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Modèle animal de mouvements anormaux après privation en oxygène chez le rat – projet pilote
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité sévère. Privés d'oxygène sous anesthésie pour reproduire le syndrome de Lance-Adams, ils subissent ensuite des stimulations sonores quotidiennes pendant quatre semaines et des injections de molécules anti-myocloniques, avant la mise à mort pour analyses. Le porteur reconnaît que la privation d'oxygène peut tuer certains animaux et provoquer des secousses gênant leur déplacement et leur alimentation, tout en rappelant que ces secousses ne sont pas jugées douloureuses chez l'humain. Il affirme qu'aucun modèle non animal ne peut étudier la mort des neurones et présente ce projet pilote comme un préalable à des travaux ultérieurs.
Objectifs
Chez l’homme, l’arrêt brutal de l'oxygénation du cerveau (ou anoxie cérébrale) peut être liée à des causes variées comme un arrêt cardiaque ou une crise d’asthme très sévère. Chez les survivants, ce manque d’oxygène peut entraîner des problèmes neurologiques chroniques comme le syndrome de Lance-Adams (LAS). Le LAS est caractérisé par des secousses musculaires involontaires (qu’on appelle myoclonies) très importantes et qui ne sont pas qualifiées comme douloureuses par les patients. Elles apparaissent spontanément ou en réaction aux sons notamment. Elles rendent impossible la réalisation de nombreux gestes de la vie quotidienne : marcher, s’alimenter, se laver ou aller aux toilettes. Les patients reçoivent souvent de nombreux médicaments qui exposent à des effets secondaires parfois graves et aux risques d’interactions entre médicaments. Malheureusement, l'efficacité de ces médicaments est souvent insuffisante pour traiter les secousses musculaires du LAS. Les mécanismes à l'origine du LAS restent peu connus. A ce jour, le principal modèle animal de secousses musculaires induites par un manque d’oxygène (donc équivalent du LAS chez l’humain) existe chez le rat. Compte-tenu des limites de cet ancien modèle, l'objectif de notre projet pilote est donc de mettre au point un nouveau modèle animal de secousses musculaires après un manque d'oxygène reproduisant les caractéristiques du LAS chez l’Homme. Avec une procédure expérimentale plus simple, moins invasive et plus représentative du mécanisme du LAS chez l’humain, nous souhaitons identifier les divers paramètres expérimentaux permettant d’obtenir un modèle fiable et reproductible tout en limitant la mortalité et la douleur chez l’animal, indispensable pour vérifier nos hypothèses concernant les mécanismes à l'origine du LAS.
Bénéfices attendus
La prise en charge des patients atteints du syndrome de Lance-Adams (LAS) est aujourd’hui limitée avec des traitements globalement peu voire pas efficaces. L’amélioration de la prise en charge des patients passe avant tout par une meilleure compréhension des mécanismes aboutissant aux secousses involontaires (appelées myoclonies) du LAS. Cela repose donc notamment par l’exploitation des modèles animaux qui reproduisent cette pathologie. Comme évoqué précédemment, le principal modèle déjà publié de LAS a des points faibles. Nous souhaitons donc développer ce nouveau modèle de LAS chez le rongeur pour ensuite l’explorer finement afin d’approfondir nos connaissances sur les mécanismes pathologiques du LAS. Les études animales déjà réalisées avec le modèle existant donnent des résultats assez hétérogènes. Chez l’homme, les études cliniques semblent indiquer que les secousses des patients avec un LAS pourraient provenir de l'écorce du cerveau appelée cortex. Dans notre groupe de patients atteints de LAS, les premiers résultats sont très en faveur d’une atteinte du cortex pouvant être à l'origine des secousses. Par ailleurs, certains neurones spécifiques du cortex sont très consommateurs d'oxygène. Le manque d'oxygène pourrait donc en priorité affecter le fonctionnement de ces neurones-là. Nous faisons donc l’hypothèse que les secousses musculaires du LAS sont, au moins en partie, dues à un souffrance de cette population de neurones au sein du cortex responsable des mouvements. A court terme, cette étude pilote permettra d’établir les différents paramètres expérimentaux permettant d’obtenir un nouveau modèle animal de LAS. A long terme, le bénéfice de la mise en place de ce nouveau modèle sera d’approfondir, dans un projet ultérieur, les connaissances déjà acquises sur le LAS, en particulier par des méthodes électrophysiologiques et immunohistochimiques afin de tester notre hypothèse.
Procédures
Le protocole des stimulations auditives sera réalisé chez tous les animaux, pendant 45 secondes, une fois par jour tous les jours pendant la semaine précédant la procédure de privation en oxygène, puis une fois par jour tous les jours pendant les 4 semaines suivant la procédure de privation en oxygène. Ces stimulations auditives se feront chez des animaux vigiles. Le protocole de privation en oxygène sera réalisé à une seule reprise sur tous les animaux, entre 0et 10 minutes. Cette procédure se déroulera alors que les animaux seront anesthésiés et après injection de médicaments anti-douleur. Au cours de la procédure d’évaluation de la survenue des secousses pendant les semaines suivant le manque d’oxygène, des injections de molécules anti-épileptiques et anti-myocloniques (durée d’injection et temps de maintien : 1 minute) seront réalisées une fois pour chaque animal par voie intra-péritonéale.
Impact sur les animaux
Ce projet pilote va permettre d’évaluer les effets indésirables possibles de ce protocole expérimental. Le risque anesthésique est à prendre en considération. La mort des animaux au cours de la procédure de privation en oxygène est une possibilité expérimentale. Les secousses musculaires engendrées dans un délai de quelques jours après l’anoxie pourront entrainer des difficultés de déplacement pour les animaux ainsi que des difficultés d’alimentation. Il nous semble également important de rappeler que, chez l’humain, les myoclonies (secousses musculaires) ne sont pas considérées comme étant douloureuses.
Devenir
Les mêmes animaux sont impliqués dans les manipulations de privation en oxygène et d’évaluation des secousses musculaires. A l’issue de ces manipulations, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire, l’euthanasie étant requise pour réaliser des prélèvements et analyses post-mortem.
Remplacement
Certaines questions d’intérêt scientifique nécessitent des expériences sur les animaux. Bien que des procédures alternatives existent, ni les processus aboutissant à la mort des neurones ni les processus favorisant l'apparition de crises d'épilepsie ou de secousses musculaires involontaires (myoclonies) ne peuvent être légitimement bien étudiés chez l’homme ou dans d’autres modèles non animaux. De plus, il n’est pas légitime de provoquer une crise d’épilepsie ou des myoclonies chez un patient pour des études scientifiques. Enfin, lors des expériences sur les animaux, l’environnement est mieux contrôlé et la qualité des données est nettement supérieure.
Réduction
Nous sommes sensibles au besoin d’utiliser le moins d’animaux possible et de diminuer la souffrance animale tout en respectant la rigueur scientifique. C’est dans cette objectif que nous conduisons cette étude pilote afin d’établir les paramètres du protocole permettant de réduire au maximum la mortalité du protocole donc le nombre d’animaux à utiliser. Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum (100) pour produire une conclusion scientifique et statistique tenable. Une fois le modèle établi grâce à cette étude, nous calculerons plus précisément les différents indicateurs statistiques permettant d’évaluer le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Une période d’une semaine d’acclimatation à la zone d’hébergement est respectée après la livraison des animaux. De façon à réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront maintenus au sein de groupes sociaux de plusieurs individus. Les conditions d’hébergement, incluant température, éclairage, bruit et espace ainsi que les conditions d’enrichissement de l’environnement, d’alimentation et soins si nécessaire, seront adaptées aux animaux et à leur âge. Un soin particulier sera apporté à la réduction de l’inconfort, de la douleur ou du stress des animaux. Un protocole d’intervention sera mis en place pour chaque indicateur de souffrance (modification de comportement, signes identifiables de douleur ou d’inconfort, perte de poids, difficultés d’alimentation). Une période d’une semaine d’habituation à la manipulation humaine est respectée avant la réalisation de nos procédures. Avant le début de chaque expérience, une période d’acclimatation de 30 minutes sera observée au cours de laquelle les animaux, laissés dans leur cage, ne seront pas manipulés. Cela leur permettra de s’habituer à leur nouvel environnement et éviter toute forme de stress. Les animaux bénéficieront alors de nourriture et d’eau à volonté ainsi que d’un environnement enrichi à l’aide de tunnels. Pendant la procédure d’anoxie, les paramètres physiologiques (fréquence cardiaque et saturation en oxygène) seront surveillés constamment. Tout au long de la procédure expérimentale, des points limites adaptés ont été définis afin de limiter la douleur à son minimum.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce choisie pour ce projet. Les méthodes d’investigations électrophysiologiques et immunohistochimiques (qui seront utilisées dans un deuxième temps au cours d’un projet ultérieur) sont maîtrisées au laboratoire et ont déjà permis la publication d’études sur d’autres modèles d’anoxie et d'épilepsie réalisées sur des rats adultes. Par ailleurs, les études déjà publiées sur les modèles animaux de syndrome de Lance-Adams (LAS) précédemment citées ont été faites chez le rat. Nous allons utiliser des rats adultes entre 5 et 10 semaines de vie. Le LAS chez l’humain est en effet décrit uniquement chez des adultes. Par ailleurs, les études électrophysiologiques d’anoxie cérébrale et d’épilepsie réalisées dans l’équipe dans d’autres projets ont été faites chez des rats adultes. Ces mêmes techniques seront utilisées dans un deuxième temps sur un projet ultérieur.
Etude d’efficacité de nouveaux candidats médicaments dans des modèles murin d’hyperthermie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
4 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pour provoquer une hausse de température, elles sont soit contenues et isolées afin d'induire un stress, soit injectées de lipopolysaccharide déclenchant une inflammation, avec mesure de la température rectale, puis tuées pour prélever sang et cerveau. Le porteur indique que le lipopolysaccharide peut provoquer hypoactivité et perte de poids et que l'isolement dure jusqu'à 72 heures. Il affirme qu'aucun test in vitro ni modèle informatique ne permet d'évaluer l'hyperthermie induite par le stress ou l'inflammation.
Objectifs
Les troubles anxieux sont des troubles mentaux multifactoriels avec une étiologie complexe. Selon le DSM-V, les troubles anxieux comprennent le trouble anxieux généralisé, le trouble panique, les phobies et le trouble de stress post-traumatique. Ces troubles ont un impact sévère sur la qualité de vie et les traitements sont inconstamment efficaces et associés à des effets secondaires. Afin d’évaluer l’efficacité de nouveaux candidats médicaments sur l’hyperthermie, deux modèles animaux seront utilisés. Le premier modèle animal est celui reflétant l’anxiété anticipatrice : l'hyperthermie induite par le stress (SIH). La première utilisation du SIH dans la recherche sur l'anxiété a eu lieu après que l'on ait remarqué que le fait de retirer les souris une par une d'une cage où elles étaient logées en groupe augmentait la température corporelle de la dernière souris par rapport à la première. Par la suite, ce modèle a été affiné en hébergeant individuellement les animaux et la température rectale a été mesurée deux fois à 10 minutes d'intervalle. Cela a permis de réduire considérablement le nombre d'animaux nécessaires par expérience. Ainsi, les effets reproductibles du SIH rendent ce modèle très approprié pour le criblage de nouveaux candidats médicaments. Par ailleurs, l’hyperthermie peut être également d’origine infectieuse. Pour cela, un second modèle par injection de Lipopolysaccharide (LPS), qui mime une réaction inflammatoire, sera utilisé. Chez l’homme, l’administration de médicament contre la fièvre (aspirine, paracétamol etc…) va réduire la température corporelle induite par l’infection. Cependant, ces traitements peuvent interagir avec d’autres médicaments. C’est le cas de l’Aspirine avec les anticoagulants et le paracétamol qui, quant à lui, est contre indiqué en cas d’insuffisance hépatocellulaire. Ainsi, ce second modèle d’hyperthermie peut être utile pour le développement de cible thérapeutique pour traiter cette problématique.
Bénéfices attendus
Depuis quelques années, il a été démontré que le stress/anxiété provoquait une hausse de la température corporelle. Ce phénomène est appelé "hyperthermie fonctionnelle". Celle-ci peut entraîner une augmentation de la température corporelle jusqu’à 41°C chez des personnes exposées à d’intenses événements émotionnels (comme par exemple les personnes souffrant d’anxiété généralisée, de trouble panique, de phobies et de troubles de stress post-traumatique). Dans notre premier modèle, la contention de l’animal engendre un stress/anxiété provoquant une augmentation de la température. Ce modèle est donc pertinent pour le développement de molécules contre l’anxiété/stress contrecarrant l’hyperthermie fonctionnelle. Le second modèle concerne l’hyperthermie d’origine infectieuse. Le plus connus et utilisé des traitements de l’hyperthermie chez l’homme est le paracétamol. Son efficacité clinique est variable et il est contre indiqué en cas d’insuffisance hépatocellulaire. Notre second modèle est donc pertinent pour le développement de candidat médicament pour traiter l’hyperthermie induite par une inflammation d’origine infectieuse.
Procédures
L’ensemble des animaux sera soumis aux interventions suivantes : (1) Des administrations sont réalisées sur animaux vigiles (moins d'une minute par administration). Les fréquences d'administration dépendent des caractéristiques pharmacologiques des produits (une à deux administrations par jours pendant un mois maximum) - (2) La température rectale est mesurée deux fois à 10 minutes d’intervalle (durée de l’acte moins d’une minute) - (3) La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont réalisés à la fin du test d’hyperthermie (après la seconde prise de température); juste avant la mise à mort de l’animal. Ces prélèvements sont réalisés sous anesthésie générale profonde (anesthésie gazeuse sous isoflurane 2%). La durée totale pour réaliser ces prélèvements est d’environ 15 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances/effets indésirables sont : (1) dans le premier modèle, la contention de l'animal engendre un stress chez celui-ci provoquant une augmentation de la température. Dans le second modèle, l’administration de LPS engendre une hyperthermie. Le LPS peut également induire chez la souris une hypoactivité et une baisse de masse corporelle durant les heures qui suivent l’injection. ; (2) Dans les deux modèles d’hyperthermie, les animaux sont logés individuellement durant 72h maximum ; et (3) lors de l’administration d’une nouvelle molécule, différents effets indésirables peuvent être observés tels que : l’inconfort dû à l’injection, une diminution ou une augmentation de l’activité. De par notre expérience, les effets indésirables sont rares car la toxicité des candidats médicaments est généralement testée en amont.
Devenir
Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux sont soumis à la fin de l’expérience (juste après la dernière prise de température) à un prélèvement sanguin et de cerveau.
Remplacement
L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement des médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet de molécules sur le comportement est la conséquence de leur action au niveau de l’ensemble de l’organisme et en particulier sur le système nerveux. La mise en évidence de ces effets est réalisée sur un organisme vivant entier. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou modèle informatique ne permet de rendre compte de l’ensemble de ces phénomènes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent pas donc être remplacés par des méthodes alternatives. Pour le présent projet : il n’existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer l’hyperthermie induite par un stress ou par l’administration de LPS. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire pour étudier l’efficacité de nouvelles molécules.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d'une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité probable des réponses aux candidats médicaments, 10 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d'assurer un nombre minimum d'animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale.
Raffinement
Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Toutes les expériences sont réalisées après une période d’acclimatation de 6 à 10 jours. Les animaux sont hébergés par 5 dans des cages transparentes. Une observation quotidienne sur des caractéristiques spécifiques (Physiologie clinique, aspect général, comportement...) est effectuée durant la période d’acclimatation et d’expérimentations.Tout animal ayant atteint un ou plusieurs points limites (repérés le plus précocement possible grâce à l'observation et à l'appui d'une grille du bien-être animal) est mis à mort.
Choix des espèces
Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. La souris est le modèle le plus courant en première intention pour évaluer les effets de candidats médicaments et les données obtenues permettent de calculer facilement les doses administrables à l'homme prévues dans le cadre de premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle animal et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur ces pathologies dans toute sa complexité. En effet, les animaux sont utiles pour modéliser la base biologique des troubles anxieux, du stress ainsi que l'inflammation. Ils sont donc nécéssaires pour évaluer l'efficacité des candidats médicaments. Dans ce projet, seuls les animaux adultes (entre 6 à 12 semaines au moment du test) seront utilisés car il n'a pas pour objectif d'étudier les effets du candidat médicament sur l'animal à d'autres stades de développement.
Cycle hormonal et déficits de reconnaissance chez des souris modèles de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
974 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Modèles génétiques de la maladie d'Alzheimer, elles subissent des frottis vaginaux, des tests de mémoire nommés, reconnaissance et association objet-place, des IRM répétées et, pour 114 d'entre elles, une ovariectomie, avant la mise à mort et le prélèvement du cerveau. Le porteur soutient que le phénotype de ces souris n'est pas dommageable et que leurs déficits de mémoire n'affectent pas leur bien-être. Il affirme qu'aucun modèle in silico ou cellulaire ne reproduit encore les processus cognitifs de façon fiable.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer (MA) est caractérisée par des pertes de mémoire et par la pathologie tau et la pathologie amyloïde qui sont liées respectivement à des formes de la protéine tau et de la protéine amyloïde anormalement aggrégées dans le cerveau. L’APP est la protéine précurseur du peptide amyloïde. Les modèles rongeurs actuels surexpriment des gènes humains de l’APP avec des mutations rares provoquant la MA (formes familiales) et/ou des gènes mutés de tau qui ne sont pas associés à la MA mais qui provoquent une pathologie tau. La présence de pathologies tau et amyloïde chez ces animaux ont permis des progrès dans la compréhension de la MA, mais la surexpression de l’APP et/ou de tau provoque aussi d’autres effets qui ne se retrouvent pas dans la MA. Les souris double knock-in (dKI) AppNL F/MAPT évitent ces effets car elles ont un gène de l’APP humanisé avec deux mutations familiales humaines (Swedish et Iberian : AppNL,F) et le gène humain normal de tau (MAPT) au lieu des mêmes gènes chez la souris. En analysant la mémoire de nos souris dKI de l’âge de 2 à 6 mois, nous avons découvert que les femelles dKI ne parviennent plus à reconnaitre un objet après un délai de 24h (test RO24h) dès l’âge de 2 mois. De plus, elles n’ont pas de bons résultats dans un test de changement de la règle dans un labyrinthe, contrairement aux mâles dKI. Or ces deux tests dépendent du dialogue entre deux structures du cerveau, l’hippocampe (HC) et le cortex préfrontal (CPF). Ces résultats sont cohérents avec une étude montrant une altération de la connectivité HC-CPF plus marquée chez les femmes que chez les hommes en début de MA. Une perturbation des rythmes veille/sommeil, comme celle observée chez le patient, peut perturber le dialogue HC-CPF. A 4 mois, les dKI des deux sexes oublient rapidemment une association objet-place (OiP). Cette forme de mémoire dépend du dialogue HC-cortex entorhinal latéral (CEL). Elle est atteinte chez des personnes âgées des deux sexes et c’est un signe précurseur de la MA. En conclusion, chez les souris dKI de 4 mois, la voie CEL-HC semble affectée chez les deux sexes, tandis que les femelles semblent affectées en plus et plus tôt sur la voie HC-CPF. Les souris dKI sont les premières à montrer une perturbation aussi précoce et aussi proche de celle trouvée en phase préclinique des patientes développant une MA. Le but de ce projet est de comprendre l’origine de cette vulnérabilité féminine dans la pathologie Alzheimer.
Bénéfices attendus
L’objectif du projet est de mieux comprendre l’origine de la vulnérabilité féminine dans les premiers stades de la MA. Il est important d’explorer le rôle des oestrogènes car le développement de la MA a maints fois été attribué à la baisse marquée de production d’œstrogènes privant ainsi le cerveau d’un puissant neuroprotecteur contre les pathologies amyloïde et tau. Ici, nous analyserons chaque étape clé de l’implication des œstrogènes dans les processus de mémoire affectés chez les dKI femelles dès les premiers signes de la pathologie. Si nous découvrons une altération d’une ou plusieurs étapes, cela aidera à la compréhension de cette vulnérabilité féminine et révèlera des cibles intéressantes pour mettre au point des tests de diagnostique précoce et/ou de traitements adaptés à la femme. Cette démarche s’insère dans la statégie actuelle de développement d’une médecine personalisée. Le projet décrit ici ne représente que l’approche fondamentale développée dans un vaste. Ce programme inclue aussi des approches translationnelles en utilisant des techniques applicables à l’Homme : investigations en IRM (IRM fonctionnelle, tractographie, …), en électroencéphalographie à haute densité (EEGhd) et en biologie des rythmes (évaluation comportementale du fonctionnement de l’horloge circadienne). De plus, après adaptation et validation des tests de RO24h et OiP à l’Homme, ils pourront être intégrés dans des évaluations neuropsychologiques pour un dépistage. En conclusion, le programme dans son ensemble aborde certes les cibles neurobiologiques (présente saisine) qui seront utiles à long terme, mais il ouvre également des perspectives à moyen terme pour le développement d’outils de diagnostique par IRM, par EEGhd et par de nouveaux tests neuropsychologiques. Les résultats de notre étude bénéficieront d’abord à l’Homme puisque les souris ne développent pas la MA. Néanmoins, certains animaux de compagnie (chien, octodon) ou sauvages (microcèbe, ours blanc) développent une pathologie rappelant la MA avec pathologie amyloïdes et tau. Au mois deux de ces espèces (octodon ; microcèbe) possèdent un gène de risque génétique majeur pour la MA (APOE4). Chez l’Homme, l’APOE4 peut multiplier par 10 le risque de développer une MA. Il est donc tout à fait envisageable que les progrès réalisés dans le domaine de la MA en termes de dépistage et de traitement pourraient être adaptés à des pathologies proches chez l’animal, puis intégrée dans une approche vétérinaire.
Procédures
Procédure 1 modérée: 4 groupes de souris (de génotype et sexe différents, maximum 60 au total) sont mises dans des cages individuelles placées côte à côte sur une étagère munie de détecteur de mouvement (petites cellules de détection) pour mesurer leur activité locomotrice sur 4 jours. Malgré la proximité de leur congénères, cette séparation pourrait générer un stress modéré, mais transitoire. Les autres procédures P2 à P8 et P10 sont légères pour 800 souris. Elles comportent 1) la réalisation de frottis vaginaux sur les femelles (dépôt d’une goutte à l’entrée du vagin puis réaspiration), 2) la passation d’un ou deux tests d’exploration d’objet dans un environnement rendu familier par une habituation (10 min) préalable avec leur groupe social, et 3) les manipulations préalables à la mise à mort (dislocation ou perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde). Aucune perte de poids, inactivité/mobilité réduite ou expression d’un comportement anormal n’est connu pour ces trois types de manipulations. dans la procédure 8, les souris seront transportées (aller-retour dans la journée) en restant dans leur groupe social (2-3 souris/cage) pour effectuer un scan IRM à 2 mois, 4 mois et 12 mois. Seule la procédure 9 modérée concerne une chirurgie pour l'ovariectomie sur 114 souris.
Impact sur les animaux
Le suivi de lignée jusqu’à l’âge de 12 mois indique que le phénotype des souris dKI n’est pas dommageable : le succès reproducteur, le poids et l’occurrence d’anomalies comportementales ou physiologiques restent identiques entre les WT et les dKI. Leur fonds génétique C57BL/6J est entretenu par backcross pour éviter une dérive génétique. Par ailleurs, il faut préciser que ces souris ont été caractérisées dans des tests de mémoire et d’anxiété classiques et dans des tests hypersensibles à la pathologie Alzheimer. Les mâles et femelles dKI de 2 à 6 mois réussissent comme leurs témoins les tests classiques (test spatial en labyrinthe de Barnes, tests de reconnaissance d’objet et de place jusqu’à un délai de 3h). Même à 12 mois, il n’y a toujours pas de déficit dans ces tests. Entre 2 et 6 mois, le problème n’apparait que dans des tests hypersensibles : une performance moindre au premier jour du changement de règle dans un labyrinthe, un déficit marqué dans les tests d’association objet-place (test OiP), de mémoire du détail et pour un long délai de rappel (RO24h). En conclusion, les souris dKI présentent des problèmes légers de mémoire qui sont présents chez des personnes âgées déclarées cognitivement normales. Ces déficits ne sont donc pas de nature à affecter le bien-être des souris dKI par rapport à leurs témoins WT. Seules deux procédures pourraient induire un stress transitoire : la procédure 1 pour l’isolement en cage permettant de mesurer l’activité locomotrice individuelle sur 4 jours et la procédure 8 où les souris seront transportées (aller-retour dans la journée) en restant dans leur groupe social (2-3 souris/cage) pour un scan IRM à 2 mois, 4 mois et 12 mois. La procédure 9 impliquant une ovariectomie ne devrait pas affecter le bien-être avec les traitement analgésiques et précautions de manipulation prévues. La couverture analgésique, les soins et le suivi individuel des souris devrait permettre d'éviter toute souffrance ou de l'interrompre rapidement s'il y a complication.
Devenir
Le but du projet est de découvrir les altérations neuropathologiques impliquées dans le dimorphisme sexuel face à l’émergence d’une pathologie Alzheimer afin de mieux comprendre les causes de la vulnérabilité du cerveau des souris dKI femelles par rapport aux mâles. A part pour les mises au point de techniques, les cerveaux seront systématiquement recueillis et analysés afin de déterminer ces causes.
Remplacement
L'étude des animaux modèles de la MA est encore indispensable pour progresser dans la compréhension de cette pathologie. Il n'est pas encore possible actuellement de modéliser les processus cognitifs de façon fiable et complète dans un modèle in silico ou en culture cellulaire. Il est donc encore nécessaire de recourir à des modèles animaux dont on analyse la relation entre la neuropathologie et les performances cognitives.
Réduction
Pour étudier le lien entre les performances comportementales (mémoire et rythme circadien de l’activité locomotrice) et les données neuropathologiques obtenues par des approches histologiques ou biochimiques (P1 à P6, et P10), le nombre d’animaux sera au maximum de 15 animaux par groupe pour assurer l’efficacité des statistiques dans les tests comportementaux. Cet effectif est nécessaire en particulier dans notre modèle car nous testons des souris avec une pathologie débutante et des déficits subtils qui pourraient passer inaperçus si les groupes sont trop petits. La procédure 8 est une étude longitudinale d’animaux destinés à des analyses en IRM. Elle permet donc le suivi d'un même animal à trois âges pour étudier l’émergence et l’évolution de la pathologie ce qui permet une réduction du nombre d'animaux. Le nombre de souris sera au maximum de 35 animaux par groupes (4 groupes mâles et femelles des génotypes dKI et témoins WT) afin d’assurer l’efficacité des tests statistiques et donner des résultats statistiquement fiables pour les données IRM et pour des analyses corrélatives avec les données comportementales et histopathologiques obtenues sur les mêmes animaux au sein de notre laboratoire. La procédure 9 fait appel à la technique d'ovariectomie pour tester l'origine cérébrale de la vulnérabilité des souris femelles dKI. Le risque de perte avec une opération chirurgicale est couvert en augmentant à 16 le nombre de souris par groupe. L’ensemble du projet requiert 974 souris.
Raffinement
Les souris bénéficieront d’éléments d’enrichissement dans leur cage (matériel de construction du nid, un tube refuge et des boulettes de nourriture à manipuler), ainsi qu’un suivi quotidien de leur état général. Elles seront maintenues en groupe sociaux sauf pendant deux périodes de 10 minutes/jours pour chacun des tests de mémoire. Tous ces tests sont basés sur le comportement d’exploration spontanée de la souris dans un milieu adapté à l’espèce (lumière faible de 20 lux maximum et ambiance sonore atténuée à 45 dB). Un suivi spécifique à chaque procédure avec des points limites adaptés est mis en place pour éviter toute souffrance éventuelle. Trois nouvelles techniques de raffinement sont à mettre/mise en place au cours du projet. Elles concernent la manipulation/transport des souris, l’habituation à l’enceinte des tests de mémoire et une méthode non invasive de prélèvement pour le génotypage. Les souris sont d’ores et déjà transportées de la cage à l’enceinte de tests (et vice versa) grâce au tube refuge présent dans leur cage. L’habituation à l’enceinte des tests se fait depuis plus de 6 mois avec l’ensemble du groupe social de chaque cage. Le bien-être qui en résulte se reflète par une plus grande régularité dans la durée d’exploration des objets présents dans l’enceinte au cours des tests de mémoire réalisés ensuite en individuel. Enfin, la nouvelle méthode de prélèvement non invasive pour le génotypage à partir d’une pincée de poils (au lieu du punch d’oreille de 2 mm) est désormais appliqué en routine pour cette lignée.
Choix des espèces
A ce jour, les modèles animaux de la MA ont essentiellement été créés chez la souris, même s'il existe des modèles chez la drosophile et d'autres espèces. Nous avons un modèle de souris qui est en rupture par rapport aux modèles précédents, car il n’a pas les effets secondaires dûs à la surexpression des protéines clé. Il présente une différence entre les deux sexes dans l'apparition des premiers troubles de la mémoire qui ressemble à celle trouvée au stade préclinique de la MA, c'est-à-dire 5 à 10 ans avant le premier diagnostic. Toutes les souris seront sur un fonds génétique C57BL/6J. Dans toutes les procédures sauf une, les souris seront utilisées entre 1 et 4 mois (jeunes adultes) car c’est l’âge où apparaissent les premiers déficits de mémoire dans ce modèle de maladie d’Alzheimer. Dans la procédure 8, les souris atteindront l'âge de 12 mois pour analyser leur neuropathologie lorsqu’elle devient manifeste (plaques amyloïdes notamment).
Effets xenoestrogènes sur développement du cerveau de poissons zèbres transgéniques
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
2 700 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Exposés dès le stade embryonnaire à de l'éthinylestradiol et à des bisphénols ajoutés à leur eau, larves, juvéniles et adultes sont ensuite tués et fixés pour observer au microscope le développement de leur cerveau. Le porteur indique que ces perturbateurs endocriniens peuvent modifier le sex-ratio, le comportement locomoteur et provoquer de l'anxiété. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit le fonctionnement du cerveau et de sa barrière hémato-encéphalique sur le long terme.
Objectifs
Le projet vise à comprendre les effets d'une exposition à des molécules polluantes de notre environnement : l'ethinyl estradiol (EE2), molécule très souvent utilisée en contraception et très largement retrouvée dans les milieux aquatiques, et certains bisphénols, molécules utilisées dans la fabrication de nombreux objets plastiques et emballages alimentaires. L'effet de ces expositions sera observé sur le développement et le fonctionnement du système nerveux central chez le modèle poisson zèbre (Zebrafish). Ces molécules sont déjà décrites pour être des perturbateurs endocriniens. Cette étude se fera sur des lignées transgéniques de poissons zèbres
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d'évaluer l'effet de ces molécules polluantes/pertubatrices endocriniennes à court (larve), moyen (juvénile) et long terme (adulte) sur le développement et le fonctionnement du cerveau de vertébrés. La mise en place notamment des vaisseaux dans le cerveau (voie d'entrée de toutes substances dans le cerveau) et des cellules souches neurales devraient être observés facilement par la création de la lignée doublement transgénique et le traitement des échantillons permettant ainsi de les rendre transparent (transparisation). La mise au point de cette nouvelle lignée et sa transparisation devrait aussi permettre à l'avenir d'analyser rapidement l'exposition à d'autres molécules polluantes de notre environnement et leur impacts sur la mise en place et le bon fonctionnement du cerveau.
Procédures
Les animaux aux stades embryonnaires seront uniquement traités à des doses environnementales, ou légèrement supérieures, du 1er Jour au 4eme jour de développement embryonnaire. Le traitement des oeufs/embryons se fera par simple addition de la molécule dans le milieu aquatique d'incubation des oeufs/embryons. 2700 animaux (larves, juvéniles et adultes) traités dériveront de ces oeufs/embryons. L'analyse des animaux se fera après leur euthanasie. Pour rappel une seule ponte d'une femelle poisson zèbre correspond à environ 500 embryons.
Impact sur les animaux
Les effets de perturbateurs endocriniens sont en général subtiles, surtout aux doses utilisées (proche des doses environnementales). Pour certains perturbateurs endocriniens, et en fonction de la concentration, les effets suivants ont été observés dans la litérature : comportements reproducteurs modifiés, changement du sex-ratio avec des possibilités de féminisation chez certaines espèces, modification du comportement locomoteurs et anxiété. Certains perturbateurs peuvent aussi avoir des effets obésogènes.
Devenir
La visualisation au microscope confocal (microscope à haute résolution) des cerveaux des animaux transgéniques traités ne peut se faire que sur des animaux fixés (non vivants)
Remplacement
Le cerveau est un des organes les plus complexe de notre organisme. Il contient de nombreux types cellulaires (neurones, astrocytes, oligodendrocytes, cellules microgliales, ependymocytes). Son fonctionnement ne peut se faire que par sa vascularisation et les échanges de métabolites et de gaz qui se font avec le tissu neural passent par la barrière hémato-encéphalique, structures complexes présentes partout dans le cerveau. Il n'existe pas de modèles physiologiques in vitro qui mimerait le fonctionnement du cerveau et celui de la barrière hématoencéphalique. Par ailleurs les effets des perturbateurs endocriniens sont visibles très souvent à moyen et long terme : c'est ce qu'on appelle" le concept de l'origine développementale des maladies humaines". Les effets à moyen/long terme ne sont pas compatibles avec des modèles de cultures de cellules (2 dimensions, sphéroides, organoides....) dont l'utilisation dans le temps est limité
Réduction
Les groupes d'animaux seront mis en place de façon suivante afin de pouvoir réaliser de solides statistiques. Nombre de molécules à tester : 4 (éthylniestradiol, Bisphenol A, Bisphenol S et Bisphenol AF) Nombre de concentrations des molécules à tester : 4 (Emax, EC50, EC20) et Condition contôle : DMSO (solvant pour les molécules à tester). Donc 5 conditions par expérience. Nombre d'animaux par condition : 15. Ce nombre de 15 est justifié par le fait qu'il peut y avoir une perte d'échantillon : l'individu ne survit pas jusqu'à la fin de l'expérience ou encore la qualité des coupes de cerveau obtenue à partir des échantillons biologiques est insuffisante pour permettre une quantification des marqueurs d'intérêt. 3 répétitions indépendantes : pour collecter et comparer des données avec un pouvoir statistique suffisant pour générer des conclusions. Les tests statistiques paramétriques de comparaison multiple one way ANOVA seront utilisés car ils sont les plus appropriés aux tests statistiques d’échantillons paramétrés ayant une distribution de type gaussienne. La répétition de 3 expériences permet aussi de stopper le projet si l’analyse des données des première et deuxième expériences se révèle être non encourageante. L’état de santé des animaux, la souffrance et l’angoisse seront évalués. La survenue répétitive d’épisodes de nage agitée, de diminution de la prise alimentaire, d’augmentation de comportement agressif nous indiquera un problème de bien-être chronique.
Raffinement
L’état de santé des animaux, la souffrance et l’angoisse seront évalués. La survenue répétitive d’épisodes de nage agitée, de diminution de la prise alimentaire, d’augmentation de comportement agressif nous indiquera un problème de bien-être chronique.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est utilisé car nous possédons déjà les deux lignées transgéniques à partir desquelles la lignée doublement transgénique sera réalisée par simple reproduction des geniteurs. Le modèle poisson zebre est largement utilisé en biologie du développement et toxicologie/perturbation endocrinienne. 675 larves (entre 5 et 10 jours), non sexé 675 juvéniles (entre 30 et 40 jours), non sexé 675 X 2 adultes (entre 90 et 120 jours) Males/femelles = 1350 adultes
Carence en vitamine D chez la souris mâle et conséquences sur la descendance.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, et une partie des descendants est tuée dès quatre jours après la naissance. Des mâles sont nourris pendant dix semaines d'un régime privé de vitamine D ou d'un régime contrôle, puis accouplés à des femelles qui ont eu une oreille percée à leur arrivée, et les procédures décrites ajoutent un isolement d'une trentaine de minutes pour recueillir des fèces et une prise de sang à la queue sur souris éveillée. Les autres descendants sont pesés chaque semaine puis tués à différents âges pour étudier leur tissu adipeux, le porteur en attendant des recommandations nutritionnelles pour les hommes en âge de procréer. Six groupes de dix descendants font 60 souris, le total déclaré, sans que le texte dise où se comptent les pères, les femelles accouplées et les trois cohortes de géniteurs prévues sur trois ans.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’apporter des données permettant d’évaluer l’impact d’insuffisance en vitamine D chez la souris mâle, sur les trajectoires métaboliques de la descendance. Des souris mâles seront nourris pendant 10 semaines avec un régime contrôle ou un déficient en vitamine D. Les males carencés seront étudiés (suivi de l'evolution pondérale, prise alimentaire, impact sur le microbiote). Ces males seront ensuite accouplés avec des souris femelles nourries avec une alimentation contrôle. Ceci permettra de générer une descendance issue de pères carencés ou non. L'etude portera ensuite sur cette descendance. Des groupes de 10 animaux de chaque sexe sont utilisés. Au total, l'etude sur la descendance portera donc sur 6 groupes d'animaux étudiés à différents stades de leur vie (4 jours post naissance; post-sevrage et age adulte), repartis de la façon suivante : mâles après naissance, femelles après naissance, mâles post-sevrage, femelles post-sevrage, mâles adultes, femelles adultes. Sur la descendance, à l'exception des animaux mis à mort 4 jours apres la naissance, un suivi de croissance sera réalisé par pesée toutes les semaines ainsi que la quantification de la consommation alimentaire. Les animaux seront euthanasiés à différents stades afin d'etudier l’adiposité, l’expression génique du tissu adipeux et l’empreinte épigénétique du tissu adipeux. A noter qu'il est prévu de réaliser 3 cohortes de géniteurs sur la période des 3 années sur laquelle va se dérouler ce projet.
Bénéfices attendus
Les données obtenues dans le cadre de ce projet permettront de connaitre l'impact d'une déficience paternelle en vitamine D sur la descendance. Cela servira de base pour émettre des recommendations nutritionnelles aux hommes en âge de procréer.
Procédures
Les animaux femelles seront soumis à un perçage d'une oreille une fois à leur arrivée. À 9 semaines d'alimentation contrôlée, un prélèvement de fécès nécessitant de les ioler pendant ~30 minutes sera réalisé; suivi d'une prise de sang à la queue sur animal vigile à 10 semaines.
Impact sur les animaux
Les animaux mâles seront soumis à un régime carencé en vitamine D, aucune souffrance n'est attendue mais des nuissances peuvent survenir (nuissance de gravité légère, longue durée). Les animaux seront également maintenu en isolement lors des recueils de fécès ce qui peut constituer une source de stress (nuissance de gravité légère, courte durée). Un prélèvement de sang sera réalisé à la veine caudale (nuissance de gravité légère, courte durée). Enfin l'induction de l'anesthsie puet constituer une source de nuisance (nuissance de gravité légère, longue durée).
Devenir
Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'intérêt qui seront ensuite analysés.
Remplacement
Il n'existe à l'heure actuelle aucune méthode de substitution in vitro pour étudier l'impact de la nutrition périnatale. La souris est un modèle de choix car elle présente des mécanismes physiologiques proches de ceux qui sont observables chez l'homme. Le but de ce projet est de rechercher les conséquences métaboliques chez la descendance, d’une carence en vitamine D chez le mâle géniteur. Ce processus est complexe et met en jeu de nombreux organes et systèmes métaboliques, qu’il n’est pas possible de reproduire in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux est le minimum nécessaire pour étudier la variabilité biologique de la descendance (descendance issue de 10 géniteurs différents). Ce nombre minimal est également nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, à l'aide d'un test de student, notamment en ce qui concerne la prise de masse des animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cage de 2 pour les mâles et les femelles, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en focntion des observations faites permettra l'application des points limites et la mise en application de critères d'arrêt. Aucune analgésie n'est prévue lors de ce protocole.
Choix des espèces
La souris est un modèle classiquement utilisé dans les études concernant les désordres métaboliques causés par l’alimentation en raison des similitudes avec l’homme. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 8 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondant tels que le vieillissement.
Approches physiopathologiques et thérapeutiques du syndrome de Sanfilippo B EU 3/3
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Modèles du syndrome de Sanfilippo B, une maladie neurodégénérative pédiatrique, elles passent des séances d'IRM d'une heure sous anesthésie, puis sont tuées par prélèvement intracardiaque à 2, 5 ou 9 mois pour mesurer le fer cérébral. Le porteur présente l'IRM comme non invasive et le prélèvement intracardiaque terminal comme la nuisance la plus importante du projet. Il affirme qu'à ce stade le recours à l'animal est "inévitable" pour confirmer les résultats obtenus sur cellules.
Objectifs
Le projet financé est une étude préclinique de thérapie génique intraveineuse pour le syndrome de Sanfilippo B. Ce syndrome est une pathologie neurodégénérative pédiatrique touchant 1 enfant sur 200 000 et pour lequel il n’y a aucune thérapie aujourd’hui. Ce syndrome est dû à la déficience d’une enzyme lysosomale impliquée dans la dégradation d’un glycosaminoglycane, l’héparane sulfate. Cette déficience conduit à l’accumulation de ce substrat qui présente une toxicité majeure pour les cellules du système nerveux central. Nous souhaitons, à travers cette étude, pouvoir proposer un essai clinique par thérapie génique permettant d’apporter l’enzyme déficitaire (N-acétylglucosaminidase). L'objectif de l'exploration par IRM, technique non invasive permettant la caractérisation anatomique et fonctionnelle des tissus, objet de ce projet, sera de vérifier s'il est possible de détecter de façon reproductible et fiable des variations de susceptibilités magnétiques caractéristiques de la teneur en fer (Fe) dans différentes régions cérébrales (cortex, striatum, …) des différents groupes expérimentaux sans mise à mort des animaux comme c’est le cas pour les méthodes classiques de mesures post-mortem. L'IRM est un outil important pour le diagnostic in vivo des pathologies ainsi que pour suivre au cours du temps la réponse à différents traitements ou procédures chirurgicales. La durée maximale des acquisitions sera d’une heure par animal.
Bénéfices attendus
Dans le contexte de l’étude physiopathologique, l'objectif de l'exploration par IRM, technique non invasive permettant la caractérisation anatomique et fonctionnelle des tissus, objet de ce projet, sera de mesurer des valeurs de susceptibilités magnétiques T2* dans le cerveau des animaux. Ces mesures permettront de comparer la teneur en Fe dans différentes régions cérébrales (cortex, striatum, …) des différents groupes expérimentaux. L’accumulation de fer ou non dans le cerveau est un marqueur de validation de l’efficacité du traitement de nos souris en préclinique. A terme, cette mesure IRM pourrait remplacer les mesures faites post-mortem et devrait donc nous permettre de réduire le nombre d'animaux mis en œuvre pour mesurer la quantité de fer dans les tissus et permettre de suivre l'évolution au cours du temps de la teneur en fer de différents organes d'intérêt dans un même animal renforçant ainsi la valeur statistique des résultats.
Procédures
L'IRM est une procédure d'imagerie in vivo, non invasive et atraumatique. La totalité de la procédure étant menée sous anesthésie volatile (1h maximum), les animaux ne subissent que le stress dû à la préhension avant induction de l'anesthésie. Le réveil post-anesthésique est la seconde étape critique, les animaux restent sous surveillance pendant toute la phase de réveil.
Impact sur les animaux
L'IRM est une technique non invasive d'imagerie qui n'entraine aucune douleur chez les animaux. Les signes vitaux (respiration, fréquence cardiaque et température) sont contrôlés tout au long des manipulations afin de garantir le suivi du bien-être des animaux. La procédure est cependant susceptible d'induire un stress au moment de la préhension des animaux pour les placer dans la cage d'induction de l'anesthésie. Le prélèvement intracardiaque que subiront les animaux au moment de leur mise à mort (sans réveil) est la nuisance la plus importante du projet, elle est cependant indispensable pour réaliser dans des conditions optimales la mesure de teneur en fer intra-tissulaire de référence.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue des délais 2, 5 ou 9 mois de vie suivant une technique réglementaire qui permettra de pouvoir obtenir des prélèvements de qualité tout en protégeant l'animal de la douleur.
Remplacement
Une modélisation intégrée est nécessaire pour valider les études in vitro. Les animaux sont utilisés en fin d’étude afin de confirmer des résultats démontrés et des hypothèses formulées à partir des travaux réalisés sur cellules. A ce stade de l’expérimentation, l’utilisation de l’animal est inévitable. Les études sont systématiquement optimisées (quantité de vecteurs, temps de traitement et nombre d’animaux) d’après la littérature ou les observations réalisées au laboratoire. Même si le traitement est administré en injection intraveineuse, il est réalisé par un personnel compétent.
Réduction
L’utilisation de l’animal est réduite au maximum. Nous allons utiliser des tests statistiques afin de comparer les groupes. Les tests sont réalisés avec un logiciel de statistique. Nous utiliserons des groupes de 10 souris par expérience et nous répéterons les expériences à 3 âges différents afin de rendre nos résultats comparables à ceux de nos études antérieures. Pour chaque expérience, le maximum d’échantillons autorisés réglementairement seront prélevés sur l’animal afin d’éviter d’avoir à reproduire l’expérience par manque de tissus. Chaque fois que cela sera possible, nous analyserons un maximum de paramètres cellulaires et moléculaires sur les mêmes individus afin de limiter le nombre d’expériences in vivo. L'IRM étant une technique d'exploration non invasive, elle permet le suivi longitudinal des lots d'animaux mis en œuvre ce qui participe à la réduction globale.
Raffinement
Cette procédure expérimentale a pour objectif d'évaluer la possibilité de remplacer une procédure post-mortem (mesure de la teneur en fer dans les tissus prélevés) par une procédure non invasive, in vivo qui permettra de suivre une même cohorte au cours du temps dans un but de raffinement (suivi du même animal pour s'affranchir de la variabilité interindividuelle et réduction du nombre de lots d'animaux nécessaire pour assurer ce suivi longitudinal selon la procédure classique). Tous les animaux sont hébergés selon les conditions de la réglementation en vigueur (directive européenne 2010/63, décret n°2013-118 du 1er février 2013). Nous nous attachons à ne pas laisser un animal seul dans une cage (groupes sociaux de 5 individus maximum par cage). Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel ou paper wool). Lors des expériences d’imagerie, les animaux sont anesthésiés à l’isoflurane (gaz vecteur O2) dès le début de la procédure pour réduire leur stress et éviter tout mouvement au cours de l’exploration IRM. La cellule d’imagerie dans laquelle est maintenue la souris est thermo régulée. Pendant la phase de réveil, la cage est également placée sur tapis chauffant et reste sous contrôle visuel jusqu’au réveil complet de l’animal. Tout animal présentant des signes de souffrance, de léthargie, une perte de poids supérieure à 20% ou une tumeur de 10% du poids corporel sera exclu de l’étude et sacrifié.
Choix des espèces
L’espèce Mus musculus est un modèle animal adapté aux pathologies de surcharge lysosomale. L’application de la politique de réduction mise en place permet d’optimiser au mieux chaque expérimentation afin de retirer d’un minimum d’animal un maximum d’information. De plus la formation des personnes habilitées à manipuler les animaux et la diffusion par ces personnes de leur savoir dans des conditions appropriées (temps de formation respecté) permet de réaliser nos expérimentations animales dans le respect de l’animal et des conditions optimales du suivi des règles d’hygiène et de sécurité. Il est nécessaire d’utiliser les souris à partir de d'âge de 2 mois afin de pouvoir comparer les résultats avec ceux obtenus dans nos précédentes études et celles décrites dans la littérature.
Développement d’un modèle murin pour l’étude de la physiologie de la glande mammaire et du cil primaire au cours du cycle de reproduction.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
689 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 200 remises à disposition d'autres équipes et les autres tuées. L'étude repose sur deux élevages de souris génétiquement modifiées, avec biopsie de la queue avant sevrage et administration de tamoxifène aux femelles pendant l'allaitement. Le porteur reconnaît que certaines souris peuvent présenter perte de poids, perte d'appétit et hypothermie persistante. Il rattache le projet à la compréhension des cancers du sein et affirme travailler en parallèle sur des mini-glandes mammaires in vitro pour limiter le recours à la souris.
Objectifs
Le développement et le remodelage de la glande mammaire lors du cycle de reproduction dépendent de plusieurs types cellulaires. Sous influence hormonale, les cellules mammaires prolifèrent et se différencient pour permettre le développement du tissu mammaire et la lactation. Une partie des cellules mammaires meurt post-lactation pour permettre le retour de la glande mammaire à un stade semblable à la glande vierge. Ce processus est appelé involution. Des cellules immunitaires de la glande mammaire permettent l’involution par l’élimination des débris de cellules mammaires. La nature des communications entre cellules mammaires et immunitaires qui permettent l’involution reste méconnue. Nous avons récemment montré que des cellules mammaires assemblent une antenne cellulaire nommée cil primaire. Cette antenne pourrait être impliquée dans la régulation des communications entre cellules pour permettre l’involution mammaire. Notre objectif est de tester cette hypothèse chez la souris à l’aide d’animaux génétiquement modifiés. Ces animaux permettent une inactivation de la formation de l’antenne cellulaire spécifiquement au cours du cycle de reproduction dans la glande mammaire. Ils représentent le seul moyen de pouvoir étudier le rôle du cil dans ce processus physiologique qui implique de nombreux acteurs cellulaires en interaction et sous influence hormonale.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est de révéler de nouveaux mécanismes qui coordonnent la lactation et l’involution de la glande mammaire. Le bon déroulement de ces deux processus physiologiques est nécessaire à l’allaitement et au remodelage de la glande mammaire au cours du cycle de reproduction. Des anomalies de lactation et de remodelage de la glande mammaire post-lactation peuvent conduire à des défauts d’allaitement et à des cancers du sein aggressifs. Les résultats du projet permettront le développement de nos connaissances sur la physiologie de la glande mammaire au cours du cycle de reproduction. Ils révéleront de nouvelles informations sur les causes des maladies qui y sont associées et pourraient à long-terme révéler de nouvelles pistes pour améliorer l’allaitement et prévenir les cancers du sein suite à une grossesse. Le développement d’un modèle murin est essentiel pour comprendre la biologie de la glande mammaire qui répond à des hormones dans l’organisme entier. Le modèle murin nous permettra d’étudier la physiologie de la glande mammaire dans un contexte unique et pertinent.
Procédures
Le développement du projet nécessite la constitution de deux élevages de souris génétiquement modifiées. L’identification des animaux d’intérêt au sein de ces élevages nécessitera de petites biopsies sur l’extrémité de la queue d’animaux avant leur sevrage (intervention < 1 min). Cette intervention n’interviendra qu’une fois dans la vie de la souris. De plus, du tamoxifène (un médicament qui est utilisé chez l’homme pour le traitement de certains cancers) sera administré à un groupe restreint de souris adultes dans le projet, soit par la nourriture ou par injection sous la peau. L’administration du tamoxifène se fera durant 5 jours à la fin de la lactation, en continue dans la nourriture, ou par injection à 5 reprises sous la peau au cours des 5 derniers jours de l’allaitement (durée < 1 minute/animal/injection, 1 injection par jour sur 5 jours).
Impact sur les animaux
Les petites biopsies de l’extrémité de la queue chez la souris ne devraient pas engendrer de douleur car elles se feront sous anesthésie mais pourraient générer une nuisance pour les animaux qui serait liée au processus de cicatrisation. Nous injecterons du tamoxifène par voie sous cutannée chez des souris femelles en allaitement. Cet acte pourrait générer un incomfort pour les souris. Nous n’excluons pas que des animaux pourraient démontrer des signes de mauvais état général (du fait de la procédure ou non) comme la perte de poids et d’appétit ainsi qu’une hypothermie persistante. Des observations et examens cliniques seront réalisés très régulièrement afin de mettre en lumière les animaux montrant des signes cliniques atteignant des points limites qui nécessite des soins adaptés. Nous suivrons les recommandations éthiques de la Structure de Bien-Être Animal de notre établissement.
Devenir
Les animaux reproducteurs qui détiennent les modifications génétiques souhaitées dans nos élevages seront maintenus en vie tout au long du projet pour l'élevage et l'administration au tamoxifène puis mis à mort à la fin du projet pour collecter les tissus et afin d'effectuer nos analyses ex vivo. Les animaux qui ne détiennent pas les modifications génétiques souhaitées et qui auront toutefois été exposés au tamoxifène avant leur sevrage (par allaitement) seront mis à mort au sevrage car le tamoxifène pourrait interférer avec d'autres expérimentation si les animaux étaient mis à disposition de la communauté. Les animaux qui ne détiennent pas les modifications génétiques souhaitées dans le projet et qui n’auront pas été au contact du tamoxifène seront mis à disposition de la communauté pour pouvoir être réutilisés.
Remplacement
Le projet vise à identifier des nouvelles connaissances sur le fonctionnement de la glande mammaire au cours du cycle de reproduction. Notre objectif est d’étudier les communications intercellulaires dans cet organe et l’implication d’une antenne cellulaire, le cil primaire, dans ces communications au sein de ce tissu qui répond aux hormones dans l’organisme entier. Il n’existe pas à ce jour de modèle alternatif à l’animal pour la culture en dehors de l’organisme de divers types de cellules qui répondent aux hormones et miment le cycle de reproduction. L’utilisation de la souris est essentielle à la compréhension fine du fonctionnement de la glande mammaire. Toutefois, nous travaillons sur la culture de mini-glandes mammaires en dehors de l’organismes (organoides in vitro) qui contiennent les différents types cellulaires mammaires. Nous nous efforçons d’utiliser ces modèles alternatifs pour répondre à nos questions scientifiques qui ne concernent que la biologie du tissu mammaires en absence d’autres types cellulaires et sans stimuli hormonaux. Nous avons par exemple utilisé ces modèles pour développer notre stratégie génétique chez la souris. Nos travaux in vitro nous permettent de limiter tant que possible le recours à la souris et de proposer des stratégies pertinentes et optimisées lorsque le recours à la souris est indispensable.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombres d’animaux utilisés, le personnel est formé aux outils statistiques appliqués à l'expérimentation animale. Les protocoles d’administration du tamoxifène, issus de la bibliographie, sont validés par la communauté internationale et robustes. Nous anticipons donc que notre stratégie avec un nombre d’animaux restreint au minimum aboutira à une étude féconde et à de nouvelles découvertes. Le personnel collaborera avec d’autres équipes, notamment dans le partage des animaux (pour les animaux disponibles et inadaptés pour notre projet) et dans le partage des données notamment par la mise en commun des données et des expertises analytiques.
Raffinement
Le bien-être des animaux de l’étude sera particulièrement porté à l’attention du personnel qui veillera aux meilleures conditions d’hébergement possible, notamment via un maintien des groupes sociaux et l’enrichissement de l'habitat (frisottis de papier, cabanes). La gestion du stress des animaux sera maximisée, par une manipulation la plus rapide et la moins fréquente possible. Différents lieux accueilleront les animaux pour une distanciation maximale entre les lieux d’hébergement, de soins et d’euthanasie. Enfin, la douleur des animaux utilisés sera fréquemment suivi par un examen clinique afin de déterminer le plus précocement possible les douleurs éventuelles qui nécessitent d’adapter le protocole et d’apporter des soins nécessaires.
Choix des espèces
La souris est particulièrement adaptée pour notre étude puisque les phases du cycle de reproduction sont bien décrites. Le remodelage de la glande mammaire au cours du cycle de reproduction est rapide chez la souris et la physiologie de la glande mammaire murine et humaine est similaire. Nous avons déjà des résultats préliminaires chez la souris sur la biologie de la glande mammaire. Nous avons accès à des souris génétiquement modifiées et ne devons pas créer de nouveaux modèles. Pour ces raisons nous choisissons de poursuivre nos travaux chez la souris. Nous souhaitons étudier la biologie de la glande mammaire au cours du cycle de reproduction. Nous élèverons des souris mâles et femelles pour créer nos modèles d’étude. Une fois les modèles établis, nous travaillerons avec des femelles en cours d’allaitement, post-allaitement et en gestation pour nos analyses du fonctionnement de la glande mammaire femelle. Nous travaillerons avec des souris entre 6 semaines et 1 an d'âge. Les animaux de cette classe d'âge sont aptes à la reproduction. Ils permettent nos analyses de la physiologie de la glande mammaire au cours du cycle de reproduction.
Mécanismes cellulaires et moléculaires de la calcification valvulaire aortique dépendante de Pou5f1/ERRalpha et d’une dyslipidémie
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par un régime gras sans vitamine D pendant quatre mois, ces souris ApoE-/- reçoivent un gavage de tamoxifène et des échographies cardiaques sous anesthésie, avant la mise à mort pour prélever les valves aortiques. Le porteur reconnaît que le régime gras apporte un inconfort mais affirme qu'il n'affecte pas la mobilité des animaux. Il présente la souris comme "un des très rares modèles" de calcification des valves et attend des données extrapolables à l'humain.
Objectifs
Environ 500 millions de personnes dans le monde souffriront de calcification de la valve aortique (CVA) d’ici 2050. La CVAest une maladie progressive caractérisée par une inflammation, une fibrose et finalement une calcification de la valve. Cela conduit à un retréssissement aortique, une maladie grave précipitant le patient vers une insuffisance cardiaque. Le seul traitement pour la CAVD, le remplacement de la valve , n’est pas disponible pour 85% de la population mondiale. En France, 10000 remplacements valvulaires aortiques sont effectués chaque année sans toujours un bon résultat et avec des suites à la chirurgie ou même au protocole sans chirurgie . Il n’existe aucun médicament pour cette pathologie. La dyslipidémie joue un rôle majeur dans la CVA. Cependant, les cellules valvulaires (unités biologiques composant la valve) spécifiquement impliquées dans la maladie sont encore en débat. De plus, les femmes, même atteintes de dyslipidémie, sont beaucoup moins sujettes à la CVA que les hommes. Fait intéressant, le microbiote intestinal masculin et féminin diffère. Notre projet propose : 1. Le suivi et l'identification des cellules et de leur profil de gènes à l’origine de la CVA dans un modèle murin de dyslipidémie- 2. L 'analyse du microbiote des souris mâles et femelles atteintes de dyslipidémie au cours de la CVA et après dérégulation de la voie dépendante de des hormones oestrogènes
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mieux cibler une thérapie anti calcification valvulaire par une connaissance plus précise du mécanisme pathologique notre étude devrait apporter des informations sur la différence de pathologie valvulaire ches les hommes et les femmes et des pistes de médicaments pour la maladie. Comme le microbiote de l'intestin de la souris est fonctionnellement similaire à plus de 90 % à celui de l'homme, nous nous attendons à ce que les données soient extrapolables à la situation des patients humains.
Procédures
régime riche en acide gras (42% matière grasse, ENVIGO MD.88137 sans vitamine D3) :24 4 mois echocardiographie sous anesthésie isoflurane 30 min: 48 gavage tamoxifène: protocole de 1 min: 6
Impact sur les animaux
L’obésité des souris ApoE-/- en régime gras et le régime sans vitamine D peut leur apporter un inconfort qui néanmoins n'affecte pas leur mobilité ou leur agilité. L’échocardiographie est réalisée sous anesthésie . Le gavage au tamoxifène
Devenir
tous les animaux utilisés dans le projet seront mis à mort à la dernière étape (Echocardiographie) du projet. Cela permetra de plus de collecter les valves aortiques pour les experience de transcriptomique.
Remplacement
Notre projet se fera dans la continuité d’une étude in vitro. Le passage au modèle in vivo est une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’Homme. Nous avons au laboratoire et utiliserons des cellules valvulaires aortiques de patients CVA VEC / VIC pour suivre le processus de fibrose et de calcification et avons dérivé à partir de ces cellules des cellules iPS spécifiques ; nous les re-différencions en cellules valvulaires et faisons des co-cultures 3D de VEC / VIC pour suivre le processus de fibrose et de calcification et identifier les cibles médicamenteuses.
Réduction
Les mêmes souris serviront à nos deux objectifs analyse clonale et micobiote intestinal . Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour mettre en évidence une apparition d’effets secondaires liés à l’utilisation de notre modèle avec une signification statistique
Raffinement
Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). Le laboratoire de stabulation est éclairé par cycle de 12H. Des points limites clairs et spécifiques seront définis et les animaux seront euthanasiés lorsqu’ils atteindront les critères d’interruption. L'enrichissement de cages sera multiple (papier kraft, dômes, petits batonnets). Les souris sont visitées chaque jour incluant le week end par l’expérimentateur et sont conditionnées à la contention avant le gavage. Le tamoxifène est donné en présence de progestérone pour éviter les effects néfastes de blocage des récepteurs endogènes. L’anesthésie est utilisée pour l’échocardiographie qui se réalise en positionant l'animal sur un tapis chauffant et une sonde rectale pour controller sa température pendant les 20-30 min du protocole d’ échocardiographie.
Choix des espèces
la souris ApoE-/- est un des très rares modèles animal de calcification des valves les souris seront adultes, seul stade pour observer la pathologie
Etude du rôle des Facteurs de Transcription de la famille Ikaros dans la mégacaryopoïèse
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles reçoivent des injections intra-péritonéales de tamoxifène cinq jours de suite et subissent jusqu'à six prélèvements de sang à la queue espacés d'une semaine, puis un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie, pour étudier le rôle de la famille de protéines Ikaros dans la formation des plaquettes. Le porteur indique que les injections peuvent provoquer des lésions cutanées ou une surinfection au point d'injection. Il affirme que les cellules souches humaines ne parviennent pas encore à maturer suffisamment en culture pour ce type d'étude.
Objectifs
Les thrombopénies constitutionnelles sont un groupe de maladies rares d’origine génétique caractérisées par un faible nombre de plaquettes sanguine ce qui est à l’origine de l’apparition de troubles hémorragiques. Récemment, des mutations dans la protéine PEGASUS (Ikzf5), appartenant à la famille IKAROS (IKZF), ont été identifiées chez des patients présentant une thrombopénie modérée, des plaquettes de grande taille et une absence de granules. La famille de protéines Ikaros est composée de 5 membres, Ikaros (Ikzf1), Hélios (Ikzf2), Eos (Ikzf3), Aiolos (Ikzf4) et Pegasus (Ikzf5) qui n’avaient jusqu’ici qu’été impliqués dans le contrôle de la production des globules blancs. Dans ce contexte, nous souhaitons mieux comprendre le rôle des différents membres de la famille Ikaros dans la biogénèse des plaquettes sanguines et identifier les mécanismes moléculaires mis en jeu.
Bénéfices attendus
La compréhension des thrombopénies constitutionnelles a bénéficié ces dernières années d’une amélioration des connaissances des étapes de formation des plaquettes (mégacaryopoïèse). Cependant, ces maladies restent encore largement incomprises et sous-diagnostiquées. Etudier le rôle de facteurs de transcription comme ceux de la famille Ikaros permettra d’accroître nos connaissances sur les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent les différentes étapes de maturation des plaquettes (extension du cytoplasme, biogénèse des granules, capacité des mégacaryocytes à produire des plaquettes). Ce projet nous permettera d’améliorer notre compréhension de l’étiologie des saignements observés chez les patients et leur prise en charge.
Procédures
Des injections intra-péritonéales d'une durée de quelques secondes seront réalisées sur 72 animaux vigiles à raison d'une injection par jour pendant 5 jours consécutifs. Des prélèvements sanguins de moins d'une minutes seront toujours faits sur animaux sous anesthésie générale. 72 souris auront un prélèvement unique de sang de quelques microlitres à la queue puis une semaine plus tard un prélèvement de sang terminal (grand volume), toujours sous anesthésie générale. 72 souris auront 6 prélèvements de sang à la queue espacés d'une semaine chacun. Après les 6 semaines de prélèvements, un prélèvement de sang terminal (grand volume) sera effectué, toujours sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Pour l’ensemble des lignées - possible stress au moment de l’anesthésie gazeuse pour le prélèvement à la queue (environ 30s avant l’endormissement). -possibilité et/ou difficulté de mobilité/engourdissement au réveil des suites de l’anesthésie gazeuse, durée maximale estimée à 3min. - prélèvements de sang à la queue : possible apparition d’inflammation ou de douleur au site de coupure - Apparition de lésions cutanées ou à des surinfections au site d’injection du tamoxifène en intra-péritonéale.
Devenir
Les animaux sont tous mis à mort à la fin des procédures car un grand volume de sang est prélevé afin de compter et analyser différents composants du sang (globules rouges, globules blancs et plaquettes).
Remplacement
Les différentes étapes de la biogénèse des plaquettes sanguines ne sont pas suffisamment caractérisées chez l'humain alors qu’elles le sont dans les modèles murins. En effet, si les cellules iPS (cellules pluripotentes induites) peuvent être utilisées pour reproduire des mutations retrouvées chez l'Homme, les techniques de culture cellulaires actuelles ne leur permettent pas encore de maturer de manière suffisamment efficace pour réaliser des études approfondies de la biogénèse des plaquettes.
Réduction
Nous avons estimé la taille des groupes selon nos expériences du modèle le but étant de réduire le plus possible le nombre d’animaux utilisés tout en assurant la robustesse statistique de notre étude.
Raffinement
Les souris seront observées tous les jours jusqu’à la mise à mort et les observations seront consignées dans une fiche de suivi. A la moindre apparition d’un signe de souffrance, un score sera calculé et des mesures seront prises. Tous les prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Le laboratoire possède une expérience éprouvée de l’étude de la biogénèse des plaquettes dans les modèles murins. Les animaux seront utilisés au stade adulte, pubères âgés de 8 à 20 semaines maximum, tranche d’âge où il y a un intérêt à observer et analyser la biogénèse des plaquettes au stade adulte afin d’avoir des groupes représentatifs.
Elevage d’une lignée murine immunodéficiente à phénotype dommageable
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
9 660 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 8 882 transférées vers d'autres projets d'expérimentation et les autres tuées. Issues du croisement de deux lignées immunodéficientes, elles portent un phénotype déclaré dommageable qui les rend vulnérables à toute infection, et sont élevées en conditions stériles pour que ce phénotype ne s'exprime pas. Le porteur indique que le génotypage combine tatouage des phalanges et biopsie de la queue sur des animaux de dix jours, geste qui peut provoquer un inconfort. Il revendique l'intérêt de ces souris pour "mimer les cancers humains" et présente la demande comme une simple déclaration d'élevage imposée par la réglementation.
Objectifs
La lignée de souris qui est l'objet de cette Demande d'Autorisation de Projet (DAP) est un croisement entre deux lignées immunodéprimées : les animaux issus de ce croisement sont donc fortement immunodéficients (sans défenses immunitaires). Leur phénotype (l'ensemble des caractères visibles) est par conséquent considéré comme dommageable : ils deviennent sensibles et vulnérables à tout pathogène, dont l'infection peut leur être délétère. Cependant, ce phénotype peut ne pas s'exprimer si leur élevage est réalisé dans des conditions sanitaires optimales : statut sanitaire contrôlé sans pathogène, hébergement en cages ventilées, manipulation sous hotte, utilisation d'équipements, d'aliment, d'eau de boisson et d'enrichissements stériles, ce qui est le cas dans notre Etablissement Utilisateur. Désormais la règlementation européenne nous demande de déclarer l'élevage de ces animaux à phénotype dommageable, même si ce phénotype ne s'exprime pas grâce aux conditions adéquates de maintien de cette lignée. C'est l'objet de cette demande.
Bénéfices attendus
Cette lignée est utilisée par de nombreuses équipes de notre Etablissement Utilisateur, étant immunodéficiente elle représente un modèle de choix en oncologie afin de pouvoir mimer les cancers humains. Elle est également très résistante aux rayons X, ce qui permet de combiner la chimiothérapie et radiothérapie lors de protocoles de traitement, et de s'approcher au plus près des protocoles thérapeutiques humains.
Procédures
Il y aura une biopsie de queue (1-2 mm) sur certains nouveaux-nés d'environ 10 jours, une seule fois, pour leur génotypage. Ce prélèvement dure quelques secondes.
Impact sur les animaux
L’élevage en lui-même de la lignée de souris qui fait l'objet de cette DAP ne présente pas de nuisance ou d’effet indésirables : étant donné les conditions d’hébergement et de soin, le phénotype délétère ne s’exprime pas. La technique de génotypage décrite dans cette DAP pour les animaux nécessaires au rafraichissement génétique est composée de 2 actes techniques invasifs: l'identification par tatouage des phalanges, et la biopsie de queue. Chacun de ces actes à lui seul n'induit pas de douleur, mais le cumul des deux actes de manière très rapprochée (quelques secondes d'intervalle) peut induire un inconfort léger et transitoire pour l'animal âgé de 10 jours.
Devenir
Procédure 1: Les animaux arrivant en fin de fertilité (environ 6 mois d'âge) sont mis à mort par inhalation d'un gradient de CO2. Les animaux destinés à être expérimentés sont transférés en zone d'Expérimentation et inclus dans d'autres DAP en utilisation continue. Procédure 2: Après génotypage, si le génotype n'est pas d'intérêt, les animaux seront mis à mort par inhalation d'un gradient de CO2. Si le génotype correspond à celui qui doit être utilisé pour le rafraichissement génétique, alors ils seront destinés à la mise en accouplement.
Remplacement
Les méthodes alternatives à l'expérimentation animale se développent de plus en plus, cependant pour certaines problématiques telles que l'étude de phénomènes physiologiques elles restent incomplètes et insuffisantes, puisqu'elles ne mettent pas en jeu toutes les interactions au sein d'un organisme vivant. De plus, les lignées de souris immunodéficientes restent très intéressantes pour appliquer des paramètres humains en oncologie sans risque de rejet.
Réduction
Nous essayons de prévoir nos plans de production au plus précis afin de ne pas surproduire. Tous les animaux sont utilisés soit en expérimentation soit en renouvellement de géniteurs. Seuls les animaux qui n'ont pas le génotype d'intérêt au moment du rafraichissement génétique seront sacrifiés.
Raffinement
Tous les animaux sont utilisés soit en expérimentation soit en renouvellement de géniteurs. Ils sont hébergés par couple pour les reproducteurs, ou par 5 pour les animaux de stock avant transfert en expérimentation. Nos conditions d'élevage permettent au phénotype dommageable de ne pas s'exprimer : cages ventilées, change sous hotte à la pince, litière, aliment, eau et enrichissements stérilisés. Ces derniers sont variés et adaptés au type d'animaux dans la cage (reproducteurs : plateforme+boule papier kraft+cotons; stock : plateforme+tunnel+cotons). Concernant les lots d'animaux qui doivent être génotypés (rafraichissement génétique), les préleveurs de notre Etablissement Utilisateur sont des expérimentateurs chevronnés et ont plusieurs années de pratique dans cette procédure de génotypage. Le geste est précis, rapide et maîtrisé. Ainsi l'inconfort et le stress de l'animal sont de courte durée.
Choix des espèces
Au sein de notre Etablissement Utilisateur, l'ensemble des équipes de recherche utilise le modèle souris pour sa facilité de manipulation technique, génétique, la rapidité de production de lots expérimentaux, et le grand nombre de pathologies humaines qu'il est possible de mimer Les animaux utilisés dans cette DAP sont déclarés dès leur naissance, génotypés aux environs de 10 jours (procédure 2), puis mis en accouplement à l'âge de 8 semaines (procédure 1), jusqu'à la fin de leur période fertile (environ 6 mois).
Evaluation de l’efficacité de molécules pour le traitement des accidents vasculaires cérébraux dans un modèle d’attaque thromboembolique chez le rat (acronyme : MATERAVC-2023)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
308 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque rat subit une chirurgie du cou de 40 minutes pour injecter des caillots dans une artère et déclencher un accident vasculaire cérébral, puis un traitement à tester et des tests comportementaux de J1 à J21 mesurant les déficits moteurs, avant la mise à mort et le prélèvement du cerveau. Le porteur indique que le modèle reproduit paralysie et déficits sensorimoteurs, et écrit vouloir "reproduire une gravité qui sera jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable". Il affirme qu'aucune méthode in silico ou in vitro ne modélise l'ischémie-reperfusion cérébrale, et résume les bénéfices en une seule phrase sur de possibles nouveaux traitements.
Objectifs
Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) sont la 2ème cause de mortalité dans le monde. Environ 80% des AVC sont induits par une interruption de la circulation sanguine dans le cerveau. A l’heure actuelle, le rt-PA est le seul médicament préconisé dans cette pathologie. Toutefois, ce traitement possède de nombreuses limites : efficacité limitée et risque de complication avec aggravation des symptömes. Ainsi, il parait indispensable de développer de nouveaux médicaments visant à traiter efficacement cette pathologie.
Bénéfices attendus
Cette étude pourra mettre en évidence de nouveaux traitements dans la lutte contre l'AVC.
Procédures
L'ensemble des animaux seront soumis à une chirurgie au niveau du cou afin de pouvoir injecter des caillots dans une artère pour induire l'accident vasculaire cérébral. Cet acte chirurgical durera 40 minutes sous anesthésie générale. Deux heures plus tard, sur animaux vigiles, un traitement sera administré. Avant et après chirurgie, un prélèvement sanguin sera réalisé sur animaux vigiles. Des séries de tests comportementaux, s'étalant de J1 à J21 post-AVC, seront réalisés pour une durée totale de 30 minutes maximum, afin de mesurer les déficits moteurs et sensoriels liés à l'accident vasculaire cérébral et la récupération au cours du temps des animaux. Enfin, à la fin du projet, un ensemble d'organes sera prélevé. Les procédures pouvant engendrer une douleur seront réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie.
Impact sur les animaux
L’hébergement en cage individuelle des animaux induits, nécessaire durant les 72h suivant la chirurgie, pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les points de suture ou le cathéter nécessaire au traitement, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes. Le modèle par définition reproduit les effets d’un AVC à savoir : déficit sensorimoteur et lésions cérébrales. Cela peut occasionnellement entrainer des pertes d’équilibre, une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion et une atteinte des fonctions motrices. L’AVC est un évènement grave chez un patient et sa survie est engagée. Le modèle d’étude chez l’animal présente, lors de l’induction et durant les 48 premières heures suivant l’induction, des signes cliniques d’inconfort manifestes (paralysie). Certains animaux atteindront des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé et une mise à mort en conformité avec les recommandations éthiques. Pour évaluer les effets de notre composé, nous nous fixons comme objectif de reproduire une gravité qui sera jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique et conservant toute pertinence scientifique.
Devenir
Tous les animaux nécessaires à la réalisation de ce projet seront mis à mort 3 ou 21 jours après l’induction de l’AVC, c’est-à-dire à la fin de la procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale), afin de récupérer le cerveau et les organes pour des analyses histologiques.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Les études in silico ou in vitro ne permettant pas de prédire l’efficacité d’un traitement dans le cadre d’une intervention visant par exemple à limiter la taille des lésions cérébrales au cours d’un AVC thromboembolique chez l’Homme. Le nombre et la complexité des mécanismes mis en jeux au cours de l’ischémie-reperfusion du tissu cérébral chez l’Homme ne sont actuellement pas modélisés par des méthodes alternatives alors qu’ils sont présents de façon similaire chez le rat. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut donc être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Sur la base de notre expérience de ce modèle, le nombre de rats utilisé pour chaque étude est réduit au minimum et révisé à la baisse au fur et à mesure de nos expériences tout en garantissant une interprétation statistique et scientifique des résultats. Ce modèle présente une variabilité importante en ce qui concerne les résultats obtenus lors des évaluations comportementales ou des observations neuroanatomiques post-mortem. Cette variabilité, bien que comparable à ce qui se passe dans la réalité clinique, entraine l’utilisation d’un nombre important d’animaux par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles. Les rats seront 3 par cage avec du papier kraft et une brique d'Aspen comme enrichissement, auront de la nourriture et de l’eau ad libitum. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Une attention toute particulière sera portée aux animaux pendant la chirurgie (analgésie pré-opératoire, anesthésie générale, maintien de la température corporelle, désinfection et anesthésie locale du site d’incision) ainsi qu’après (analgésie post-opératoire). Le choix de la technique de sutures se portera sur la méthode des points séparés, offrant une plus grande résistance que le surjet par exemple, limitant le risque pour l’animal de rompre ses points. Après chirurgie, les animaux seront placés en cage individuelle dans une pièce dédiée chauffée à 28°C jusqu’à leur réveil. Pour pallier aux problèmes liés aux signes cliniques du modèle (perte d’équilibre, faiblesse musculaire, atteinte des fonctions motrices), les animaux seront habitués quelques jours avant la chirurgie à une nourriture sous forme de gel nutritif en plus de leurs granulés conventionnels. Ce gel riche en glucides et en électrolytes améliore la prise en charge des rats pendant les phases post-opératoires, et demeure davantage accessible (placé sur le sol de la cage, contrairement aux granulés situés en hauteur). Une litière à forte granulométrie sera également utilisée pour éviter les risques d’étouffement en phase post-opératoire. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil et durant les 48h suivantes. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si en période postopératoire, un dépassement des points limites précédemment fixés est constaté, l’animal sera mis à mort dans des conditions éthiques. La remise en cage par 3 ne sera réalisée que lorsque la récupération des animaux sera suffisante (reprise de poids après la perte attendue liée à l’induction du modèle). Les animaux d’une même cage recevront le même traitement afin de limiter le risque de dominance d’un animal avec traitement sur un animal sans traitement par exemple. Une surveillance stricte des rats sera réalisée pendant l’intégralité du projet : pesée des animaux et contrôle des points limites.
Choix des espèces
Les mécanismes et les conséquences physiologiques de l’ischémie-reperfusion cérébrale sont similaires chez le Rat et chez l’Homme. Le Rat est donc une espèce pertinente pour modéliser les AVC thromboemboliques chez l’Homme. Les animaux utilisés seront des rats mâles Wistar Han de 300-350g à l’arrivée au laboratoire. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.
Lumière artificielle de nuit : perturbation des rythmes circadiens et santé visuelle
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
374 Psammomys obesus vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Isolés en cage individuelle dès le sevrage, ils reçoivent une injection sous-rétinienne et jusqu'à 24 injections hebdomadaires et subissent des examens oculaires répétés sous anesthésie, pour étudier les effets de la lumière artificielle nocturne sur la rétine. Le porteur reconnaît que l'isolement prolongé induit du stress et que les anesthésies répétées peuvent entraîner une perte de poids. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit l'ensemble des structures rétiniennes et qu'il faut travailler à l'échelle de l'animal entier.
Objectifs
Nous vivons dans un monde illuminé en permanence et l'exposition à la lumière artificielle la nuit (LAN) est devenue une réalité quasi universelle. Bien qu'elle soit essentielle à nos modes de vie modernes, il est clair que la LAN a des impacts négatifs sur la santé, en favorisant le développement notamment de cancers et troubles métaboliques. Il est également évident que ces effets néfastes sur la santé sont causés par des perturbations induites par la LAN dans notre horloge biologique. Cette horloge joue un rôle vital en coordonnant de façon optimale toutes nos fonctions physiologiques (sommeil, prise de repas et digestion,etc) au cours du cycle jour/nuit. L'oeil est doublement concerné par les processus circadiens car c’est par lui que la LAN entre dans l'organisme et perturbe le système circadien, et l'oeil est lui-même sous contrôle d'une "horloge" intrinsèque. Malgré cela, on sait peu de choses sur les effets de la LAN sur la santé oculaire et la vision. Notre laboratoire est l'un des rares à explorer activement cette question, et nous savons qu'une exposition aiguë à la LAN entraîne des changements spectaculaires dans le fonctionnement rythmique de la rétine. Notre hypothèse de travail est que, de manière analogue à l'horloge biologique principale, la perturbation induite par la LAN dans les rythmes de la rétine a un impact négatif sur la santé visuelle. À l'aide d'un modèle animal unique de rétine humaine riche en cônes, Psammomys obesus, les deux EU impliqués dans ce projet multisite ont montré que l’exposition chronique à la LAN (lumière intense en début de nuit) telle qu’elle se produit dans le travail posté, induit une altération de la structure rétinienne et de la fonction visuelle à long terme (résultats non publiés). Nos objectifs sont de comprendre dans le même modèle animal et le même paradigme d'exposition lumineuse, les effets (moléculaires et cellulaires) de la LAN sur la santé rétinienne, de déterminer quelle part de la lumière est responsable des effets toxiques et de d'évaluer si un traitement (anti-oxydant) à la vitamine E peut contrecarrer les effets à long terme de la LAN.
Bénéfices attendus
Nous espérons que nos résultats généreront de nouvelles connaissances et de nouveaux cadres conceptuels concernant les mécanismes de dégénérescence dans la rétine déclenchée par un éclairage environnemental aberrant (une lumière trop intense pendant la nuit). Ils doivent aider à définir recommandations pour limiter l'exposition à un tel éclairage chez l'homme et en particulier chez les patients souffrant de maladies rétiniennes.
Procédures
138 Psammomys obesus sont inclus dans une procédure comprenant une injection sous-rétinienne (réalisée dans l'EU 1). Tous les animaux feront l’objet d’une analyse fonctionnelle de la vision à l'aide de trois méthodes: tomographie par cohérence optique, fond d'oeil (tous deux réalisés dans EU2) et électrorétinographie (réalisé dans EU1). L'injection sous-rétinienne (EU1) s’effectue sous anesthésie gazeuse suivie d’une anesthésie locale et de l’application d’un gel limitant le dessèchement de l’oeil, environ 10 minutes pour chaque animal. Les méthodes employées pour l’étude fonctionnelle de la vision sont non invasives, ne provoquant pas de souffrance particulière. Ces trois méthodes d'une durée de 15 à 60 minutes maximum chacune sont réalisées sous anesthésie gazeuse (imagerie, EU2)) ou par voie sous-cutanée (électrorétinographie, EU1). Chaque animal subira au maximum 3 examens par imagerie de l'oeil et 3 examen par électrorétinographie (examen fonctionnel). Le traitement pharmacologique (EU1) mettra en jeu des injections hebdomadaires pendant toute la durée de la procédure soit au maximum 24 injections d'une durée de 1 minute. Le traitement à la vitamine E (EU1) impliquera une injection sous-cutanée hebdomadaire pendant toute la durée de la procédure soit 24 injections au maximum d'une durée de 1 minute.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent être soumis à différentes nuisances listées ci-dessous : 1) Impact généré par la LAN : nous nous attendons à une potentielle altération du système circadien et de l’humeur pour des animaux exposés pendant plusieurs mois. 2) A partir du sevrage et jusqu’à la fin des procédures, les animaux seront placés dans des cages individuelles pour mieux contrôler les conditions d'exposition lumineuse. L’isolement sur une longue période est susceptible d’induire du stress chez les Psammomys obesus. 3) Les animaux seront soumis à des anesthésies susceptibles d'altérer le bien-être de l'animal. 4) les animaux seront soumis à des injections susceptibles d’induire une douleur modérée, un risque infectieux et/ou inflammatoire. 5) Les animaux seront également soumis à électrorétinogrammes, susceptibles d’induire des anomalies oculaires dans certains cas (inflammation, infection, rougeur, opacité…). Liée à ces procédures, l'administration répétée d'anesthésies chez Psammomys obesus peut entraîner une perte de poids (10%) dans certains cas, indiquant une complication métabolique. 6) Des effets délétères du traitement à la vitamine E peuvent être observés, tels qu'une diminution de la pression artérielle, des problèmes de coagulation. 7) L'injection intra-péritonéale peut causer de la douleur, un stress et une inflammation chez le rongeur en raison de l'introduction d'une aiguille dans l'abdomen.Le transport entre les deux EU pourrait induire un stress aigu transitoire chez les animaux.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure pour prélèvements.
Remplacement
Le but de ce projet est d’évaluer l’impact d’une exposition anormale à la lumière sur la vision en étudiant plus particulièrement les altérations du système circadien de la rétine. A l’heure actuelle, il n’est pas encore possible de modéliser in vitro et/ou in silico l’ensemble des structures impliquées de la rétine, ce qui nécessite donc d’avoir recours au modèle animal. Le projet nécessite la réalisation d’expériences dans un environnement intégral, à l’échelle de l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux a été choisi dans le respect des règles statistiques en vigueur, en minimisant le nombre d’animaux utilisés. Il a été déterminé par calcul de puissance à l’aide d’un logiciel, et sur la base de notre connaissance du modèle Psammomys obesus, des techniques utilisées et de nos expériences à ce sujet, ainsi que sur la littérature scientifique. De plus, afin de réduire le nombre total d'animaux: - Nous utilisons des approches non invasives et longitudinales ne conduisant pas à la mise à mort de l'animal. Les animaux utilisés lors des approches non-invasives seront utilisés dans le cadre d'une procédure ex-vivo, après prélèvements post-mortem des globes oculaires. De plus, nous utiliserons les mâles et les femelles de nos portées, puisque que nos résultats antérieurs n’ont pas montré d’effet du sexe sur la dégénérescence rétinienne induite par la LAN. Nous réaliserons des analyses statistiques pertinentes robustes et adaptées à nos groupes.
Raffinement
Pour réduire l'impact de l'isolement, les animaux sont hébergés en cages ouvertes ce qui permet de maintenir les contacts visuels et olfactifs entre les congénères. Pour optimiser leur croissance, les animaux dont le poids est inférieur à la moyenne (en tenant compte de la dispersion des valeurs), disposeront d’un biberon à tétine longue pour leur faciliter l’accès à la boisson, ainsi que des croquettes directement dans leur cage. En cas de problème d’alimentation récurrente objectivé par une perte de masse, les animaux auront accès à de la nourriture gélifiée directement dans une coupe dans la cage et les dents des animaux seront vérifiés. Les différents examens seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie. Durant ces procédures la température de l’animal sera maintenue à l’aide d’un tapis chauffant. Après les procédures les animaux seront suivis quotidiennement à l’aide d’une grille de score permettant d’objectiver différents paramètres (apparence, poids, examen clinique). A partir des grilles de score des points limites ont été définis, permettant de soustraire immédiatement l'animal à la souffrance. Les animaux sont transportés dans des boites de transport pour animaux de laboratoire contenant litière et enrichissements type bâton et frisure. De la nourriture et de l'eau gélifiée sont ajoutés pour que l'animal puisse se nourrir et s'hydrater sans risque d'écoulement de l'eau. Durant le transport selon la température extérieure, la voiture sera chauffée pour éviter toute hypothermie aux animaux. Les animaux seront transportés pendant le jour donc sans déphasage du cycle lumière/obscurité. L'état de santé des animaux sera évalué avant et après les procédures sur chaque site.
Choix des espèces
Psammomys obesus a une rétine remarquablement riche en cônes et représente un modèle animal pertinent de vision centrale, primordiale pour la vue humaine. Dans la nature, ces animaux sont sevrés après 20 jours et atteignent la taille adulte au bout de 4 mois. Ils deviennent sexuellement matures à 3-6 mois. L'espérance de vie est 14-18 mois, et six ans en captivité. Les animaux seront exposés à la LAN dès l'âge de 2 mois et maintenus dans ce régime plusieurs semaines. Les injections sous-rétiniennes seront pratiquées sur des animaux à P15.