Recherche fondamentale

312 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Seuls des mâles sont retenus, recevant chaque jour pendant six semaines un antidépresseur ou du tramadol par micropipette, puis passant des tests comportementaux nommés, piscine de Morris, actimétrie et reconnaissance d'objet, avant une mise à mort par overdose d'anesthésique et décapitation pour prélever le cerveau. Le porteur décrit les troubles cognitifs recherchés, sédation, confusion et pertes de mémoire, comme l'objet même de l'étude. Il affirme qu'aucune approche in vitro ou in silico ne reproduit la "complexité de notre organisme" et justifie le rat par son "large répertoire comportemental" et son volume sanguin.

Objectifs

L’objectif de cette étude est d’évaluer l’impact de l’administration chronique de médicaments psychoactifs sur la cognition et l’équilibre chez le rat. Nous souhaitons évaluer en particulier l’impact de l’administration chronique des antidépresseurs, largement prescrits chez la personne âgée du fait de la présence de troubles anxiodépressifs dans cette population. Les médicaments ayant une activité anticholinergique, comme certains antidépresseurs, sont un facteur de risque de troubles confusionnels, c’est-à-dire une altération de la vigilance ou des capacités attentionnelles. Cela peut toucher l’ensemble des fonctions cognitives : mémoire, orientation temporo-spatiale… Son incidence est élevée chez les personnes âgées et sa survenue associée à une augmentation de la morbi-mortalité. Cette étude permettra également d’évaluer le lien entre troubles cognitifs et potentiel anticholinergique des antidépresseurs testés. L’objectif de notre étude est donc d’évaluer les effets cognitifs à court et long terme de différents antidépresseurs, appartenant à des classes médicamenteuses différentes et ayant une affinité différente sur les récepteurs muscariniques, dans un modèle rongeur. Les différents effets observés seront comparés selon la population observée (animaux jeunes ou âgés). Dans le but de valider le protocole mis en place, et pour avoir une évaluation la plus sensible possible des troubles cognitifs, nous réaliserons ce même protocole une première fois avec le tramadol. En effet, le tramadol est une substance active connue pour ses effets indésirables négatifs sur la cognition et ses effets sont décrits dans la littérature. Il altère notamment les performances mnésiques. De plus, la méthode d’administration que nous souhaitons utiliser pour l’ensemble de cette étude n’a, à notre connaissance, jamais été utilisée pour le tramadol. Il s’agit de l’administration de substances actives par micropipette (méthode MDA pour Micropipette-guided Drug Administration) à l’aide de lait concentré sucré dilué au 3/10. Le tramadol sera donc utilisé pour valider le protocole mis en place et son utilisation. Ce protocole sera ensuite répété pour les antidépresseurs à tester : duloxétine, citalopram, paroxétine et imipramine. Les effets de ces différentes substances actives sur la cognition des animaux jeunes ou âgés seront évalués et pourront confirmer ou infirmer les effets observés chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’abord de développer un protocole complet d’étude des troubles cognitifs d’origine iatrogénique chez l’animal. Ce protocole sera ensuite utilisé pour l’identification des médicaments psychoactifs à risque d’entrainer des troubles cognitifs et potentiellement accroître le risque de chute, notamment chez la personne âgée. Ainsi, nous espérons prévenir l’apparition de ces troubles chez la personne âgée et ainsi avoir une action préventive en apportant un conseil quant aux posologies les plus adaptées chez la personne âgée ou des alternatives thérapeutiques lorsqu’il en est possible.

Procédures

Les animaux seront soumis à une administration quotidienne de substance active par micropipette pendant 6 semaines soit un total de 42 administrations. Lors de nos précédents travaux, nous avons mis en évidence que la durée de cette administration est d’une minute environ. Ces administrations seront précédées d’une pesée de chaque animal soit 42 pesées au total (1 minute par pesée).

Impact sur les animaux

Plusieurs tests comportementaux seront réalisés durant l’étude : piscine de Morris, actimétrie, reconnaissance d’objet. Ces tests peuvent entrainer un stress chez les animaux. Concernant les molécules administrées, elles peuvent entrainer des troubles cognitifs chez les animaux, c’est ce que nous cherchons à évaluer. Le tramadol est un antalgique de palier II, pouvant entraîner des troubles digestifs comme une constipation. La duloxétine est un IRSNa pouvant avoir un effet sédatif. La paroxétine et le citalopram sont des ISRS pouvant entrainer des troubles digestifs, une confusion par hyponatrémie, une somnolence. L’imipramine est un antidépresseur tricyclique pouvant entrainer une sédation, une confusion, une constipation.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort à la fin de la procédure. En effet, la récupération de pièces cérébrales conditionne les études électrophysiologiques ex-vivo, sur tranches de cerveau. Par conséquent, ceux-ci seront mis à mort à l’issu du dernier test comportemental. Ces analyses nous permettent d’évaluer si l’administration chronique des différentes substance actives étudiées affecte la plasticité synaptique. Lors de la mise à mort, des prélèvements sanguins seront également réalisés pour un dosage sanguin en substances actives.

Remplacement

Des études in vitro ou in silico ne permettent pas de mettre en évidence l’impact de la consommation chronique de substances actives dans l’apparition de troubles cognitifs et de l’équilibre. Il ne serait pas non plus possible de démontrer les mécanismes mis en jeu dans l’apparition de ces troubles. En effet, ce qui fait la complexité de la compréhension de l’installation des effets indésirables médicamenteux est justement la complexité de notre organisme (système sensoriel, système musculosquelettique, système nerveux etc.). Ce système complexe est modulé en fonction de nombreux facteurs, extrinsèques (liés à l’environnement, mode de vie) comme intrinsèques. Parmi les facteurs intrinsèques, on retrouve la prise de médicaments, qui peut entrainer des modifications physiopathologiques chez les patients. S’ajoute à cela un autre facteur intrinsèque, l’âge, qui va induire, là encore, une variabilité pharmacocinétique et pharmacodynamique. Il est donc nécessaire de réaliser ces tests comportementaux in vivo car il est impossible de prévoir la résultante cognitive à toutes ces contraintes. De plus, nos résultats seront comparés aux données obtenues chez l’Homme lors de nos précédents travaux, il est donc important de travailler chez l’animal pour avoir une meilleure comparabilité, le rongeur ayant un large répertoire comportemental, les résultats seront comparables à ce qui peut être observé chez l’Homme. Pour les enregistrements électrophysiologiques, nous avons besoin de tranches de cerveaux obtenues à partir d’organismes ayant été exposés de façon chronique aux substances actives d’intérêt dans notre projet. La technique utilisée dans notre étude est la MultiElectrode Array (MEA). Celle-ci permet de réaliser des enregistrements extracellulaires et fournit une vue globale du réseau neuronal. Les études électrophysiologiques consisteront en l’enregistrement de potentiels par l’évaluation de la transmission de base et de la potentialisation à long terme dans l’aire CA1 hippocampique (tranche d’hippocampe). Nous avons également besoin d’échantillons sanguins pour réaliser des dosages pharmacocinétiques, ce qui n’est pas possible in vitro ou in silico. Nous avons choisi le modèle rat afin d’avoir un répertoire comportemental plus large et un volume sanguin plus important pour nos prélèvements et ainsi réaliser les dosages nécessaires.

Réduction

Le nombre d’animaux prévus dans les expérimentations a été réduit à son strict minimum. Seuls des mâles seront utilisés dans cette étude afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires. Dans la littérature, les mâles représentent la majorité des animaux utilisés dans la recherche sur les rongeurs. Notre méthode d’administration est par voie orale par micropipette en utilisant du lait concentré sucré dilué. Après la puberté, les femelles montrent une nette augmentation de la préférence pour la saccharine, qui est en partie sous contrôle hormonal. Après la maturation, les mâles préfèrent une solution de glucose, tandis que les femelles préfèrent une solution de saccharine. Les femelles préfèrent également des concentrations plus élevées de saccharine que les mâles. Le lait concentré sucré contient du sucre de betterave et du sucre de canne, qui sont tous deux des saccharoses. Si les rats mâles sont suffisamment motivés pour prendre la micropipette, les femelles le seront encore plus. Des groupes de 12 rats mâles seront formés afin d’avoir une puissance statistique suffisante. De plus, en utilisant des rats (et non des souris), nous pouvons réduire le nombre d’animaux utilisés car le rat possède un volume sanguin plus important que celui de la souris et nous permet donc de pouvoir effectuer tous les dosages sanguins en un seul prélèvement. Tous les animaux utilisés pour les études comportementales seront également utilisés pour les études post-mortem ce qui permet de réduire considérablement le nombre d’animaux.

Raffinement

Diverses mesures seront prises pour raffiner les expérimentations qui ne seront réalisées que par du personnel formé et ayant un livret de compétences à jour. Les animaux seront hébergés par deux tout au long de l’expérimentation dans des cages standards, répondant aux normes d’éthique. La stabilité des groupes permettra de réduire une éventuelle agressivité. Les animaux seront maintenus dans des conditions contrôlées d’hébergement, c’est-à-dire dans un environnement stabilisé en température, hygrométrie, luminosité et en cycle normal. Après leur arrivée au laboratoire, les animaux ne seront pas manipulés (hormis la surveillance quotidienne et le change de cage bi-hebdomadaire) pendant 1 semaine afin de les laisser s’acclimater à leur nouvel environnement. La semaine suivante, les animaux seront habitués à leur expérimentateur, pendant 5 min par jour, afin de réduire le stress lié aux manipulations. Lors des tests comportementaux, les rats seront placés dans la pièce expérimentale 1h avant le début des tests pour s’acclimater à la pièce. Leur environnement est enrichi avec des lamelles de papier kraft et un rouleau de carton afin d’assurer un enrichissement minimum, permettant aux animaux de trouver un abri en cas de conflit et d’avoir une activité minimale (construction de nid). L’eau sera fournie ad libitum et l’apport en nourriture sera contrôlé. Leur poids sera mesuré tous les jours et un responsable des animaux vérifiera leur apparence physique externe (poils hérissé, chromodacryorrhée…) ou des changements de comportement (attitude de prostration, animal ne répondant plus à son environnement ou réagissant de manière inhabituelle à l’expérimentateur, réduction importante de l’activité motrice…). Un animal présentant un tel état de mal-être ou de souffrance sera immédiatement exclu de l’étude et une discussion sera entreprise avec des membres de la SBEA concernant son éventuelle mise à mort sous anesthésie et analgésie si jugé nécessaire (cf grille de points limites). Lors de la mise à mort des animaux, une overdose d’anesthésique sera réalisée sous isoflurane suivie d’une décapitation pour récupération des cerveaux.

Choix des espèces

L’espèce choisie est la rat (Rattus norvegicus), il s’agit avec la souris, d’espèces très utilisées en recherche pré-clinique. Le rat est une espèce facile à maintenir, en termes de coût et de place, son comportement est bien connu et détaillé dans la littérature et sa proximité génétique avec l’espèce humaine permet d’accéder à des mécanismes cérébraux communs et à des fonctions cognitives et des comportements en beaucoup de points similaires et mesurables (anxiété, mémoire, locomotion). Du fait de sa taille supérieure, le rat possède un plus grand volume sanguin que la souris et permet donc d’augmenter le nombre d’analyses sanguines réalisées tout en réduisant le nombre d’animaux utilisés Pour les expérimentations sur rats jeunes, des rats âgés de 6 semaines seront utilisés. Ils auront plus de 4 mois pour l’étude de la plasticité synaptique hippocampique par électrophysiologie, leur croissance et développement cérébral seront atteints. Pour les expérimentations sur rats âgés, des rats âgés de 22 semaines seront utilisés. Ce groupe permettra de réaliser une comparaison avec le groupe de rats jeunes.

450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Différents vecteurs viraux dérivés de l'AAV9 leur sont injectés, dès le premier jour de vie pour une partie, par voie abdominale, intraveineuse ou derrière l'œil, avec un suivi hebdomadaire par bioluminescence. Le porteur reconnaît que l'injection derrière l'œil peut provoquer un gonflement de l'œil, une proptose ou une cécité, et que les anesthésies prolongées peuvent causer des troubles cognitifs. Il compare l'efficacité de ces vecteurs pour la thérapie génique musculaire et juge le recours à l'"organisme entier" nécessaire.

Objectifs

Les vecteurs viraux sont des outils largement utilisés en thérapie génique. Parmi eux, les virus adéno-associés (AAV) présentent de nombreux avantages comparés aux autres vecteurs car ils ne sont pas pathogènes chez l’Homme et présentent une faible immunogénicité ainsi qu’une grande stabilité génétique. Il existe plusieurs sérotypes d’AAV dont l’AAV9 présentant un tropisme pour les muscles. Une des limites de l’utilisation des AAV en tant que vecteur est le manque de spécificité. D'autres AAV dérivés de l'AAV9 décrit dans différentes publications présenteraient une augmentation de la spécificité musculaire en vitro et en in vivo. L’objectif du projet est donc de pouvoir comparer l'efficacité des différents dérivés de l'AAV9 avec l'AAV9 ainsi qu'entre eux chez la souris et par la suite de sélectionner celui qui montrera la meilleure optimisation de l’efficacité et la spécificité dans le muscle tout en limitant celle dans les autres organes. Le but final est d’améliorer la thérapie génique pour traiter les maladies génétiques du système musculaire.

Bénéfices attendus

L’identification du meilleur sérotype d’AAV ciblant le plus spécifiquement les muscles et moins les autres organes permettra une meilleure efficacité des thérapies géniques applicables aux maladies musculaires.

Procédures

La cohorte « injections intrapéritonéales » seront soumises aux procédures suivantes : -Injection intrapéritonéale unique au premier jour post-natal, 1 minute par animal -Injection sous cutanée (1minute) de la substance émettrice de lumière chaque semaine à partir de la 2ème semaine de vie pour l’analyse en bioluminescence. La cohorte « injections intraveineuses » seront soumises aux procédures suivantes : - Injection intraveineuse (1 minute) unique par la veine caudale chez la souris éveillée -Injection sous cutanée (1 minute) de la substance émettrice de lumière chaque semaine à partir de la 2ème semaine de vie pour l’analyse en bioluminescence. La cohorte "injections rétro-orbitales" seront soumises aux procédures suivantes :- Injection rétro-orbitale (1 minute) unique chez la souris sous anesthésie -Injection sous cutanée (1 minute) de la substance émettrice de lumière chaque semaine à partir de la 2ème semaine de vie pour l’analyse en bioluminescence

Impact sur les animaux

L’injection peut provoquer chez l’animal un stress dû à l’acte, ainsi qu’une perte de poids. L’injection intrapéritonéale peut provoquer une douleur transitoire chez l’animal. Une anesthésie prolongée peut causer des troubles cognitifs chez l’animal. L’injection rétro-orbitale peut provoquer l'apparition de gonflement oculaire au site d'injection, une proptose ou encore une cécité. Une anesthésie prolongée peut causer des troubles cognitifs chez l’animal.

Devenir

Notre projet nécessite la collection d’organes pour l’analyse au niveau histologique et moléculaire

Remplacement

Ces analyses ne peuvent pas être remplacées par des tests in vitro sur des lignées cellulaires musculaires car celles-ci ne permettent pas l’étude de l’impact de l’AAV sur un organisme entier. En effet seul le modèle animal pourra nous permettre l’étude de la bio distribution d’un produit injecté. De plus, le modèle murin est physiologiquement assez proche de l’Homme, ce qui va nous permettre une étude représentative de l’efficacité et de la spécificité des différents vecteurs viraux.

Réduction

Le nombre d’animaux a été basé sur le nombre de virus et de doses à tester par âge. Ce nombre a été basée sur de précédentes études similaires et permet d’assurer une robustesse statistique nécessaire à l’interprétation des résultats. L’expérience de bioluminescence, qui est une expérience permettant de visualiser la localisation du virus dans l'animal, nous permet d’avoir un suivi hebdomadaire de l'expression du virus chez la souris, ce qui nous évite la création de plusieurs groupes de souris à différents âges.

Raffinement

Une alimentation enrichie en plus de l’alimentation inscrit dans l’agrément de l’EU sera mis en place si une perte de poids (inférieure à 22 grammes) est observée suite à l’injection des virus. Les animaux seront surveillés chaque semaine jusqu’à leur mise à mort. Si des difficultés de locomotion apparaissent lors de l’hébergement, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. De l’ocrygel sera appliqué dans l'ensemble des procédures expérimentales pour prévenir tout inconfort d’assèchement oculaire lors du réveil. Les point limites seront déterminés en fonction des observations faites d'une part pendant l'anesthésie (évaluation du rythme cardiaque, variation de la température de l'animal) et d'autre part pendant et après l'injection de l'animal (changement du comportement, réponses à des stimuli externes). L'anesthésie et la procédure d'injection seront arrêtés si ces points limites sont atteints.

Choix des espèces

Pour tester l'éventuelle amélioration de l’efficacité et de la spécificité du vecteur viral, nous avons besoin d'effectuer des expériences in vivo sur modèle animal. Des projets similaires sur ce modèle animal ont déjà été publié, l’utilisation de ce modèle s’inscrit donc dans un effort de continuité et de reproductibilité de nos études. Enfin, le modèle murin présente l’unique avantage d’être génétiquement très proche de l’homme et facile d’élevage en raison de sa taille et de ses capacités de reproduction. La cohorte concernant le groupe de souris qui seront injectées par voie intrapéritonéale utilisera des souris dès le premier jour de naissance. Cela permettra d’évaluer l’efficacité des virus pour mettre en place une stratégie de thérapie génique préventive. La cohorte concernant le groupe de souris qui seront injectées par voie intraveineuse utilisera des souris de 6 semaines d’âge. Cela permettra d’évaluer l’efficacité des virus pour mettre en place une stratégie de thérapie génique curative. A partir de la modification, La cohorte RO à P1 utilisera des souris dès le premier jour postnatal. Cela permettra d’évaluer l’efficacité de l’AAV pour mettre en place une stratégie de thérapie génique préventive. La cohorte RO à 6w utilisera des souris de 6 semaines d’âge. Cela permettra d’évaluer l’efficacité de l’AAV pour mettre en place une stratégie de thérapie génique curative. Le groupe de 10 souris pour l'apprentissage du geste RO à P1 utilisera des souris à P1.

375 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit des injections de candidats-médicaments ou de sondes, subit jusqu'à huit anesthésies gazeuses sur une semaine pour l'imagerie et jusqu'à dix micro-prélèvements de sang. Le porteur teste la biodistribution de molécules aux applications variées, du traitement anticancéreux à l'antidépresseur, et affirme qu'aucun modèle alternatif ne reproduit l'absorption et l'élimination d'un médicament dans l'organisme. Il indique renoncer à toute grille de score, celle-ci supposant de "maintenir la souffrance de l'animal pour en évaluer l'évolution".

Objectifs

Pour le développement de nouveaux médicaments ou de cibles thérapeutiques, il est nécessaire d'étudier le devenir de la substance active ou de la sonde dans l'organisme, dans le but de déterminer l’absorption, la distribution, le métabolisme et l’élimination du composé (ADME), des propriétés qui vont influencer la posologie du médicament (dose administrée et fréquence d'administration) ou permettre la mise en évidence du devenir de la sonde et in fine la localisation in situ de cible. L’objectif scientifique est de suivre la biodistribution de produits pharmacologiques ou de sondes en cours de développement chez la souris, visualisée par fluorescence ou par bioluminescence à l’aide d’un imageur. Les produits pourront être de différentes natures: chimique, peptidique, oligonucléotidique et pour diverses applications : analgésie, anti-inflammatoire, antibiotique, immunodépresseur, anticancéreux, cardio-protecteur, anti-arthrosique, antidépresseurs, neuro-protecteur…

Bénéfices attendus

La mesure de la bio-distribution des candidats-médicaments permettra de sélectionner les candidats-médicaments ou les sondes les plus adaptés et d’en affiner la posologie (dose et fréquence d’administration) selon les critères tels que l’ADME, l'affinité et la spécificité de la sonde pour sa cible et sa capacité à atteinte la cible. Ces caractéristiques sont indispensables pour les futures études pharmacologiques. Ce projet s'inscrit pleinement dans les étapes indispensables au développement des candidats-médicaments et des sondes pour le traitement des pathologies humianes ou leur diagnostique et permettra de séléctionner les molécules les plus interressante. Cette séléction évitera de mesurer ensuite l'activité pharmacologique chez l'animal de toutes les molécules éliminées et permettra donc de réduire le nombre d'animaux nécéssaire tout en augmentant les probabilités d'obtenir un médicament.

Procédures

Les animaux seront soumis a des injections effectuées afin d'administrer les candidat-médicaments, sondes, médicaments et/ou compétiteurs étudiés. Les molécules pourront être administrées par voie intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée, intra-dermique, intr-anasale ou par voie orale. Généralement 1 (sonde) à 2 (sonde + compétiteur) administrations seront effectuées. Pour l'aquisition des images ("photos"), des anesthésies gazeuses de quelques minutes chacune sont nécessaires pour que la souris soit parfaitement immobile. Ces anesthésies pourront être répétées jusqu’à 8x sur une période de 24h à 7j pour suivre la liaison puis l'élimination de la sonde et determiner son activité. Afin de suivre la concentration sanguine de la sonde au cours du temps, des micro-prélèvements de sang pourront être réalisés à l’extrémité de la queue. Ces prélèvements seront réalisés durant l’anesthésie nécessaire à la "photo"ou sur les animaux vigiles et non contraints. Un maximum de 10 micro prélèvements de sang seront réalisés sur une durée minimum de 48h.

Impact sur les animaux

Les administrations uniques du candidat médicament, de la sonde (administrations orale ou intraveineuse ou intrapéritonéale ou sous cutanée ou intradermique ou intranasale) et/ou répétée de la luciférine (intrapéritonéale) nécessite une préhension et une contention des animaux. Les animaux seront maintenus sous anesthésie gazeuse durant les "photos" : quelques minutes chacune et pouvant être répétée jusqu’à 8x sur une période de 24h à 7j. Des micro-prélèvements de sang sont réalisés à l’extrémité de la queue sur les animaux anesthésiés (simultanément à une "photo") ou vigiles et non contraintes. Un maximum de 10 micro-prélèvements de sang seront réalisés sur une durée minimum de 48h.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses.

Remplacement

Les candidats-médicaments et les sondes auront été sélectionnés préalablement pour leur activité et leur innocuité sur les modèles cellulaires, ainsi que pour leur caractéristiques pharmacochimiques (solubilité, stabilité plasmatique et microsomale…). Cependant, tous les essais réalisés ne peuvent prédire avec exactitude l'activité d'un composé car aucun modèle alternatif (bio-informatique, moléculaire et/ou cellulaire) n’est suffisamment intégré et complexe pour reproduire l’ensemble des phénomènes biologiques impliqués dans l’absorption, la distribution, la dégradation et l’élimination des médicaments. Ces phénomènes biologiques sont liés à la circulation sanguine, aux barrières biologiques et aux voies d'élimination (dégradation par le foie, élimination biliaire et rénale...) et régulent l’activité des médicaments. Pour ces raisons, une approche chez l’animale reste indispensable pour sélectionner les candidats-médicaments les plus prometteurs avant de poursuivre leur développement. La mesure de la bio-distribution sera réalisée chez le souris, car cette espèce est la plus utilisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments et qu’elle permet d’avoir recourt à des animaux génétiquement modifiés.

Réduction

La réalisation des procédures par un technicien rompu à ces manipulations garantit une bonne reproductibilité et permet de limiter le nombre d’animaux à engager dans les protocoles. Nous avons montré que la procédure expérimentale parfaitement maîtrisée permet une mesure efficace à l’aide de 3 souris par condition testées. Les résultats sont exploités sous la forme de courbes cinétiques ou d’images. Aucune comparaison statistique n’est requise. Le plus souvent 2 à 5 conditions seront testées pour un composé (doses, voies d’administration, en présence ou absence d’un compétiteur). La mise en place de micro-prélèvements répétés chez un même animal permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux utilisés pour suivre les paramètres sanguins mesurés. Il est prévu de mesurer la bio-disponibilité de 5 candidats-médicaments ou sondes par an chez la souris (30 à 75 souris) sur une période de 5 ans, soit un maximum de 375 souris.

Raffinement

La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance. La souris étant un animal social, les souris seront maintenues en groupes sociaux, dans des cages enrichies d’un tube de change et de matériaux de « nidification ». Une période d'acclimatation et d'habituation d'une semaine sera respectée. Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long de l’étude, avec un suivi journalier de l’état des animaux par l’expérimentateur. Les souris seront anesthésiées pour permettre des acquisitions efficaces et parfaitement répétables. Les souris seront placées sur un tapis chauffant afin de prévenir une hypothermie durant l’anesthésie. La douleur liée aux injections est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration des candidats-médicaments ou des sondes, pour mettre en évidence tous signes de toxicité imprévue qui nécessiterait la mise à mort de l’animal. Aucun animal ne sera maintenu en vie s’il présente des signes de douleur ou d’inconfort. Pour cette même raison, aucun « scoring » n’est envisagé, car il nécessite de maintenir la souffrance de l’animal pour en évaluer l’évolution. Il arrive cependant qu’aucun signe extérieur de douleur ne puisse être observé, et que seule une perte ou absence de prise de poids soit mise en évidence. Dans ce cas, les animaux seront mis à mort dès la mise en évidence d’une différence significative. Les micro-prélèvements de sang sont indolores et réalisés lorsque les animaux seront anesthésiés ou sur les animaux vigiles et non contraints (sans boite ou tube de contention) à même de signifier librement tout manquement à leur bien-être.

Choix des espèces

La mesure de la biodistribution sera réalisée chez le souris, car cette espèce est la plus utilisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments, le plus souvent car sa petite taille permet d’utiliser moins de composés (des composés souvent difficiles à synthétiser) et qu’elle permet d’avoir recourt facilement à des animaux génétiquement modifiés. Le recourt à des animaux génétiquement modifiés, déficients pour la cible, peuvent s’avérer indispensable pour la validation de la spécificité de la sonde dans l'organisme. L’âge des souris sera déterminé en fonction de l’évolution de l’expression de la cible durant la vie de l’animal selon les informations disponibles dans la littérature. Les souris seront âgées d’au minimum 4 semaines afin que la procédure puisse être réalisée sans remettre en cause le bien-être de l’animal.

864 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À cinq jours de vie, les souriceaux subissent une chirurgie du cou pour isoler la carotide et, pour une partie, une privation d'oxygène à 8 % pendant quarante-cinq minutes destinée à provoquer des lésions cérébrales proches de la paralysie cérébrale humaine, avec des séparations maternelles répétées. Le porteur reconnaît que ces séparations déclenchent des appels à la mère et cherche à tester des molécules neuroprotectrices, avec des tests comportementaux jusqu'à l'âge adulte. Il juge le recours à la souris "indispensable" pour suivre la plasticité cérébrale sur le cerveau entier.

Objectifs

La paralysie cérébrale (PC) est la première cause de handicap moteur de l’enfant. En France, elle concerne 4 nouveau-nés chaque jour, avec une vulnérabilité accrue chez les garçons. La prématurité, une hypoxie-ischémie (HI) et le stress sont des facteurs de risque de la PC, pouvant engendrer des lésions cérébrales. La problématique générale du projet est de valider chez l’animal des approches de neuroprotection périnatale, en comparaison avec les effets du MgSO4 (unique molécule, à effet neuroprotecteur partiel, recommandée en clinique). Un modèle expérimental chez la Souris permet d’induire ces lésions en réalisant une HI périnatale, tout en reproduisant les différences intersexuelles observées en clinique. La vulnérabilité cérébrale en période périnatale évolue rapidement, montrant des profils lésionnels dépendants de l’âge d’exposition et du sexe. En effet, la période de la naissance correspond à une phase tardive du développement cérébral (gliogénèse, migrations cellulaires, synaptogénèse, vasculogénèse). La compréhension des mécanismes lésionnels et de plasticité cérébrale sont un préliminaire aux études de neuroprotection. Celles-ci consistent à tester à court et long termes les effets de molécules pharmacologiques sur le comportement sensori-moteur et cognitif des souris ayant subi une HI néonatale, ainsi qu'à analyser leurs effets aux niveaux tissulaire, cellulaire et moléculaire.

Bénéfices attendus

Les études cliniques ont permis d’affirmer qu'à court terme le MgSO4 diminue significativement les séquelles neuromotrices graves à type de paralysie cérébrale justifiant son administration en routine aux mères en menace d’accouchement prématuré. Le projet permettra d'étudier les effets mécanistiques et comportementaux du MgSO4 administré seul, en différenciant les sexes. D'autre part, des travaux récents du laboratoire rapportent que l’administration de MgSO4 chez le souriceau hypoxo-ischémié à P5 prévient à court terme, les déficits sensorimoteurs, l’inflammation et l’apoptose induits pas une HI néonatale. Cependant, il est remarquable qu’à long terme, le MgSO4 ne parvient pas à prévenir les troubles moteurs et cognitifs alors qu’il semble prévenir les modifications tissulaires induites par l’HI (désorganisation des fibres myélinisées du corps calleux). En clinique, aucun effet délétère du MgSO4 n'a été rapporté chez la mère ni chez le foetus. Cependant, des études précliniques ont alerté sur le fait qu'une dose élevée de MgSO4 pouvait entrainer des altérations de l'angiogenèse corticale. Ainsi, ce projet permettra également de tester les effets de l'association du MgSO4 avec d'autres molécules pharmacologiques. L'une des molécules qui sera étudiée dans le cadre de ce projet est le 4-Phénylbutyrate (4-PBA) qui a des propriétés neuroprotectrices, qui est un inhibiteur d'histone déacétylase (iHDAC) et qui est administré chez le nouveau-né en clinique pour traiter des troubles du cycle de l'urée.

Procédures

Les souriceaux subiront une procédure chirurgicale (uniquement isolement de la carotide ou hypoxie-ischémie) à 5 jours de vie (P5) afin d'induire des lésions cérébrales similaires à celles observées dans le cerveau de certains enfants nés prématurément entre 24 et 32 semaines d'aménorrhée. Tous les souriceaux subiront 4 isolements maternels, respectivement de 8, 10, 45 et 10 minutes, le jour où seront réalisés à la fois la chirurgie et les traitements. Ils ne seront isolés de la fratrie que pendant l’acte chirurgical et la phase de réveil (8 minutes en tout). La chirurgie impliquera de faire une injection sous-cutanée (d’analgésique), une incision de la peau du cou et du tissu sous-jacent afin d’isoler la carotide, puis de réaliser deux points de suture. Tous les animaux seront tatoués pendant l’anesthésie. Les traitements nécessiteront de réaliser 2 injections intrapéritonéales par individu. Les animaux des groupes hypoxo-ischémiés subiront une hypoxie à 8% d’O2 pendant 45 minutes. Les tests comportementaux réalisés chez le souriceau, la souris adolescente puis chez l’adulte visent à évaluer son développement sensorimoteur et ses capacités cognitives lors d’activité spontanées.

Impact sur les animaux

Les phases d’isolement maternels provoquent systématiquement des appels à la mère de la part des souriceaux. Les manipulations des petits et de la mère se font quotidiennement dès 24h après la naissance et évitent ainsi des stress répétés lors des tests comportementaux. La molécule A peut provoquer une vasodilatation, bradycardie et myorelaxation, mais à la dose injectée, le comportement des souriceaux et de la mère envers ses petits n’est pas altéré. La molécule B ne provoque pas non plus d’altération du comportement des souriceaux ni de la mère envers ses petits. Du fait de la variabilité interindividuelle, certains animaux hypoxo-ischémiés présenteront à court et long termes des déficits sensorimoteurs et cognitifs très discrets, mis en valeurs par des tests comportementaux spécifiques. Les animaux restent autonomes et tout à fait mobiles. Ils maintiennent des interactions sociales. Les souriceaux étant retirés progressivement à la mère pendant la chirurgie, celle-ci n’est jamais totalement dépourvue de ses petits.

Devenir

Les souriceaux opérés sont maintenus en vie pendant une durée allant de 6 à 60 jours post-opératoires puis euthanasiés sous anesthésie profonde pour le prélèvement des cerveaux en vue des différentes expérimentations

Remplacement

Il est indispensable pour notre étude d'avoir recours à l'animal, ici la Souris: 1) Le stress est connu pour être l’un des facteurs de risque de la PC. Les séparations subies par le couple mère-souriceau à P5 renvoient aux difficultés rencontrées par les parents d'enfants prématurés pour être en contact avec leur enfant en couveuse, intubés et portant de multiples sondes; 2) Plasticité cérébrale: celle-ci apparaît au cours du développement cérébral ce qui nécessite de travailler de façon longitudinale sur le cerveau entier. L'analyse à long terme des altérations comportementales, histologiques et neurochimiques et de la neuroprotection, nécessite de travailler sur l'animal au stade juvénile, adolescent et adulte; 3) Interactions intercellulaires: les altérations tissulaires induites par l'HI à P5 ciblent préférentiellement, mais pas seulement, la substance blanche cérébrale produite par les oligodendrocytes (OL). La prolifération, la migration et la différenciation des OL sont vasculo-dépendantes et fonction de l'activité neuronale. Une approche intégrée est donc indispensable dans le cadre de ce projet.

Réduction

Nous aurons 8 groupes de souris : 4 groupes contrôles et 4 groupes ayant subi une chirurgie. Chez les contrôles, comme chez les opérés, nous testerons les effets de deux traitements A et B, séparés ou combinés. Notre modèle de chirurgie reproduit les variabilités interindividuelles rapportées en clinique, nous contraignant à avoir des effectifs importants par groupe. Notre modèle chirurgical reproduit également les variabilités sexuelles rapportées en clinique. Dans un 1er temps, les groupes d’animaux seront constitués sans différencier les sexes. Ce n'est que dans le cas où des différences intersexuelles sembleraient apparaitre que le dédoublement des groupes sera fait afin de pouvoir analyser statistiquement les potentiels effets sexe. Les mêmes animaux réaliseront à la fois les études comportementales à court et à long terme et leur cerveau sera prélevé pour les études histologiques et/ou neurochimiques. Les données obtenues chez les groupes contrôles pourront être utilisées pour la mise au point de protocoles afin d'éviter l'utilisation d'animaux supplémentaires.

Raffinement

Les chirurgies réalisées à 5 jours de vie seront effectuées dans une pièce isolée, au calme, avec seulement un ou deux manipulateurs expérimentés présents. La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale. On pratique une hyperoxygénation avant anesthésie. Un analgésique sera injecté. Le souriceau sera maintenu sur une couverture thermique. Après la chirurgie, les souriceaux seront remis dans leur cage avec la mère dans un environnement calme permettant la nidification et les soins maternels et stabilisé. Les comportements des souriceaux et de la mère seront observés très attentivement et ceci de façon répétée pendant les 24 premières heures post-chirurgie. Un suivi post-opératoire quotidien sera réalisé : suivi du poids des animaux, observation de leur apparence, vérification de l'accès aux mamelles, léchage des petits. Chez l'adulte, l'indice de grimace facial sera utilisé pour évaluer le niveau de douleur et le comportement de l'animal sera régulièrement observé.

Choix des espèces

La Souris est une espèce couramment utilisée en Neurosciences. L’espèce est prolifique (cycle de reproduction court (21 jours)), à faible coût d’élevage, utilisée abondamment dans la bibliographie scientifique. Une Hypoxie-Ischémie (HI) réalisée chez la Souris à 5 jours de vie permet d'induire des lésions cérébrales similaires à celles observées dans le cerveau de certains enfants nés entre 24 et 32 semaines d'aménorhée. Ce modèle expérimental permet également de reproduire les différences intersexuelles observées en clinique. Les souris NMRI étant non consanguines, les données obtenues sont plus proches de ce que l'on observe chez l'Humain. L'inconvénient est que cela est à l'origine d'une plus forte variabilité interindividuelle que chez des souris consanguines, ce qui nécessite des effectifs plus importants pour le traitement statistique des données. Les souriceaux seront utilisés : - durant les deux premières semaines de vie (le stade de 5 jours de vie chez le souriceau correspond au stade 24-32 semaines d’aménorrhée chez l’Humain au cours duquel la substance blanche est particulièrement vulnérable). Durant ces deux premières semaines, des tests sensorimoteurs seront réalisés ainsi que des études histologiques et/ou neurochimiques. Le sevrage sera réalisé à 21 jours de vie si le poids corporel est supérieur à 10 grammes. - puis à l’adolescence (P30-P45), - puis à l’âge adulte (60 à 90 jours). Ce sont souvent les mêmes souriceaux qui seront utilisés aux différents âges car de potentielles corrélations seront recherchées entre d'une part les déficits comportementaux discrets et les altérations histologiques observés à long terme et d'autre part les altérations comportementales discrètes observées à court terme. Les souris femelles non utilisées dans le projet pourront être mises en reproduction, si besoin, à partir de l'âge de 8 semaines et pour une durée maximale de 6 mois. Entre le sevrage d'une portée et le prochain accouplement, un repos d'une durée de 14 jours est respecté pour les mères. Les pères seront mis en reproduction à partir de 8 semaines pour une durée totale de 1 an.

438 souris vont être utilisées, en majorité tuées à l'issue et dix-huit femelles réutilisées comme reproductrices, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les phalanges sont tatouées ou amputées pour l'identification et le génotypage, une hypothyroïdie est induite pendant trois semaines par l'alimentation, y compris chez des femelles gestantes, ce qui ralentit la croissance des souriceaux. La plupart des animaux sont ensuite mis à mort après un prélèvement de sang à la veine cave ou une perfusion de fixateur dans le cœur, pour prélever le cerveau. Le porteur cherche à identifier les gènes cibles de l'hormone thyroïdienne dans l'hypothalamus et affirme qu'aucun modèle in vitro pertinent n'existe pour cette structure.

Objectifs

L'hormone thyroïdienne est primordiale pour le bon fonctionnement de l'organisme, autant pendant le développement foetal que pendant la vie adulte. Elle régule notamment le neurodéveloppement durant la vie foetale, et le maintien de fonctions vitales, comme la production de chaleur par le corps, à l'âge adulte. L'ormone thyroïdienne agit dans presque tous les tissus de l'organisme. Les perturbations de cette signalisation entraînent des conséquences délétères sur la santé des individus : hypothyroïdie, problèmes de développement cérébral, déficit intellectuel... L'hormone thyroïdiennes agit en activant ou en inhibant la transcription de gènes cibles. Toutefois, ces gènes-cibles sont globalement mal connus et ne sont pas les mêmes d’un tissu à l’autre. Le manque de compréhension des mécanismes d’action de l'hormone thyroïdienne freine le développement de traitements adaptés aux différentes pathologies associées. Ce projet consiste à déterminer les gènes cibles de l'hormone thyroïdienne dans l’hypothalamus chez la souris, à la fois chez le jeune et chez l'adulte. Cette aire cérébrale représente un élément essentiel du contrôle des fonctions physiologiques. L’influence qu’y exerce l'hormone thyroïdienne est importante, mais la façon dont cette influence s’exerce, c’est-à-dire la nature des gènes-cibles de l'hormone, est très peu connue.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à faire avancer les connaissances fondamentales dans un domaine dans lequel beaucoup d’inconnues persistent. Il devrait permettre d’effectuer une distinction fondamentale entre les processus développementaux et les régulations physiologiques contrôlés par l'hormone thyroïdienne dans l’hypothalamus. À terme on peut en attendre les bénéfices suivants : - une compréhension des liens qui existent entre différents phénomènes qui dépendent de l'hormone thyroïdienne dans l’hypothalamus : le déclenchement de la puberté, la perception des saisons, la régulation de l'activité de la glande thyroïde... - des hypothèses innovantes pour des traitements pharmacologiques de l’obésité. L'hormone thyroïdienne donnée en excès est capable d’augmenter la dépense calorique et de provoquer une perte de poids. Un tel traitement reste cependant inenvisageable en raison de ses effets secondaires majeurs (fonte de la masse musculaire et tachycardie). Si nous parvenons à identifier un type cellulaire de l’hypothalamus dans lequel l'hormone thyroïdienne exerce un effet favorable, il sera possible de cibler ces cellules pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques de lutte contre l'obésité, en évitant les effets indésirables sur d'autres organes.

Procédures

Les souris utilisées à l'âge adulte seront identifiées individuellement par tatouage des phalanges à l'âge de 10-12 jours (geste < 1 minute). Une biopsie de queue (< 20 secondes) sera réalisée le même jour sur ces animaux pour pouvoir réaliser des analyses génétiques. Les souris utilisées à l'âge de 15 jours seront identifiées entre 5 et 7 jours d'âge par prélèvement d'une phalange distale sur un ou deux doigts (< 1 minute). Ces prélèvements permettront également de réaliser des analyses génétiques. Des souris adultes seront nourries pendant 3 semaines avec un aliment contenant un médicament qui bloque la fonction de la glande thyroïde et induit une hypothyroïdie. Ce traitement pharmacologique prolongé n’a pas d’effet flagrant chez les adultes, mais peut causer une légère perte de poids. Des mères gestantes seront également nourries avec cet aliment, à partir du 10ème jour de gestation et jusqu'à 15 jours après la mise bas. Ce traitement provoque chez les souriceaux en développement un net ralentissement de la croissance pondérale après la naissance. Des souris adultes et des souriceaux âgés de deux semaines précédemment rendus hypothyroïdiens recevront une injection unique d'hormone thyroïdienne (< 20 secondes). Certaines souris recevront également une injection (< 20 secondes) d'un marqueur de prolifération cellulaire, 24h avant leur mise à mort. En fin de procédure, les souris seront profondément anesthésiées (par injection de médicaments, < 20 secondes), après injection d'un analgésique (< 20 secondes). Sur une partie d'entre elles, nous réaliserons un prélèvement sanguin à la veine cave (2-3 minutes), puis elles seront mises à mort sous anesthésie. Sur les autres souris, une procédure chirurgicale sera employée (durée < 10 minutes) pour injecter dans le coeur un produit qui permet d'assurer une bonne conservation de la structure du cerveau, pour la réalisation d'analyses histologiques. Ces souris seront également mises à mort sous anesthésie après la procédure chirurgicale.

Impact sur les animaux

Les actes liés à l'identification des souris et aux biopsies pour analyses génétiques (tatouage des phalanges, biopsie de queue ou de phalange) induisent une douleur aigüe temporaire. Chez la souris adulte, nous induirons une hypothyroïdie temporaire, qui a un effet modéré et réversible. Cela se traduit par une perte de poids modérée (inférieure à 10% du poids initial) et une légère baisse d’activité, qui n'est pas détectable de façon évidente, mais qui peut être mesurée en utilisant des tests comportementaux dédiés. Par analogie avec les données médicales humaines, on peut supposer une fatigue générale. Le médicament utilisé donne un goût amer à l'aliment, ce qui limite la prise de nourriture par les souris. L’induction d'une hypothyroidie au cours de la gestation a des effets significatifs sur le développement des petits. Toutefois, notre expérience passée montre que le degré d’hypothyroïdie atteint dans nos conditions expérimentales ne compromet pas la survie des souriceaux, le seul effet notable étant un retard de croissance (10-15 % de retard pondéral par rapport aux souris témoins). L'injection d'hormone thyroïdienne induit une douleur temporaire liée à l'injection mais ne provoque pas d’inflammation ni d'altération notable du bien-être animal. Le prélèvement d'un grand volume de sang sous anesthésie générale, ainsi que l'injection d'un produit fixateur dans le coeur, également sous anesthésie générale, n'induisent pas de douleur et sont systématiquement suivis de la mise à mort des souris.

Devenir

420 souris de ce projet seront mises à mort pour prélèvement de leur cerveau. Les femelles utilisées pour mettre au monde des souriceaux pourront être gardées et réutilisées comme reproductrices au sein de l'animalerie, après une période de récupération d'au moins 2 semaines pour les femelles qui auront reçu l'aliment induisant une hypothyroïdie.

Remplacement

L’hypothalamus est une structure neurale pour laquelle il n’existe aucun modèle in vitro pertinent. Le recours aux cultures primaires n'est possible pour quelques types cellulaires. Nous avons mesuré la réponse à l'hormone thyroïdienne de cultures primaires de certaines cellules de l’hypothalamus, mais il n’est pas encore démontré qu’elle soit comparable à leur réponse in vivo. Il n’existe pas de situations qui permettraient de prélever des tissus provenant de patients hypothyroïdiens ayant reçu un très court traitement hormonal pour évaluer les modifications d'expression de gènes induites par l'hormone thyroïdienne dans l'hypothalamus.

Réduction

Les méthodes prévues pour l'analyses du tissu cérébral ont été optimisées pour être applicables avec des quantités minimes de matériel. Pour les études impliquant un séquençage des ARN , notre expérience passée montre que des lots de 6 animaux minimum (3 mâles + 3 femelles) sont requis pour garder une marge de sécurité. L’analyse statistique est effectuée à l’aide d’une méthode dédiée capable de mettre en évidence des différences mineures avec des effectifs très faibles en prenant en compte une interférence possible entre la réponse hormonale et le sexe des animaux. Toutefois, ces méthodes peuvent conduire à l’élimination occasionnelle d’un échantillon en raison de problèmes techniques. Des animaux surnuméraires permettent également de réaliser des expériences de confirmation (analyse ciblée sur certains gènes identifiés comme intéressants par l'analyse globale). Le nombre de femelles nécessaire pour générer les souriceaux pour l'étude du développement du cerveau a été déterminé sur la base de l'obtention d'environ 6 souriceaux par portée. Nous réutiliserons les femelles pour plusieurs portées. Notre estimation prévoit également de possibles problèmes de reproduction (interruption de gestation, mortalité des souriceaux...).

Raffinement

Les souris adultes et juvéniles seront observées et pesées régulièrement pendant toute la durée des procédures. En cas d'approche d'un point limite par l'un des animaux, la surveillance sera réalisée quotidiennement. Chaque femelle sera utilisée au maximum pour 2 gestations sous traitement hypothyroïdien, avec une période de repos d'au moins 15 jours (alimentation normale) entre la mise à mort des petits et la nouvelle mise en reproduction. En fin de procédure, les souris seront profondément anesthésiées pour éviter toute douleur liée au prélèvement sanguin ou à la perfusion intracardiaque de fixateur. Elles recevront également un analgésique 30 minutes avant induction de l'anesthésie.

Choix des espèces

Le recours à des outils génétiques performants et la spécificité du métabolisme énergétique des espèces homéothermes impose le choix de la souris comme modèle. Le mode d’action de l'hormone thyroïdienne, ainsi que la structure des récepteurs, sont similaires chez l’homme et la souris. Des adultes âgés de 2 à 4 mois seront utilisés pour étudier le rôle de l'hormone thyroïdienne dans l'hypothalamus chez l'adulte. La maturation de l’hypothalamus est considérée comme terminée à l’issue de la puberté. Des juvéniles traités indirectement (via la mère) dès le 10ème jour de vie foetale et âgés de 15 jours en fin de procédure seront utilisés pour étudier le rôle de l'hormone thyroïdienne au cours du développement de l'hypothalamus.