Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
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- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etude des interactions neurogliales au niveau des réseaux moteurs spinaux chez la souris nouveau-née après lésion médullaire
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
739 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, les reproducteurs étant réutilisés et le reste tué. Des souris nouveau-nées subissent une lésion de la moelle épinière à la naissance, sont séparées de leur mère plusieurs heures, puis passent des tests moteurs répétés comme le rotarod, pour étudier le rôle des astrocytes dans la spasticité après lésion médullaire. Le porteur indique que la lésion entraîne des troubles de la marche et de la posture, que la séparation maternelle et les tests stressent les animaux, et signale le cannibalisme maternel comme principale difficulté. Sur le remplacement, il affirme que cet objectif ne peut être atteint qu'en étudiant l'animal entier et ne peut se faire chez l'humain.
Objectifs
La spasticité est un déficit moteur invalidant qui touche environ 75 % des patients ayant subi une lésion de la moelle épinière. Elle est caractérisée par des réflexes d’étirement du muscle hyperactif, des spasmes et des réactions exacerbées à des stimuli sensoriels normalement anodins. Il a été montré qu’elle est sous-tendue par une hyperexcitabilité des neurones des réseaux moteurs au niveau de la moelle épinière. Les approches thérapeutiques donnent actuellement des résultats insatisfaisants, d'où la nécessité de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents. Jusqu’à maintenant, la plupart des mécanismes proposés se concentraient sur les neurones et les cellules non-neuronales telles que les astrocytes étaient négligées. Or, on sait désormais que, dans plusieurs pathologies, ces astrocytes jouent un rôle clé dans le contrôle de l'activité neuronale. En effet, ils sont par exemple capables de diminuer l'excitabilité neuronale en recaptant le potassium (K+) et le glutamate extracellulaires. Dans ce contexte, l'objectif de notre projet est (1) de caractériser finement les mécanismes astrocytaires impliqués dans la mise en place de l’hyperexcitabilité des réseaux moteurs de la moelle épinière et (2) d’évaluer l’efficacité de stratégies thérapeutiques ciblant les astrocytes dans le développement de la spasticité.
Bénéfices attendus
En identifiant le dysfonctionnement astrocytaire comme un des mécanismes responsables de l’hyperexcitabilité neuronale après lésion de la moelle épinière, ce projet approfondira nos connaissances sur la physiopathologie de la spasticité. Sachant que la spasticité est un des déficits moteurs causés par plusieurs pathologies (accident vasculaire cérébral, sclérose en plaques, paralysie cérébrale) en plus de la lésion de moelle épinière, ce projet pourra bénéficier à l'ensemble de la communauté biomédicale travaillant sur la spasticité en apportant une meilleure compréhension de ses mécanismes physio-pathologiques. Ce projet dépassera également le cadre de la spasticité. En effet, en combinant un grand nombre de techniques complémentaires (biologie moléculaire, biochimie, histologie, imagerie, électrophysiologie, outils génétiques et comportement), il permettra de fournir une compréhension intégrative de la fonction astrocytaire à travers les échelles (i.e. du moléculaire à l’organisme) et élargira le spectre des cibles thérapeutiques pour restaurer l'excitabilité neuronale dans les maladies neurologiques caractérisées par une hyperexcitabilité neuronale (épilepsie, Huntington, syndrome de Rett).
Procédures
Les souris nouveau-nées subiront une lésion de la moelle épinière à la naissance et selon les cas une injection d'outils génétiques. La chirurgie proprement dite dure entre 10 et 15 minutes et les souris seront séparées de leur mère pendant 4h30 au maximum. Une partie des animaux passera également un ensemble de tests comportementaux ainsi que des enregistrements musculaires tous les 5 jours. Au jour post-natal 5/6 (P5/6) et 10/11 (P10/11), les souris seront soumises à 3 tests et à P15/16 et P20/21 à 4 tests. Les animaux seront séparés de leur mère pendant 4h au total les jours de test. En ce qui concerne les mâles reproducteurs, ils auront une biopsie au niveau de la queue.
Impact sur les animaux
Les souris nouveau-nées subiront une lésion de la moelle épinière à la naissance et selon les cas une injection d'outils génétiques. Cette intervention entraînera des troubles de la marche et de la posture chez les animaux. Une partie des animaux subira également un panel de tests comportementaux ainsi que des enregistrements musculaires. Pendant ces tests, les animaux seront séparés de leur mère, ce qui engendrera du stress. Les tests comportementaux induisent également un stress plus ou moins important selon leur nature (par exemple, la mesure de l’activité locomotrice spontanée est peu stressante alors que le rotarod - cylindre qui tourne sur lui-même sur lequel les souris doivent marcher - est plus stressant). L’utilisation d’animaux transgéniques nous amènera à effectuer des biopsies de la queue en vue du génotypage, ce qui engendrera un stress et une douleur au niveau de la queue des animaux biopsiés.
Devenir
Tous les animaux lésés et leurs contrôles seront mis à mort pour les prélèvements. Les animaux reproducteurs seront réutilisés dans la mesure du possible.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de déterminer les mécanismes astrocytaires mis en jeu lors de lésion de la moelle épinière et résultant en une hyper-excitabilité des réseaux moteurs de la moelle épinière amenant au phénomène de spasticité au niveau musculaire. Cet objectif ne peut être atteint qu’en étudiant l’animal dans son ensemble et il ne peut être réalisé sur le sujet humain.
Réduction
Les animaux qui effectueront les tests comportementaux seront également utilisés pour les analyses post-mortem. Les données seront normalisées par rapports aux contrôles de la même portée afin d’éviter tout biais lié à la portée. Lorsqu’il nous restera des échantillons, ils seront mis à disposition d’autre membres de l’équipe ou du laboratoire travaillant sur des thématiques similaires (exemple : étude des propriétés intrinsèques des neurones ou de l’inflammation après lésion de la moelle épinière). Lorsque les nouveau-nés ne peuvent rentrer dans ce projet car la mise-bas a eu lieu un week-end ou un jour où nous ne pouvons pas expérimenter, les autres groupes de recherche du laboratoire expérimentant sur cette souche sont prévenus afin qu’il puisse rentrer ces animaux dans leur projet.
Raffinement
Lors de la chirurgie, les animaux sont anesthésiés et ils reçoivent une injection d'analgésique. Nous limitons la portée à 10 animaux, ce qui permet d'éviter une compétition alimentaire trop importante entre les animaux lésés et les animaux contrôles (la souris a 10 mamelles). Que ce soit pour la chirurgie ou les test comportementaux, nous veillons à ce que les animaux soient en contact avec de la litière provenant de leur cage d'origine afin qu'ils soient en présence d'odeurs familières. A partir du jour post-natal 15 (P15), du gel nourrissant leur est fourni dès qu'ils sortent de la zone de stabulation pour les tests comportementaux. Le plus gros problème rencontré dans nos procédures est le cannibalisme maternel. Afin de diminuer au maximum ce phénomène, nous mettons en place plusieurs actions : 1- seules les femelles qui ne présentent pas de signes de stress sont utilisées 2- nous favorisons l'utilisation de femelles non primipares 3- une grande quantité de matériel de nidification est fournie 4- les femelles ne sont manipulées qu'avec des tunnels 5- deux à trois fois par semaine pendant la gestation, nous fournissons quelques friandises ou du gel nourrissant aux femelles afin qu'elles associent notre intervention à quelque chose de positif. La croissance pondérale est le principal marqueur de bonne santé chez les nouveau-nés puisqu'elle indique que l'individu arrive à se nourrir et que la mère s'occupe bien de lui. Ainsi tout individu qui présente une croissance pondérale altérée est, selon le degré, suivi de plus près (point limite) ou euthanasié (point d'arrêt).
Choix des espèces
La souris est l'espèce la plus pertinente pour notre étude car (1) le modèle de lésion spinale chez la souris est largement documenté dans la littérature, (2) ce modèle est très bien maitrisé dans notre équipe de recherche et (3) notre projet implique l'utilisation de souris transgéniques. Nous utiliserons le modèle de lésion de la moelle épinière chez la souris nouveau-née plutôt que le modèle adulte car nous voulons déterminer l'impact des astrocytes sur l'excitabilité des motoneurones de grande taille. L'enregistrement de ces motoneurones dans des tranches adultes est extrêmement difficile, principalement en raison de leurs ramifications développées et de leur plus grande sensibilité au manque d'oxygène, inévitable au cours du processus de coupe d’où l’utilisation du modèle nouveau-né.
Influence de l’arasement des barrages en rivière sur l’histoire de vie de poissons migrateurs: cas de l’Anguille et du Flet
- Conservation des espèces
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
740 poissons, anguilles et flets, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la majorité des anguilles étant relâchée après mesures et 140 individus tués. Capturés en rivière et en estuaire, ils sont anesthésiés pour une biométrie, puis 70 anguilles et 70 flets sont tués afin d'analyser leurs otolithes et leurs parasites, pour évaluer les effets de l'arasement de deux barrages sur ces poissons migrateurs. Le porteur indique que la capture et la manipulation stressent les poissons et que l'anesthésie peut perturber leur comportement. Il affirme qu'aucune modélisation ne peut prédire ces réponses et que le prélèvement en milieu naturel est "indispensable", alors que l'anguille européenne est classée en danger critique d'extinction.
Objectifs
L’objectif du projet est de caractériser les réponses biologiques des poissons migrateurs aux modifications des conditions environnementales suite à l’arasement de deux barrages majeurs sur un bassin versant côtier. Les poissons migrateurs amphihalins, qui réalisent une migration entre milieux marins et milieux continentaux à des stades précis et sensibles de leurs stades de vie, sont particulièrement vulnérables à la présence de barrages qui empêchent la migration. L’Anguille d’Europe (Anguilla anguilla) et le Flet (Platichthys flesus) sont deux espèces amphihalines (reproduction en mer, croissance en eau douce), avec des répartitions spatiales différentes en rivière. Ces deux espèces apportent donc des informations complémentaires en permettant de caractériser les effets du démantèlement des barrages sur l’ensemble du bassin versant (cas de l’Anguille) et sur les zones en aval des ouvrages (cas du Flet). L’effacement des barrages est une occasion unique d’explorer les effets sur la variabilité des traits biologiques des individus (âge, taux de croissance, habitats utilisés, position trophique, parasitisme…). La caractérisation de ces évolutions au cours du processus de recolonisation est un enjeu important pour constituer un retour d’expérience solide permettant d’anticiper les conséquences de futures actions d’arasement de barrages. Les objectifs opérationnels de 2019 à 2022 étaient de finaliser l’état de référence pré-arasement. Les travaux d’arasement (finalisés en 2022) facilitent désormais le déplacement des espèces aquatiques migratrices en l’absence de ces ouvrages. Il s’agit donc d’obtenir des données post-arasement sur ces deux espèces piscicoles en suivant les mêmes protocoles que précédemment. L’euthanasie de certains des poissons est nécessaire à l’étude des traits biologique des anguilles et des flets.
Bénéfices attendus
Ce projet scientifique, conduit depuis 2012, a pour objectif de fournir un retour d’expérience sur l’effacement des barrages de rivières côtières. Afin de suivre les effets de cette opération de restauration, un suivi environnemental sur le long terme a été mis en place avant, pendant et après le démantèlement. L’objectif est de caractériser la démographie et l’expansion des populations des poissons migrateurs et la modification de leurs traits biologiques. La présente demande vise à poursuivre ces suivis sur la période post-effacement (phase de restauration de la vallée) au cours de laquelle de nombreux changements biologiques sont attendus. L’arasement des barrages devrait fortement modifier la répartition des anguilles et diminuer la compétition intra-spécifique, avec des effets sur la croissance, l’âge et la taille des anguilles en migration qui rejoignent la mer pour se reproduire. De plus, il est probable que la diminution de la densité à l’aval du barrage et l’accès aux zones amont induise une évolution du sexe ratio des géniteurs et une modification des caractères biologiques (ex. taux de croissance, âge de migration). La modification des écoulements de la rivière devait également modifier les habitats de la zone estuarienne avec des conséquences probables sur la croissance et la survie des juvéniles de flets. Cette étude fournit donc des informations précieuses pour la gestion des poissons migrateurs, notamment des anguilles dont la population est actuellement classée en danger critique d’extinction.
Procédures
Les anguilles seront capturées en rivière, puis anesthésiées pour être placées dans une gouttière spéciale où le poisson est maintenu sur le dos afin de réaliser des mesures (taille, poids) et de décrire l’état sanitaire externe (présence de lésions, parasites…). Cette opération prend environ une minute. L’individu est ensuite placé dans un vivier de réveil avant d’être remis à l’eau au maximum 60 minutes après le début des manipulations. Durant l’ensemble du projet, un maximum de 600 anguilles seront anesthésiées, puis relâchées en milieu naturel sur le site de capture. Les flets seront capturés dans la partie estuarienne de la rivière. Ils seront capturés au nombre de 35 individus par an, soit 70 au total durant le projet. Ces individus seront anesthésiés, puis euthanasiés. Au total, un sous-échantillon de 70 anguilles et de 70 flets seront euthanasiés afin de caractériser les caractères biologiques des individus (âge, taux de croissance, habitats utilisés, position trophique, parasitisme…). L’euthanasie de ces individus est indispensable pour estimer l’âge à partir des otolithes (pièce calcifiée de l’oreille interne des poissons) et décrire la présence de parasites internes.
Impact sur les animaux
La capture, la rétention et la manipulation pour effectuer la biométrie des individus pourra occasionner du stress pour les poissons. L’anesthésie peut vraisemblablement créer des perturbations du comportement de certains individus. Afin de limiter ce stress, le nombre de poissons dans le bain d’anesthésiant ne dépassera 5 individus de manière simultanée, voire moins dans le cas de gros individus afin de ne pas dépasser 5% du volume. Si les individus ne sont pas endormis après 10 minutes de balnéation, la solution d’anesthésiant est renouvelée afin de palier le phénomène de dilution et d’utilisation par les individus. La transition milieu aquatique/air libre éclairé (lampe à lumière blanche) le temps de réaliser la biométrie peut également être source de perturbations pour les anguilles. En conséquence, les manipulations seront réduites au strict minimum (généralement moins d’une minute) et la tête des poissons sera recouverte par un linge humide afin de limiter l’exposition à la lumière. Durant la pêche effective, une trop grande densité d’anguilles piégées pourrait entrainer des lésions des individus dans le piège. En conséquence, le piège sera relevé toutes les deux heures et la fréquence des relèves sera augmentée (toute les heures) si le nombre de captures excède 30 individus lors d’une relève afin de limiter les surdensités d’individus.
Devenir
La majorité des anguilles capturées seront gardés en vie et relâchés dans le milieu naturel après avoir réalisé des mesures biométriques (N = 600 maximum). Un total de 70 anguilles et de 70 flets seront euthanasiés afin de caractériser les traits de vie sur deux années.
Remplacement
Cette étude vise à comprendre l’impact de l’arasement des barrages sur le fonctionnement des populations de migrateurs amphihalins. Il n’existe actuellement aucune donnée sur la modification des traits de vie de l’anguille et du flet en réponse à ce type d’action de restauration. De plus, il n‘existe aucune méthode substitutive, notamment en modélisation, car il est impossible de prédire les réponses individuelles. Les processus étudiés ne peuvent pas être simulés en laboratoire, avec des organismes de substitutions (tels que des invertébrés), en raison de la complexité du cycle de vie (migration mer-rivière à large échelle spatiale). Il est donc indispensable de prélever ces poissons dans le milieu naturel.
Réduction
Le protocole mis en place pour la pêche des anguilles en migration n’a pas pour objectif d’être exhaustif et le nombre d’individus migrants capturés ne peut être connu à l’avance. Toutefois, les deux précédentes campagnes (pré-arasement) ont permis de capturer entre 90 et 200 individus. En conséquence, le nombre d’individus anesthésiés pour réaliser les mesures biométriques devrait être compris entre 100 et 300 anguilles. Les mâles et les femelles seront capturés afin de caractériser la variabilité liée au sexe ratio dans le bassin versant. La caractérisation des traits de vie et de leurs réponses à l’arasement des barrages nécessite le sacrifice d’un nombre d’individus statistiquement suffisant des deux espèces cibles présentes dans la zone d’étude, et qui permette la comparaison avec les échantillons déjà collectés avant l’arasement du barrage. Le nombre d’individus doit être suffisant pour réaliser des analyses statistiques robustes visant à décrire la variabilité des traits observés en fonction des années et des histoires de vie (i.e. habitats utilisés). Au cours du projet, un sous-échantillon de 70 anguilles argentées sera euthanasié (de manière aléatoire et sans distinction du sexe) afin de caractériser les traits de vie sur deux années (35 individus par année). Pour les flets, l’effort d’échantillonnage sera adapté jusqu’à l’obtention du nombre requis d’individus (pas d’individus capturés en surplus). Les flets seront capturés au nombre de 35 individus par an et au stade juvénile, essentiellement né durant l’année, afin d’estimer le taux de croissance des juvéniles dans la partie aval du bassin versant. Durant l’ensemble du projet, un maximum de 600 anguilles seront anesthésiées, puis relâchées en milieu naturel sur le site de capture. Un sous-échantillon de 70 anguilles et 70 flets sera euthanasié (de manière aléatoire et sans distinction du sexe) afin de caractériser les traits de vie. Au total : 35 spécimens euthanasiés x 2 années x 2 espèces = 140 individus euthanasiés + 300 anesthésiés x 2 années (anguille seulement) = 600 individus anesthésiés
Raffinement
La capture des anguilles sera réalisée grâce à un dispositif de piégeage installé sur la rivière et relevé toutes les deux heures durant la nuit de pêche afin d’éviter des risques de mortalité, de limiter le stress et la dépense énergétique des anguilles. Si le nombre de captures excède 30 individus lors d’une relève, la fréquence des relèves sera augmentée à une heure afin de limiter les surdensités d’individus dans le piège. Les anguilles capturées seront placées en stabulation dans des bacs contenant de l’eau de la rivière oxygénée, avec utilisation de bulleurs si nécessaire (suivant la température de l’eau). Puis elles seront anesthésiées afin de réaliser les mesures biométriques convenablement (taille, poids, état sanitaire, …). La manipulation d’un individu se fera avec épuisettes et gants, sur des appareils de mesures humidifiés et sera limité au strict nécessaire du protocole (généralement moins d’une minute de manipulation). Après la biométrie, les individus non euthanasiés seront mis dans un vivier de réveil contenant de l’eau de la rivière oxygénée pour leur permettre de se réveiller tranquillement. Les poissons seront ensuite relâchés sur le site de capture (60 minutes maximum après le début de leurs manipulations) dès que tous les signes de l’anesthésie auront disparus : reprise de l’équilibre, des réflexes médullaires et d’une activité de nage volontaire. Afin de réduire au minimum le temps entre la capture et l’euthanasie des flets, les individus seront manipulés avec des gants et placés dans la solution anesthésiante, puis euthanasiés au fur et à mesure des captures.
Choix des espèces
L’utilisation d’espèces amphihalines est indispensable car il s’agit d’un des objectifs du projet de restauration de la continuité écologique. En effet, les poissons migrateurs amphihalins, qui réalisent une migration entre milieux marins et milieux continentaux, sont particulièrement vulnérables à la présence de barrages qui empêchent la migration. L’arasement des barrages apparait aujourd’hui comme une solution efficace et durable pour rétablir la continuité écologique, mais les retours d’expérience sont encore très parcellaires et nécessitent d’être documentés. L’anguille et le flet apportent des informations complémentaires et essentielles permettant de caractériser les effets du démantèlement des barrages sur l’ensemble du bassin versant (cas de l’Anguille européenne) et sur les zones en aval des ouvrages, au niveau de la zone estuarienne (cas du Flet). Les anguilles capturées pour caractériser les traits de vie seront essentiellement au stade « argenté » qui caractérise la phase de migration vers les zones de pontes (océan). Ce stade est privilégié pour l’étude car il permet de qualifier les traits et la qualité des individus produits par le bassin versant. La capture d’individus non migrants au stade « jaune » en phase sédentaire peut avoir lieu accessoirement. Ces individus au stade « jaune » seront anesthésiés et mesurés, mais aucun ne sera prélevé (euthanasié). Les flets seront capturés au stade juvénile, essentiellement nés durant l’année, afin de qualifier la fonction de nourricerie de la partie aval du bassin versant.
Modèle d’animaux d’études précliniques sur la fibrose pulmonaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système respiratoire
5 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une instillation de bléomycine dans la trachée déclenche une fibrose pulmonaire, puis les animaux reçoivent des traitements chroniques, pour tester les molécules de clients contre cette maladie respiratoire. Le porteur indique que le modèle provoque des difficultés respiratoires et une perte de poids massive qui mène généralement à la mort, une perte allant jusqu'à 30 % étant tolérée avant l'exclusion. Sur le remplacement, il reconnaît l'existence de cultures et de coupes de poumon in vitro en cours de mise en place, mais les juge insuffisantes et conclut au recours à l'animal "entier".
Objectifs
La fibrose pulmonaire idiopathique est une cicatrisation anormale du tissu pulmonaire (bronchioles, alvéoles et vaisseaux sanguins pulmonaires) à la suite à une agression violente (par exemple une infection virale ou bactérienne) et/ou chronique. Le tissu pulmonaire s’épaissit et se rigidifie et des cicatrices non fonctionnelles apparaissent que l’on appelle fibrose. La conséquence est principalement l’insuffisance respiratoire puis dans des stades plus avancés une insuffisance cardiaque droite. Elle peut nécessiter à terme la transplantation pulmonaire et/ou cardiaque. Aujourd’hui les causes de la maladie ne sont pas connues, d’où le terme idiopathique, mais la pollution semble être un facteur privilégié. Elle concerne aujourd’hui 5500 patients et 1800 nouveaux patients sont concernés par an en France. La maladie touche davantage les hommes et le risque augmente avec l’âge et les maladies métaboliques. Les deux traitements actuellement sur le marché, la pirfénidone et le nintedanib, ont pour but de ralentir la progression de la fibrose et donc de la maladie mais n’atténue pas les symptômes. Il est donc nécessaire de mettre en place des modèles animaux d’études précliniques dans le but de développer de nouvelles thérapies mais également comprendre les mécanismes moléculaires mis en place.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes mis en place dans le développement de la maladie, tout comme le développement de nouvelles thérapies
Procédures
Afin d’induire le développement de fibrose pulmonaire, nous devons instiller dans la trachée des souris, sous anesthésie gazeuse, la bléomycine, un anti-cancéreux utilisé en clinique actuellement et qui induit de la fibrose pulmonaire chez l’homme. Les animaux contrôles seront instillés avec de la solution saline. Les animaux sont ensuite replacés au milieu de leurs congénères dans leur cage d’origine placée sur un tapis chauffant. Une surveillance particulière est réalisée jusqu’au réveil de l’animal afin de déceler au plus tôt tout signe de souffrance ou de douleur (étouffement, détresse respiratoire, etc.). Tous les animaux du projet seront soumis à ce geste. Afin de tester les molécules de nos clients, les souris seront traités de façon chronique afin de montrer l'efficacité des dits traitements. Tous les animaux du projet seront soumis à cette phase de traitement.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont des difficultés respiratoires des animaux et la perte de poids massive qui est telle qu’elle mène généralement à la mort et le stress chronique liée à l'administration chronique des traitements. La perte de poids observée dans ce modèle est corrélée significativement au niveau d’atteinte pulmonaire et reste un criète à la fois d'acceptation de la pathologie et un critère d'exclusion si celle ci devenait trop importante.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure.
Remplacement
Des alternatives non animale sont envisageable aujourd'hui comme la mise en place de culture de cellules pulmonaires in vitro mais ce modèle reste limitée car ne mime par l'organisation structurelle et cellulaire du poumons comme décrit dans un organisme. Cette dernière technique va être testée puis mise en place au sein de l'entreprise dans les prochains mois. Les tests de molécules peuvent être réalisé sur des coupes de poumons issue de l'animal évitant ainisi de traiter chroniquement ces derniers. Cependant, avec cette technique, la pathologie doit être induite chez l'animal vivant avant de réaliser les coupes de poumons. Bien que ces alternatives existent, elles ne sont pas suffisantes pour démontrer l'efficacité des traitements de façon complète. Comme la plupart des maladies et la validation des nouveaux traitements il est nécessaire d’utiliser des animaux à des fins expérimentales. En effet, les maladies qui se développent sont souvent la conséquence d’altérations multi-organes qui nécessitent l’utilisation d’un organisme dans son entier. De plus, ceci permet d’évaluer les conséquences des nouveaux traitements sur l’état général d’un individu et les possibles atteintes de certains organes.
Réduction
Afin d'obtenir des résultats interprétables et de montrer l'efficacité d'un traitement, il est nécessaire d'avoir un nombre d'animaux par groupe égale à 10 minimum.
Raffinement
La perte de poids tolérée pour ce modèle est de 30%. En effet, comme mentionné ci-dessous il s’agit d’un critère important pour évaluer l’atteinte pulmonaire. La mesure du poids étant faite 3 fois par semaine, le suivi est rapproché.Pour limiter la souffrance liée à la perte de poids, afin de faciliter la prise alimentaire, des croquettes humidifiées seront positionnées en fond de cages. Pour les souris âgées et obèses, des mangeoires suspensdus seront utilisés pour favoriser la prise alimentaire. Un ajout d'aspen brik permettra au souris âgées et obèses d'user leur dent et de favoriser la prise alimentaire. Pour favoriser la nidification et permettre une bonne régulation de la température corporelle souvant dérégulée en cas de perte de poids, de l'enirchissement supplémentaire sera apporté (sizzlenest, coton). Après l’instillation et pendant la phase de réveil, les animaux sont placés sur tapis chauffant. Enfin, lors de l'euthanasie, pour limiter la souffrance lors du prélèvement terminal du sang effectué par ponction intracardiaque ou en veine cave sera réalisé de deux possibles façon: en option 1, les animaux seront anesthésiés sous isoflurane, une injection de lidocaine sera effectué en sous cutané à plusieurs endroits le long de la zone d'incision et une injection de buprénorphine en sous cutanée 60 minutes avant; en option 2, les animaux seront anesthésiés avec un mélange kétamine/xylasine en i.p. et une injection de lidocaine sera effectué en sous cutané à plusieurs endroits le long de la zone d'incision.
Choix des espèces
Trois types de souris seront utilisées : Des souris C57Bl6 mâles âgées de 8 semaines. Des souris mâles sont utilisées car la fibrose pulmonaire touche plus les hommes que les femmes. L’utilisation de souris jeunes permet d’avoir un modèle de souris moins fragiles pour subir l’instillation. Des souris C57Bl6 mâles âgées de 22 semaines et rendues obèses par ingestion d’un régime gras pendant 16 semaines. En effet, les maladies métaboliques comme l’obésité sont des facteurs de risques du développement de la maladie. Des souris C57Bl6 mâles âgées de 22 mois. Afin de limiter le transport de souris trop âgées, elles seront livrées à 18 mois puis hébergées jusqu’à 22 mois dans nos locaux. L’utilisation de souris âgées est totalement adaptée car le risque de fibrose pulmonaire est accru lorsque l’on vieillit. Tous les animaux seront utilisés à l’âge adulte afin de se rapprocher de ce qui est observé chez l'homme à l'âge adulte.
Caractérisation des conséquences d’une stimulation des neurones corticospinaux lombaires chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une chirurgie d'environ une heure et demie, elles subissent des tests d'aversion et des tests comportementaux répétés avec application de composés, pendant lesquels une voie nerveuse est stimulée, parfois sans soulagement de la douleur, pour déterminer si cette stimulation déclenche un mouvement moteur ou une douleur. Le porteur indique que la chirurgie provoque stress, douleur et perte de poids passagère, et cherche justement à savoir si l'activation de cette voie est aversive et douloureuse. Sur le remplacement, il affirme que ces neurones parmi les plus longs de l'organisme ne peuvent être ni cultivés ni modélisés et doivent être étudiés intacts chez l'animal.
Objectifs
La stimulation, chez la souris, des neurones qui relient le cortex à la moelle épinière (neurones corticospinaux) entraîne un mouvement de la patte arrière. Nous cherchons à identifier si ce movement correspond à une commande motrice portée par ces neurones, ou est une conséquence d’une perturbation des informations sensorielles reçues par l’organisme, qui entraînerait une « gêne », voire une douleur. Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des neurones corticospinaux dans la motricité.
Bénéfices attendus
La voie corticospinale est atteinte dans plusieurs pathologies (sclérose latérale amyotrohique, lésion traumatique de la moelle épinière, etc.) sans que l’on sache précisément son rôle en situation physiologique. Notre projet permettra de caractériser les conséquences de l’activité de ces neurones, et ainsi de poser des hypothèse sur les conséquences de leur dysfonctionnement.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie durant environ 1,5 heure, puis deux semaine après un ou des tests expérimentaux comme suit : Un groupe subira l’expérience d’aversion sur 5 jours d’affilés (chaque session quotidienne au maximum de 30min). Le 4ème jour, ils recevront une application (crème ou injection) de composé pharmacologique à tester. Les autres animaux effectueront un test comportemental d’une durée max de 30 min, une fois par jour pendant 2 jours, puis après 24h de repos, à nouveau 1 test/j pendant 2 jours en présence d’un composé pharmacologique appliqué juste avant le test ; enfin, après 48h de repos, à nouveau 1 test/j pendant 2 jours en présence d’un autre composé pharmacologique appliqué juste avant le test.
Impact sur les animaux
Les chirurgies entrainent inévitablement un stress et des douleurs chez la souris. Une perte de poids est souvent constatée les jours suivant la chirurgie mais l’animal récupère son poids initial en 3-4 jours. Les sutures peuvent aussi entrainer une gêne ou des démangeaisons qui poussent l’animal à se gratter et, très rarement, à endommager sa cicatrice. Cette gêne disparait également en quelques jours. L’activation de la voie corticale entraîne un mouvement dont nous ne savons pas encore s’il est le signe d’une commande motrice ou d’une perturbation sensorielle voire d’une douleur. Ce projet a pour objectif de répondre à cette question, et il y aura donc des expériences consistant en une stimulation de cette voie, en présence, mais aussi en absence de soulagement de l’éventuelle douleur, car nous chercherons justement à identifier si cette activation est aversive et douloureuse (soulagée par des analgésiques).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement.
Remplacement
Le projet porte sur les neurones corticospinaux, qui sont parmi les plus longs de l’organisme, allant du cortex à la partie lombaire de la moelle épinière. Ils sont impossibles à reconstituer avec des techniques de remplacement de type culture cellulaire et doivent être intacts pour pouvoir être étudiés. Ils sont impossibles à modéliser numériquement car leurs cibles sont encore méconnues. Nous devons donc recourir à l’animal pour atteindre les objectifs du projet.
Réduction
Les mesures pour réduire le nombre d’animaux ont été étudiées en adéquation avec le projet. Le nombre d’animaux utilisé a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement valides. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire et produire des résultats spécifiques de genre.
Raffinement
Les souris sont hébergées en cohorte, elles font l’objet d’observations quotidiennes et l'enrichissement des cages est systématique (bâton à ronger, matériaux de nidification). Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie pré et post-opératoire et la température de l’animal est maintenue grâce çà un tapis chauffant thermostaté relié à une sonde rectale. Les yeux sont hydratés avec un gel oculaire. L’état de santé des animaux est surveillé quotidiennement après la procédure chirurgicale et estimé selon une grille de score pondérée qui évalue l'apparence générale de l'animal, l'apparence de la plaie, le comportement spontané, le comportement provoqué et le poids. Des points limites ont été établis pour chaque item permettant de soustraire l’animal à la souffrance.
Choix des espèces
L’étude de la communication entre le cortex et les circuits locomoteurs spinaux requiert l’utilisation de mammifère. La souris est un modèle largement utilisé dans l’étude du cortex moteur, et des comportements locomoteurs. De plus, de nombreuses connaissances sont établies sur l’organisation des projections corticospinales chez la souris. Animaux utilisés à partir de 30 jours après la naissance, car c’est l’âge où la voie corticospinale a fini son développement.
Lumière artificielle de nuit : perturbation des rythmes circadiens et santé visuelle
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
374 Psammomys, un rongeur à la rétine riche en cônes, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent une injection sous la rétine, subissent des examens oculaires répétés et des injections hebdomadaires pendant sept mois, en cages individuelles, pour étudier l'effet de la lumière artificielle de nuit sur la vision. Le porteur indique que l'exposition prolongée peut altérer le rythme circadien et l'humeur, que l'isolement de longue durée stresse ces animaux et que les injections peuvent provoquer douleur, inflammation et perte de poids. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la rétine entière et qu'il faut travailler à l'échelle de l'animal.
Objectifs
Nous vivons dans un monde illuminé en permanence et l'exposition à la lumière artificielle la nuit (LAN) est devenue une réalité quasi universelle. Bien qu'elle soit essentielle à nos modes de vie modernes, il est clair que la LAN a des impacts négatifs sur la santé, en favorisant le développement notamment de cancers et troubles métaboliques. Il est également évident que ces effets néfastes sur la santé sont causés par des perturbations induites par la LAN dans notre horloge biologique. Cette horloge joue un rôle vital en coordonnant de façon optimale toutes nos fonctions physiologiques (sommeil, prise de repas et digestion etc.) au cours du cycle jour/nuit. L'œil est doublement concerné par les processus circadiens car c’est par lui que la LAN entre dans l'organisme et perturbe le système circadien, et l'œil est lui-même sous contrôle d'une "horloge" intrinsèque. Malgré cela, on sait peu de choses sur les effets de la LAN sur la santé oculaire et la vision. Notre laboratoire est l'un des rares à explorer activement cette question, et nous savons qu'une exposition aiguë à la LAN entraîne des changements spectaculaires dans le fonctionnement rythmique de la rétine. Notre hypothèse de travail est que, de manière analogue à l'horloge biologique principale, la perturbation induite par la LAN dans les rythmes de la rétine a un impact négatif sur la santé visuelle. À l'aide d'un modèle animal unique de rétine humaine riche en cônes, Psammomys obesus, les deux EU impliquées dans ce projet multisite ont montré que l’exposition chronique à la LAN telle qu’elle se produit dans le travail posté, induit une altération de la structure rétinienne et de la fonction visuelle à long terme (résultats non publiés). Nos objectifs sont de comprendre dans le même modèle animal et le même paradigme d'exposition lumineuse, les effets (moléculaires et cellulaires) de la LAN sur la santé rétinienne, de déterminer quelle part de la lumière est responsable des effets toxiques et de d'évaluer si un traitement (anti-oxydant) à la vitamine E peut contrecarrer les effets à long terme de la LAN.
Bénéfices attendus
Nous espérons que nos résultats généreront de nouvelles connaissances et de nouveaux cadres conceptuels concernant les mécanismes de dégénérescence dans la rétine déclenchée par un éclairage environnemental aberrant (une lumière trop intense pendant la nuit). Ils doivent aider à définir recommandations pour limiter l'exposition à un tel éclairage chez l'homme et en particulier chez les patients souffrant de maladies rétiniennes.
Procédures
138 Psammomys obesus sont inclus dans une procédure comprenant une injection sous-rétinienne. Tous les animaux feront l’objet d’une analyse fonctionnelle de la vision par électrorétinographie, ainsi qu’un suivi ophtalmologique par deux modalités d’imagerie (tomographie par cohérence optique et fond d’œil). L’ensemble des procédures expérimentales seront réalisées chez le partenaire 1, à l’exception de l’imagerie, qui sera réalisée chez le partenaire 2. L'injection sous-rétinienne s’effectue sous anesthésie gazeuse suivie d’une anesthésie locale et de l’application d’un gel limitant le dessèchement de l’œil, environ 10 minutes pour chaque animal. Les méthodes employées pour l’étude fonctionnelle de la vision sont non invasives, ne provoquant pas de souffrance particulière. Ces trois méthodes d'une durée de 15 à 60 minutes chacune seront réalisées sous anesthésie gazeuse (imagerie) ou par voie intra-péritonéale (électrorétinographie), sur 312 animaux. Pour 144 Psammomys, un traitement pharmacologique mettra en jeu des injections intra-péritonéales hebdomadaires sur une durée de 7 mois. Pour 48 autres, un traitement à la vitamine E impliquera une injection sous-cutanée hebdomadaire sur une durée de 7 mois.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent être soumis à différentes nuisances listées ci-dessous : 1) Impact généré par la LAN : nous nous attendons à une potentielle altération du système circadien et de l’humeur pour des animaux exposés pendant plusieurs mois. 2) A partir du sevrage et jusqu’à la fin des procédures, les animaux seront placés dans des cages individuelles pour mieux contrôler les conditions d'exposition lumineuse. L’isolement sur une longue période est susceptible d’induire du stress chez les Psammomys obesus. 3) Les animaux seront soumis à des anesthésies susceptibles d'altérer le bien-être de l'animal. 4) les animaux seront soumis à des injections susceptibles d’induire une douleur modérée, un risque infectieux et/ou inflammatoire. 5) Les animaux seront également soumis à des électrorétinogrammes, susceptibles d’induire des anomalies oculaires dans certains cas (inflammation, infection, rougeur, opacité…). Liée à ces procédures, l'administration répétée d'anesthésies chez Psammomys obesus peut entraîner une perte de poids (10%) dans certains cas, indiquant une complication métabolique. 6) Des effets délétères du traitement à la vitamine E peuvent être observés, tels qu'une diminution de la pression artérielle, des problèmes de coagulation. 7) L'injection intra-péritonéale peut causer de la douleur, un stress et une inflammation chez le rongeur en raison de l'introduction d'une aiguille dans l'abdomen. Le transport entre les deux EU pourrait induire un stress aigu transitoire chez les animaux.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure pour prélèvements.
Remplacement
Le but de ce projet est d’évaluer l’impact d’une exposition anormale à la lumière sur la vision en étudiant plus particulièrement les altérations du système circadien de la rétine. A l’heure actuelle, il n’est pas encore possible de modéliser in vitro et/ou in silico l’ensemble des structures impliquées de la rétine, ce qui nécessite donc d’avoir recours au modèle animal. Le projet nécessite la réalisation d’expériences dans un environnement intégral, à l’échelle de l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux a été choisi dans le respect des règles statistiques en vigueur, en minimisant le nombre d’animaux utilisés. Il a été déterminé par calcul de puissance à l’aide d’un logiciel, et sur la base de notre connaissance du modèle Psammomys obesus, des techniques utilisées et de nos expériences à ce sujet, ainsi que sur la littérature scientifique. De plus, afin de réduire le nombre total d'animaux : - Nous utilisons des approches non invasives et longitudinales ne conduisant pas à la mise à mort de l'animal. Les animaux utilisés lors des approches non-invasives seront utilisés dans le cadre d'une procédure ex-vivo, après prélèvements post-mortem des globes oculaires. De plus, nous utiliserons les mâles et les femelles de nos portées, puisque que nos résultats antérieurs n’ont pas montré d’effet du sexe sur la dégénérescence rétinienne induite par la LAN. Nous réaliserons des analyses statistiques pertinentes robustes et adaptées à nos groupes.
Raffinement
Pour réduire l'impact de l'isolement, les animaux sont hébergés en cages ouvertes ce qui permet de maintenir un contact visuel, olfactif et auditif entre les congénères. Pour optimiser leur croissance, les animaux dont le poids est inférieur à la moyenne (en tenant compte de la dispersion des valeurs), disposeront d’un biberon à tétine longue pour leur faciliter l’accès à la boisson, ainsi que des croquettes directement dans leur cage. En cas de problème d’alimentation récurrent objectivé par une perte de masse, les animaux auront accès à de la nourriture gélifiée directement dans une coupe dans la cage et les dents des animaux seront vérifiés. Les différents examens seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie. Durant ces procédures la température de l’animal sera maintenue à l’aide d’un tapis chauffant. En complément d’une évaluation hebdomadaire de leur état de santé, les animaux seront suivis quotidiennement sur trois jours après les examens ophtalmologiques. Ce suivi se fera à l’aide d’une grille de score permettant d’objectiver différents paramètres (apparence, poids, examen clinique), et de définir des points limites, permettant de soustraire immédiatement un animal si une souffrance été détectée. Les deux sites expérimentaux sont distants de moins de 10 km. Les animaux sont transportés dans des boites de transport pour animaux de laboratoire contenant litière et enrichissements type bâton et frisure. De la nourriture et de l'eau gélifiée sont ajoutées pour que l'animal puisse se nourrir et s'hydrater sans risque d'écoulement de l'eau. Le transport sera effectué de jour, donc sans déphasage du cycle lumière/obscurité, en présence de la personne habituée à les manipuler, dans un véhicule chauffé en fonction de la température extérieure. Lors de deux précédents projets, les animaux n’ont montré aucun signe de stress à leur arrivée dans chacun des sites. L'état de santé des animaux sera évalué avant et après chacune des procédures.
Choix des espèces
Psammomys obesus a une rétine remarquablement riche en cônes et représente un modèle animal pertinent de vision centrale, primordiale pour la vue humaine. Dans la nature, ces animaux sont sevrés après 20 jours et atteignent la taille adulte au bout de 4 mois. Ils deviennent sexuellement matures à 3-6 mois. L'espérance de vie est 14-18 mois, et six ans en captivité. Les animaux seront exposés à la LAN dès le sevrage (20 jours), et maintenus dans ce régime plusieurs semaines. Les injections sous-rétiniennes seront pratiquées sur des animaux à P15.
Programme d’immunisation de poules pour la génération d’anticorps polyclonaux
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
150 poules vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections intramusculaires d'un antigène couplé à un adjuvant sur soixante-trois jours, puis sont tuées, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur indique que les injections avec adjuvant complet de Freund peuvent provoquer ulcérations, fièvre et baisse de mobilité, et présente le prélèvement des anticorps dans le jaune d'œuf comme un raffinement. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace et que l'immunité de l'animal vivant est "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.
Objectifs
Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tels que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherches publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de poule. La poule est une hôte d’intérêt, pour le développement d’anticorps dirigés contre des protéines hautement conservées chez les mammifères. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole durera 63 jours.
Bénéfices attendus
Les anticorps polyclonaux sont des auxiliaires et des réactifs employés dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie. Ils permettront notamment d’approfondir les connaissances nécessaires pour l’avancement de la recherche et le développement de test de diagnostic voir de nouvelles pistes d’applications thérapeutiques.
Procédures
5 injections en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (10 minutes)
Impact sur les animaux
Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les animaux sont surveillés après injection afin de vérifier qu’aucune douleur n’est apparue.
Devenir
Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J63.
Remplacement
La méthode usuelle pour produire des anticorps polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budgets et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.
Réduction
Le nombre d’animaux (2 poules par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique, a été adapté au plus juste par rapport au besoin pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole
Raffinement
Les animaux sont injectés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. La recherche sur la douleur aviaire est limitée, mais une grande partie des connaissances provient de la science du bien-être avec un intérêt pour les pratiques agricoles de routine. Dans ce cadre, une attention particulière sera portée à 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du plumage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). La récupération des anticorps à partir des œufs de poule constitue un raffinement, car les prélèvements sanguins ne sont pas nécessaires. Lors de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les poules disposeront d’un environnement enrichi (perchoir, miroir, bloc à picorer ou type coquilles d'huîtres...).
Choix des espèces
La poule est utile pour la production d’anticorps contre des protéines de mammifères, car elle est éloignée phylogénétiquement de la classe des Mammalia. L’utilisation de poules pondeuses est en totale conformité avec le principe des 3R et cette méthode est fortement recommandée depuis un certain temps par le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives. Il s'agit d'un raffinement du protocole de production d'anticorps, car ces derniers peuvent être extraits du jaune d’œuf sans avoir à prélever du sang sur l’animal. Un autre avantage est que les poules pondeuses sont capables de produire des anticorps en plus grande quantité, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir les anticorps. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les poules entreront en protocole dès l’âge de 5 mois. Auparavant elles auront subi une période de quarantaine de 14 jours, et si les animaux ne présentent aucun signe clinique, elles seront aptes à rentrer en protocole.
Réponse du Système NeuroSécréteur Caudal (SNSC) aux contraintes environnementales chez un requin, la petite roussette Scyliorhinus canicula
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
66 roussettes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ces petits requins pêchés en mer sont soumis à des changements de salinité et de température pendant 24 heures avec quatre prélèvements sanguins, avant d'être tués pour disséquer leur moelle épinière et caractériser des cellules nerveuses, afin d'étudier l'adaptation des requins aux variations de leur milieu. Le porteur affirme que ces variations restent dans la gamme naturelle et n'attend de stress que lors des manipulations et des prises de sang. Il indique qu'aucune culture de ces cellules n'est possible faute de connaissances, et qu'il n'existe donc "pas d'alternative" in vitro.
Objectifs
Chez les poissons, comme chez les autres vertébrés, l’organisme adapte sa physiologie aux variations de son environnement grâce à la perception des fluctuations environnementales comme par exemple les variations de températures ou de lumière par son système nerveux central qui contrôle alors les sécrétions hormonales, notamment au niveau de l’hypophyse, qui régulent différentes fonctions biologiques. En plus du cerveau, il existe chez les poissons un système nerveux supplémentaire situé à l'extrémité caudale de la moelle épinière, appelé système neurosécréteur caudal. Ce système neurosécréteur caudal jouerait un rôle dans la coordination de différents processus physiologiques de l’organisme en réponse à des variations de salinité ou de température, comme montré récemment dans la littérature chez le flétan. Chez les requins, le système neurosécréteur caudal est constitué de neurones géants appelés cellule de Dahlgren. Bien qu’identifiées depuis longtemps, aucune étude récente n'a porté sur la caractérisation plus poussée de ces cellules. L'objectif du présent projet est d’analyser et de comparer les sécrétions hormonales des cellules de Dhalgren isolées à partir de roussettes adultes mâles qui auront été soumises à des changements de température et de salinités sur un temps court et dans le respect du principe des 3R.
Bénéfices attendus
L’analyse de la réponse hormonale des cellules de Dahlgren chez des animaux soumis à des variations de température et de salinité nous permettra d’établir ou non si ces cellules peuvent jouer un rôle essentiel dans l’adaptation des requins aux contraintes environnementales liées au changement climatique. A plus long terme, les bénéfices susceptibles de découler de cette étude chez une espèce de requin largement abondante sont de différents niveaux : (1) apporter des connaissances sur un modèle de requin qui seront bénéfiques à la compréhension des capacités d’adaptation d’autres espèces de requins dont les populations sont en danger ; (2) comparer les résultats obtenus sous un angle de l’évolution des espèces et d’identifier ainsi des processus fondamentaux conservés ; (3) disposer de marqueurs hormonaux en tant qu’outil pour caractériser les capacités d’adaptation d’une espèce donné en fonction de son environnement et ainsi adapter cet environnement pour un meilleur bien-être dans le cadre de programmes de préservation d’espèces aquatiques ou d’élevages. L’absence de variations hormonales des cellules de Dahlgren posera la question d’un autre rôle de ces cellules et c’est pourquoi nous prélèverons, en fin d’expérimentation, un maximum de tissus biologiques chez un même animal pour explorer différentes fonctions physiologiques.
Procédures
Des roussettes mâles adultes seront pêchées puis acclimatées dans des bacs de grande dimension alimentés avec de l'eau de mer naturelle à 15°C et sous un cycle de lumière artificielle 8L:16D correspondant aux conditions optimales décrites dans la littérature. Trois procédures dont les paramètres seront dans la gamme des conditions naturelles pour les requins, seront mises en place : (1) Test de salinité de 24h effectué sur 3 lots : 1 lot de 6 animaux transférés d’une eau de mer non diluée (100%) vers une eau de mer 100% (lot contrôle) ; 1 lot de 6 animaux transférés d’une eau de mer diluée (eau de mer à 80%) vers une eau de mer 100% ; 1 lot de 6 animaux transférés d’une eau de mer 100% vers une eau à 80%. (2) Test thermique de 24h effectué sur 3 lots : 1 lot de 6 animaux transférés de 15°C vers 15°C (contrôle) ; 1 lot de 6 animaux transférés de 15°C vers 10°C ; 1 lot de 6 animaux transférés de 15°C vers 20°C. (3) Test combinant les changements de température et de salinité et qui portera sur 5 lots, chacun de 6 animaux, sur une durée de 24h : eau de mer 100% vers 100% à 15°C; eau de mer 80% vers100% à 10°C; eau de mer de 80% vers 100% à 20°C; eau de mer 100% vers80% à 10°C; eau de mer de 100% vers 80% à 20°C. Pour l’ensemble des animaux, une série de 4 prélèvements sanguins à 0h, 6h, 12h et 24h après les transferts, de moins de 1mL et n’excédant pas, au total, 10% du volume sanguin de l’animal sera effectuée pour des analyses biochimiques. A la fin des expérimentations, les animaux seront mis à mort pour récupérer un grand nombre de tissus biologiques dont les moelles épinières pour la caractérisation des cellules de Dahlgren. Ces dernières seront analysées par des approches techniques hautement résolutives afin d’obtenir des résultats significatifs à partir d’un minimum de cellules, et donc d’animaux, collectées.
Impact sur les animaux
Les variations de température et/ou de salinité qui seront appliquées sont dans des gammes physiologiques et naturellement rencontrées par les requins, dont la roussette ; il n’y a donc pas de nuisance ou d’effet indésirable attendu sur la base de ces variations. Par contre, un stress et inconfort est attendu lors de la prise (manipulation) des animaux lors des transferts d’une condition à l’autre ainsi que lors des prélèvements sanguins. Ces derniers correspondent à un degré de sévérité de classe légère. Une acclimatation et une sédation sont envisagées.
Devenir
Mise à mort pour prélèvement des cellules de Dahlgren en vue de leur caractérisation moléculaire et le prélèvement de différents organes pour analyser l’impact des variations de température et/ou de salinité sur différentes fonctions biologiques. Du fait de leurs localisations dans la moelle épinière, les cellules de Dahlgren ne peuvent être prélevées qu’après dissection.
Remplacement
L’impact des variations environnementales sur la physiologie de ce requin sera abordé en ciblant les cellules de Dahlgren mais également en prélevant un nombre maximum de tissus biologiques chez un même animal afin d’avoir une analyse plus large et plus intégrée. L'accès à la veine caudale, dans laquelle les hormones des cellules de Dahlgren sont libérées, est facilement accessible et permettra une analyse des sécrétions dans le temps et évitera ainsi d’utiliser des animaux supplémentaires. L’utilisation de culture de cellules de Dahlgren n’est actuellement pas possible du fait, justement, de l’absence de connaissances sur ces cellules spécifiques et il n’y a donc pas d’alternative in vitro disponible. Cependant, les hormones identifiées au niveau des cellules de Dahlgren au cours de ce projet seront, par ailleurs, testées in vitro sur des lignées cellulaires pour étudier leur mode d’action.
Réduction
L’expérimentation in vivo est réduite à 6 animaux par condition expérimentale pour permettre une analyse statistique appropriée pour les faibles effectifs. Les variations testées de température et de salinité, la durée de l’expérimentation ainsi que les temps de prélèvement des échantillons sanguins ont été définis et réduits au minimum sur la base des données bibliographiques. Ces données ont notamment montré qu’une exposition de la petite roussette, ou d’une autre espèce de requin, dans un milieu de salinité différente provoquait une variation significative des paramètres plasmatiques à 6h et que la réponse de tissus biologiques impliqués dans l’osmorégulation était observée entre 12h et 24h après le changement de milieu. Les températures choisies correspondent à celle qui impacte (20°C) ou non (10°C) la spermatogenèse et à celle qui impacte (20°C) ou non (15°C) la croissance embryonnaire de la roussette. Ces températures correspondent également à une augmentation de 5°C des température moyennes de surface des océans dans les scénarios de changement climatique. Ces données bibliographiques nous ont donc permis de bien cerner les conditions à tester et d’éviter l’utilisation d’un nombre plus important d’animaux. De plus, l’utilisation de technologies performantes à haute résolution permet d'obtenir des données statistiquement analysables à partir de faibles quantités d’échantillons, ce qui permet de limiter le nombre de cellules de Dahlgren à prélever, et donc d’animaux. Un maximum d’organes sera prélevé sur un même animal pour des études ultérieures liées au projet et pour leurs utilisations dans des projets différents réalisés par d’autres chercheurs s’intéressant à cette espèce.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés pendant au minimum 4 semaines avant les expériences dans des systèmes à flux ouvert avec de l'eau de mer naturelle à 15°C, sous un cycle de lumière artificielle 8L:16D et ils seront en groupe à raison d’une densité de 5 animaux / 100L (environ 35kg/m3). Cette période de 4 semaines est justifiée par une préconisation généralement admise de 2 semaines de délai entre le transport des animaux et leur inclusion expérimentale auxquelles sont rajoutés 2 semaines minimum qui permettront une manipulation des animaux (caresses du museau, caresses ventrales, prise en main dans les bacs, tests d’immobilité tonique). Au cours de cette période, les animaux seront nourris de poissons ou de mollusques ad libitum à une fréquence d'une fois par semaine, ce qui est en accord avec le mode d'alimentation des requins. Les animaux seront également pesés et mesurés puis identifiés par un marquage externe (fil de couleur placé autour du corps devant la nageoire dorsale). Lors des tests, les animaux seront transférés dans un bac de 100L (hauteur de 60 cm) permettant une nage sans contrainte et ainsi assurer une bonne irrigation des branchies et, selon les conditions, permettant également aux animaux de boire. Lors de ces tests une observation de comportements de stress (nage rapide et comportement de fuite hors du bassin, rougeurs de la peau) entrainera aussitôt l’exclusion des animaux. Pour les prélèvements sanguins les animaux seront transférés dans un bac de petite dimension (1m x 0.30m) pour permettre leur sédation et la mise en place d’une pompe buccale non invasive pour assurer l’irrigation des branchies. En fin de procédure, les animaux seront mis à mort pour procéder aux prélèvements des tissus biologiques.
Choix des espèces
L’espèce utilisée, Scyliorhinus canicula est un requin Carcharhiniforme non classé comme vulnérable (Least Concern) sur la liste rouge de l’UICN (Union internationale pour la conservation de la nature). Du fait de son abondance et de la disponibilité de données scientifiques, dont génomiques, cette espèce est considérée comme une espèce modèle pour l’étude des requins. Ces derniers appartiennent au groupe des poissons cartilagineux (Chondrichtyens) qui regroupe également les holocéphales (ou chimères) et les raies. Au cours de l’évolution, les poissons cartilagineux ont divergé des vertébrés osseux il y a environ 420 millions d’années. Ils constituent donc un taxon d’intérêt pour les études phylogénétiques. De plus, les études en physiologie des poissons s’intéressent très peu à celle des requins et des raies alors qu’ils constituent un groupe très différent des poissons osseux et qu’ils sont de plus en plus menacés dans nos écosystèmes marins. Seuls des animaux adultes de sexe mâle seront utilisés. Les roussettes mâles atteignent une maturité sexuelle à 6,6 ans pour une taille de 54 cm. Afin d’utiliser des lots homogènes, nous identifierons les animaux au préalable dans une gamme de taille de 60±3 cm et de poids de 680±30g. L’utilisation d’adultes est justifiée par le fait de prélever des animaux en milieu naturel qui aient eu des cycles de reproduction, donc moins impactant pour la ressource, et de disposer d’animaux de taille suffisante pour le prélèvement des échantillons biologiques.
Rôle de la protéine kinase A de type I dans la compartimentation de l’AMP cyclique dans les cardiomyocytes
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent une biopsie de la queue pour le génotypage et des injections, dont une dans la veine caudale sous anesthésie, avant d'être tuées pour prélever le cœur et d'autres organes, afin d'étudier les mécanismes de toxicité de l'adrénaline sur le cœur dans l'insuffisance cardiaque. Le porteur indique que les biopsies et injections provoquent une douleur légère et que la manipulation stresse les animaux. Sur le remplacement, il affirme le recours "incontournable" à l'animal, les cellules cardiaques adultes ne survivant pas au-delà de deux à trois jours en culture.
Objectifs
L'insuffisance cardiaque est une maladie grave et fréquente (1 à 2 % de la population des pays développés) dont l'espérance de vie à 5 ans est de seulement 50% malgré les traitements actuels. Quelle que soit son étiologie, l'insuffisance cardiaque est associée à une augmentation chronique d’adrénaline et de noradrénaline dans la circulation et ceci a des conséquences néfastes pour le cœur. L'objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes de toxicité de ces hormones sur le coeur, dans l'espoir de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour de futurs traitements de l'insuffisance cardiaque.
Bénéfices attendus
Comprendre les mécanismes de la toxicité de l'adrénaline et de la noradrénaline pourrait permettre de trouver à terme de nouveaux traitements pour améliorer la contraction du cœur dans l’insuffisance cardiaque et donc la survie des patients atteints de cette maladie.
Procédures
Un prélèvement sur animaux vigiles, durée 30 secondes. 2 injections, durée 3 secondes/injection, 1 injection caudale, durée 30 secondes, sous anesthésie. 1 injection pour euthanasie.
Impact sur les animaux
Le prélèvement d'une biopsie de queue (1 mm) pour le génotypage et les injections occasionnent une douleur légère. L'injection à la queue est réalisée sous anesthésie mais est susceptible d'entraîner une douleur passagère au réveil. La manipulation des animaux pour effectuer ces opérations, bien qu'effectuée par du personnel formé, provoque un stress.
Devenir
L'ensemble des animaux sera euthanasié pour prélèvement du coeur et des autres organes majeurs, ce qui sera indispensable pour mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques conduisant à l'insuffisance cardiaque.
Remplacement
Le recours incontournable à des animaux se justifie par la nécessité d’étudier la répartion de l’AMPc dans les cardiomyocytes. Il se justifie par l’impossibilité d’obtenir des lignées de cellules cardiaques adultes possédant les mêmes caractéristiques que les cardiomyocytes primaires, par le fait que les cellules cardiaques adultes ne conservent pas un phénotype stable en culture et ne survivent pas au delà de 48 à 72h.
Réduction
Des souris des deux sexes seront utilisés dans ce projet car il n'existe pas d'évidence que le sexe modifie la répartition de l'AMPc et ceci permettra de réduire le nombre d'animaux produits. Une planification minutieuse a permis de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en préservant la validité statistique de l’étude, et en conservant une puissance statistique suffisante pour observer un effet. Dans la mesure du possible, les cardiomyocytes et les tissus seront partagés afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés. Des expériences d’imagerie, de biochimie et de biologie moléculaire seront effectuées à partir du même isolat de cardiomyocytes afin de réduire encore le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s’assurer qu’ils ne subissent aucun stress. Au quotidien, l’aspect des souris sera examiné (aspect général, état du pelage, prostration éventuelle) et des pesées seront effectuées une fois par semaine afin de mettre en œuvre les points limites appropriés. Afin d’améliorer leurs conditions d’hébergement de l’enrichissement sera ajouté dans leurs cages. Les rats sont mis en cage et observés tous les jours. Les cages sont changées 2 fois par semaine afin de minimiser une éventuelle infection. L’injection dans la veine caudale est réalisée sous anésthésie à l'isoflurane.
Choix des espèces
La souris est un mammifère comme l’Homme dans lequel il est possible d’étudier la fonction d’un gène pour mieux comprendre son rôle dans le développement des maladies. Dans ce projet, nous utilisons des souris dont un gène est modifié uniquement dans le cœur dans le but de mieux comprendre son rôle dans l’insuffisance cardiaque ce qui pourrait permettre à terme de trouver de nouveaux traitements de cette maladie. Nous utilisons des animaux adultes car l’insuffisance cardiaque touche principalement des sujets adultes.
Evaluation de l’effet d’un traitement sur un modèle murin du Syndrome de l’X Fragile (2023-E-023).
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Porteuses d'une mutation modélisant le syndrome de l'X fragile, elles reçoivent un composé dans l'eau de boisson pendant huit jours, puis sont tuées pour prélever le cerveau et enregistrer l'activité électrique sur des coupes, afin de tester si ce composé calme l'hyperexcitabilité du cortex. Le porteur indique que ces souris ne montrent pas d'altération du comportement à l'âge utilisé et que le composé n'a pas provoqué d'effet indésirable. Sur le remplacement, il affirme qu'étudier l'activité neuronale dans le cerveau entier est "indispensable" et ne peut se faire sur des cultures cellulaires.
Objectifs
Le syndrome de l’X fragile (SXF) est une maladie génétique qui provoque des problèmes intellectuels et touche environ 10 000 personnes en France. Cela est dû à une mutation dans un gène qui empêche la production d'une protéine essentielle pour le fonctionnement normal des cellules nerveuses dans le cerveau. Ce dysfonctionnement des cellules nerveuses entraîne des problèmes d'excitabilité dans le cerveau, plus particulièrement dans une région appelée cortex. Actuellement, il n'y a pas de traitement spécifique pour cette maladie héréditaire. Les traitements existants ne font que soulager certains symptômes, mais ne guérissent pas la maladie. C'est pourquoi il est très important de rechercher de nouveaux traitements qui pourraient changer le cours de la maladie. Une approche potentielle pour traiter le SXF serait de trouver un traitement qui pourrait réduire cette hyperexcitabilité dans le cerveau. L'objectif de ce projet est de tester l'effet d'un composé administré dans l'eau de boisson sur l'hyperactivité du cortex observée dans un modèle de souris atteintes de SXF. En d'autres termes, nous allons étudier si ce composé peut aider à calmer l'excitabilité excessive dans le cerveau de ces souris pour améliorer leur état.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les dysfonctionnements des cellules neuronales observés dans le SXF, forme la plus fréquente de déficience intellectuelle héréditaire, et notamment les mécanismes responsables de l’hyperexcitabilité au niveau du cortex cérébral, et de tester l'effet d'un candidat médicament sur cette hyperexcitabilité, dans le but de développer de nouvelles approches thérapeutiques chez l’Homme afin de traiter cette pathologie.
Procédures
Administration d'un composé dans l'eau de boisson pendant 8 jours. Euthanasie : Administration du mélange d’anesthésiques/analgésiques (10 secondes), anesthésie de la souris par inhalation d'un anesthésique (maximum 5 minutes), prélevement du cerveau (2 minutes).
Impact sur les animaux
Les souris modèles du SXF que nous utilisons ne présente pas d’altération de leur comportement à l’âge utilisé. Le composé étudié n’induit aucun effet indésirable après 8 jours d’administration dans l’eau de boisson.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés afin de réaliser les coupes cérébrales et procéder aux enregistrements de l’activité cérébrale sur ces coupes.
Remplacement
Les expériences in vivo, en utilisant des modèles animaux, permettent d'étudier le fonctionnement des neurones dans leur contexte naturel, c'est-à-dire à l'intérieur du cerveau entier. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour étudier l'activité éléctrique neuronale des différentes régions du cerveau et le bénéfice de certains traitements sur ces modifications d'activité neuronale envisagés dans ce projet. Ces approches expérimentales ne peuvent pas être remplacées par des méthodes substitutives type approche in sillico / in vitro ou culture cellulaire ... L'utilisation du modèle souris nous permet de mimer la physiologie et la pathologie humaine et de corréler les modifications anatomiques et physiologiques observées in vivo à des déficits.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un programme adapté. Les résultats seront analysés par des tests statistiques. Nous adapterons les tests statistiques en fonction des observations.
Raffinement
Avant toute administration, une période d’acclimatation des animaux d’au moins 5 jours sera respectée. Une observation des animaux sera effectué quotidiennement sans exception (Week-ends & jours fériés). Pendant la période d’administration du composé dans l’eau de boisson (8 jours), un contrôle renforcé selon la fiche de suivi sera réalisé à minima 3 fois, afin de s’assurer de l’absence d’effet indésirable inattendu. En cas d’altération de l’état de l’animal, la surveillance sera rapprochée et il sera soigné selon les recommandations du vétérinaire et en accord avec le directeur d’étude.
Choix des espèces
Nos expérimentations sont réalisées chez la souris, dont l’étude est extrêmement répandue au sein des laboratoires de recherche en Neurosciences, rendant les résultats pertinents pour la communauté scientifique nationale et internationale. Ces rongeurs, de petite taille et d’élevage facile, possèdent un système nerveux dont le développement est extrêmement proche de celui du système nerveux humain, et dont l’organisation, certes simplifiée, est suffisamment complexe. Pour l'étude des déficits du SXF, un modèle de souris de cette maladie nous permettra d’étudier l’effet d’un traitement sur les dysfonctionnements neuronaux observés dans le SXF. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, de 6 semaines à 15 semaines. En effet, des études préliminaires réalisées par notre client ont montré une efficacité du composé testé sur un autre modèle de souris malades à l’âge adulte.
Modèles précliniques de gliome chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de glioblastome sont implantées dans leur cerveau, suivies de résection chirurgicale, d'irradiation, d'imagerie IRM et de tests comportementaux de dépression, d'anxiété, de motricité et de mémoire, pour reproduire la prise en charge des patients et évaluer de nouveaux traitements. Le porteur indique que la tumeur peut entraîner perte d'appétit, posture anormale, isolement, troubles de l'équilibre et de l'orientation, les manipulations répétées ajoutant du stress. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité d'un glioblastome et que l'animal reste le seul moyen de mener ce projet.
Objectifs
Les traitements pour les patients souffrant de glioblastome (GBM) incluent la chirurgie (pour un peu plus de 60% des cas) et la combinaison de radio- et chimiothérapie (principalement appliquée par l’utilisation de l’agent alkylant temozolomide (TMZ)). Lors d'une étude précédente nous avons mis en place un modèle animal qui récapitule la prise en charge du patient ce qui rend la validation de nouvelles approches thérapeutiques très pertinentes. Ce nouveau modèle nous ouvre maintenant de nombreuses perspectives afin d'utiliser ce modèle dans des applications précliniques originales. Pour cela, nous utiliserons un modèle murin immunocompétent ou immunodéprimé afin d’y implanter des cellules tumorales de souris (modèle syngénique) ou humaines, pour reproduire au mieux les conditions de formation de ces tumeurs chez l’homme. Les animaux sont produits à cet effet dans une structure agréée qui tient compte de l’éthique animale et assure l’élevage et le suivi quotidien des animaux dans les meilleures conditions de bien-être conformément à la législation et la règle des 3R. De notre côté nous veillons à bien définir le projet et sa pertinence comme le stipule la règle des 3R. En effet avant de réaliser les procédures des études de préliminaires seront réalisées afin de remplacer chaque fois que cela est possible le modèle in vivo par des modèles in vitro. A ce stade du projet, l’utilisation de modèles animaux reste inévitable puisqu’aucun modèle suffisamment précis n’est disponible pour étudier le glioblastome et sa réponse aux traitements. L’efficacité d’un nouveau traitement passe nécessairement par ces études in vivo et l’intérêt d’avoir un modèle, à ce jour jamais réalisé, reproductible et mimant toutes les phases d’une radio-chimiothérapie pour l’homme est essentiel pour bien appréhender
Bénéfices attendus
Les glioblastomes sont responsables de nombreux décès, à ce jour une résection de tumeurs avec un traitement adapté permet une survie des patients de 6.9 à 14.6 mois. L’objectif est donc de prolonger ces délais mais aussi et surtout améliorer le confort des patients. A ce jour les traitements pour les patients souffrants (GB) incluent la chirurgie (pour un peu plus de 60% des cas) et la combinaison de radio- et chimiothérapie (principalement appliquée par l’utilisation de l’agent alkylant temozolomide (TMZ). La validation d’un inhibiteur passant la barrière hématoencéphalique et potentialisant la combinaison radio- et chimiothérapie et ceux en diminuant les doses de TMZ ont pour objectif d’améliorer la survie mais aussi le confort de vie des patients..
Procédures
Implantation tumorale 10 minutes. La résection tumorale 15 minutes. L'imagerie IRM 40 min. L'irradiation 2min. La bioluminescnce 2 min. Pour les testx comportementaux les tests de dépression de 4 à 20 min une fois par semaine, les tests de l'anxiété 5 min 1 fois par semaine , les tests de la motricité de 1 à 4 min 1 à 3 fois par semaine et les tests de la mémoire et de l'anxiété 10 min 1 fois par semaine.
Impact sur les animaux
Les souris seront surveillées quant à leur comportement et aux signes indicateurs de croissance tumorale pouvant générer une perte de l’alimentation une posture anormale, un manque de toilettage et un isolement social et seront pesées quotidiennement à partir de l'apparition des premiers signes cliniques. Les tests de comportements vont permetre de déceller des des symptomes tels que une perte de l'équilibre et des troubles de l'orientation mais aussi provooquer du stress suite à de nombreuses manipulations.
Devenir
A la fin de l'étude nous prélevons les cerveaux pour des analyses immuohistologiques
Remplacement
Il est impossible d’évaluer l’effet thérapeutique d'anticorps sur un modèle in vitro ou in silico. Aucun modèle cellulaire ne permet de reproduire la complexité d'un glioblastome, et seul le modèle animal permet de conduire ce projet. Les souris sont des animaux très adaptés à ce travail avec une littérature validant ce choix.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au strict minimum nécessaire pour être statistiquement significatif et scientifiquement irréprochable. Pour ces études les tests statistiques non paramétriques seront utilisés en cohérence avec le nombre de groupes analysés et d'animaux. Au total 800 souris maximum seront nécessaires pour cette étude.
Raffinement
Afin de raffiner les conditions de vie des souris, un suivi adapté des animaux sera instauré afin de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'ils pourraient éprouver. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux et bénéficient d’un enrichissement adapté. Pour cela des soins pré-, per- et postopératoires adéquats seront réalisés. Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie générale et des traitements analgésiques sont systématiquement utilisés pour prévenir toute douleur.
Choix des espèces
Nous utiliserons un modèle syngénique (souris C57BL/6rJR ) et un modèle immunodéprimé pour les glioblastomes humains. L’utilisation de ces modèles va nous aider à mieux appréhender la croissance tumorale et surtout avoir un modèle animale très proche des procédures effectuées chez les patients. Les cellules utilisées nous permettent de contrôler la croissance tumorale par bioluminescence ou par IRM. Nous utiliserons des souris de 8 à 10 semaines pour avoir une croissance tumorale optimale. En effet, les expériences peuvent s’étaler sur plusieurs semaines dans un modèle immunocompétent ou immunodéprimé, donc l’implantation sur des jeunes animaux permet de s’affranchir de l’affaiblissement d’individus plus âgés.
Rôle du récepteur nucléaire CAR comme senseur hépatiques des fibres alimentaires dans les maladies métaboliques du foie
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Génétiquement modifiées pour invalider le gène CAR, elles sont soumises trente semaines à un régime gras qui induit obésité et foie gras, avec gavages oraux, tests de tolérance au glucose et prélèvements de sang à la queue, avant un prélèvement terminal d'organes, pour étudier le rôle des fibres alimentaires et du microbiote dans les maladies du foie. Le porteur affirme que le régime provoque ces désordres "sans souffrance visible", et signale que le gavage peut stresser les animaux et irriter l'œsophage. Sur le remplacement, il décrit un dialogue entre foie, intestin et tissu adipeux qu'aucun modèle cellulaire ne reproduirait, et conclut au recours à l'animal "entier".
Objectifs
Le syndrome métabolique affecte actuellement 18% de la population française. Au niveau du foie, les complications de ce syndrome se caractérisent par une accumulation de lipides dans celui-ci puis peuvent évoluer vers des stades plus avancés d'inflammation, de fibrose et de dysfonction du foie. Ces maladies représentent maintenant la 2ème cause de transplantation de foie et aucun médicament contre ces maladies n'a été approuvé. De plus, des études ont démontré que l’augmentation de la température d’hébergement des animaux, associée à un régime gras permettait d’induire le développement d’une maladie du foie plus sévère. Par ailleurs, le microbiote intestinal est impliqué dans le développement de cette maladie en produisant des petites molécules qui circulent entre l’intestin et le foie via la veine porte et qui peuvent favoriser le développement de l’inflammation dans le foie. Les fibres alimentaires (dont l’inuline) peuvent être transformées par le microbiote intestinal et ont des effets bénéfiques sur ces maladies hépatiques. Les effets de l’inuline sont dépendants des petites molécules produites par le microbiote intestinal, cependant ces molécules et les mécanismes en jeu dans le foie sont peu connus. Nos résultats préliminaires démontrent que les fibres alimentaires ont également un impact sur une protéine (le récepteur nucléaire CAR (Constitutive Androstane Receptor) connue pour être impliqué dans le maintien des fonctions de détoxification et de métabolisme lipidique du foie. Dans ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur l’impact des fibres sur le développement des maladies hépatiques via la production de molécules microbiennes, ainsi que la fonction du récepteur CAR dans cet axe microbiote intestinal-foie. Ainsi, pour cette étude, nous utiliserons des souris dont le gène CAR a été invalidé et qui seront nourries avec un régime gras induisant une maladie hépatique similaire à celle observée chez l’Homme. Les institutions internationales recommandent de prendre en compte l’effet du sexe dans le métabolisme énergétique puisqu’il existe chez l’Homme un fort dimorphisme sexuel dans le développement de la NAFLD mais également dans l’expression du récepteur CAR, donc nos études seront effectuées dans les 2 sexes.
Bénéfices attendus
Avec ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur l’impact des fibres alimentaires fermentescibles sur le développement des maladies hépatiques et via la production de molécules microbiennes et leur impact sur le récepteur CAR. L’identification de molécules issues du microbiote intestinal et ayant des effets bénéfiques ou délétères sur le foie permettra une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques hépatiques et aidera potentiellement au développement de futurs agents thérapeutiques issus du microbiote intestinal (pro-, pré- ou post-biotiques) dans ces pathologies.
Procédures
Après les 2 semaines d’acclimatation, les animaux seront placés sous régime Western Diet (WD). Au cours des 30 semaines de régime, nous réaliserons 2 tests de tolérance orale au glucose (semaine 14 et 28) et 2 tests de mesure de la perméabilité intestinale in vivo qui nécessiteront un gavage oral puis un prélèvement d’un ou 2 gouttes de sang à la queue. Le gavage oral sera réalisé après une contention rapide de l'animal puis un gavage oral avec une sonde de gavage adaptée. Le geste de contention et de gavage durera moins d'une minute par animal. Les prélèvements sanguins à la queue seront réalisés après application d'un analgésique local sur la queue puis une incision légère de celle-ci sera réalisée. Le geste de prélèvement sanguin durera moins d'une minute par animal et nécessitera un maintien uniquement de la queue. Après 30 semaines de régime, nous procéderons à un prélèvement de sang à la veine porte et la veine cave sous analgésie et anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Le régime WD induit une obésité chez les animaux, ainsi que des perturbations métaboliques généralement associées à l'obésité : intolérance au glucose (diabète), accumulation de triglycérides dans le foie, augmentation de la perméabilité intestinale, sans souffrance visible des animaux, ni changement drastique de leur comportement. Lors du test de tolérance orale au glucose et de la mesure de la perméabilité intestinale in vivo, le gavage oral peut provoquer un stress lié à la contention et des irritations de l’œsophage. Le prélèvement sanguin à la queue peut parfois induire un changement comportemental chez les souris mâles qui nécessitera une surveillance accrue des animaux afin d’éviter l’agressivité.
Devenir
A l'issu de la procédure, tous les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés. Différents organes (foie, intestin, …) seront prélevés afin d’approfondir les connaissances sur l’impact des fibres sur le développement des maladies hépatiques via la production de molécules microbiennes, ainsi que la fonction du récepteur CAR dans cet axe microbiote intestinal-foie.
Remplacement
L'utilisation d'animaux de laboratoire entier est nécessaire car le projet étudie des phénomènes biologiques (voies métaboliques) qui font intervenir différents tissus (foie, intestin, tissu adipeux) agissant en synergie via un dialogue inter-organe. De plus, afin d'étudier l'interaction entre l'alimentation et le microbiote intestinal, ainsi que les voies métaboliques impliquées dans l'axe intestin-foie, l'utilisation de souris de laboratoire est appropriée avec notamment la possibilité d'utiliser des animaux génétiquement modifiés. Enfin, actuellement, il est impossible de mimer ce dialogue complexe entre les différents compartiments et organes par l'utilisation de méthodes alternatives (modèles cellulaires).
Réduction
Nous avons soigneusement conçu les expériences pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs. Un nombre suffisant de souris sera utilisé dans toutes les expériences afin d'observer des effets biologiquement pertinents et statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé par un test statistique et basé sur nos résultats préliminaires. Le nombre idéal d’animaux par lots est donc de 12. Chaque groupe expérimental sera donc constitué de 12 souris. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages dont le milieu d'élevage est enrichi d'un abri en inox permettant aux souris de s'isoler de leurs congénères si besoin. Afin de limiter le stress, les animaux sont manipulés régulièrement et habitués à la contention. Afin d'évaluer la souffrance, la détresse et l'inconfort des animaux, des points limites gradés seront mis en place basés sur l'évaluation de 5 aspects de l'état de l'animal : variation du poids de l'animal (et variations connexes au niveau de l'ingestion d'aliment et d'eau) ; apparence physique externe ; signes cliniques mesurables (changements du rythme cardiaque, respiratoire et de la nature de ceux-ci) ; changement dans les comportements non provoqués et réponses comportementales aux stimuli externes. Pour chaque catégorie, un système d'évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) sera proposé. L'indice cumulatif obtenu en ajoutant les valeurs à chacune des catégories indiquera chez l'animal une déviation croissante par rapport à la normale qui peut être interprétée comme étant une indication de souffrance et/ou de détresse croissante. Ainsi, si un animal présente un score de 3 après évaluation de ces 5 critères, le critère d'arrêt sera atteint et l'animal sera retiré de l'expérimentation.
Choix des espèces
Le modèle murin est largement utilisé dans la recherche concernant le métabolisme. En effet, il est bien connu que les souris (C57Bl6J) soumises à un régime gras développent une insulino-résistance importante, élément corrélé avec l'apparition des maladies hépatiques. De plus, nous souhaitons étudier le rôle hépatique du récepteur CAR dans les pathologies hépatiques, ainsi nous utiliserons un modèle murin C57Bl6J déficient pour le récepteur CAR au niveau systémique. Ce modèle existe uniquement chez la souris. Nous utiliserons uniquement des souris adultes car il est nécessaire que la fonction hépatique ait pleinement atteint sa maturité physiologique (7 semaines minimum). De plus, nous utiliserons des souris mâles et femelles car il existe chez l'homme un fort dimorphisme sexuel dans le développement des maladies hépatiques mais également dans l'expression le récepteur CAR.
Evaluation de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques et de leur effet vasoconstricteur par imagerie laser doppler dans un modèle murin de rosacée
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Rats : 80
600 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des inducteurs de rosacée sont injectés de façon répétée pour provoquer une inflammation cutanée, puis les animaux reçoivent des traitements quotidiens par voie orale, cutanée ou injectée, avec imagerie, mesures de l'épaisseur des oreilles et du dos et prélèvement sanguin terminal, pour tester de nouvelles molécules contre cette maladie de peau du visage. Le porteur reconnaît que la rosacée est "sans gravité" mais insiste sur son retentissement psychologique, et décrit une inflammation locale "transitoire" ainsi qu'un possible dessèchement de la peau. Il écarte le remplacement au motif qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la peau comme tissu vivant, alors que le bénéfice reste conditionné à ce qu'une molécule "se révèle efficace".
Objectifs
La rosacée touche 2 à 3 % de la population adulte, majoritairement des personnes âgées de 30 à 60 ans et atteint deux fois plus les femmes que les hommes. La rosacée est une maladie cutanée chronique caractérisée par une atteinte des petits vaisseaux sanguins du visage. Cette maladie de la peau touche essentiellement la partie centrale du visage (front, nez, joues, menton). Elle se manifeste par des rougeurs du visage occasionnelles ou persistantes ; de la couperose (dilatation anormale et permanente de petits vaisseaux sanguins de la peau, visibles à l'œil nu) ; et éventuellement, diverses lésions cutanées comme des papules, des pustules...Bien que sans gravité, la rosacée peut avoir un fort retentissement psychologique en raison de la visibilité des lésions du visage. Il est indispensable de tester ces molécules dans un modèle murin pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas de modèle in vitro de rosacée pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux destinés à être appliqués sur la peau - L’efficacité ne pouvant être complètement testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme). De ce fait, il est important d’avoir un modèle préclinique prédictif de la rosacée afin d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques (non cosmétiques) qui permettront dans un futur proche d'apporter au patient plus de confort au quotidien.
Bénéfices attendus
La rosacée est une maladie de la peau qui a des répercussions psychologiques très importantes chez les patients car elle modifie l'image corporelle des individus et parce qu'elle atteint le visage, elle interfère alors dans la relation avec les autres. Les personnes touchées sont en proie au mal-être et ont tendance à se replier sur elles-mêmes. Les bénéfices de ce projet, si une molécule se révélait efficace, serait de mettre sur le marché cette molécule permettant aux patients atteints de rosacée de guérir de la rosacée et de son érythème, réduisant ainsi les conséquences physiques et les répercussions psychologiques impactées par cette maladie de peau.
Procédures
Des traitements seront administrés quotidiennement aux animaux par voie orale, topique, intrapéritonéale, sous-cutanée ou intraveineuse afin d'évaluer leur efficacité dans le cadre de la rosacée (durée d'intervention
Impact sur les animaux
L'injection répétée des inducteurs de la rosacée induit de l'inflammation locale, mais très transitoire chez l'animal, du fait de l'injection en elle-même et du produit injecté. Il est possible également que les molécules testées par voie topique puissent assécher localement de façon excessive la peau des oreilles. Si tel était le cas, les fréquences de traitement seraient espacées (dans le cas de traitement de 1 à 2 semaines).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures car ils ne pourront pas être réutilisés du fait du prélèvement des tissus chez ces derniers.
Remplacement
Nous n'utiliserons le modèle animal de rosacée qu'en dernier recours après des tests préalables de criblage et d'efficacité in vitro. Il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas vraiment de modèle in vitro de rosacée pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux destinés à être appliqués sur la peau (voie dermique / topique) - L’efficacité ne pouvant être complètement testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme).
Réduction
La stratégie d’expérimentation sera une expérimentation en mesures répétées (étude longitudinale) par observation répétée avec ou sans procédure d’imagerie. Cette approche expérimentale permet d’appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées (ANOVA ; seuil de significativité alpha de 5 % dont le critère principal sera l'épaisseur des oreilles en fonction du temps) et permet d’avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle. Le nombre d’animaux sera de 8 par groupe (groupe d’animaux traités avec excipient de la molécule à tester, la molécule à tester et le traitement thérapeutique de référence commercialisé). Ce nombre est le minimum pour avoir une significativité acceptable avec une variation de 15 %, une puissance de 70 %, et une différence à souligner de 20 % entre groupes témoins et tests. Des analyses post mortem sur les tissus seront réalisées afin d’obtenir le plus d’informations possibles relatives à l’efficacité des molécules administrées sur les animaux. L'utilisation de l'imagerie permettra aussi d'augmenter le raffinement (finesse de l'analyse, suivi longitudinal,...) et entraîne une réduction du nombre d'animaux utilisés grace au suivi longitudinal du meme animal. Cette approche permet donc de réduire le nombre d’animaux de 50 % au moins comparé à une technique telle que l'histologie qui aurait nécessité le sacrifice des animaux à différents temps.
Raffinement
Tous les animaux sont hébergés selon les conditions de la réglementation en vigueur (directive européenne 2010/63/UE). Nous veillerons à ce que chaque cage d'hébergement bénéficie d'un enrichissement adapté (igloo, bûchettes, cotons pour nidification). Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, l'utilisation de points limites adaptés et établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien-Être Animal (SBEA) de notre établissement sera mise en place ainsi que l'utilisation d'un arbre décisionnel et des critères d'arrêt de souffrance.
Choix des espèces
Les espèces animales utilisées dans ce projet (souris / rat) sont les plus utilisées et il s'agit d'excellents modèles pour ce type d'études. Ainsi il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives aux études dans ces espèces. Les multiples homologies de séquences entres ces espèces et l'Homme rendent ces modèles prédictifs du comportement des molécules après administration. Ils sont ainsi d'un grand intérêt pour le criblage de nouvelles molécules. De plus ils présentent certains intérêts pratiques décisifs : faible coûts, cycle de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Il est important de préciser que les molécules actuellement utilisées en clinique ont été découvertes ou évaluées sur ces modèles. Les animaux seront utilisés entre 6 et 10 semaines, nous permettant ainsi d’avoir un point de comparaison par rapport aux résultats issus de la littérature relative à ce modèle.