote intestinal, la composition en lien avec les données biologiques obtenues à partir du sang et des tissus intestinaux de l’hôte
Réduction
Le nombre d’animaux prévu permet d’effectuer des tests statistiques (10 animaux par lot) sans nécessitée de répétition ultérieure de l’expérience.
Raffinement
Les volumes de gavage seront adaptés aux poids des animaux et celui-ci sera pratiqué par des expérimentateurs entrainés à la contention et au gavage. Les animaux seront habitués à être manipulés tous les jours durant la phase d’adaptation afin de diminuer leur stress lors des prélèvements. Toutes les souris auront dans chaque cage un enrichissement de milieu par l’ajout d’un abri obscur en polycarbonate. Les souris seront 5 par cage pour éviter l’isolement. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. Cela nous permettra d’intervenir rapidement et de façon appropriée si un problème survenait. Les équipements utilisés sont adaptés à la physiologie du petit animal telle que l’utilisation de lecteur de glycémie performant (rapide et nécessitant un volume de sang faible). Enfin, des points limites adaptés sont définis afin de réduire au maximum la douleur.
Choix des espèces
Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques induites par des régimes riches en énergie ainsi que sur les maladies inflammatoires chroniques intestinales en raison de ses réponses reproductibles permettant une reproductibilité des résultats. De plus ce modèle nous permet d’appréhender la réponse immunitaire dans son ensemble et plus particulièrement la réponse de la voie d’intérêt. Des données publiées par un groupe britannique a montré l’importance du gène impliqué dans la voie immunitaire étudiée dans ce projet dans l’équilibre intestinal en utilisant ce modèle, justifiant de l’utilisation de ces mêmes souris pour nos expériences. Nous avons choisi de travailler sur des animaux en fin de croissance de 8-10 semaines d’âge afin de travailler sur des animaux adultes ayant un microbiote stabilisé.
Étude de l’homéostasie et fonctionnement de cellules immunitaire et de leurs rôles dans la réponse immunitaire contre des tumeurs solides
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 234 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 252 dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil et 982 impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur par chirurgie abdominale, puis des séances d'imagerie qui les maintiennent endormies deux à quatre heures, pour étudier le rôle de cellules immunitaires dans les cancers solides de l'intestin. Le porteur affirme que les souris rencontrent "peu d'effets indésirables" liés à la tumeur, et que, faute de lignées cellulaires d'ILC, le recours au "modèle murin" est "essentiel". Les retombées cliniques annoncées, de nouvelles approches contre le cancer, sont renvoyées au conditionnel.
Objectifs
Ce projet propose de s’appuyer sur l’imagerie d’animaux entiers afin (1) d’analyser l’organisation de la réponse immunitaire anti-tumorale et (2) d’identifier le mode d'action des cellules lymphoïdes innées (ILCs). Nous souhaitons identifier le rôle de chacune des populations cellulaires retrouvées au sein d'une tumeur afin d'évaluer leur contribution directe ou indirecte dans la réponse immunitaire. Nous nous intéresserons particulièrement aux réponses immunitaires impliquées dans les cancers « solides » qui représentent la majorité des cancers, et plus particulièrement ceux touchant l’intestin. Ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur l’utilisation des ILCs dans les cancers primaires de l’intestin pour ainsi contribuer, au long terme à améliorer de la prise en charge et/ou le diagnostic des patients en clinique.
Bénéfices attendus
Nous proposons ici de caractériser au niveau moléculaire et cellulaire le mécanisme de surveillance immunitaire des cellules lymphoïdes innées dans un modèle tumoral et suite à un défi inflammatoire. Ainsi, nous obtiendrons une compréhension intégrée du système immunitaire dans des conditions normales et pathologiques. Ainsi, la compréhension du mécanisme qui régule les premières phases de l'immunité innée contre la progression tumorale pourrait conduire à de nouvelles approches thérapeutiques pour prévenir ou améliorer l'espérance de vie après la tumorigenèse.
Procédures
La greffe tumorale consistera à une intervention chirurgicale de 15 minutes et les animaux seront sous surveillance quotidienne. Certains animaux subiront une intervention chirurgicale de 30 minutes pour effectuer l’imagerie et seront maintenus endormis pendant 2 à 4h.
Impact sur les animaux
Notre connaissance suggère que les souris rencontrent peu d’effets indésirables causés par la pousse tumorale. La localisation de la tumeur ne semble pas impacter leur mobilité, leur alimentation, leur pelage et leur comportement. L’injection de molécules que nous proposons d’étudier dans ce projet aura peu d’effets indésirables ou à court terme (24-72h).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront reçu initialement des cellules tumorales ou une chirurgie viscérale non opérable.
Remplacement
La validation de facteur des cellules lymphoïdes innées (ILCs) seront faites au préalable in vitro à l’aide des lignées cellulaires tumorales pour remplacer les animaux. Ces expériences pourront être effectuées dans des cultures cellulaires et nous permettront de déterminer des doses ou la cinétique sur laquelle nous souhaiterions étudier le mode d’action de ces potentiels molécules. Ces travaux nous permettront de réduire le nombre d’animaux que nous utiliserons par la suite pour identifier leur mode d’action. Néanmoins, les lignées cellulaires d’ILC humaines ou murines n’existant pas, les tests in vitro ne pourront pour le moment pas être réalisés. De plus, les modèles in vitro actuels ne permettent pas de récapituler la complexité des réponses immunitaires ayant lieues in vivo. De ce fait, nous avons recours aux animaux afin de décortiquer le mécanisme d’action des ILCs.
Réduction
D'après notre expertise issue des projets précédents et notre collaboration avec des statisticiens, nous avons déterminé́ le nombre d'animaux par groupe qui nous permettront d'utiliser les tests statistiques robustes. La nombre de souris nécessaire à l’expérimentation a été déterminée en tenant compte d’une réduction maximale du nombre d’individus tout en garantissant une significativité statistique des résultats. Les résultats seront analysés par des tests statistiques adaptés. Les animaux ne pourront pas être réutilisés car ils seront porteurs de tumeur(s). L'utilisation de l'imagerie sur l'animal vivant nous permet de réduire le nombre d'animaux utilisé car l'observation en temps réel permet d'acquérir plusieurs données à partir d’un un même animal, en observant les cellules immunitaires avant traitement, puis dans les heures qui suivent l'administration des traitements. Dans la mesure du possible, les expériences utilisant différentes techniques ex vivo seront effectuées sur les même animaux afin de limiter leur utilisation.
Raffinement
Pour épargner toute douleur, les animaux seront suivis quotidiennement fréquemment et des points limites (poil ébouriffé́, prostration, diarrhée) sont établis pour raffiner les procédures et soulager les animaux à l’aide d’analgésique ou de les mettre à mort si la souffrance persiste. Dans le cadre de la tumorigenèse intestinale, la tumeur ne pourra pas être mesurée au cours de l’expérimentation mais le volume tumoral sera mesuré après la mise à mort afin de contrôler la pousse tumorale. Le nombre de cellules tumorales injectées est volontairement faible afin de prévenir une pousse tumorale trop importante. L’injection se faisant dans la partie externe de l’intestin, l’animal qui n’aura aucune difficulté à bouger ou à s’alimenter. Concernant l’intervention chirurgicale pour la greffe de tumeur, l’animal sera administré en amont de l’opération avec une dose d’antalgique afin de minimiser la douleur et sera anesthésié sur plaque thermo contrôlée pour limiter la perte de chaleur corporelle. La cage sera supplémentée avec du gel hydrique et la litière pourra être remplacée par une litière en cellulose en post-chirurgie.
Choix des espèces
Le développement lymphocytaire et les réactions immunitaires sont des processus complexes. De façon générale, l’immunité nécessite plusieurs types de lymphocytes participants chacun dans une ou plusieurs interaction(s) directe(s) ou indirecte(s) avec un ordre spatio-temporel. De ce fait, les systèmes de culture in vitro actuels ne permettent pas de modéliser cet environnement complexe. De plus, il n’existe, pour le moment, aucune lignée cellulaire murine ou humaine de cellules lymphoïdes étudiées. Par conséquent, l’étude de ces processus nécessite pour l’instant l’utilisation d’animaux vivants. Cependant, la compréhension du mécanisme de développement cellulaire faite in vivo, nous permettra probablement d’établir de nouveaux modèles in vitro utilisant des lignées cellulaires afin de réduire la contribution animale. Par conséquent, le modèle murin est essentiel dans notre domaine de recherche. Tous les animaux utilisés dans ce projet de recherche seront adultes (>6 semaines). Notre étude s’effectue sur un système immunitaire adulte afin de se rapprocher au mieux de la clinique et des patients porteurs de ces cancers.
Effets à long terme d’une exposition à la nicotine pendant l’adolescence sur la prise de décision chez les souris adultes
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
1 216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des chirurgies du crâne pour implanter des électrodes de stimulation et des fibres optiques et injecter des virus dans le cerveau, avant deux mois de tâches de prise de décision et un enregistrement neuronal terminal sous anesthésie. Le porteur signale des douleurs possibles liées aux craniotomies, des infections des sutures et des bagarres entre souris pouvant les blesser. Il justifie le recours à la souris par le fait que l'étude ne serait "réalisable que sur des animaux", et rattache les retombées, de futures pistes de traitement de l'addiction à la nicotine, au long terme.
Objectifs
L’exposition à la nicotine pendant le développement peut augmenter la vulnérabilité à l’addiction, vu que plus de 90 % des fumeurs adultes ont commencé à fumer pendant leur adolescence. Cependant, la manière dont la nicotine produit cette vulnérabilité reste peu connue, limitant ainsi notamment nos pistes d’intervention et de traitements visant à réduire l’usage de la nicotine. L'adolescence est une période où le cerveau est supposé subir une poussée de plasticité qui sous-tend en particulier l'émergence des aspects cognitifs, émotionnels et motivationnels des comportements chez l’adulte, qui sont tous liés à l'activité des neurones dopaminergiques (DA) de l’aire tegmentale ventrale (ATV). L'apprentissage par renforcement et la flexibilité comportementale sont des domaines comportementaux-clés, qui ont été largement associés aux changements d'activité des neurones DA. La flexibilité comportementale fait référence à la capacité d'abandonner des activités précédemment gratifiantes pour explorer de nouvelles stratégies lorsque les conditions environnementales changent. L'exploration est un processus adaptatif important qui permet de découvrir des alternatives plus avantageuses. En particulier, l'exploration peut être orientée vers des options incertaines, puisque la réduction de l'incertitude a une valeur informative. La flexibilité comportementale est donc un comportement-clé dans le cadre de la vulnérabilité à l’addiction, qui peut être changée par l’exposition à la nicotine pendant l'adolescence. D’un point de vue fondamental, ces travaux visent donc à améliorer notre compréhension des effets de la nicotine sur le développement du système dopaminergique pendant l’adolescence, et les effets à long terme d’une exposition à la nicotine pendant cette période sur la prise de décision chez les adultes. De manière importante, si l’exposition à la nicotine pendant l’adolescence produit des changements dans la prise de décision quand ces souris atteignent l’âge adulte, nos résultats nous permettront aussi d’envisager de développer des interventions visant à réduire la vulnérabilité à l’addiction à la nicotine.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en lumière les voies neuronales spécifiques de la vulnérabilité individuelle face aux substances addictives et de comprendre comment celles-ci sont impactées par l’usage de nicotine pendant l’adolescence. De nombreuses pathologies sont associées à un déficit d'adaptabilité, et elles sont liées à la prise de la nicotine pendant l’adolescence, qui – bien qu’étant un enjeu de santé majeur en France- se généralise avec l’introduction des « e-cigarettes ». Une meilleure compréhension de ces mécanismes, notamment à un niveau comportemental et physiologique permettra d'appréhender efficacement les cibles cellulaires en vue de traitements futurs face à cet enjeu sociétal majeur.
Procédures
Une biopsie d’oreille et/ou de queue va être réalisée sur les souris transgéniques. Les souris subiront des procédures chirurgicales en vue d'implantater d'électrodes de stimulation electriques, mais aussi d'injecter des adenovirus-associés (AAV) permettant l'expression de gènes spécifiquement dans le cerveau, et de fibres optiques afin d'enregistrer l'activité neuronales. Tous les chirurgies durent environ 1h chacune. Les chirurgies d'injection d'AAV et d'implantation sont séparées car l'expression d'un AAV au sein du cerveau est d'environ 3-4 semaines. Ainsi, afin d'éviter d'abimer les électrodes et les fibres implantées, celles-ci seront implantées 2-3 semaines plus tard, augmentant grandement les chances d'avoir des résultats exploitables à l'enregistrement. Le comportement des animaux sera évalué durant 2 mois environ, et à la fin les animaux seront anesthésiés et un enregistrement unitaire de neurones sera effectué. A la fin de l'enregistrement, la souris sera euthanasiée sans être réveillée.
Impact sur les animaux
Les souris transgéniques pourront connaître un inconfort transitoire lors du prélèvement rapide des biopsies. Les souris qui subiront des neurochirurgies peuvent éventuellement avoir des douleurs associées aux craniotomies effectuées sur l'os mais aussi au niveau des sutures. Des infections au niveau des sutures peuvent également survenir. Des bagarres entre souris blessant superficiellement ou gravement certaines souris peuvent aussi survenir. Il peut également y avoir des effets indésirables liés à la stimulation électrique ou optogénétique, pouvant troubler l'activité locomotrice des animaux.
Devenir
A l'issue des procédures, tous les animaux seront euthanasiés. - Soit directement à la fin de la procédure en tant qu'étude électrophysiologique – Soit si des points limites sont atteints, - Soit que pour extraire le cerveau de l'animal pour l'étudier. En effet, nous prélevons systématiquement le cerveau de tous les animaux testés afin de confirmer la bonne expression des virus injectés dans le cerveau et l'emplacement des électrodes/fibres implantées. Cette confirmation est indispensable comme contrôle pour prouver que l'enregistrement ou la manipulation de l'activité neuronale est bien liée à la zone cérébrale étudiée. Donc on étudie les cerveaux de tous les animaux utilisés dans ces expériences après leur mort.
Remplacement
Notre projet vise à étudier la complexité́ du comportement de la souris. Le découplage et la corrélation entre comportement et neurophysiologie est aussi une composante majeure de ce projet. Cette étude n’est donc réalisable que sur des animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux, pour ce projet, est déterminé sur la base d'une littérature vaste et robuste dans des domaines similaires ainsi que les tests de puissance statistique. Afin de réduire l'utilisation de souris au minimum, nous nous imposerons un cahier des charges strict. Pour ce faire, les procédures ont été pensées pour qu'une même souris puisse passer dans un nombre maximum d'expériences afin de réduire l'utilisation de nouveaux animaux pour chaque expérimentation. Vu que notre projet porte sur les variations inter-individuelles en identifiant les stratégies idiosyncratiques/personnalisées de souris, un nombre minimum de 50 animaux par groupe pour les expériences comportementales est nécessaire pour atteindre la puissance statistique pour pouvoir comparer ces variabilités. Pour les expériences ne concernant que l’électrophysiologie, notamment en procédure 5, on peut réduire le nombre de souris nécessaires vu que l’analyse est faite par groupe et pas par individu. Pour ces expériences, le nombre de souris nécessaire pour une puissance statistique est 20.
Raffinement
Les animaux seront habitués aux taches comportementales progressivement pendant la première semaine de conditionnement. Pour faciliter l’habituation des animaux aux manipulations et aux environnements de test, les animaux seront toujours tenus en « berceau » c’est-à-dire sortis de leur cage en glissant les mains ouvertes sous la souris pour la transporter entre les environnements sur les mains ouvertes. Toutes manipulations par la queue de la souris seront évitées. Pour la gestion de la douleur, les souris vont être examinées par le même expérimentateur chaque jour, dès le jour de leur chirurgie. Des points limites adaptés aux procédures ont été définis entrainant une réponse appropriée. Cependant, des bagarres entre animaux peuvent aussi arriver, blessant superficiellement ou gravement certaines souris. Si l'étendue des blessures n'est pas trop grave, des soins seront apportés aux souris blessées (en fonction de la grille d’évaluation) et celles-ci seront isolées le temps de la récupération. Une fois le regroupement effectué, les souris seront surveillées pendant quelques heures pour observer tout comportement agressif envers l'animal préalablement blessé. Si certains effets indésirables liés à la stimulation électrique ou optogénétique sont constatés, la stimulation sera immédiatement arrêtée et l'animal laissé au repos. Les critères d'arrêt surtout pour les phases post-opératoires concernent des signes de douleurs accrues constatés.
Choix des espèces
La souris a été choisie car le système dopaminergique mésocorticolimbique est bien conservé chez l'ensemble des mammifères et en particulier chez les rongeurs par rapport à l'Homme, anatomiquement et fonctionnellement. En addition, il y a une période adolescente bien marquée chez la souris, ce qui n'est pas le cas chez les espèces comme les invertébrés, les poissons ou encore les oiseaux. Ces deux points indiquent que les souris sont l’espèce idéale pour ce projet. De plus, la génétique de la souris offre des outils de modulations des réseaux neuronaux, difficilement accessibles chez d'autres modèles. Ces outils génétiques sont des moyens de moduler les réseaux neuronaux (par exemple l'utilisation d'organismes génétiquement modifiés permet l’invalidation d'un gène, sa réexpression ciblée en utilisant l’optogénétique) difficilement accessibles même chez d'autres mammifères, tels que le rat ou le singe. Les souris sont considérées juvéniles lorsqu'elles sont à moins de 21 jours après la naissance, l'adolescence commence quand les souris sont naturellement sevrées environ 21 jours après la naissance. L'âge adulte est atteint quand les souris complètent leur maturation sexuelle et hormonale à environ 60 jours après la naissance. Des animaux âgés de 3 semaines sont utilisés pour les pré-traitements nicotiniques et les expériences, mais toutes les étapes de chirurgie, conditionnement comportemental, et neurophysiologie/euthanasie ne sont réalisées qu’une fois atteint l'âge adulte.
Etude de la biologie des tumeurs pédiatriques et développement de nouvelles approches thérapeutiques.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une greffe de fragments de tumeurs d'enfants ou une injection de cellules tumorales, puis des injections répétées et des prélèvements sanguins, pour étudier le sarcome d'Ewing et tester des traitements. Le porteur décrit des greffes et injections jugées peu gênantes et des prélèvements sanguins brièvement douloureux. Sur le remplacement, il affirme que ces modèles reproduisant l'écosystème tumoral sont les seuls proches des tumeurs de patients et restent nécessaires avant les essais chez l'humain.
Objectifs
Les tumeurs pédiatriques sont rares, puisqu’en France, un enfant sur 440 va développer un cancer avant l’âge de 15 ans, mais elles représentent 28 % de la mortalité enfantine ce qui en fait la 2e cause de décès chez les 1-14 ans après les accidents. Le sarcome d’Ewing est la seconde tumeur osseuse maligne pédiatrique la plus fréquente après l’ostéosarcome et touche environ 80 à 100 nouveaux patients par an en France. Malheureusement, 20 % des patients présentent des métastases au diagnostic ce qui diminue drastiquement leur chance de survie. Génétiquement, le sarcome d’Ewing a bien été caractérisé et est lié à une fusion entre deux gènes, aboutissant à l’expression d’une protéine anormale. Cependant, les mécanismes d’action de cette protéine dans la transformation tumorale doivent encore être élucidés. Afin de comprendre cette transformation tumorale et identifier les meilleures pistes thérapeutiques pour ces patients, l’utilisation des modèles animaux est primordiale pour nos projets. Nous utilisons des modèles de PDX (patient derived xenograft) qui sont générés après une greffe chez la souris d’un fragment de tumeur issu de patients. A l’heure actuelle, ces modèles animaux n’ont pas d’équivalence qui leur permettrait d’être remplacés par des approches alternatives de type in vivo puisqu’ils sont les seuls qui se rapprochent le plus de la tumeur de patients. . L’objectif du projet est d’identifier les mécanismes qui sont impliqués dans la transformation tumorale et de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont : - la génération de nouveaux modèles d’étude de cancers pédiatriques (PDXs ainsi que de nouvelles lignées cellulaires dérivées de PDX) qui sont limitants aujourd’hui. En effet, les modèles de PDX nous permettent d’obtenir du matériel tumoral suffisant pour réaliser nos études puisque nous ne pouvons pas les effectuer sur les tumeurs de patient, vu la quantité de matériel obtenue et la rareté des échantillons. De plus, les modèles PDX sont les seuls modèles qui se rapprochent le plus aux tumeurs de patient. - Etudier la structure 3D de la chromatine sur ces échantillons de PDX pourra générer un maximum de données qui seront primordiales à la compréhension de la biologie des tumeurs d’Ewing et des Ewing-Like. Ces résultats et analyses vont nous permettre de répondre à nos questions biologiques et par la suite, ces données pourront être utilisées par toute la communauté scientifique afin de répondre à leur propre hypothèse. - La validation des nouvelles molécules identifiées sur des modèles de PDX. En effet, les découvertes qui seront réalisées grâce à ces nouvelles technologies et grâce au criblage in vitro, vont nous permettre l'identification de nouvelles molécules. Il sera donc important de valider ces dernières in vitro sur des cellules dérivées de PDX et in vivo sur des modèles de xénogreffe/PDX avant de passer aux tests cliniques chez l’homme.
Procédures
Une partie des souris de ce projet sera opérée sous anesthésie (1 fois) pour recevoir un fragment tumoral en sous-cutanée au niveau du dos (durée de l’anesthésie : 15 min). Certains de ces animaux seront ensuite traités à raison de 3 injections par jour (injections des traitements en sous-cutanée sur animaux vigiles) ou de 2 fois par jour pour les traitements administrés par voie orale (durée de chaque geste inférieure à 10 sec). La durée du traitement variera en fonction de la molécule administrée et sera en accord avec la littérature. Des prélèvements de sang seront réalisés sur les animaux vigiles à raison d’une fois par semaine. (durée du geste inférieure à 30 sec) Une autre partie des souris sera injectée avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée aux animaux anesthésiés (1 fois – durée de l’anesthésie inférieure à 1 min). Certains de ces animaux seront ensuite traités à raison de 3 injections par jour (injections des traitements en sous-cutanée sur animaux vigiles) ou de 2 fois par jour pour les traitements administrés par voie orale (durée de chaque geste inférieure à 10 sec). La durée du traitement variera en fonction de la molécule administrée et sera en accord avec la littérature. Des prélèvements de sang seront réalisés sur les animaux vigiles à raison d’une fois par semaine (durée du geste inférieure à 30 sec)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues au cours de la greffe de fragments tumoraux seront celles liées à l’incision de la peau sur des animaux anesthésiés (gène d’intensité faible et de courte durée). Suite à ces greffes, les souris développeront des tumeurs en sous cutanée au niveau du dos qui ne devraient pas induire de gêne particulière. Les nuisances attendues lors des injections de cellules tumorales seront celles à l’injection de produits non toxiques et non douloureux (gène d’intensité faible, de courte durée). Suite à ces injections, les souris développeront des tumeurs en sous cutanée au niveau du flanc qui ne devraient pas induire de gêne particulière. Les prélèvements de sang au niveau de la joue entraineront une douleur de courte durée liée à la piqûre elle-même. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection de produits non douloureux et non toxiques dans l’abdomen des souris.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
L'utilisation de modèles pré-cliniques pertinents de la maladie est nécessaire, pour étudier les mécanismes qui sont impliqués dans la transformation tumorale et de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques. En particulier, l'utilisation de la souris qui est un organisme vivant, mammifère intégré et autonome, présente de nombreuses similitudes avec l’homme. L’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques ne peut se limiter à des expériences in vitro. En effet, nous réalisons d’ores et déjà pour nos différentes études des expériences in vitro pour tester par exemple des molécules sur des lignées cellulaires. Aussi, nous réalisons en collaboration, des expériences ex-vivo en microfluidique en utilisant des cellules dérivées de PDX. La microfluidique permet de miniaturiser l’expérience afin de tester un grand nombre de molécules avec peu de cellules ce qui permet de réduire le nombre de souris à utiliser pour ces tests. Nous effectuons également des expériences sur des tumeurs de patients pour caractériser l’expression des gènes. Cependant, la rareté des échantillons humains et la faible quantité obtenue ne nous permettent pas de réaliser des expériences complémentaires sur ces échantillons. D’où l’importance d’utiliser ces - modèles murins, reproduisant au mieux la complexité de l’écosystème tumoral, incluant cellules tumorales et cellules du microenvironnement, avant d’envisager des tests chez l’Homme dans le cadre d’essais cliniques.
Réduction
Toutes les précautions seront prises pour réduire le nombre d’animaux utilisés, tout en assurant une valeur significative des résultats obtenus. Les tests préliminaires in vitro permettent de limiter le nombre de molécules à tester sur les souris. Le nombre minimum d’animaux qu’il faut utiliser pour répondre aux questions posées a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats.
Raffinement
Les souris recevront anesthésique et analgésique au moment de la greffe. En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de la cancérologie, lors des greffes ainsi que des traitements, les animaux auront une surveillance accrue afin d'assurer leur bien-être. Une observation et une notation de leur état général seront évaluées de façon objective en utilisant une grille de score. Les expérimentations sont arrêtées dès l'atteinte d'un point-limite.
Choix des espèces
La souris est un modèle pertinent pour les expériences menées en oncologie. En effet, les souches murines sont parfaitement définies (modèles génétiquement modifiés, souches immunodéprimées permettant le développement de tumeur d'origine humaine) et présentent une parenté biologique avec l’Homme (génome murin/humain, physiologie). Ceci est vrai pour la tumeur que nous étudions, à savoir le sarcome d’Ewing. Nous utilisons des modèles PDXs reproduisant la diversité des tumeurs de patients. Dans le contexte préclinique du cancer, les PDXs reconstituent l’écosystème tumoral avec ses différentes composantes, incluant cellules tumorales et autres cellules présentes de la tumeur tel qu’il existe chez les patients. Nous travaillons sur des cancers qui atteignent des individus entre l'enfance, l'adolescence et les jeunes adultes. De ce fait, nous serons amenés à utiliser des animaux âgés de 5 semaines (réception de souris âgées de 4 semaines, utilisation après une semaine d’acclimatation) à 8 semaines afin de pouvoir mimer le stade de développement de ces tumeurs pédiatriques.
Etude de souris avec déficits partiels de l’hydrolyse de l’acétylcholine
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Aucun geste expérimental ne leur est infligé, la souffrance provenant des modifications génétiques elles-mêmes, qui produisent un retard de croissance, un nanisme et des faiblesses musculaires, certaines souris ne survivant pas au sevrage. Le projet étudie deux enzymes qui dégradent un neuromédiateur, avec pour horizon les inhibiteurs médicaux et les gaz neurotoxiques. Sur le remplacement, le porteur affirme que la fatigabilité musculaire et la communication entre organes ne peuvent être reproduites en culture cellulaire.
Objectifs
L’acétylcholine est une molécule de communication locale entre neurones (neuromédiateur) mais aussi une molécule de communication à l’extérieur du système nerveux. Nous cherchons à comprendre les fonctions de deux cholinestérases qui détruisent très efficacement l’acétylcholine. Dans les jonctions neuromusculaires, ces deux enzymes sont localisées dans des domaines différents et contrôlent la fatigabilité des souris. Nous utilisons des approches génétiques sophistiquées pour établir une nouvelle voie de signalisation contrôlée par ces enzymes dans cette synapse et montrer son importance dans la fatigabilité. Au niveau de l’animal entier, ces deux cholinestérases jouent des rôles complémentaires probablement pour maintenir les réseaux de communications par l’acétylcholine relativement indépendants. Nous utilisons des approches génétiques sophistiquées pour établir que les muscles pourraient être une source d’acétylcholine qui interfère avec des fonctions physiologiques autres que la motricité.
Bénéfices attendus
Les inhibiteurs de cholinestérases sont largement utilisés (Alzheimer, myasthénie, anesthésie, syndrome du golfe) et provoquent beaucoup d’effets indésirables. Des pesticides et des armes de destruction massive (gaz neurotoxiques sarin VX novitchok) sont aussi des inhibiteurs de cholinestérases et sont extrêmement toxiques. En comprenant les fonctions respectives des deux cholinestérases dans le contrôle du niveau d’acétylcholine dans les systèmes nerveux et en dehors des systèmes nerveux, nous devrions pouvoir 1) sélectionner de nouveaux inhibiteurs pour le traitement des maladies neuromusculaires ou pour les anesthésies; 2) proposer de nouvelles prises en charge des intoxications par des pesticides ou des gaz neurotoxiques.
Procédures
Aucune. Les animaux présentent des altérations fonctionnelles d'origines génétiques.
Impact sur les animaux
Les résultats préliminaires obtenus dans notre laboratoire ainsi que sur les lignées transgéniques publiées ont montré que les nuisances pour les souris sont variables en fonction des génotypes mais concernent principalement un retard staturo-pondéral et des faiblesses musculaires. Nous anticipons qu’une partie des lignées aura un développement incomplet jusqu’à l’âge adulte. Ces phénotypes ont été observés avec des souris sans la protéine AChE ou souris sans les protéines AChE et BChE. Les souriceaux de ces lignées seront étudiés dans la période périnatale (P0-P1) et en fin de développement embryonnaire. Certaines souris ne survivent pas après le sevrage et seront étudiés à P13-P15. L’autre partie de lignées développées pourront développer des atteintes du fonctionnement de la communication neuromusculaire mais peuvent se développer jusqu’à l’âge adulte. Elles sont actives, se nourrissent dans la mangeoire. La respiration basale s’est adaptée et les souris vivent plus d’un an. Ces souris présentent une fatigabilité notable, une faiblesse musculaire qui ne permet pas à la souris de rester accrocher à une barre. Elles sont plus petites à partir de 7-8 jours de développement post-natal et ce nanisme persiste à l’état adulte. Les mécanismes impliqués sont probablement nombreux (thermorégulation, métabolisme, digestion, circulation).
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort afin de procéder à des analyses histologiques
Remplacement
Objectif 1 La fatigabilité est une notion qu’il est difficile d’explorer ex-vivo car les stimulations nerveuses utilisées ex-vivo pour contracter un muscle ne reproduisent pas le profil d’activations utilisé dans la réalisation de ses mouvements. La fatigabilité n’est pas simplement liée à la force maximale développée par un muscle. Objectif 2 Le retard de croissance dans les différents mutants de souris résulte probablement d’une communication entre organes, l’ACh qui s’échappe des muscles, interfère avec des communications médiées par l’ACh entre les cellules variées dans d’autres organes. Cette communication ne peut pas être reproduite en culture cellulaire ou organoïde. La modélisation est impossible en absence de connaissance 1) du niveau de la fuite potentielle d’ACh à partir des muscles (hypothèse), 2) des cibles possibles : cardiorespiratoires, vasculaire, digestives, inflammatoires ; 3) des conséquences sur le métabolisme ; de la dynamique de l’ACh dans le milieu intérieur.
Réduction
Les études sur l’ACh sont conduites jusqu’à présent en utilisant des inhibiteurs des cholinestérases, ces approches nécessitent l’utilisation de différentes doses d’inhibiteurs et donc de nombreuses cohortes d’animaux. Les interprétations sont difficiles car les inhibiteurs peuvent avoir d’autres cibles que les enzymes visées. Nous développons ici des approches génétiques pour utiliser moins d’animaux. Pour l’objectif 1, chaque souris est son propre contrôle. Le suivi longitudinal des souris dans leur cage d’élevage limite le nombre d’animaux. Pour l’objectif 2, une approche systématique permettait de produire 48 génotypes, nous proposons de produire une moitié de ces génotypes (24), et les avons soigneusement choisis afin qu’ils soient pleinement exploités pour valider notre hypothèse.
Raffinement
Pour étudier spécifiquement les questions liées aux conséquences de l’ACh endogène, nous avons développé des approches génétiques sophistiquées, mutations ponctuelles dans une sélection de gène qui abolissent la fonction hydrolyse d’ACh et pas d’autres propriétés du gène AChE, délétion de courte séquence dans le génome pour limiter les modifications chromosomiques. Nous avons aussi sélectionné des lignées parmi toutes les combinaisons alléliques possibles, pour lesquelles le retard de croissance devrait être visible de façon précoce et touchera tous les animaux nés. Nous utilisons des conditions propices à l’élevage des souris. Les croisements sont conduits avec un mâle et une femelle en élevage continu.
Choix des espèces
La souris est un mammifère qui permet d’aborder la dynamique de l’ACh dans l’organisme, 1) L’ACh est le neuromédiateur des muscles chez la souris comme chez l’homme (une source majeure d’ACh); 2) il est possible de créer des modèles génétiques afin de modifier précisément la fonction, la production ou la localisation des enzymes de dégradation de l’ACh. Objectif 1 Souris adultes âgées de 2 à 9 mois. Objectif 2 Jeunes à P0et à P13.
Injection de vésicules liposomales dans le traitement des lymphomes et des leucémies sur des modèles murins
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
322 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de lymphome ou de leucémie puis des injections de vésicules liposomales, pour tester un candidat traitement contre ces cancers du sang. Le porteur indique que les animaux peuvent présenter fatigue, pâleur, difficultés à s'alimenter et signes d'aplasie de la moelle. Sur le remplacement, il affirme avoir déjà validé les composés in vitro et conclut qu'à ce stade préclinique le recours aux méthodes sans animaux "n'est plus possible".
Objectifs
Les Lymphomes et les leucémies sont des cancers des cellules du tissu hématopoïétique caractérisé par un blocage de maturation et une prolifération excessive des cellules cancéreuses. Près de la moitié des cancers du sang sont des lymphomes. Ce sont des cancers du système lymphatique, avec environ 80 % de lymphomes non hodgkinien (LNH) et 20% de lymphomes hodgkiniens (LH). Les lymphomes se caractérisent par la prolifération excessive des lymphocytes (B, le plus souvent, ou T) au niveau des ganglions, du foie, de la rate et plus rarement d'autres organes. Ils provoquent une augmentation de leur taille. La Leucémie Aiguë Lymphoblastique (LAL) concerne les cellules de la lignée issue du progéniteur lymphoïde. Elle représente environ 1,5 nouveau cas pour 100.000 habitants par an, soit environ 1000 nouveaux cas par an en France. Elle se déclare en majorité chez l’enfant de 2 à 5 ans, 75% des malades ont moins de 18 ans, et représente 30% des cancers de l’enfant. La LAL est une maladie hétérogène qui touche les précurseurs des lymphocytes T ou B dans respectivement 25% et 75% des cas. Malgré les améliorations des traitements actuels chez l’homme, les taux de rechute restent élevés. Ainsi, pour réduire l’intensité de la chimiothérapie et traiter avec succès les patients en rechute, il est encore nécessaire de développer de nouvelles thérapies. Nous avons identifié de nouveaux candidats thérapeutiques (immunoliposomes et liposomes biologiques) susceptibles d’être utilisés dans le traitement de ces pathologies. Nous les avons validés dans un premier temps par des méthodes alternatives, à l’aide d’outils in vitro. Nous souhaitons maintenant étudier leurs efficacités dans cette étude préclinique in vivo. Pour cela, nous allons utiliser des modèles murins incluant des xénogreffes de cellules humaines (lignées cellulaires humaines déjà établies) dans des souris immunodéficientes, ou des greffes de cellules leucémiques humaines et lymphomateuses murines (lignées cellulaires murines déjà établies) dans des souris. Lors de cette étude préclinique, les souris seront traitées avec les immunoliposomes afin d’étudier leurs effets sur l’activation de l’immunité antitumorale et le ralentissement de la croissance tumorale.
Bénéfices attendus
En effectuant des expérimentations in vitro sur nos modèles de leucémie et de lymphomes, nous avons identifié de nouveaux composés (Immunoliposomes artificiels) qui bloquent la prolifération des cellules cancéreuses. Après avoir validé in vitro leurs actions, nous souhaitons maintenant tester leurs efficacités sur nos modèles murins in vivo lors d’études précliniques. Le bénéfice attendu du projet concerne la découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques moins intenses et susceptibles d’être utilisées dans le traitement des leucémies et des lymphomes et leurs rechutes.
Procédures
Pour les lymphomes, les animaux seront soumis à des implantations de cellules lymphomateuses par des injections sous cutanées (s.c.) sur leur flanc sous anesthésie générale. Une seule injection est prévue par souris, (durée de 30 secondes). Après la greffe, des injections par voie intra-veineuses (i.v.) d’immunoliposomes (2 injections par souris sont prévues, à J6 et J9, durée par injection de 5 secondes sur souris vigile). Un prélèvement de sang à partir de la veine de la queue (un seul prélèvement par souris, 1 à 2 gouttes soit au maximum durée de 1 minute) sera réalisé Pour les leucémies, les animaux seront soumis à des transplantations de cellules leucémiques par des injections intraveineuses (i.v.) (une seule injection d’une suspension tumorale est prévue par souris, durée totale de 5 secondes sur souris vigile). Après la transplantation, des injections par voie intraveineuses (i.v.) d’immunoliposomes (3 injections par souris sont prévues, à J15, J20, J25 , durée par injection de 5 secondes sur souris vigile). Un prélèvement de sang à partir de la veine de la queue (un seul prélèvement par souris, 1 à 2 gouttes, durée de 1 minute) sera réalisé à J35 jours après la transplantation.
Impact sur les animaux
. Dans moins de 1% des cas, une nécrose de la tumeur peut être observée. les souris peuvent présenter un état de fatigue et une couleur pâle de la peau au niveau des oreilles et aux extrémités des pattes avants et arrières. , elles pourront avoir des difficultés pour s’alimenter , montrer des signes d’aplasie médullaire, Les injections peuvent provoquer un stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort après la procédure.
Remplacement
Pour remplacer des modèles animaux, il est parfois possible de travailler sur des cellules ou des tissus (in vitro). Le recours aux modèles in vitro doit être l’objectif du chercheur si son expérimentation le permet. Les immunoliposomes et les liposomes biologiques que nous allons tester dans ce projet préclinique ont d’ores et déjà été testés in vitro par des méthodes alternatives, sur des lignées cellulaires. Ceci nous permet d’être sûr que les composés qui vont être étudiés in vivo sont fonctionnels sur les cellules cancéreuses. Il nous faut maintenant valider sur des études précliniques in vivo l’efficacité de ces molécules et le remplacement par des méthodes alternatives n’est plus possible à ce stade du projet de recherche.
Réduction
Dans ce projet, nous allons diminuer le nombre d’animaux utilisés à des fins de recherche. S’il est essentiel d’utiliser le plus petit nombre d’animaux possible, il faut néanmoins éviter que cet effort de réduction nuise à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a alors été intégrée à la construction de ce projet. Pour les tests, nous utiliserons des groupes de de 7 souris afin d’effectuer des tests du Logrank, pour les tests sur la viabilité cellulaire, nous utiliserons des groupes de 5 souris afin de réaliser des tests de Student (t test ou ANOVA).
Raffinement
Afin de réduire, supprimer ou soulager la douleur ou la détresse des animaux, et ainsi améliorer leur bien-être, en amont des expériences, nous allons planifier les protocoles nous allons aussi planifier et établir les points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure. Afin de limiter le stress des animaux, ils sont placés par groupe de 5 à 10 dans des cages agrémentées d’éléments en carton ou en plastique leur permettant de se regrouper dans un nid. La litière des cages est changée une fois par semaine et les animaliers veillent quotidiennement à ce que les animaux ne manquent ni d’eau, ni de nourriture. Afin qu’une prise en charge des animaux puisse se faire le plus rapidement possible, nous communiquerons les points limites au personnel de l’animalerie. Après le prélèvement de sang et les injections, nous donnons des soins adéquats, la queue de la souris en légèrement pincée pendant 30 secondes pour éviter tout saignement. Les souris pour lesquelles nous avons prélevé le sang ou injecté sont placées dans une nouvelle cage et dans une litière propre. Une surveillance des animaux sera également réalisée par les expérimentateurs tout le long de la procédure (au minimum 2 fois par semaine puis tous les jours à l’approche du J35 ). Nous avons établi les points limites de nos procédures expérimentales. Les procédures d’euthanasie appropriées seront appliquées des lors où un des points limites est observé.
Choix des espèces
Pour qu’un nouveau traitement puisse être commercialisé, il est nécessaire de mener des études précliniques et cliniques, afin de prouver son efficacité, d'optimiser les dosages mais aussi d'identifier ses effets indésirables possibles. Les études précliniques nécessitent d’avoir recours à des animaux. Nous disposons d’échantillons de cellules lymphomateuses qui sont des lignées cellulaires murines établies et commercialisées et de cellules leucémiques provenant de patients que l’on peut transplanter à des souris immunodéficientes sans crainte de rejet de greffe. L’hématopoïèse et la leucémogénèse des souris (A1, mus musculus) est l’une de celle qui se rapproche le plus de l’homme. L’infiltration des cellules leucémiques dans la moelle osseuse ainsi que dans la rate reproduit la physiopathologie de la maladie. Nous utilisons des souris, car nous possédons des modèles de xénogreffes reproduisant de façon assez fidèle le développement des leucémies humaines. C’est pourquoi l’étude de l’immunité anti tumorale des souris est en effet celle qui se rapproche le plus de l’homme. Les animaux âgés entre 2 et 5 mois seront utilisés, ceci correspond à un âge optimal pour la greffe des cellules lymphomateuses sur le flanc des animaux et des cellules hématopoïétiques saines et leucémiques.