Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
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- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
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- Système urogénital
Rôle d’une molécule dans la progression tumorale et validation de l’efficacité anti-tumorale d’une thérapie ciblant cette molécule dans un modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 584 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la quasi-totalité tuées à l'issue et 28 réutilisées. Immunodéficientes, elles reçoivent une greffe de cellules de glioblastome sur le flanc, puis des injections intraveineuses trois fois par semaine, jusqu'à seize prélèvements sanguins et une chimiothérapie, pour tester un anticorps bloquant une protéine du cancer. Le porteur décrit une possible nécrose de la tumeur à la surface de la peau, une cachexie avec forte perte de poids et une fragilisation des veines par les injections répétées. Il affirme que l'in vitro ne fournit ni microenvironnement tumoral ni hôte complexe, ce qui rend selon lui l'in vivo nécessaire.
Objectifs
Une protéine a été identifiée dans la survenue, la survie et la résistance du glioblastome, cancer très agressif d’un type de cellules du cerveau. Il sera vérifié ici ces rôles avec notamment le traitement par des anticorps bloquant la protéine.
Bénéfices attendus
Le cancer du cerveau étudié dans cette étude est l’une des plus fréquentes tumeurs originaire du cerveau, et en dépit des efforts de la recherche, cette pathologie reste incurable. Les traitements actuels sont très délétères et la survie des patients après diagnostic est de 14-15 mois. Cette étude apporterait une solution thérapeutique supplémentaire pour la prise en charge de ces patients. Par ailleurs, plus de 90% de la mortalité des patients atteints de cancer est attribuée à la résistance aux médicaments utilisés. Cette étude pourrait apporter une alternative dans les cas de résistance observée lors de traitement par chimiothérapie activant le suppresseur de tumeur.
Procédures
Les animaux recevront une greffe de cellules tumorales dans le flan (1x, 40sec). A la suite de cette injection la souris développera une tumeur sous-cutanée. La croissance tumorale est suivie par des mesures au pied à coulisse 3 fois par semaine au maximum, l’animal est maintenu immobile environ 30 sec. Les composés sont administrés par injection intraveineuse (3x par semaine de traitement, 1min dont 3sec d’injection). Des prélèvements sanguins sont réalisés (16x maximum, 2 min dont 2x3sec d’insertion de l’aiguille de la seringue dans la queue). L’une des chimiothérapies sera injectée par voie intra-péritonéale (3x par semaine, 1min dont 5sec d’injection).
Impact sur les animaux
Un stress peut être observé lors de la contention des animaux (greffe, administration de composés, et pesées). Lorsque les animaux présentent des tumeurs sur le flanc, il est possible d’observer des phénomènes de nécrose des tumeurs à la surface de la peau. Plus rares sont les phénomènes de métastases pour la greffe de certaines lignées de cancer du cerveau qui seront mis en évidence par la perte de poids. Pour les traitements avec chimiothérapie, une cachexie chez certains individus (associée à une forte perte de poids) pourrait être observée. Les veines caudales peuvent finir par être fragilisées aux points d'injections des anticorps dû au caractère répétitif de ces injections.
Devenir
Les souris sont mises à mort pour le prélèvement - des tumeurs en vue d’analyses biomoléculaires, - d’organes pour évaluer la toxicité des molécules injectées. Les souris qui n’auront pas développées de tumeurs seront mises à mort, car elles ne peuvent pas être considérées comme naïves.
Remplacement
Les travaux menés in vitro montrent que la stratégie de blocage de la protéine X induit la mort des cellules cancéreuses. Mais ces tests ne bénéficient pas d’un microenvironnement tumoral et d’un environnement hôte complexes. Aussi il est nécessaire d’avoir recours à l’in vivo pour étudier la capacité du nouvel outil thérapeutique à atteindre la tumeur, pour analyser son comportement dans cet environnement complexe, évaluer son efficacité et pouvoir valider cet outil. Ces méthodes sont complémentaires d’expérimentations sur des cellules en culture qui sont largement utilisées en parallèle pour cette étude.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux lors de l’analyse pharmacocinétique du traitement, pour laquelle il y a besoin de prélever des échantillons sanguins sur plusieurs temps, une même souris sera être prélevée à 3 temps différents. De plus, chaque lot de souris permettra d’analyser 4 anticorps différents, en respectant un temps d’attente de 15 jours, nécessaire pour reconstituer le volume sanguin initial de la souris et éliminer le précédent anticorps. Par ailleurs, les différentes expériences se feront de façon séquentielle. L’optimisation des greffes pour chaque lignée cellulaire permettra de choisir la condition assurant le bon développement des tumeurs pour la réalisation des tests d’efficacité. Les lignées cellulaires qui ne pousseront pas seront exclues de l’étude ce qui réduira le nombre de souris utilisées dans ces tests. Un maximum de 5 anticorps candidats parmi les 8 analysés dans ces études sera étudié dans les tests d’efficacité. Ces tests d’efficacités permettront de sélectionner un seul anticorps sur les 5, soit celui qui aura la plus grande efficacité anti-tumorale avérée. Cet unique anticorps sera utilisé en combinaison avec la chimiothérapie. Le nombre d’animaux ainsi comptabilisé est le nombre maximum dans le cas où toutes les lignées cellulaires pousseraient, que 5 anticorps candidats seraient sélectionnés, et qu’il serait nécessaire de reproduire certaines expériences dû à des problèmes techniques.
Raffinement
Toute manipulation susceptible d’entraîner du stress sera réalisée par un expérimentateur formé aux techniques de contention et de manipulation. Les prélèvements sanguins seront réalisés par un expérimentateur formé à cette technique. Il est important de noter qu’une surveillance adaptée (3 fois par semaine) permettra la détection et notation des signes de souffrance grâce à une feuille de scoring contenant des points d'arrêt objectifs, reproductible et standardisés et qui conduiront à l'arrêt du protocole et à la mise à mort immédiate des animaux si nécessaire. Les analyses de croissance des tumeurs seront non invasives (mesure au pied à coulisse) et ne requièrent pas d’injection d’anesthésiant.
Choix des espèces
La souris immunodéficiente est le modèle le plus approprié pour greffer des cellules cancéreuses humaines afin qu’il n’y ait pas de rejet des cellules, tout en permettant de faire des suivis de croissance tumoraux dans le cadre d’essais de nouveaux traitements. Par ailleurs les schémas d’administration des chimiothérapies sont biens standardisés (voie, doses, posologies...) contrairement à d’autres modèles tels que le Zebrafish. Les expérimentations seront effectuées sur des femelles de 6 à 7 semaines, âge où la prise de greffe est la plus efficace et la plus homogène. De plus les femelles présentent un caractère moins agressif que les mâles, ce qui permet un remaniement plus facile de la composition des cages lors de la constitution de groupes expérimentaux homogènes.
Etude de la stimulation des neurones impliqués dans la mémoire spatiale chez le rat mâle vieillissant
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
180 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit des injections intracérébrales sous anesthésie, douze autres injections, une contention de trente minutes destinée à provoquer un stress avec prélèvements sanguins répétés, et un test de mémoire spatiale en piscine, pour étudier le rôle de nouveaux neurones dans la mémoire au cours du vieillissement. Le porteur reconnaît que la chirurgie peut entraîner douleur, perte de poids ou infection de la plaie. Il affirme qu'une approche intégrée impose l'animal vivant et écarte tout modèle in vitro ou in silico.
Objectifs
Il est maintenant bien établi qu’il existe une formation de nouveaux neurones tout au long de la vie dans l’hippocampe des mammifères (y compris l’Homme), et que ce phénomène joue un rôle dans la mémoire spatiale. L’hippocampe est une structure clé impliquée dans les processus mnésiques. Les nouveaux neurones nés à l’âge adulte s’intègrent aux réseaux des neurones formés au cours du développement. Ces nouveaux neurones, appelés néo-neurones, sont cruciaux pour l’apprentissage et la mémoire. Au cours du vieillissement, certains individus présentent un déficit de mémoire beaucoup plus précocement que d’autres. Ces individus sont dits vulnérables, en comparaison aux individus résilients chez qui les capacités mnésiques sont préservées. La compréhension des processus qui sous-tendent ces différences interindividuelles est une étape clé pour le développement de stratégies innovantes visant à prévenir les troubles cognitifs liés à l'âge. Un des processus permettant d’expliquer ces différences serait la capacité des nouveaux neurones créés à l’âge adulte dans le gyrus dentelé de l’hippocampe, à s’intégrer totalement (individus résilients) ou partiellement (individus vulnérables), dans le réseau de neurones du gyrus dentelé au cours des processus de mémoire. L’objectif de ce projet est de regarder si la stimulation des nouveaux neurones améliore la mémoire spatiale des animaux dit vulnérables.
Bénéfices attendus
Le déclin cognitif associé au vieillissement, dont la maladie d'Alzheimer est la forme la plus extrême, représente un problème de santé majeur auquel la société occidentale est confrontée. Compte tenu de l'augmentation du nombre de personnes âgées, le fardeau économique de ces troubles est élevé ; il s'agit actuellement du problème de santé le plus coûteux dans l'UE. Il est donc de plus en plus important de comprendre les changements cognitifs qui accompagnent le vieillissement aussi bien normal que pathologique. L’une des plaintes cognitives les plus courantes chez les personnes âgées est l'altération de la mémoire. Aussi, comprendre pourquoi certains individus conservent de bonnes capacités de mémorisation, alors que d'autres présentent une perte de mémoire impactant leur vie quotidienne, est essentiel pour développer de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre les troubles cognitifs liés à l'âge. Notre stratégie de recherche consiste à tirer parti de ces différences interindividuelles pour identifier de nouveaux mécanismes de préservation du fonctionnement mnésique au fil du vieillissement. Ce projet nous permettra de mieux comprendre le rôle des néo-neurones nés à l’âge adulte dans la préservation des capacités de mémoire et d’apprentissage au cours du vieillissement. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche préclinique s’intéressant aux maladies neurodégénératives touchant la mémoire, comme la maladie d’Alzheimer, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
6 gestes techniques seront réalisés : *Composition corporelle : Après une acclimatation de 30 minutes dans l’appareil à Résonnance magnétique nucléaire, les animaux vigiles sont placés dans un tube de contention en plastique durant le temps de l’examen qui dure 3 min. *Prélèvement de sang à la queue : les animaux vigiles sont placés dans un tube de contention pendant 30 min pour induire un stress. Immédiatement après, le sang est prélevé (2 min). L’opération est renouvelée 30, 60 et 120 minutes plus tard (3x2 = 6min). *Injections intracérébrales : Geste chirurgical réalisé sous anesthésie gazeuse (durée moyenne 50 min). *Injections autres : Elles sont réalisées sur animal vigile. Les animaux reçoivent au total 12 injections (durée totale préhension de l’animal + injection =36min) *Test de la mémoire : les rats nagent dans une piscine et apprennent à localiser une plateforme immergée. Lors de l’habituation, ils passent 2x60s (2min) dans la piscine sans la plateforme. Lors de l’apprentissage, ils font chaque jour 4 essais, pendant 8 jours. Pour chaque essai, les animaux passent 90s maximum dans l’eau (temps maximum passé dans l’eau au cours d’une session = 4 x 90s = 360s = 6 min). Au fil des jours, les animaux apprennent et le temps passé dans l’eau diminue : temps moyen passé dans l’eau au cours de ce test 40s x 4 essais par jour soit 160s = 2min40 (durée totale moyenne passée dans la piscine : 8x160s = 1280s = 21min20s). *Euthanasie : Les animaux sous anesthésie gazeuse sont euthanasiés (induction 5min + maintien 3-4min jusqu’à confirmation euthanasie) par injection intrapéritonéale d’une dose létale d’euthanasique.
Impact sur les animaux
Comme tout projet incluant des contentions, des injections et des gestes chirurgicaux (stéréotaxie, incision de la queue), il est possible que des effets indésirables surviennent malgré notre vigilance et la mise en place de procédures adaptées. Tout d’abord concernant la contention lors de la mesure de la composition corporelle, celle-ci sera la plus légère possible et de durée relativement courte (3min) de manière à induire le moins de stress possible. S’agissant de la contention afin d’étudier la réactivité cérébrale en réponse à un stress, nous savons que cela sera forcément générateur de stress puisqu’il est nécessaire à l’étude. Ensuite, même si cela est relativement rare, il est possible que les sites d’injection ou les plaies chirurgicales s’infectent ou deviennent douloureux. De même dans les 2 jours suivants la chirurgie stéréotaxique, il est possible que les animaux perdent du poids ou présentent des signes de douleur. Enfin, au sujet de l’isolement certes les animaux seront hébergés en cage individuelle mais les nuisances liées à cela seront limitées. En effet l’hébergement ne se fait pas en portoir isolé ainsi les animaux restent en contact visuel, olfactif et sonore.
Devenir
A l’issue de toutes les expériences, les animaux seront mis à mort en vue d’analyses réalisées sur leur cerveau.
Remplacement
Dans ce projet, nous souhaitons étudier in vivo l’impact d’une stimulation des néo-neurones du Gyrus denté au cours du vieillissement. Il s’agit d’une approche intégrée nécessitant les capacités cognitives de l’animal. Un tel travail ne pourrait être effectué par une approche in vitro, ou in silico, et nous ne pouvons donc recourir à des techniques de remplacement.
Réduction
Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrions rencontrer au cours des différentes phases expérimentales (problèmes au cours de la chirurgie, variations anatomiques interindividuelles entraînant l’injection du virus en dehors de la région cérébrale ciblée, problèmes lors de la dissection), ainsi que des problèmes de santé inhérents au vieillissement (les animaux développant arthrites, tumeurs, cécités, cataractes étant exclus). Une analyse préalable de la normalité des données sera réalisée afin de vérifier la possibilité de poursuivre l’analyse sur des statistiques paramétriques. Les effectifs ont été déterminés de façon à pouvoir effectuer des tests statistiques sur un nombre de rats suffisant pour obtenir des résultats cohérents.
Raffinement
Hébergement : Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés par 2 en cages collectives (grande taille) enrichies afin de réduire l’ennui et le stress. Les rats seront observés quotidiennement par le personnel zootechnique et manipulés mensuellement jusqu’à leur euthanasie. Ils seront hébergés dans une animalerie dont la température et le taux d’humidité seront contrôlés et avec un cycle lumière-obscurité de 12h. L’accès à la nourriture et à l’eau sera à volonté et un changement de litière sera effectué chaque semaine. Gestion de la douleur : En fin de chirurgie, un anti-inflammatoire sera injecté en vue de limiter la douleur post-opératoire. Après la chirurgie et durant 3 jours, les rats seront individuellement manipulés afin de détecter tout problème post-opératoire. Si un animal présente des signes de douleur, nous lui administrerons un analgésique par voie sous-cutanée toutes les 6 à 12h. En cas de signes d’infection de la plaie chirurgicale, nous la désinfecterons et administrerons un analgésique à l’animal toutes les 6 à 12 heures. Si le bout de la queue s’infecte, nous désinfecterons la plaie et ce jusqu’à disparition totale de l’infection. Si les sites d’injections intra-péritonéales ou sous-cutanées s’infectent ou s’enflamment, nous nettoierons la zone avec et administrerons un baume cicatrisant jusqu’à disparition complète des symptômes. Nous utilisons des grilles d’évaluation de la douleur permettant de scorer de façon objective le bien-être de l’animal. Ces grilles sont remplies par l’expérimentateur jusqu’à l’euthanasie des animaux. Plus le score est élevé plus le bien-être de l’animal est menacé et des points limite ont été définis. Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en l’absence d’amélioration sous 48h, l’animal sera euthanasié par inhalation de gaz carbonique.
Choix des espèces
Le modèle utilisé dans ce projet est le rat. La complexité du système nerveux des mammifères et des comportements qu’il sous-tend rend impossible leur reproduction in vitro ou chez des organismes d’une plus faible complexité neurophysiologique (invertébrés par exemple). Le rat est un modèle classiquement utilisé en neurosciences, notamment pour des études comportementales telles que celles réalisées auparavant au sein du laboratoire. De plus, la formation des nouveaux neurones au cours de la vie (néo-neurogénèse) est un phénomène conservé au sein des mammifères, chez le rat, chez le singe et chez l’Homme. Enfin, cette étude vient compléter nos investigations menées depuis plus de 20 ans sur cette espèce, permettant ainsi de s’appuyer sur une solide expertise et une base de données importante (continuité et contrôle des résultats). Les rats seront réceptionnés à l’âge de 10 semaines afin d’être âgés de 12 semaines au moment des injections intracérébrales. Les différentes études seront réalisées 5 à 15 mois après celles-ci. Nous utiliserons ainsi des animaux adultes à différents stades de vieillissement : 1) adulte : 8 mois ; 2) milieu de vie : 12 mois ; 3) fin de vie : 18 mois. Ces âges ont été choisis car ils permettent d’étudier le rôle des nouveaux neurones nés à l’âge adulte dans l’apparition de troubles de la mémoire au cours du vieillissement.
Shadow imaging in vivo pour l’étude du milieu extracellulaire et la perfusion intracardiaque
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les 2 718 souris de ce projet subissent sous anesthésie une chirurgie d'environ une heure pour ouvrir dans leur crâne une fenêtre d'imagerie de 3 mm, fermée par une lamelle. Parmi elles, 1 770 reçoivent une injection unique de produit fluorescent dans le cerveau, 948 un implant permettant des injections répétées, 420 une ou deux injections rétro-orbitales, et 420 un traumatisme crânien et une implantation de cellules tumorales, avec des séances d'imagerie répétées tête immobilisée et, pour les souriceaux non sevrés, un risque de rejet cité par le porteur. Le but est de cartographier, avec une nouvelle technique de microscopie, l'espace entre les cellules du cerveau. La déclaration compte 2 298 souris en souffrance modérée et 420 en souffrance sévère. La description des procédures prévoit que toutes soient tuées après la préparation de leurs tissus, et la déclaration n'en compte aucune gardée vivante. La rubrique sur leur devenir écrit que les "souris ayant un dispositif implantatoire seront maintenues en vie", soit les 948 équipées de l'implant d'injection.
Objectifs
Environ 25% du volume cérébral est occupé par l'espace extracellulaire (ECS) qui correspond à l’espace se trouvant entre les cellules et qui sert d’environnement à l’échelle microscopique pour le cerveau et forme un chemin de communication chimique entre les cellules. Il a été montré que la structure et la diffusion de l'ECS sont composés d’éléments de nature différentes et qu'elles dépendent de conditions internes et externes, telles que le système de sommeil/éveil ou d’un œdème cellulaire provoqué par un traumatisme cérébral. De plus, l’ECS fournit un réservoir pour les ions impliqués dans l'activité électrique des neurones et joue un rôle clé dans la transmission de substances entre les cellules. Ainsi, l’ECS n'est pas seulement le siège de toutes sortes d'interactions cellule-cellule, mais peut également jouer un rôle important dans des fonctions neuronales cruciales, telles que la mémorisation ou la formation de circuits neuronaux. Afin de visualiser la structure de l'ECS à très petite échelle (nanomètre), nous utiliserons une nouvelle approche d'imagerie, à savoir la technique de Shadow imaging (SUSHI). C'est une méthode de marquage où un produit fluorescent est injecté localement dans le cerveau afin de visualiser l’ECS avec une très haute résolution. En outre, comme le produit fluorescenr ne pénètre pas les cellules saines, toutes les cellules apparaissent en noires, ce qui permet d'imager également la structure anatomique des cellules non marquées. Cette méthode présente de grands avantages puisqu’elle n’est pas sensible à la perte de fluorescence de la molécule (la diffusion du produit fluorescent permet de maintenir un signal constant) ni à la toxicité (puisque le produit fluorescent reste en dehors des cellules). Dans ce projet, nous comptons tester plusieurs produits fluorescents qui présentent tous une gamme de longueur d’onde proche de celui de la GFP (Protéine fluorescente verte) et ne pénètrent pas les membranes cellulaires.
Bénéfices attendus
Cette technique sera utilisée pour imager l’ECS au travers d’un dispositif d'imagerie posée soit sur le cortex soit sur l’hippocampe (petite partie du cerveau qui sert pour la mémoire, le comportement et certaines émotions). Partant de là, nous nous proposons d'effectuer des séances d'imagerie répétées d’un même animal pour cartographier, sur animal vivant et avec une résolution spatiale inédite, la morphologie de l’ECS et caractériser la dynamique (quelques minutes à quelques semaines) des structures fines de l’ECS afin de voir les interactions cellule/cellule à l'échelle des circuits intégrés.
Procédures
Toutes les souris auront la pose d'un dispositif d'imagerie (2718 souris). Pour avoir ce dispositif il faut procéder à une chirugie sur animal endormi qui dure environ 1h avec utilisation de produits anti douleur. Un dispositif d'imagerie de 3mm de diamètre sera fait dans le crâne de la souris et une lamelle sera posée dessus afin de protéger le cerveau de l'extérieur. 1770 souris auront une injection directe dans le cerveau pendant qu'elles seront endormies. L'injection prendra environ 15 minutes et sera faite qu'une seule fois sur ces souris. 948 souris auront une pose d'un dispositif implantatoire dans le cerveau permettant d'injecter plusieurs fois le produit fluorescent. Ce dispositif implantatoire sera posée pendant la chirugie pour le dispositif d'imagerie. Chaque souris de ce groupe aura un dispositif implantatoire et plusieurs injections dans le temps d'une durée de 15 minutes environ chacune. Une injection rétro-orbitales sera faite sur 420 souris. Une injection par oeil et 2 injections par animal au maximum. L’induction d’un traumatisme cranien (impact fait en une fraction de secondes) et l’induction de cellules tumorales (une dizaine de minutes) sera faite sur un total de 420 souris. Toutes les souris auront une préparation des tissus pour l'étude des propriétés cellulaires après une ou plusieurs injections injection (si la souris a un dispositif d'injection ou non). Cette préparation des tissus se fera sur animal endormi avec utilisation d'anti douleur. L'animal sera ensuite euthanasié et le cerveau sera récupéré.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et l'induction du traumatisme cranien et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies, injection retro-orbitale et aux implants 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte. Le risque de rejet des animaux non sevrés et le stress de la séparation peuvent également entrainer une nuisance ou un effet indésirable.
Devenir
Les souris subissant la préparation des tissus pour l'étude des propriétés cellulaires seront euthanasiées à la fin de l'expérimentation afin de prélever le cerveau entier. Les souris ayant subi une chirurgie pour l'implantation d'un dispositif d'imagerie seront utilisées pour la microscopie puis euthanasiées à la fin de l'expérimentation si elles ne sont pas utilisées pour la préparation des tissus. Les souris ayant un dispositif implantatoire seront maintenues en vie.
Remplacement
La souris est l'espèce de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Ce protocole nécessite l'utilisation d'animaux. L’objectif de ce projet étant de caractériser l’ECS dans les conditions les plus naturelles possibles, cette étude ne peut être réalisée de manière pertinente avec des modèles sur ordinateurs (in silico) ou sur micro-organismes, organes ou cellules en dehors de leur contexte naturel (in vitro). Le microscope sera, dans un premier temps, validé en imageant de toutes petites particules (nanoparticules) fluorescentes. Toutefois, ces échantillons ne permettent pas réellement de reproduire l’ensemble des paramètres optiques observés dans les échantillons biologiques. C’est pourquoi une seconde étape de validation dans des tranches organotypiques (tranches de partie de cerveau sur une lamelle) apparait cruciale pour optimiser les conditions d’imagerie qui seront utilisées à terme pour l’imagerie sur animal vivant (in vivo).
Réduction
Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode de production : en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
A chaque étape du projet, le bienêtre de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Nos animaux naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventilés, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L’expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposées. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'Homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'Homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'Homme. Le projet sera réalisé sur des animaux de 1 et 21 jours. Puis sur ces mêmes animaux de 2 à 6 mois, période qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau homogène pour une meilleure reproductibilité des résultats.
Nouvelles approches thérapeutiques pour la maladie de Huntington : La régulation du transport rétrograde
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une chirurgie du cerveau de 20 à 30 minutes ou une injection intraveineuse de 5 minutes, et deux semaines d'études comportementales : 2 156 souris, témoins ou issues de lignées présentées comme reproduisant la maladie de Huntington, vont être utilisées dans ces procédures. La déclaration en compte 878 en souffrance légère et 1 278 en souffrance modérée, et toutes sont tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. Le projet teste chez la souris des régulateurs du transport d'un facteur de survie des neurones, déjà repérés dans des études sur cellules, comme cibles de traitement possibles. Le texte ne nomme ni ce qui est injecté, ni le but de la chirurgie, ni les tests comportementaux, alors qu'il indique que chez ces souris les symptômes "ne sont observés qu'au cours de stimulations comportementales".
Objectifs
La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative rare d’origine génétique (18000 personnes atteintes en France et environ 300 000 personnes dans le monde) pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Elle se caractérise par l’apparition de symptômes moteurs et psychiques conduisant à une altération de l’état général des patients (perte de poids, fonte musculaire, fatigue, douleurs et déformations articulaires) puis inexorablement à leur décès. Lors de la maladie il y a un défaut de transport d'un facteur nécessaire à la survie des neurones. Il est démontré par des études au niveau cellulaire qu'il y a différents régulateurs de ce transport qui pourraient être des nouvelles cibles thérapeutiques. Il est maintenant crucial d'étudier le rôle de ces régulateurs dans un modèle animal, afin de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour la maladie de Huntington.
Bénéfices attendus
Le déficit de transport d'un facteur essentiel à la survie des neurones est à la base de la dégénérescence des structures du cerveau lors de la maladie de Huntington qui touche 300000 personnes dans le monde. Ce projet vise à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour soulager les patients.
Procédures
Les souris seront soumises à une chirurgie du cerveau de 20-30 minutes par souris, ou à une injection intra-veineuse de 5 minutes par souris. Des études comportementales de 2 semaines.
Impact sur les animaux
1) Des souris contrôle et des souris modèle de la maladie de Huntington seront utilisées. Chez la souris, les symptômes de la maladie de Huntington ne sont observés qu’au cours de stimulations comportementales. En revanche, en dehors des tests comportementaux, ces souris ne montrent aucun signe de détresse correspondant à des points limites et n'ont pas besoin de traitement ou d'attention particulière. 2) Dans la littérature, aucun signe de douleur lié directement à l'injection intra-veineuse n'a pu être observé. 3) Pour les individus qui vont subir une chirurgie du cerveau, cela peut générer une légère douleur avec perte légère de poids.
Devenir
La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'obtenir les tissus cérébraux en vue des études biologiques qui permettront de comprendre les mécanismes du traitement.
Remplacement
Le projet traitant de problèmes fonctionnels du cerveau, il est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle de simulation informatique. Il a été précédemment démontré sur un modèle cellulaire qu'il y a des régulateurs du transport d'un facteur nécessaire à la survie du cerveau, la seconde étape consiste donc à démontrer le rôle de ces régulateurs et leur effet sur la survie du cerveau, dans des conditions physiologiques et lors de la maladie de Huntington. Il est donc crucial de passer par une étude animale car aucun modèle in vitro ne permet actuellement de reproduire les mécanismes de déclenchement des traits comportementaux de la maladie et de reproduire la complexité d’un organisme vivant.
Réduction
Pour cette procédure, le nombre d'animaux est réduit au maximum. Ces effectifs ont été calculées à l'aide de tests statistiques afin de pouvoir réaliser des analyses avec une puissance suffisante.
Raffinement
Des points limites suffisamment précoces et adaptés aux procédures expérimentales ainsi que des critères d'arrêt des souffrances sont mis en place surtout après la chirurgie. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à des grilles codifiant le niveau de bien-être. Cela permettra une intervention immédiate et de manière appropriée si des signes de souffrance apparaissent.
Choix des espèces
Compte tenu de la similarité de son anatomie avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude in vivo de la maladie de Huntington. Les modèles souris choisis permettent d'étudier la régulation du transport du facteur de survie des neurones dans les conditions physiologiques et lors de la maladie de Huntington. Les animaux seront tous en stade postnatal. Des études comportementales seront faites au stade prépuberté et si aucun effet n'est observé on gardera les souris jusqu'au stade adulte où il y aura progression des mécanismes de la maladie.
Interventions nutritionnelles pour les maladies du foie liées à l’obésité : utilisation de souris transgéniques pour caractériser les mécanismes.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Nourries douze semaines d'un régime standard ou d'un régime riche en graisses qui provoque obésité, diabète de type 2 et stéatose du foie, 640 souris passent ensuite par l'une des interventions prévues : un jeûne de 16 heures, ou six semaines de jeûne intermittent de 16 heures par jour, de régime cétogène, de retour au régime standard ou de régime gras maintenu. Les unes n'expriment pas la protéine PPARa dans le foie, les autres sont utilisées comme témoins, pour mesurer le rôle de cette protéine dans les effets des régimes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Au début et à la fin de chaque intervention, des tests de tolérance au glucose ou à l'insuline imposent six heures de jeûne, un gavage de glucose ou une injection d'insuline, puis sept gouttes de sang prélevées à la queue en deux heures, à raison d'un test ou d'une prise de sang par semaine. Le porteur écrit que le régime obésogène installe ces troubles "sans souffrance visible des animaux ni changement de leur comportement", et cite pour le jeûne un risque d'hypoglycémie et d'hypothermie. Toutes sont tuées à l'issue, pour récolter leur sang et leurs organes.
Objectifs
Les maladies métaboliques du foie (stéatose hépatique non alcoolique, ou NAFLD pour non-alcoholic fatty liver disease) sont en expansion dans les pays industrialisés, parallèlement à la prévalence croissante de l’obésité. Le premier stade de la maladie correspond à une accumulation de graisses dans le foie et est bénin mais peut évoluer chez certains patients vers une forme inflammatoire, puis vers une cirrhose, à l’origine d’autres complications sévères telles que le cancer du foie. Les mécanismes de progression de ces maladies sont encore mal compris et aucun traitement médicamenteux efficace n’est disponible à ce jour. Dans une étude non publiée du laboratoire, nous avons récemment démontré que plusieurs stratégies alimentaires sont capables de diminuer l’obésité, le diabète et la stéatose hépatique chez la souris. Nous souhaitons à présent déterminer les mécanismes impliqués dans ces effets bénéfiques. Nous émettons l’hypothèse que la protéine PPARa pourrait être impliquée dans ces effets. PPARa est principalement exprimée dans le foie où elle contrôle la dégradation des graisses, faisant d'elle une bonne cible thérapeutique pour traiter les maladies métaboliques. Nous disposons au laboratoire de souris mâles et femelles chez qui le gène PPARa est non fonctionnel dans le foie. Dans ce projet, nous utiliserons des souris mâles et femelles qui n'expriment pas PPARa dans le foie et comme contrôle, des souris chez qui PPARa s’exprime. Elles seront nourries par un régime gras induisant une obésité, un diabète de type 2 et une pathologie hépatique mimant celle observée chez l’Homme. Une fois la pathologie installée, les animaux seront soumis à différentes stratégies alimentaires : un retour à un régime contrôle, un jeûne aigu ou intermittent, un régime cétogène (presque exclusivement constitué de graisses et contenant très peu de sucre). Les effets de ces différentes stratégies alimentaires seront évalués grâce à des bilans sanguins et des analyses des prélèvements d’organes (foie, tissus adipeux brun et blanc).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de définir l’importance de PPARa spécifiquement dans le foie dans les effets bénéfiques des différentes interventions sur la progression de l’obésité, du diabète de type 2 et de la stéatose hépatique. En conséquence, ce projet pourrait identifier un des mécanismes hépatiques pouvant être impliqué dans les effets de ces différentes interventions. En effet, aucun traitement de référence n’est disponible à ce jour pour les patients atteints de ces maladies chroniques du foie qui représentent actuellement la 2e cause de transplantation de foie du monde.
Procédures
Les animaux seront nourris avec un régime standard ou un régime obésogène riche en graisses pendant 12 semaines. A l'issue de ces 12 semaines, les animaux subiront l'une des interventions nutritionnelles suivantes : une mise à jeun pendant 16h, un jeûne intermittent de 16 h par jour pendant 6 semaines, un régime cétogène riche en gras et pauvre en sucre pendant 6 semaines, un régime standard pendant 6 semaines, un groupe contrôle qui restera nourri avec le régime obésogène pendant 6 semaines. Les animaux seront aussi soumis à des tests de tolérance au glucose (OGTT) ou à l’insuline (ITT) au début et à la fin de chaque intervention. Ces tests consistent en : 6h de jeûne, suivi d'une mesure de la glycémie puis un gavage avec du glucose pour les OGTT ou une injection d'insuline pour les ITT, puis des mesures de la glycémie toutes les 15 min pendant 2h. Pour les OGTT, le glucose est administré par gavage une fois et pour les ITT, l'insuline est administrée par injection une fois. Le gavage et l'injection prennent chacun moins de 30 secondes. Pour les mesures de glycémie, le prélèvement d’une seule goutte de sang (
Impact sur les animaux
Les régimes obésogènes vont induire une obésité et des perturbations du métabolisme associées tels qu'un diabète et une stéatose, sans souffrance visible des animaux ni changement de leur comportement. La mise à jeun peut entraîner une hypoglycémie et une hypothermie. Le prélèvement sanguin et le gavage oral de glucose et d’insuline peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention.
Devenir
A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique
Remplacement
Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux de laboratoire car la pathologie étudiée (stéatose non alcoolique) est complexe et fait intervenir différents tissus agissant en synergie (foie, tissus adipeux, intestin, cerveau, muscle). Il est impossible de mimer ceci par l’utilisation de méthodes alternatives. L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car il est possible de mimer la pathologie étudiée grâce à l’utilisation du régime gras.
Réduction
Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés (calcul de puissance) et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.
Raffinement
Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement. Ainsi, les souris seront en hébergement collectif et dans un environnement contrôlé (température, hygrométrie). Des enrichissements du milieu de vie (cabanes en inox et ouate de coton ou de cellulose) seront disposés dans la cage afin de pouvoir se distraire, se cacher et fabriquer des nids. Pour un meilleur raffinement et limiter le stress, les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux, et nous mesurerons leur consommation alimentaire et hydrique afin de vérifier la bonne tolérance des différentes expérimentations. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres (indice 0 = normal ou léger, indice 3 = changements importants par rapport à la normale). Si un animal présente un signe quelconque de souffrance avec un score de 3 après évaluation de ces paramètres, l’animal sera aussitôt retiré de l’étude et replacé dans des conditions d’hébergement standard (régime standard et aucune procédure réalisée).
Choix des espèces
L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car le développement du foie est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.
Caractérisation anatomique des entrées du centre de contrôle des neurones dopaminergiques du cerveau moyen
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
35 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dix d'entre elles opérées sous anesthésie sans réveil. Chaque animal subit une à deux chirurgies cérébrales d'une heure avec injection de virus, pour cartographier les entrées d'une région qui contrôle les neurones dopaminergiques du cerveau. Le porteur reconnaît que la chirurgie peut provoquer une douleur postopératoire et une inflammation locale, et prévoit analgésiques et anti-inflammatoires. Il décrit une recherche fondamentale et affirme qu'un cerveau complet est nécessaire, ce qui exclut selon lui tout modèle in vitro ou in silico.
Objectifs
Les neurones dopaminergiques (DA) du cerveau moyen constituent le point de départ du système de récompense du cerveau. Ces neurones ont ainsi des rôles multiples allant de l'évaluation de la valeur motivationnelle d’un stimulus à la locomotion et sont donc impliqués dans des pathologies comme la dépression ou la maladie de Parkinson. Il y une quinzaine d’années une nouvelle structure du cerveau contrôlant les neurones DA du cerveau moyen a été découverte. La caractérisation de cette région a été initialement réalisée chez le rat et la grande majorité des études se sont depuis limitées à cette espèce dans laquelle les modèles génétiquement modifiés sont peu nombreux et les études difficiles à mettre en place. Ceci est dû au fait qu'aucun marqueur de cette région n'avait été identifié chez la souris. Ce n’est plus le cas puisque nous venons d'identifier un marqueur spécifique chez la souris. Cette découverte nous permet donc aujourd’hui d’utiliser des approches virales pour caractériser ce contrôleur des neurones DA chez la souris. Le but de ce projet est donc d’identifier les entrées de cette région chez la souris.
Bénéfices attendus
Le but premier de cette étude est fondamental. Il est d’identifier les régions qui projettent sur les neurones qui contrôlent les neurones du circuit de récompense du cerveau. Cela permettra, dans un second temps, d’étudier les rôles et fonctions physiopathologiques de ces neurones ainsi que les circuits qui y sont associés.
Procédures
Les animaux pourront subir une ou deux chirurgies de 1h00.
Impact sur les animaux
La chirurgie peLa chirurgie peut induire de la douleur postopératoire et une inflammation locale transitoire au niveau des sutures. Un suivi postopératoire, des analgésiques et des anti-inflammatoires sont prévus pour limiter au maximum ces effets indésirables.
Devenir
les animaux seront mis à mort pour prélèvements de tissus.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous n’est pas possible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l'analyse des réseaux neuronaux du cerveau nécessite un cerveau complet.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire le nombre d’animaux, mais en obtenant le maximum d’information scientifique par animal. Le type d’analyse de données anatomiques que nous souhaitons réaliser nécessite un nombre limité d’animaux. Aux vues du nombre de co-marquage immunohistochimiques que nous souhaitons effectuer, de notre expertise scientifique et de celle de notre collaborateur sur ce projet nous estimons que 5 à 10 animaux injectés avec succès par les deux virus et 2 animaux pour chaque contrôle (à chaque fois un seul virus) seront suffisants. Nous débuterons par 5 souris doublement injectées plus 4 contrôles (2 par contrôles) et complèterons par d’autres souris uniquement si nécessaire (analyse préalable).
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cohorte de 2 à 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement suivit afin de déceler tout signe de mal-être. Des points limites ont été établis afin de soustraire les animaux à la souffrance. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, elle pourrait être intégrée dans nos procédures.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris modifiées génétiquement pour cibler spécifiquement les neurones à étudier. Ceci implique l'utilisation de souris spécifique et ne permet pas l'utilisation d'autres espèces. Étant donné que l’étude nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à partir de 8 semaines, poids supérieur à 20g). La limite d’âge supérieur est de 18 mois afin d’éviter les facteurs liés au déclin cognitif des animaux âgés.
Etude du Glunomab pour le traitement des accidents vasculaires cérébraux dans un modèle d’ischémie-reperfusion chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
121 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un monofilament inséré dans une artère provoque un AVC par occlusion puis reperfusion, précédé de la pose chirurgicale d'une prothèse crânienne et suivi d'IRM, d'un neuroscore de J+1 à J+7 et d'une ponction cardiaque terminale, pour tester un anticorps, le Glunomab. Le porteur décrit le déficit sensorimoteur, les lésions cérébrales, la perte d'équilibre et la désorientation au réveil provoqués par le modèle. Il juge "indispensable" de trouver de nouvelles stratégies et présente la souris comme le "modèle préférentiel" de l'AVC.
Objectifs
L’objectif long terme est de tester un anticorps monoclonal, le Glunomab, dans le cas d’AVC très sévères chez l’Homme car les traitements actuels sont inefficaces voir inapplicables dans ces conditions. Ce projet vise à reproduire ces conditions sévères d’AVC chez la souris SWISS afin d’observer ou non une augmentation de la survie des individus traités et d’étudier la diminution des volumes lésionnels ainsi que l’augmentation de la récupération fonctionnelle après un AVC. Nous chercherons également à comparer l’effet de cette stratégie thérapeutique à 4 doses différentes. Son mécanisme d’action est susceptible d’agir sur différentes phases de l’AVC : la phase aigüe (24h) pour limiter la lésion et la phase inflammatoire qui s’installe les jours suivants. Cette stratégie thérapeutique sera étudiée à l’aide d’un modèle sévère d’ischémie-reperfusion.
Bénéfices attendus
Chez l’Homme, l’accident vasculaire cérébral (AVC) est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Toutefois, seule une faible proportion des patients (
Procédures
A J-7, les animaux seront soumis à une première chirurgie au niveau de la tête permettant la mise en place d’une prothèse afin de réaliser un examen IRM vigil. Cet acte chirurgicale durera 20 minutes. A J-4 et J-3, ces mêmes animaux suivront un protocole d’habituation à la contention et aux bruits de l’IRM. Ce protocole sera scindé en 2 partie de 15 et 30 minutes, 2 fois par jour, pendant 2 jours. A J0, les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau du cou afin de pouvoir insérer un monolfilament dans la carotide interne puis poussé jusqu’à la base de l’artère cérébrale moyenne (ACM) provoquant ainsi une occlusion. Cet acte chirugical durera 15 minutes. 2 heures plus tard, une seconde chirurgie sur le même site sera réalisée afin d’extraire ce monofilament et ainsi permettre une reperfusion. Cet acte chirugical durera 10 minutes. Nous comptons en moyenne une minute pour l’injection des traitements et véhicule. A J+1, ces mêmes animaux seront passés à l'IRM pour une durée totale de 8 minutes et suivront un test comportemental s'étalant de J+1 à J+7 post AVC. Nous comptons un total de 10 minutes pour la prise du neuroscore. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au coeur. Un prélèvement de sang par ponction cardiaque sera réalisé avant perfusion transcardiaque avant prélèvement. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements. Les procédures douloureuse (chirurgie, perfusion transcardiaque) seront réalisées sous anesthésie générale associée à une couverture analgésique
Impact sur les animaux
Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC à savoir : déficit sensorimoteur et lésions cérébrales. Cela peut occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion. L’embolisation de l’ACM provoque une désorientation prononcée au moment du réveil post-chirurgical (phénomène de circling). Les fonctions motrices peuvent également être altérées durant les premières heures après l’ischémie-reperfusion. Suite à une phase d’habituation à l’IRM vigile, aucune nuisance n’est à prévoir. Les injections i.v peuvent provoquer un gonflement des tissus par accumulation du produit si l’expérimentateur procède à une injection partielle. Un léger stress peut être occasionné lors des tests comportementaux.
Devenir
A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.
Remplacement
Ce projet correspond à l’étape de validation in vivo qui fait suite aux nombreuses validations réalisées in vitro, et ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que de tester ces stratégies thérapeutiques chez l'animal. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que la souris est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, la souris est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de notre stratégie thérapeutique. Le nombre d’animaux utilisés est fixé à 16 souris par groupe (+30%), ce qui nous permettra de déceler des différences significatives. Ainsi, nous concilions le nombre minimum d'animaux utilisés pour notre projet et sa valeur scientifique.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les souris seront 5 par cage avec plusieurs enrichissements (sizzle-dri kraft et alpha-dri), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Pendant les phases chirurgicales, chaque animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique administrée en intrapéritonéale. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. La température corporelle de l’animal est maintenue grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée. Le site d’incision de peau fait appel à une tonte préalable du pelage, puis à une désinfection. Lors de la phase de réveil, la concentration d’isoflurane et le débit de N2O sont ramenés à zéro, et le débit d’O2 est élevé pour permettre une meilleure récupération post-opératoire. Les animaux seront placés dans une cage individuelle chauffée pendant 1 heures avant d’être remis en cage par 5. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si en période postopératoire, nous constaterons un dépassement des points limites précédemment fixés, l’animal sera mis à mort. Enfin, une surveillance stricte des souris sera réalisée pendant les jours suivants l’opération : pesée des animaux et contrôle des points limites (2 fois par jour).
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la récupération fonctionnelle, la perfusion cérébrale ainsi que le devenir des lésions induites par une ischémie-reperfusion. Les animaux utilisés seront âgés de 10 semaines soit un poids d’environ 35g pour les SWISS. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.
PhotoBioModulation (PBM) : Évaluation préclinique de Sécurité, de Performance et d’Efficacité d’un nouveau dispositif médical en vue de traiter par PBM l’ischémie/ reperfusion cardiaque aigue sur un modèle porcin.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
95 porcs vont être utilisés, opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil. Chez 75 d'entre eux une ischémie cardiaque est provoquée puis reperfusée, avec suivi par IRM et prélèvements sanguins, pour évaluer un dispositif médical de photobiomodulation, les 20 autres étant utilisés pour en tester la sécurité. Le porteur indique que l'instabilité peut déclencher des arythmies et estime à 30 % le risque de décès malgré la réanimation. Il présente le porc comme le "modèle le plus pertinent" du fait d'une anatomie cardiaque proche de l'humain, et destine les données au marquage CE et à la FDA.
Objectifs
L'infarctus du myocarde se définit comme la nécrose d'une partie du muscle cardiaque, lorsque cette zone n'est plus irriguée par les artères coronaires qui lui apportent l'oxygène véhiculé par le sang. La prise en charge de l’infarctus du myocarde consiste à rétablir le flux sanguin en débouchant l’artère (reperfusion) le plus rapidement possible après le début des symptômes. Bien que cette reperfusion soit obligatoire pour la survie du patient, elle engendre par elle-même des répercussions que l’on associe aux problèmes d’ischémie/reperfusion qui peuvent induire des phénomènes de mort tissulaire jusqu’à plusieurs jours après la reperfusion. La thérapie par Photobiomodulation (PBM) se définit comme une irradiation lumineuse athermique et non ionisante aux longueurs d’ondes visible et proche infrarouge, pour stimuler la consommation d’oxygène en phase d’hypoxie ou stimuler la réponse cellulaire et tissulaire afin d’améliorer la cicatrisation des tissus et en réduire l’inflammation. Nous développons un nouveau dispositif médical (DM) innovant utilisant les principes de la PBM, véritable rupture technologique avec les approches thérapeutiques proposées actuellement. Nos travaux préliminaires sur la première version de notre dispositif médical ont montré des résultats pertinents en termes d’efficacité de notre dispositif médical pour améliorer la fonction myocardique après reperfusion. L’objectif de cette étude préclinique est d’évaluer une version améliorée de notre dispositif médical et de notre thérapie par PBM avec preuve statistique. Pour cette étude en phase aiguë, sans réveil, 95 porcs seront nécessaires pour fournir les informations suffisantes pour aller vers un projet de phase clinique chez l'homme : - Étude de sécurité et de performance sur 20 porcs sains - Étude d’efficacité sur 75 porcs présentant une pathologie induite (ischémie cardiaque suivie d’une reperfusion) : 25 témoins, 25 traités par PBM dose 1 et 25 traités par PBM dose 2. Le modèle utilisé est le porc adulte de taille réduite qui présente une anatomie coronaire et cardiaque très semblable à l’homme et cela fait du porc le modèle le plus pertinent pour étudier les mécanismes de l'ischémie reperfusion. Tous les animaux seront profondément endormis sous anesthésie générale, avec une prise en charge de la douleur. En fin de procédure, tous les animaux seront euthanasiés pour les prélèvements histologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra : - pour l’étude sur la sécurité et la performance du dispositif médical, DM (20 porcs sains) : • de fournir les éléments pour instruire une partie de l'analyse de risque de notre DM. Étudier et, si besoin, modifier des points faibles rencontrés sur notre DM lors de sa mise en place et lors de son utilisation. Cette étude doit aussi nous permettre de fournir des informations pour instruire nos dossiers réglementaires (dossier technique pour le marquage CE) • de valider et de disposer d'éléments tangibles et quantifiables de la capacité de notre DM à délivrer la dose photonique déterminée de façon fiable et reproductible. - pour l’étude sur l’efficacité du DM (75 porcs présentant une pathologie cardiaque induite): • de démontrer que le traitement par PBM à 2 doses différentes améliore la fonction myocardique et diminue la lésion d’ischémie et de reperfusion cardiaque comparativement au groupe Témoin non traité. Nous voulons développer un produit qui permet d’irradier le cœur in situ par PBM pour pallier significativement les effets de la reperfusion lors de la prise en charge de l’infarctus aigu du myocarde. Sur la base des résultats obtenus, nous pourrons soumettre une étude préclinique d’efficacité en phase chronique et dans les circonstances de non-risques potentiels (sécurité, performance et efficacité du dispositif médical), un essai pilote d’étude clinique sera proposé afin d’évaluer notre traitement par PBM chez des patients présentant une ischémie cardiaque. Cette nouvelle approche thérapeutique pourrait réduire significativement les lésions et la perte de la fonction cardiaque suite aux phénomènes délétères de la reperfusion suivant l’ischémie.
Procédures
La procédure est sans réveil et sera réalisée sous anesthésie générale durant toute la procédure. Les animaux seront prémédiqués, intubés et anesthésiés durant toute l’intervention. L’oxymétrie sera contrôlée par un capteur approprié qui vérifiera la saturation en oxygène. Durant l’intervention, les porcs seront sous un mélange O2/air et sous perfusion d’un agent anesthésique et sous perfusion lente d’antalgique. Cette anesthésie permettra à l’animal d’être en anesthésie profonde et sans souffrance. - La procédure chirurgicale sera réalisée sur tous les animaux, 1 seule fois, avec un suivi pendant 5h de la procédure, puis euthanasie (animal toujours placé sous AG) - Le suivi par imagerie IRM sera réalisé sur tous les animaux sous AG - Prélèvements sanguins (via le cathéter veineux central) sur tous les animaux, 3 fois, durant la procédure. - Prélèvements du cœur après euthanasie.
Impact sur les animaux
Cette procédure en phase aiguë est sans réveil. Tous les animaux seront placés sous anesthésie générale durant toute la procédure, avec une prise en charge continue de la douleur. Le stress éventuel auquel l’animal pourrait avoir été induit avant son arrivée au bloc, ainsi que son état général sont controlés par un suivi des marqueurs que nous utilisons lors de la mise sous anesthésie générale. Les effets indésirables attendus pourraient survenir lors de l’étude d’efficacité du DM, pendant la phase d’ischémie cardiaque et lors de la phase de reperfusion : une trop forte instabilité hémodynamique pourrait entraîner des arythmies et des fibrillations auriculo-ventriculaires. Des manœuvres de réanimation (massages cardiaques et défibrillation par électrochocs) ainsi qu’une médication appropriée (anti-arythmiques, vasoconstricteurs, protecteur membranaire…) sont prévues afin de minimiser les risques. Cependant, nous ne pouvons pas exclure un décès de l’animal qui sera prononcé après 50 minutes de réanimation non efficace. Selon notre expérience, ce risque s’élève à 30% des cas.
Devenir
A l’issue de la procédure, tous les animaux (toujours placés sous anesthésie générale) seront euthanasiés par injection veineuse de barbiturique afin de prélever le cœur qui sera observé macroscopiquement lors de l’explantation. Des échantillons seront ultérieurement étudiés par analyse histologique et biologique afin de nous permettre d’observer d’éventuelles lésions tissulaires, de quantifier la zone à risque et d’évaluer ainsi la sécurité de notre dispositif médical implanté in vivo.
Remplacement
Les effets de la PBM ont été testés au préalable sur des cellules cardiaques en cultures et sur des embryons de poulet. Ils se poursuivent encore actuellement sur des études in vitro de respiration mitochondriale de cardiomyocytes humains soumis à la PBM. Cependant, afin d’évaluer notre dispositif médical (DM) à taille réelle (similaire à celui qui sera utilisé chez l’homme) et dans un cadre réglementaire, nous avons besoin d’utiliser un modèle animal pour étudier sa sécurité et son efficacité et pour évaluer les risques de première utilisation.
Réduction
Pour cette étude, le nombre total d'animaux a été défini pour permettre de disposer d'éléments suffisants pour passer chez l'homme. Pour l’étude d’efficacité, cet effectif permettra de réaliser des statistiques sur les groupes traités par PBM comparativement au groupe témoin. Après expérimentation, du matériel biologique (organes, tissus) pourra être prélevé. Dans le cadre d’une collaboration dans la même structure d’expérimentation avec une autre équipe travaillant sur le sujet de l'ischémie/reperfusion, les données et tissus issus du lot témoin et des prélèvements pourront éventuellement servir pour les besoins d’autres études non liées à ce protocole et ainsi éviter d’utiliser des animaux supplémentaires. L'ensemble des informations recueillies chez l'animal "proche de l'homme" seront utilisées pour le dossier de demande de marquage européen (CE) et pour les autorités Américaines (FDA). .
Raffinement
Pour réduire le mal être et la souffrance de l’animal lors de nos interventions : - L’entrée des porcs dans la structure expérimentale est programmée de façon à fournir aux animaux un environnement optimum (mise en loge d’expérimentation au minimum 7 jours avant l’intervention, avec un enrichissement du milieu). - Les porcs sont hébergés dans les conditions adaptées à leur espèce, logés sur copeaux, en groupes sociaux, avec jeux à leur disposition. Un suivi quotidien leur est apporté. Un vétérinaire assure le suivi sanitaire - Pour le transport vers le site d’expérimentation, l’animal déjà isolé dans un box de l’animalerie à proximité de ses congénères la veille de son départ (pour la mise a jeun), est tranquillisé par un sédatif - Les animaux seront placés sous anesthésie générale pendant toute la procédure, avec une prise en charge de la douleur (perfusion continue et lente d’antalgique durant toute la procédure d’ischémie et de reperfusion) - Durant la procédure sous anesthésie générale, la température corporelle des animaux sera maintenue grâce à une couverture chauffante ou des bouillottes d’eau chaude (dont l’eau chaude sera régulièrement renouvelée). - Pour la mise à mort, l’animal est toujours placé sous anesthésie générale avant induction d’une surcharge de barbiturique.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie pour notre étude est le porc adulte de taille réduite (âgés de >24 mois, 55-70kg). Ce stade physiologique et cette taille "adulte" est nécessaire pour tester notre dispositif médical et être au plus près des conditions humaines. L'anatomie vasculaire est à ce stade plus proche de l’homme, ce qui en fait un modèle parfaitement adapté pour nos essais précliniques. Cette lignée nous permet de faire notre étude sur des porcs adultes représentatifs de l’âge où surviennent les accidents vasculaires cardiaques. Selon notre expérience, le porc charcutier (de type Large White) est moins intéressant, car pris à un âge très jeune (de 3 à 4 mois et pesant de ce fait 40/60 kg) pour avoir un poids manipulable, il présente une anatomie vasculaire plus éloignée et moins prédictive de ce qui se passe chez l’homme adulte. . Nous utiliserons des porcs adultes de taille réduite, d’âge supérieur à 2 ans, de sexe mâle (castré) ou femelle, ayant un poids compris entre 55 et 70 kg. L’éleveur est le fournisseur exclusif de cette souche de porcs. Nous avons des données expérimentales importantes sur la lignée elle-même et sur ce type d’expérimentation nous permettant de limiter le nombre d’animaux à utiliser dans de nouveaux protocoles sans réveil de l’animal. Les résultats obtenus sur les animaux de cet âge sont convaincants et suffisants dans nos études. Ce modèle animal nous permet : - De travailler sur des animaux représentatifs de l’âge où surviennent les pathologies chez l’homme. - D’utiliser un dispositif médical qui sera l’exacte copie du dispositif médical utilisé en clinique humaine (exigence réglementaire) - De transposer les connaissances acquises vers une utilisation en clinique humaine.
Effet du stress néonatal sur la réaction de sevrage et la prédisposition a des maladies inflammatoires chez l’adulte.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
4 056 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des nouveau-nés reçoivent des injections de dexaméthasone pour reproduire un stress précoce, puis à l'âge adulte une partie subit des colites induites au DSS ou à l'oxazolone, un test de comportement non précisé et des prélèvements sanguins, pour étudier l'effet du stress néonatal sur l'intestin et le poumon. Le porteur annonce une possible baisse de prise de poids et, pour les colites, une mise à mort à 15 à 20 % de perte de poids. Il affirme qu'il reste "impossible" de reconstituer in vitro les conditions de la réponse au stress, tout en décrivant des expériences sur organoïdes menées en parallèle.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de comprendre comment le stress néonatal influence la réaction de sevrage et impacte le fonctionnement physiologique de l’intestin chez l’adulte. Notre but est de comprendre comment le stress au jeune âge cause des modifications épigénétiques et transcriptionnels dans le tissu intestinal qui perdurent au cours du temps, induisant une prédisposition accrue aux maladies inflammatoires intestinales, comme le syndrome du côlon irritable ou la maladie de Crohn, ou des allergies ou infections bactériennes dans le poumon, chez les adultes. L’objectif ultime de ce projet est d’étudier quelles sont les cellules, les voies de signalisation et les molécules ciblées, au niveau de l’intestin et au niveau systémique, par la réponse au stress durant la période néonatale.
Bénéfices attendus
Le stress est un facteur environnemental qui a un impact majeur sur la physiologie du corps. Bien que bénéfique dans certaines situations, le stress peut avoir un effet très négatif sur le fonctionnement de l’organisme. Par exemple le stress est associé à des troubles psychologiques comme la dépression ou l’anxiété, mais il est aussi associé à un risque accru de développement de tumeurs et de maladies inflammatoires. L’intestin et le poumon sont des organes particulièrement sensibles au stress. Plusieurs études ont montré que des maladies inflammatoires comme la maladie de Crohn ou la rectocolite ulcérative, sont associées au stress chronique. D’autres syndromes intestinaux, comme le syndrome du côlon irritable ont été associés au stress, en particulier au stress durant le jeune âge. De même des études ont montré que la repose au stress a un impact important sur la physiologie et le développement du poumon. Dans ce projet nous voulons comprendre l’impact à long terme du stress sur le fonctionnement de l’intestin et du poumon. En particulier, nous voulons comprendre comment le stress peut influencer le développement des cellules épithéliales intestinales et pulmonaires ainsi que le fonctionnement du système immunitaire. L’objectif est de découvrir des voies de signalisation ciblées par le stress qui sont à l’origine des différentes maladies intestinales et pulmonaires associées au stress chez l’adulte. .
Procédures
4116 souris : injection intra-péritonéale(30 secondes): 3 jours consécutifs ou une seule fois. 288 souris : traitements intra-nasale(5 minutes) : 2 fois. 240 souris : gavage oral(30 secondes ) : 1 seule fois. 390 souris : test de comportement (15 mins) : une seule fois. 690 souris : traitement au DSS par voie orale dans l’eau de boisson ( 5 jours traitment, 5 jours eau normal, 5jours traitment ). 300 souris :traitment Oxazolone par voie orale dans l’eau de boisson(7 jours) : une seule fois. 480 souris : administrations d’antibiotique par voie orale dans l’eau de boisson : 3 semaines. 3648 souris: pélèvement de sang sinus-retromandibulaire : 2 mins 1 ou 2 fois selon la procédure.
Impact sur les animaux
Le modèle utilisé dans ce projet se base sur un protocole publié en 2018) dans le préstigieu journal Cell. Dans cette étude, les auteurs traitent des souris avec de la dexaméthasone à différents moments du développement embryonnaire ainsi que durant les premiers stades de la vie postnatale. Aucun effett nocif ou toxique pour les souris n’a été reporté. Cependant, des modèles de stress précoce, tel que la séparation maternelle, qui sont plus sévères, peuvent entraîner une réduction du gain de poids corporel au cours des premières semaines de vie. Il est donc possible que dans notre modèle nous puissions observer un impact sur la prise de poids des souris traitées à la dexaméthasone pendant les premières semaines de vie.
Devenir
Suite à chaque procédure les souris seront mise à mort dans le but de faire de prélévement des tissues biologiques dans le but d’étudier l’effet du stress sur la physiologie et anatomie de l’intestin, le poumon et le cerveau.
Remplacement
L’étude proposée ici, implique l’analyse de l’interaction complexe entre le microbiote intestinal, l’activation de l’axe Hipothalamo-pituito-surrenale (HPS), un circuit multi-organe qui inclue le système neveux centrale, la glande pituitaire et la glande surrénale et qui s’active lors de la réponse au stress. L’impact de cette activation affecte plusieurs types de cellules intestinales et immunitaires au cours du temps (pendant plusieurs semaines). Il est à ce jour encore impossible de reconstituer in vitro toutes les conditions nécessaires pour pouvoir établir les conclusions qui nous permettrons de comprendre l’impact du stress sur l’intestin et ses effets sur la prédisposition à développer des maladies intestinales inflammatoires. Cependant, dans l’effort de diminuer la souffrance animale, certaines expériences seront réalisées in vitro. En particulier nous allons utiliser des nouvelles techniques pour développer des organoïdes intestinaux afin d’étudier l’impact du stress sur l’épithélium intestinal. De plus nous allons générer une bases de données en faisant des experiences de sequencage de l’ARN ce qui permettra d’avoir un grand nombre d’information tout en réduisant la quantité d’animaux utilisés. De plus, nous allons utiliser des bases de données déjà existantes ( sequencage d’ARN des cellules d’interet qui sont accessible au public) pour faire des analyses in silico qui permettrons d’émettre des hypothèses et obtenir des résultats avec l’utilisation d’un nombre limité d’animaux.
Réduction
D'après la littérature , l, les effectifs par groupe prévus permettent d'atteindre des tailles d'effet compatibles avec la question biologique, en prenant en compte la forte variabilité des données (microbiote) et le caractère doublement emboité du plan d'expérience (via les effets portée et cage). Le calcul de ce nombre tient compte d’un minimum de sang, de cellules et d’organes à collecter pour l’analyse et inclut pour chaque série d’expériences le nombre nécessaire de contrôles. Il tient également compte de la nécessité de reproduire les résultats, afin de pouvoir identifier et exclure des artéfacts expérimentaux et ainsi des erreurs d’interprétation. Nous avons utilisé l’outil statistique afin de déterminer le nombre minimal de souris à utiliser par groupe pour obtenir des résultats significatifs en tenant compte de la variabilité inhérente à l’expérimentation. Les données obtenues, seront analysées grâce à des modèles statistiques ajustés sur plusieurs facteurs (sexe de l’animal, traitement). Plusieurs facteurs de variabilité indésirable seront à prendre en compte grâce à des modèles emboîtés (modèles mixtes) tels que l’effet répétition de l'expérience.
Raffinement
Le degré de sévérité des procédures expérimentales dans lesquelles les animaux sont inclus est léger ou modéré. Le degré de souffrance modéré concerne les expériences menant à une maladie inflammatoire, dont la sévérité peut être facilement suivie de manière quotidienne et non invasive. En particulier dans le cadre de l’inflammatoin intestinale les aniamux seront suivi par un examen quotidien des selles ( presence de sang), ainsi qu’une mesure du niveaux de lipocaline 2 par un test ELISA. En effet il a été montré dans literature que la mesure de lipocaline 2 est une methode non invasive permettant de surveillé l’état d’inflammation intestinale des souris. De plus, nous allons faire un suivie quotiden du poids des souris. En cas de perte importante de poids( entre 15 à 20% du poids initiale) et d’un augmentation significative de niveau de lipocaline 2 dans les selles, les souris seront mis à mort et l’expérience sera terminée. Dans le cadre de l’inflammation pulmonaires ou des allergies, nous allons faire un suivi des capacité respiratoires de souris tous les 30 mins durant les 4h qui suivent le traitment de l’allergène . De plus, nous allons surveiller, de manière quotidienne, l’état de l’animale tout au long des procédures à fin de contrôler toute modification dans son comportement (posture, poile herisé ) .
Choix des espèces
Le but de ce projet est de comprendre les effets du stress néonatal sur la physiologie de l’intestin chez l’adulte. La souris est un modèle animal idéal pour cette étude. La communauté scientifique a une connaissance importante de la biologie du stress chez la souris. De plus, chez la souris, des outils génétiques pourront être utilisés pour cibler des voies spécifiques du stress. Afin de d’étudier l’impact du stress neonatale chez l’adulte nous utiliserons des nouveau-nés et des souris adultes.
Evaluation de nouvelles cibles thérapeutiques dans la leucémie/lymphome T liée à HTLV-1 à l’aide d’un modèle de xénogreffes de souris issues de cellules humaines de patients
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 620 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Fortement immunodéprimées, elles sont greffées avec des cellules leucémiques humaines puis reçoivent des molécules candidates, avec des prises de sang hebdomadaires, pour mettre au point un modèle de leucémie liée au virus HTLV-1 et tester des traitements. Le porteur décrit les effets attendus de la greffe, amaigrissement, perte d'équilibre, difficultés motrices, gonflement du ventre et poils hérissés, suivis par une grille bi-hebdomadaire. Il juge de nouvelles approches thérapeutiques "indispensables" et affirme qu'il n'existe "pas de modèle cellulaire satisfaisant" pour cette maladie.
Objectifs
La leucémie/ lymphome T liée au virus HTLV-1 (ATLL) est une maladie du sang agressive qui est rapidement mortelle dans la majorité des cas malgré des protocoles de traitement intensifs. Ceci est principalement lié à une résistance des cellules leucémiques à la chimiothérapie chez environ 50% des patients. Il est donc indispensable de proposer aux patients de nouvelles approches thérapeutiques. Hormis les lignées dérivées historiques de cellules d’ATLL dont on sait que le comportement est éloigné de celui des cellules d’ATLL de patients, il n’existe pas de modèle cellulaire satisfaisant pour l’étude de la maladie induite. Par conséquent, il est nécessaire de tester l’efficacité de nouveaux traitements sur d’autres modèles, qui de plus représentent la diversité des mutations cancéreuses observées chez les cellules leucémiques des patients. Ce projet fait suite au précèdent projet dont l’objectif initial était l’établissement de lignées à partir de cellules primaires de patients atteints de lymphome/leucémie lié au virus HTLV-1 ou de cellules sur le même modèle de qui est réalisé dans d’autres maladies du sang. Depuis 2019, une vingtaine de cellules primaires d’ATLL ont été injectées à des souris fortement immunodéprimées. Il a été possible d’obtenir 4 lignées stables (après plusieurs réinjections). De manière intéressante, il a été possible de cultiver in vitro pendant quelques jours (2-3 semaines environ) 3 de ces lignées. Ce projet a un double objectif : 1. Mise au point d’un nouveau modèle de leucémie/lymphome T liée à HTLV pour permettre une meilleure compréhension de la maladie induite (poursuite de l’étude débutée en 2019). 2. Evaluer in vitro et in vivo l’efficacité de nouvelles thérapeutiques potentielles qui seront testées seules ou en association pour contrecarrer la résistance primaire des cellules d’ATLL à la chimiothérapie.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est l’identification d’une ou plusieurs molécules d’intérêt qui a (ont) un effet potentiel anti-tumoral sur les cellules d’ATLL. Cette (ces) molécule(s) fera (feront) l’objet d’études approfondies sur son (leur) mécanisme d’action. Enfin à terme, l’objectif est de proposer une étude clinique étant entendu que l’ATLL est une maladie orpheline qui concerne moins de 50 nouveaux patients par an en France mais environ 1000 cas par an au Japon et que l’ATLL est un modèle pour d’autres maladies du sang.
Procédures
Les souris seront greffées avec des cellules leucémiques d’origine humaine par voie intrapéritonéale, intraveineuse (queue) ou sous-cutanée (durée du geste : quelques secondes). Ce geste ne sera réalisé qu’une seule fois. Des prises de sang (50 microlitres maximum) seront réalisées de façon hebdomadaire pour évaluer la prise de greffe (durée du geste : quelques secondes). Des candidats molécules thérapeutiques seront administrées aux souris selon un schéma propre déjà décrit dans la littérature dans le cadre d’autres études sur d’autres cancers ; les doses injectées et les fréquences décrites n’engendrent pas d’effets secondaires néfastes. Différents modes d’injections seront utilisés (en respectant les volumes maximaux associés à chaque voie) : - Intrapéritonéal (quelques secondes) - Intraveineux : sous anesthésie gazeuse ou médicamenteuse (durée quelques minutes entre l’anesthésie et l’injection) - Gavage (quelques secondes)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables liés à la greffe de cellules tumorales humaines ont été observés et mesurés au cours du projet précédent et ont conduit au développement d’une grille de suivi spécifique bi-hebdomadaire : amaigrissement, ataxie (perte d’équilibre), des difficultés motrices, le gonflement du ventre, perte de poils ou poils hérissés. L’apparition d’un dos voussé ou d’un faciès douloureux est également noté. Les molécules candidates ont toutes déjà été utilisées dans des modèles murins et la quasi-totalité ont fait l’objet de publications scientifiques. Pour la majorité de ces molécules, il n’est pas rapporté d’événement indésirable notable en lien avec leur administration. Quelques-unes ont conduit à une dégradation de l’état des souris imputé à l’apparition d’un syndrome de lyse tumorale en cas d’administration à un stade de prise de greffe avancé ; pour ces molécules, nous privilégierons leur utilisation dans le cadre d’un traitement avant la prise de greffe afin de limiter ce risque et monitorerons de manière plus rapprochée les animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car immunodéficients, infectés par le virus HTLV-1 et développant une tumeur.
Remplacement
Hormis les lignées dérivées historiques de cellules d’ATL (lignées TLOMI et MT1) dont on sait que le comportement est éloigné de celui des cellules d’ATL primaires, il n’existe pas de modèle cellulaire satisfaisant pour l’étude de la maladie liée au virus HTLV-1 (conclusion tirée après concertation entre laboratoires travaillant sur cette pathologie et analyse de la littérature). Les molécules que nous utiliserons auront toutes été préalablement testées et validées in vitro sur des cultures de cellules avant leur administration chez la souris. Cependant, cette étude in vitro, qui permettra de fortement limiter le nombre de molécules candidates à tester, ne peut remplacer une étude préclinique sur modèle animal pour tester leur efficacité in vivo.
Réduction
Nous utiliserons une double stratégie de réduction du nombre d’animaux utilisés dans le cadre de cette expérimentation. Dans un premier temps, toutes les molécules candidates seront testées in vitro sur des cultures de cellules, et seules les molécules ayant démontré une efficacité sur la viabilité des cellules tumorales in vitro seront utilisés dans le cadre de cette expérimentation. Dans un deuxième temps, nous évaluerons l’efficacité des molécules les plus efficaces dans le cadre d’un traitement avant greffe de tumeurs sur souris. Seules les molécules efficaces dans la procédure 2 seront ensuite éventuellement testées dans le cadre d’un traitement curatif (après la greffe), seules ou en association avec une chimiothérapie. Au niveau statistique, le nombre d’animaux prévu pour les procédures 2 et 3 est compatible avec la mise en évidence d’effets expérimentaux forts, ce qui est l’objectif recherché. Une hétérogénéité est attendue entre les différentes lignées (hétérogénéité génétique selon les patients), donc l’analyse des données devrait faire appel à des modèles statistiques spécifiques.
Raffinement
Une grille d’évaluation spécifique ainsi que des points limites spécifiques ont été développés au cours du projet précédent de génération des cellules, et seront utilisés afin de suivre de manière rapprochée et la plus précise possible la pris de greffe chez les animaux, et d’intervenir précocément en cas de signe de souffrance. Les points suivis sont : l’amaigrissement (grâce à l’aspect de la colonne vertébrale, le poids n’ayant aucune signification lors d’une prise de greffe), l’ataxie (perte d’équilibre), des difficultés motrices, le gonflement du ventre, l’aspect du pelage (perte de poils ou poils hérissés). L’apparition d’un dos voussé ou d’un faciès douloureux est également noté. En lien avec les animaliers chargés du suivi, nous avons développé une grille d’intensité (+, ++ ou +++) de ces symptômes conduisant aux points limites des expériences. Toute observation inhabituelle est également répertoriée et évaluée. En cas d’injection de la tumeur par voie sous-cutanée dans dugel, le volume tumoral sera évalué par mesure au pied à coulisse deux fois par semaine.
Choix des espèces
Le projet précédent a permis d’établir qu’un modèle ce cellule était réalisable dans le cadre de l’ATLL sur des souris femelles immunodéficientes, en conservant la plupart des caractéristiques de la tumeur initiale, ce qui en fait un modèle très pertinent pour étudier la maladie HTLV-1 induite et rechercher de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous ne disposons pas à ce jour de modèle d’étude plus proche de la maladie initiale et représentatif de l’hétérogénéité clinique et moléculaire de la maladie. Les souris seront âgées de 7 à 15 semaines au moment de l’injection de cellules de patients ATLL (même stade de développement que dans le projet précédent de développement des lignées, et que dans d’autres projets d’études de leucémies/lymphomes). En l’absence d’apparition de signes de souffrance ou d’atteinte d’une prolifération suffisante de cellules cancéreuses dans le sang des souris, les animaux seront mis à mort au plus tard un an après injection.
Évaluations de l’efficacité des traitements antibiofilms pour les biofilms bactériens pathogènes colonisés dans des cathéters intraveineux chez le rat.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
688 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit la pose chirurgicale d'une chambre implantable et d'un cathéter, une injection sous-cutanée quotidienne jusqu'à vingt jours, une infection bactérienne et jusqu'à quatre prélèvements sanguins, pour évaluer des traitements contre les biofilms qui colonisent les cathéters. Le porteur décrit les nuisances attendues comme la chirurgie et une possible infection avec perte de poids et douleur. Il écarte le remplacement in vitro au motif qu'il ne reproduirait pas la complexité d'un "organisme entier" et sa réponse immunitaire.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans le travail de notre laboratoire visant à mieux comprendre la physiologie distincte des bactéries grandissant au sein d’une communauté de biofilm, et ce afin de mettre au point des méthodes efficaces pour contrôler les infections dues aux biofilms. Les communautés bactériennes en biofilms sont particulièrement difficiles à éradiquer car elles sont à la fois protégées de l’action du système immunitaire par la structure physique du biofilm (présence de matrice extracellulaire) ainsi que de l’action des antibiotiques par la présence, au sein du biofilm, de sous-populations de bactéries particulièrement tolérantes aux antibiotiques, les bactéries « persistantes ». Ce projet vise donc à identifier chez certaines bactéries pathogènes les fonctions responsables de la colonisation de cathéters centraux, d’évaluer des traitements de type préventifs ou curatifs pour éviter la formation de biofilms ou éradiquer des biofilms existants, et enfin de déterminer si le traitement de ces biofilms par des antibiotiques peut entraîner la sélection de résistance à ces antibiotiques. Les connaissances qui seront acquises au cours de ce projet permettront de fournir de nouvelles pistes sur les traitements à utiliser pour lutter contre les infections liées aux biofilms tout en prenant en compte le facteur sélection de résistance aux antibiotiques.
Bénéfices attendus
Les avantages escomptés sont la compréhension des mécanismes mis en jeu lors de la formation de biofilms sur des cathéters centraux par certaines bactéries pathogènes et de la réaction de ces bactéries à certains traitements. Nous pourrions mieux appréhender si certaines bactéries peuvent développer des mécanismes de résistance, ou bien si les traitements préventifs ou curatifs appliqués sont efficaces pour éviter la formation de biofilms, ou traiter les biofilms dans le cas où ceux-ci sont déjà formés. Grâce à ces études qu’on peut estimer être pré-cliniques, on peut envisager dans le futur d’adapter certains traitements contre ces infections dues à la colonisation de matériel médical et ainsi réduire le taux de morbidité et mortalité des patients malheureusement infectés.
Procédures
Toutes les interventions en dehors de la contention seront faites sur animaux anesthésiés par anesthésie gazeuse. Chaque rat subira une injection sous-cutanée quotidienne rapide (quelques secondes) sur l’ensemble de la durée des procédures employée (au maximum sur 20 jours). Chaque rat subira une pose de chambre implantable dans le dos et une cathéterisation. L’intervention chirurgicale durera 45 min. Chaque animal subira au maximum 4 prélèvements de sang au niveau caudal chacun à plus de deux jours d’intervalle. Ceux-ci dureront moins de 3 min.
Impact sur les animaux
Les nuisances causées aux animaux seront liées à la chirurgie nécessaire pour la pose du cathéter central et au possible développement d’une infection bactérienne (perte de poids et douleur dans le respect des points limites).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront tous subis une intervention chirurgicale avec pose d’un implant et été infectés par une bactérie pathogène. Cela implique que 1) leur défense immunitaire sera différente d’autres animaux non exposés à ce même pathogène et 2) ils sont potentiellement devenus porteurs asymptomatiques de cette bactérie pathogène et seraient donc susceptible de la transmettre s’ils étaient réutilisés. De plus, tous ces animaux seront sacrifiés pour analyser des organes vitaux.
Remplacement
Ce projet ne peut malheureusement pas s’envisager dans des systèmes in vitro, qui sont inappropriés pour reproduire la complexité d’un organisme entier et sa réponse à l’infection (système immunitaire). La complexité des facteurs de l’hôte qui peuvent influencer le processus de colonisation des matériels médicaux est notamment trop importante pour être reproduite à ce jour in vitro.
Réduction
D’une part, en amont des expériences conduites chez l’animal nous effectuons de nombreuses expériences in vitro afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires. Pour ce qui est des traitements innovateurs qui seront testés, aucun d’entre eux ne sera évalué in vivo si celui-ci n’a pas d’abord démontré son efficacité in vitro. Les protocoles in vivo sont rédigés en amont pour éliminer le risque de réaliser une expérience non indispensable (rejet d’investigations discutables). Un maximum de 4 souris par groupe sera utilisé afin d’assurer une représentativité statistique minimale. Au maximum 2 répétitions seront réalisées de façon indépendante pour valider les résultats expérimentaux et augmenter la puissance des analyses statistiques. L’outil de bioluminescence sera utilisé pour évaluer l’évolution de l’infection in situ au niveau du cathéter central et en dehors de celui-ci, pour suivre le même animal au cours du temps, limiter les variations inter-individuelles et ainsi diminuer le nombre d’animaux requis.
Raffinement
Les Rats hébergés à 4 maximum par cage. Le fait d'avoir un hébergement de 4 animaux par cage au lieu d'un seul conduit à un meilleur confort pour les rats, moins d’anxiété et moins d’agitation lors des manipulations. Cette cohabitation n’est pas associée à un plus grand risque de difficultés de cicatrisation ni d’ablation intempestive des chambres implantables. Nous ferons une visite quotidienne durant la phase d’acclimatation, même en l’absence de manipulation, puis au moins une fois par 24h durant les jours suivant. Une attention particulière sera donnée après la phase de chirurgie et d’inoculation des cathéters par les bactéries.
Choix des espèces
Le choix de cette espèce s’est naturellement faite par le type de matériel implantable à utiliser dans nos expériences. Le cathéter intraveineux à chambre implantable de type pédiatrique est directement pertinent pour le traitement d’infections chez les patients dû au diamètre interne du cathéter ainsi qu’au type de matériau qui ont un impact majeur sur la formation du biofilm. Les dimensions d’un cathéter de type pédiatrique ne permettent pas une adaptation à des animaux plus petits comme la souris. Tous les animaux fournis seront des rats mâles de 8 semaines et d’environ 275-300 g. À ce stade, les veines ont atteint une taille suffisante pour faciliter la pose du cathéter, et le système immunitaire pleinement développé pour participer au contrôle des contaminations du matériel implanté.
Analyse de l’infection du foie par Enterococcus faecalis
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles sont soumises à une alcoolisation forcée à doses élevées, à un régime gras ou à une cirrhose provoquée par injections, avec des injections et gavages répétés, pour comparer trois modèles de maladie du foie et étudier le rôle de la bactérie Enterococcus faecalis. Le porteur indique que l'alcool peut provoquer une réaction forte et rapide, que la cirrhose induite entraîne une inflammation péritonéale, et que les doses de bactéries choisies évitent des symptômes sévères. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune approche in vitro ne reproduit les interactions entre intestin, foie et système immunitaire et conclut au recours à la souris.
Objectifs
Les bactéries présentes dans les intestins de notre organisme jouent un rôle important dans la susceptibilité des patients atteints de maladies chroniques du foie. Les manifestations cliniques des maladies chroniques du foie sont l'hépatite, la fibrose, la cirrhose ou le cancer du foie. Ces manifestations s'accompagnent de lésions dans le foie de plus en plus graves qui empêchent cet organe vital de fonctionner correctement. Ces patients sont sensibles aux infections bactériennes en raison d'un dysfonctionnement de leur système immunitaire et de la traversée des bactéries présentes dans les intestins dans le sang pour rejoindre le foie. Chez les individus en bonne santé, Enterococcus faecalis (E. faecalis) est une bactérie présente en petite quantité dans les intestins. Elle est plus abondante dans les intestins des patients atteints de maladies chroniques du foie et c'est actuellement l’unique bactérie pour laquelle un lien entre sa surabondance intestinale et la gravité des lésions du foie liées à l’alcool a été mis en évidence. L'origine infectieuse des maladies chroniques du foie est encore mal comprise et les mécanismes sur lesquels elle repose restent à définir. Notre objectif est d’identifier les conditions qui favorisent l’infection du foie par E. faecalis et de déterminer les mécanismes qui permettent à cette bactérie d'aggraver les lésions du foie. Pour cela nous avons isoler 3 souches différentes de E. faecalis ayant des propriétés infectieuses différentes. L’objet de cette demande est de comparer trois modèles précliniques de maladies hépatiques chroniques dans lequel le rôle de ces souches de E. faecalis puisse être caractérisé. En particulier, nous analyserons comment E. faecalis aggrave les lésions du foie générées par l’alcool au cours de la maladie alcoolique du foie, celles induites par un régime riche en graisses, en glucides et en cholestérol au cours de la maladie non alcoolique du foie, et celles observées au cours de la cirrhose du foie. Ceci nous permettra d’établir le modèle pré-clinique le plus relevant pour comprendre les mécanismes d’infection de E. faecalis dans le foie. A plus long terme, ces connaissances seront utiles pour comprendre comment des bactéries présentes dans les intestins aggravent les maladies du foie et seront nécessaires pour envisager des innovations pour améliorer la prise en charge des patients atteints de maladies hépatiques chroniques.
Bénéfices attendus
Ces 30 dernières années, l’allongement de l’espérance de vie et les progrès de la médecine ont été associés à une augmentation de la population vieillissante et du nombre de personnes immunodéprimées ou affaiblies, et ont conduit à l’émergence de bactéries qui profitent de la défaillance du système immunitaire pour aggraver des maladies. Parmi ces bactéries dites "pathogènes" car elles sont responsables de maladies, E. faecalis est une bactérie à double visage: inoffensive chez les personnes en bonne santé et pathogène chez les patients avec un système immunitaire affaiblie. Son implication dans les maladies du foie est récente et nous manquons d'éléments pour comprendre son rôle aggravant dans ces maladies. L’ambition du projet dans lequel s’inscrit cette demande est d’établir le modèle de maladie hépatique le plus pertinent pour analyser le rôle de E faecalis.
Procédures
Les interventions soumises aux animaux sont les suivantes : - 160 souris vigiles recevront une injection, deux fois par semaine à 3 jours d’intervalles, pendant 7 semaines. - 240 souris anesthésiées recevront 1 injection, 2 jours par semaine, à 3 ou 4 jours d’intervalle pendant 2 semaines. - 250 souris vigiles recevront 3 injections, 1 fois par jour, 3 jours consécutifs. - 250 souris vigiles seront soumises à un gavage oro-gastrique, 1 fois par jour, 4-5 jours consécutives pendant 2 semaines
Impact sur les animaux
Nous soumettrons les animaux à une alcoolisation forcée avec des doses élevées d’alcool. La quantité d’alcool dans le régime peut engendrer une réaction forte chez la souris en peu de temps. Au cours du traitement riche en graisses, en glucides et en cholestérol, les souris accumulent généralement de la graisse abdominale et présentent une accumulation de graisses dans le foie avec une augmentation modérée du ratio foie/poids corporel. Aucune complication évidente n'est enregistrée autre qu'une légère hyperglycémie. L’injection pour déclencher la cirrhose peut entraîner une irritation locale de la peau et une légère inflammation péritonéale. L’infection ne sera pas à l’origine de symptômes sévères car nous utiliserons des doses de bactéries bien tolérés par les souris. L’utilisation d’un antibiotique pendant 3 jours pourra générer un inconfort digestif qui disparaitra après l’arrêt du traitement. Les effets indésirables de l’anesthésie sont l’hypothermie et l’abolition des réflexes comme pour avaler ou cligner des yeux.
Devenir
Euthanasie pour analyses sur organes post-mortem
Remplacement
Les approches expérimentales chez la souris permettent d’intégrer la complexité des interactions entre l’organisme et la bactérie pathogène. A ce jour, aucune approche in vitro n’est disponible pour remplacer ce type de modèle et « mimer » ces interactions. Au niveau métabolique, les complications qui vont être observées au cours des maladies métaboliques du foie (accumulation de lipides, inflammation, fibrose…) mettent en jeu des interactions entre plusieurs organes en l’occurrence le microbiote intestinal, la barrière digestive dont son système immunitaire, le foie et dans certains cas, les tissus adipeux, interactions qu’il est actuellement impossible de reproduire in vitro. Si nous réalisons en amont un certain nombre d’expériences in vitro sur des hépatocytes, le principal type cellulaire du foie, le foie est composé de différents types cellulaires qu’il est également difficile de mimer in vitro. Le seul modèle auquel nous pouvons avoir recours est donc l’animal permettant d’intégrer la complexité des interactions entre organes et au niveau cellulaire et métabolique et immunologique.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux euthanasiés, nous avons estimé le nombre d’individus à utiliser par groupe sur la base de nos précédents travaux et de la littérature. Dans les trois modèles testés (alcool, régime riche et cirrhose), nos critères de jugement sont liés à la quantité de bactéries présentes dans le foie et à la modulation des transaminases (des enzymes produites principalement par le foie dont l’augmentation traduit la maladie hépatique). Nous avons évalué que le nombre total d’animaux par groupe nécessaire est égale à 20 pour obtenir des résultats significatifs.
Raffinement
Nous veillerons à ce que la réalisation de ce projet soit conforme aux exigences de raffinement liées à l’expérimentation animale. Les souris seront hébergées en petit nombre, par 2 ou 4. Les souris bénéficieront d’un enrichissement dans chaque cage car il diminue le stress de l'animal et facilite la thermorégulation de l'animal. Tout au long des procédures, les souris seront pesées et examinées régulièrement pour détecter des signes de de détresse (changements dans la respiration, poil rêche comportement inhabituel, posture voûtée, perte de poids). La longueur des dents sera vérifiée lors des pesées et coupées avec des ciseaux, si nécessaire. Le temps de manipulation des souris vigiles sera minimisé au maximum afin de limiter le stress et l’angoisse des souris. Les gavages seront réalisés sur souris vigiles pour éviter les fausses routes et réalisés avec un volume réduit et des canules de gavage fines et courtes bien adaptées au modèle murin et à la taille de l’animal. Les gavages seront réalisés par le même ingénieur, formé à cette technique, tout du long du protocole pour limiter le stress des animaux. Le jour des prélèvements d’organes, les souris seront manipulées dans un local différent de celui où seront hébergées les autres souris en attente d’être manipulées.
Choix des espèces
Le modèle murin présente, en plus de qualités propres en terme d'expérimentation, plusieurs avantages pour l’étude des infections par des bactéries pathogènes car les pathologies sont similaires à celles que l’on peut observer chez l’homme. E. faecalis est capable de coloniser le tractus gastro-intestinal des souris, de proliférer et de disséminer via la circulation sanguine comme cela est observé chez certains patients. De plus, les mécanismes cellulaires développés dans les maladies du foie chez la souris sont proches de ceux observés chez l’Homme même si le stade n’évolue pas vers les formes les plus sévères. Dans cette étude, des souris « jeunes adultes » âgées au minimum de 8 semaines seront utilisées. Leur poids devra être supérieur ou égal à 20 g. Il permettra d’assurer une continuité avec les expériences déjà réalisées pour lesquelles les doses de bactéries que nous utilisons ne sont pas à l’origine de symptômes sévères chez ces souris.