Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etude d’efficacité d’un extrait de raisin chez le chien adulte sain
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
18 chiens adultes en bonne santé vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réaffectés à d'autres projets. Ils reçoivent quotidiennement dans leur alimentation un extrait de raisin, produit commercial déjà autorisé pour les animaux d'élevage, et subissent deux prises de sang, l'objet étant de démontrer que ce complément améliore leurs paramètres anti-oxydants. Le porteur relie l'étude au concept "One Health" et à une future option nutritionnelle pour les chiens en surpoids. Il indique qu'aucun remplacement n'est envisageable puisque le chien est "l'espèce cible" du produit.
Objectifs
L’extrait de raisin, objet de cette étude, est un produit commercial qui possède déjà une autorisation de vente et dont les cibles actuelles sont les animaux d’élevage et d’aquaculture. Ce produit est un mélange d’extraits de pépins de raisin riches en proanthocyanidines et d’extraits de peau de raisins riches en anthocyanes. Les bénéfices anti-oxydants de cet extrait ont déjà été validés chez les animaux d’élevage. Cette étude a pour but de montrer que cet extrait peut également protéger efficacement les chiens contre le stress oxydatif. L'objectif du projet est donc de valider l'efficacité de l’extrait de raisin chez le chien adulte sain, c’est à dire s'assurer que celui-ci permet d'améliorer les paramètres anti-oxydants sanguins.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait apporter une nouvelle option nutritionnelle pour la gestion du stress-oxydant chez le chien qu'il soit un animal de propriétaire, un animal de chenil ou un animal d'élevage et ainsi contribuer au concept One Health.
Procédures
Les chiens recevront l'extrait de raisin dans leur alimentation quotidiennement durant la durée de l'étude et deux prises de sang seront réalisées sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Une baisse de l'acceptation de l'aliment peut être envisagée mais la quantité d'extrait est tellement faible et homogène dans l'aliment que cela ne doit pas avoir d'impact sur la consommation de la ration. Les prises de sang constituent une nuisance attendue à cause du stress de la contention et mais les animaux sont habitués à la procédure de contention permettant la réalisation de celles-ci dans les meilleurs conditions de rapidité et de bien-être de l'animal.
Devenir
Les animaux pourront soit être réintégrés à un projet dont la demande d'autorisation est encore en cours soit intégrés dans un nouveau projet.
Remplacement
Aucun remplacement n'est envisageable dans la mesure où le chien est l'espèce cible.
Réduction
Cette étude est un projet préliminaire qui permettra une fois l'efficacité établie sur un petit nombre d'animaux sains, d'envisager de montrer des effets positifs de l'extrait sur des animaux souffrant de désordres métaboliques liés au surpoids. La taille des groupes proposée est celle minimale basée sur notre expérience, permettant d’obtenir des résultats reproductibles et d’assurer la robustesse des analyses statistiques (tests statistiques non paramétriques Mann-Whitney).
Raffinement
Cette étude ne limite pas les sorties des animaux en laisse et leur sociabilisation. Ils peuvent de plus continuer à vivre en groupe (2 chiens dans un box de 4 m2 avec présence d'une niche chauffée et de jeux type kong ou ballon). Ils ont accès à l’eau à volonté. Lors de la prise des repas, les animaux sont attachés dans leur box et ne peuvent ainsi consommer que la ration qui leur est présentée. Ils sont amenés, en laisse, de leur box jusqu’à la salle de prélèvement se trouvant dans le même bâtiment.
Choix des espèces
Le chien est l'espèce cible de l'extrait testé. Les animaux utilisés seront adultes, car ils sont les cibles de l'utilisation de cet extrait (stade de développement le plus susceptible d'être sujet à l'embonpoint).
Etude de l’interaction neurone-microglie et son lien avec la fonction motrice dans un modèle murin inflammatoire de sclérose en plaques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une encéphalite auto-immune leur est induite par injection pour reproduire une sclérose en plaques, provoquant troubles de la marche, faiblesse musculaire et perte de poids, avant une série de tests moteurs sur couloir filmé, grille d'agrippement et tapis roulant. Le porteur veut mesurer si un entraînement physique modéré module le dialogue entre neurones et microglie et favorise la rémyélinisation, les applications pour les patients restant formulées au conditionnel. Il indique travailler d'abord sur des modèles in vitro et ex vivo, mais conclut que le modèle murin est "ultimement nécessaire".
Objectifs
La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire, démyélinisante et dégénérative du système nerveux central et la première cause d’handicap neurologique non traumatique chez les jeunes adultes. Dans cette maladie, on observe des phases de démyélinisation dans lesquelles l’organisation des fibres myélinisées est altérée, conduisant à des déficits fonctionnels chez les patients. Un mécanisme de réparation existe, mais il est incomplet et très variable selon les patients. Les cellules microgliales, cellules immunes du système nerveux central sont activées précocément lors de la démyélinisation et participent à la réparation de la gaine de myéline. La microglie contacte par ailleurs les neurones et cette interaction peut influencer positivement la réparation post-démyélinisation. Dans ce projet nous souhaitons étudier le lien potentiel entre les interactions microglie-neurones et l’évolution du déficit moteur dans un modèle murin de sclérose en plaques. Nous voulons de plus évaluer comment un entrainement physique d’intensité modérée durant la phase de réparation pourrait influencer les interactions microglie-neurones et ainsi moduler la rémyélinisation.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des interactions neurones-microglie dans la sclérose en plaques. La mise en évidence d’effets bénéfiques de l'activité physique sur la réparation via une modulation directe du dialogue neurone-microglie pourrait permettre d'envisager des stratégies thérapeutiques visant à limiter la progression du handicap chez les patients.
Procédures
Les animaux sont entrainés à effectuer des tests comportementaux non invasifs durant une semaine (sessions de maximum 10 min/jour par animal). Ensuite, nous immunisons les souris pour induire l’encéphalite expérimentale auto-immune, le model murin inflammatoire de sclérose en plaques. Le jour de l’induction deux types d’injections sont nécessaires, en injection sous-cutanées et par voie intrapéritonéale. Afin de minimiser le stress et la douleur liée à l’induction de l’encéphalite autoimmune experimentale, les animaux sont préalablement anesthésiés par anesthésie gazeuse, qui est rapidement réversible (durée totale d'anesthésie et du geste 10 minutes/animal). Les animaux ayant déclenché la maladie seront amenés à effectuer de nouveaux les tests comportementaux non invasifs auxquels ils étaient préalablement entrainés. Durant ces tests, les animaux seront amenés à marcher dans des couloirs équipés d’une caméra ou de capteurs mesurant automatiquement les caractéristiques de la marche, agripper une grille avec les quatre pattes pour mesurer la force musculaire ou marcher sur un tapis roulant. Tous les tests ont une durée courte (maximum 10 min/session) avec des intervalles de repos de minimum 2 heures par souris et n’entrainent pas de stress émotionnel ou physique pour les animaux. Les animaux sont euthanasiés en fin d’étude par une méthode réglementaire pour réaliser différents prélèvements tissulaires.
Impact sur les animaux
Nous étudions un modèle murin de démyélinisation inflammatoire, l’encéphalite auto-immune expérimentale, fréquemment utilisé pour étudier la sclérose en plaques. Après immunisation, les souris peuvent développer des troubles de la marche, de la coordination, une faiblesse musculaire et une perte de poids. Ces symptômes s’installent progressivement sur 3-5 jours suivis d’une récupération partielle ou complète. Aucun autre effet délétère n’est attendu chez les animaux en rapport avec les tests fonctionnels et l’activité physique mais une fatigue et un stress léger sont possibles. L’anesthésie gazeuse mise en place pour minimiser le stress lié à la manipulation des souris et la douleur des injections sous-cutanées étant très courte (2 à 3 minutes), le risque de défaillance cardio-respiratoire est infime.
Devenir
Des prélévements et analyses sont réalisés post mortem, ce qui implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux
Remplacement
Dans un effort de remplacement, nous travaillons en première approche avec des modèles in vitro et ex vivo. Les modèles murins in vivo sont ultimement nécessaires pour l’étude fondamentale de la sclérose en plaques, car ils permettent d'étudier la démyélinisation et la remyélinisation dans un contexte intégré, impliquant des interactions entre tissus nerveux, effecteurs de l’immunité circulante et apports métaboliques par le réseau sanguin, qui sont des composantes importantes de cette pathologie.
Réduction
Des approches statistiques permettront d’optimiser le nombre d’animaux utilisés, estimés à 150, après des expériences pilotes, et de ne pas sur-dimensionner le nombre d’animaux étudiés lors de nos expériences : ce nombre sera calculé pour chaque groupe d’expériences à l’aide d’un calcul de puissance après utilisation initiale de 8 à 10 animaux par condition, selon l’expérience considérée. Des tests paramétriques, des tests de corrélation et de régression linéaire seront utilisés pour l’analyse statistique des résultats obtenus, adaptées à chaque expérience et réalisées en partenariat avec des biostatisticiens.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe, dans un environnement à température et d’hygrométrie contrôlées, avec cycle diurne-nocturne de 12h. L’eau et la nourriture sont fournies à volonté. Les animaux sont examinés quotidiennement par les expérimentateurs, sous la supervision de la structure bien être animal du vétérinaire désigné. Un environnement enrichi est fourni aux animaux, comprenant nidification (carré de coton, kraft), cachette (maisonnette, dôme) et/ou bâtonnet à ronger. Les animaux sont manipulés uniquement par un personnel qualifié et sensibilisé au bien-être animal. Nous mettons en place des points-limites définis en accord avec le vétérinaire ainsi qu’un suivi quotidien par l’équipe de recherche pour éviter la souffrance de l’animale. Afin de minimiser le stress et la douleur liée à l’induction de l’encéphalite autoimmune experimentale, les animaux sont préalablement anesthésiés par anesthésie gazeuse, qui est rapidement réversible (durée totale d'anesthésie et du geste 10 minutes/animal). Concernant les tests comportementaux, les animaux ont des phases d’habituation et de repos adaptés aux différents tests effectués.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et sa génétique sont bien connues et sont relativement proches de l'Homme. Le modèle d’encéphalite autoimmune expérimentale chez la souris est un modèle classique de sclérose en plaques, permettant de reproduire en partie l’aspect inflammatoire observé chez les patients, et qui apporte une approche intégrée des déficits observés dans la pathologie. Des animaux adultes C57BL6, âgés de 10-12 semaines au moment de l’induction de l’encéphalite autoimmune expérimentale seront utilisés pour cette étude. L’âge adulte est requis pour pouvoir induire l’encéphalite autoimmune expérimentale et faire les tests comportementaux envisagés. L’usage de jeunes adultes reproduit par ailleurs bien les conditions d’initiation de la sclérose en plaques chez l’humain et limite les risques d’artefacts liés au vieillissement de l’animal.
Etude de la maturation du BDNF dans les plexus choroïdes de souris.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
92 souris vont être utilisées, opérées sous anesthésie puis tuées avant tout réveil. Elles reçoivent une injection intraveineuse d'une protéase fluorescente, le tPA recombinant, avant un prélèvement de liquide cérébro-spinal, un prélèvement de sang intra-cardiaque et l'extraction du cerveau, une partie servant d'abord à un apprentissage de la pose de cathéter. L'objet est de comprendre si les plexus choroïdes participent à la maturation du BDNF, les retombées pour les patients victimes d'accident vasculaire cérébral ou de sclérose en plaques restant renvoyées à un horizon thérapeutique lointain. Le porteur affirme le "caractère de stricte nécessité" du recours aux souris et l'impossibilité d'un remplacement.
Objectifs
Les plexus choroïdes, structures cérébrales dont le principal rôle est de produire le liquide cérébro-spinal (LCS), sont aussi capables de sécréter de nombreux facteurs neurotrophiques dont le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF). Le BDNF existe sous sa forme précurseur (pro-BDNF) ou, après protéolyse, mature (mBDNF). Malgré leur localisation parfois commune, le mBDNF et le pro-BDNF se distinguent parfois dans leurs (dys)fonctions neurologiques. Différentes protéases semblent capables de réaliser la maturation du pro-BDNF en mBDNF, notamment l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA). Le tPA est une protéase synthétisée par les cellules endothéliales, puis libérée dans la circulation sanguine pour favoriser la fibrinolyse, grâce à sa capacité à activer le plasminogène en plasmine. Il est également sécrété par les neurones et par d’autres types cellulaires du système nerveux, tels que les astrocytes, la microglie et les oligodendrocytes. Par ses propriétés fibrinolytiques, le tPA recombinant (rtPA) est le seul traitement pharmacologique de la phase aigüe des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques. En plus de participer à la maturation du BDNF, l’ARNm (acide ribonucléique messager) du tPA est parfois retrouvé dans les mêmes régions cérébrales que celui du BDNF. De plus, le tPA et le BDNF sont présents dans les mêmes vésicules au niveau des neurones, co-transportés et co-libérés par les dendrites neuronales. Le tPA a précédemment été identifié dans les plexus choroïdes, suggérant également une synthèse endogène de cette protéase dans ces structures. De plus, le tPA vasculaire peut être transporté par des vésicules à travers les plexus choroïdes. Ainsi l’objectif de cette étude est de determiner si les plexus choroïdes peuvent être une zone de maturation et de libération de BDNF et si le tPA (endogène ou exogène) est un acteur de la maturation et/ou de la sécrétion de BDNF dans le LCS par des approches in vivo chez des souris entièrement déficientes en tPA (tPANull) et des souris contrôles (tPAWT).
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va permettre d’acquérir des données fondamentales sur la maturation du BDNF dans les plexus choroïdes et sa modulation potentielle par le tPA à des fins thérapeutiques. En effet, une meilleure compréhension de la maturation du BDNF nous aidera d’une part à évaluer le potentiel effet du tPA vasculaire, et d’autre part, à envisager d’améliorer les performances de patients dans des conditions pathologiques, par le couple pro/m-BDNF.
Procédures
L'unique procédure réalisée, consistera en une injection intraveineuse de tPA recombinant couplé à un fluorochrome chez des souris entièrement déficientes en tPA et des souris contrôles, pour suivre son passage du compartiment vasculaire vers le parenchyme cérébral et détecter sa présence en immunohistochimie à différents temps. De même, du LCS et du sang seront prélevés pour réaliser diverses études protéiques et transcriptomiques. - Souris Swiss : phase d’apprentissage (Pose d’un cathéter veineux et prélèvement intra-cisternal de LCS). - Souris contrôles : injection I.V saline ou rtPA. - Souris déficiente : injection I.V saline ou rtPA. Mise à mort des souris de la phase d’apprentissage, immédiatement après le prélèvement intra-cisternal. Mise à mort des souris contrôles/déficientes à différents temps post injection : +10 minutes, à +30 minutes et à +60 minutes. Pour chaque animal : un prélèvement de LCS sera effectué, puis un prélèvement de sang en intra-cardiaque et enfin le cerveau sera extrait.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient pour cette procédure sans réveil : du stress lié à la manipulation des animaux.
Devenir
Les souris seront mises à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies humaines (AVC, SEP, inflammation).
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Ainsi, la procédure expérimentale décrite dans ce projet a un caractère de stricte nécessité et ne peut pas être remplacée par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de l'aisance des expérimentateurs. L’ensemble des échantillons collectés permettra un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards aux normes. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permettra de détecter tous signes cliniques de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront également placés dans un environnement enrichi : coton, paillettes, petite maison. Les animaux seront pesés tous les jours et mis à mort si une perte de poids de plus de 20% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques suivant l’approche chirurgicale. Tout le matériel et les consommables utilisés seront neufs (comme les seringues et aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques). Durant l’ensemble des procédures, les souris seront sous anesthésie générale (et sous anesthésie locale. Les yeux seront couverts afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir leur déshydratation.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des AVC et les techniques employées sont bien connues et maitrisées dans notre équipe. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend donc cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Concernant l’ensemble des procédures, les souris utilisées seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature.
Examens IRM sur modèles rongeurs en provenance d’établissements utilisateurs extérieurs
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 200
600 rongeurs, 400 souris et 200 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal peut subir jusqu'à six examens d'IRM sous anesthésie gazeuse de quatre heures, parfois avec injection d'un produit de contraste au gadolinium, le porteur signalant un risque de non-réveil après la narcose. Il s'agit d'un service de plateforme mutualisant un appareil d'imagerie pour des équipes extérieures, chaque animal étant ensuite réintégré au protocole autorisé dont il relève, où les procédures se poursuivent. Le porteur affirme qu'aucune approche in vitro ou in silico ne permet d'étudier le cerveau entier et présente l'IRM répétée comme un moyen de réduire le nombre d'animaux.
Objectifs
L'imagerie par résonance magnétique (IRM) du petit animal est une technique non invasive et non destructive des tissus in vivo. Elle permet l'étude longitudinale et tri-dimensionnelle notamment du cerveau normal et pathologique. Les divers types de contrastes et de modalités structurelles, fonctionnelles et spectroscopiques font de l'IRM une technique de choix pour la recherche en neurosciences expérimentales. Les applications de l'IRM expérimentale sont notamment le phénotypage d'une cohorte d'animaux, le suivi longitudinal de la progression d'une maladie ou d'un traitement thérapeutique, la validation de nouveaux biomarqueurs d'imagerie. Une IRM à très haut champ magnétique ainsi que des antennes dédiées à l’imagerie du cerveau de souris et de rat sont des déquipements de pointe qui peuvent apporter des informations déterminantes dans des projets scientifiques variés impliquant le petit animal via l’utilisation d’un large spectre de protocoles d’imagerie standards mais aussi avancés et innovants. Ce projet a pour but de faciliter la mise en place de collaborations avec des équipes externes pour réaliser des études d’imagerie IRM sur des modèles rongeurs de diverses pathologies ou des modèles de rongeurs sains afin d’investiguer des questions plus fondamentales sur le fonctionnement cérébral. Pour atteindre cet objectif, des expériences sur animaux anesthésiés doivent être menées.
Bénéfices attendus
Ce projet présente des bénéfices scientifiques à long terme aussi bien pour la plateforme que pour les équipes utilisatrices. Du point de vue scientifique, il permet d’intégrer de nouvelles données d’imagerie pour répondre à une question scientifique précise (expliquée dans les projets scientifiques autorisés par le ministère de l’étude concernée) et aider à la compréhension de pathologie humaine sur les modèles animaux en vue d’un traitement thérapeutique ou de l’aide au diagnostic. D’autre part, dans le cas d’étude longitudinale l’imagerie par résonance magnétique (IRM) présente un grand intérêt en réduisant le nombre d’animaux.
Procédures
Les animaux, 600 au total incluant 400 souris et 200 rats, seront soumis à des examens d'imagerie par résonance magnétique (IRM) sous anesthésie gazeuse avec ou sans injection intraveineuse dans la veine de la queue d’un agent de contraste à base de gadolinium selon le besoin de l’étude. La procédure IRM dure 4h maximum (de l’induction de l’anesthésie au réveil de l’animal). Les examens pourront être répétés au maximum 6 fois sur le même animal avec un délai de 72h minimum de récupération.
Impact sur les animaux
Différents risques sont identifiés : (i) Risques liés à l’anesthésie: stress thermique (hypothermie), difficultés cardio-respiratoires, non récupération de la vigilance suite à la narcose ; (ii) Risques liés à l’injection intraveineuse de produit de contraste : douleur au point d’injection , hématome, saignement possible très localement ; (iii) Risques liés au transport (stress) lors du changement d’établissement utilisateur.
Devenir
A l’issue des examens IRM (imagerie par résonance magnétique), les animaux seront réintégrés dans leur hébergement d’origine pour réaliser les procédures décrites dans le projet scientifique global autorisé par le ministère de l’étude concernée. Les examens IRM ne couvrent qu'une étape dans le cadre du projet scientifique global. Il s'agit ici d'une utilisation continue des animaux et non d'une réutilisation car les animaux ne peuvent être remplacés par d'autres. Ils sont inclus dans un projet scientifique global autorisé par le ministère et subissent une suite de procédures (avant et après les examens IRM) décrites dans le projet global.
Remplacement
Il n’existe pas d'alternatives (études in vitro, in silico ou sur animaux invertébrés) qui permettent d’étudier des mécanismes cellulaires, moléculaires, métaboliques complexes à l’échelle global du cerveau. Le rongeur est une des espèces les plus appropriées pour les études d'imagerie par résonance magnétique (IRM) dans un contexte neurologique, d’autant plus que l’IRM permet l’étude longitudinale des paramètres d’intérêt de façon non invasive.
Réduction
600 animaux au total sont inclus dans le projet dont 400 souris et 200 rats. Le nombre d’animaux est réduit au maximum. Des études pilotes et tests statistiques ont préalablement étaient réalisés pour estimer le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une puissance statistique satisfaisante pour chaque étude. Les tests statistiques seront dépendants des différentes études qui auront une phase d’imagerie dans leurs protocoles.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans leur établissement utilisateur avec les mesures de raffinement et conditions d’hébergement décrites dans projet initial autorisé par le ministère. Les animaux sont transportés de leur lieu d’hébergement initial vers le laboratoire au calme dans une cage adaptée avec de la nourriture, de l’eau à dispositions des animaux ainsi que l’enrichissement mis en place dans leur hébergement d’origine. L’arrivée se fait au niveau du quai de livraison où l’expérimentateur réalisant les IRM (imagerie par résonance magnétique) amène les animaux dans la pièce de préparation à l’aide d’un chariot en empruntant un monte charge. Les animaux sont laissés dans leur cage pendant 30 min à 1h dans la pièce de préparation, et une vérification de l’état des animaux (état du poil, comportement dans la cage, position des oreilles et du museau) est réalisée à la fois par l’expérimentateur réalisant les IRM et une personne responsable des animaux de l’établissement extérieur. La tête des animaux est maintenue immobile par un système de contention (barres d’oreille et mors à dent) intégré au berceau. Un anesthésique local est appliqué au niveau des points d'appui des barres d'oreilles, un gel ophtalmique est appliqué pour limiter la déshydratation oculaire. De la vaseline sera également appliquée avant d’introduire la sonde rectale. Tout au long de l’examen IRM (4h maximum), la profondeur de narcose et la température interne de l'animal sont contrôlées. La procédure sera immédiatement arrêtée et l’animal sorti pour vérification en cas de souffrance/angoisse chez les animaux pendant l’IRM, repérée par : une respiration anormale (trop rapide ou trop basse malgré l'ajustement d'anesthésique) ou une température anormale (trop élevée ou trop basse malgré l'ajustement de la consigne de température du bain marie ou de la modification de l’anesthésie). Nous accorderons également une grande importance à la période de réveil (chambre thermostatée, stimulation régulière de l’animal). Une personne référente des animaux à imager sera présente de façon à guider l’expérimentateur qui réalise l’IRM et à contrôler au mieux l’anesthésie de l’induction au réveil complet de l’animal.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les principales espèces utilisées sur notre plateforme, leur taille permet de les utiliser dans ce type de machine pour acquérir des séquences capables de donner des détails anatomiques et fonctionnels qui contribue à répondre aux questions scientifiques posées. De plus, les rongeurs permettent l’étude de comportements complexes et de nombreux modèles de rongeurs génétiquement modifiés sont développés pour mimer des pathologies humaines. En raison de sa taille, le rat possède un cerveau plus facile à imager (plus gros). Il est donc plus facile d’obtenir un meilleur signal chez le rat, notamment dans des zones cérébrales de petite taille. Cependant, de nombreuses pathologies cérébrales sont préférentiellement induites et étudiées chez la souris que nous pouvons imagées plus aisément avec des antennes adaptées. Le stade de développement sera décrit dans le projet initial autorisé par le ministère de l’étude concernée. L’âge minimum requis pour passer un examen par imagerie par résonance magnétique (IRM) est fixé à 3 semaines (rats et souris confondus), en raison des contraintes de berceau IRM que nous possédons à la plateforme IRM et de l’anesthésie gazeuse qui sera optimale sur des animaux sevrés qui ont acquis une capacité respiratoire suffisante. De même pour la récupération, elle sera plus facile si on travaille sur des animaux qui sont sevrés.
Développement d’outils pour la thérapie des cancers de la prostate résistants à la castration
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 530 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous la peau de cellules tumorales de prostate humaine, 180 d'entre elles subissant en outre une castration, avant l'administration répétée de composés de thérapie génique pendant onze semaines et le prélèvement terminal du sang et des tumeurs. Le porteur décrit une technologie "prometteuse" relevant de la médecine de précision, dont les bénéfices pour les patients sont renvoyés au futur, l'étape immédiate étant de mesurer l'efficacité de composés déjà criblés in vitro. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode ne peut se substituer à la souris pour cette phase préclinique.
Objectifs
Le cancer de la prostate est l'un des cancers les plus courants dans les pays développés. Les patients atteints d'un cancer localisé peuvent être traités par chirurgie ou radiothérapie, tandis que la castration est utilisée comme traitement initial pour les patients atteints d'une maladie avancée. Bien que la plupart des patients répondent initialement à cette thérapie hormonale, une résistance peut apparaître dans les deux ans, ce qui signifie que le cancer de la prostate devient résistant à la castration. Les chimiothérapies actuelles ne permettent qu'une survie de 12 à 18 mois, provoquant 9000 décès par an et faisant de ce cancer l’un des plus mortels. Par conséquent, il est nécessaire de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de cancer de la prostate résistant à la castration. Une stratégie appelée thérapie d'acides nucléiques ou thérapie génique peut améliorer les traitements actuels en ciblant les gènes actifs après la castration pour retarder ou empêcher l'apparition de la résistance aux traitements. La thérapie génique présente un intérêt thérapeutique pour notre laboratoire. Nous avons développé des composés qui ont été utilisés pour induire la mort des cellules tumorales in vitro et pour réduire la progression tumorale in vivo chez la souris. Notre laboratoire souhaite réaliser des tests précliniques chez la souris afin d'évaluer l'efficacité de nos composés de troisième génération. Les modèles que nous utiliserons sont basés sur la transplantation de cellules de prostate humaines résistantes aux traitements à des souris immunodéficientes, capables de mimer la maladie observée en clinique. Il n'existe actuellement aucune autre méthode satisfaisante qui pourrait se substituer à l'expérimentation animale durant cette étape préclinique.
Bénéfices attendus
La thérapeutique génique est de plus en plus considérée comme une solution prometteuse pour la prise en charge des cancers de la prostate. Elle s'intègre dans la médecine de précision et permet de fabriquer un traitement individualisé en quelques semaines, pour une guérison plus rapide et efficace. Contrairement aux médicaments classiques, qui peuvent prendre jusqu'à dix ans pour être développés et cibler spécifiquement la mutation génétique responsable de la tumeur, la technologie génique agit directement sur des gènes impliqués dans la prolifération tumorale. Notre technologie est conçue pour contourner les principales limites de l'expansion du marché des composés géniques, notamment la faible biodisponibilité, la toxicité et la difficulté à atteindre les tissus cibles. En utilisant des lipides comme vecteurs de délivrance des composés géniques, nous sommes en mesure d'augmenter la stabilité, la solubilité et la spécificité de nos composés. De plus, notre technologie offre également la possibilité de co-délivrer sélectivement des agents diagnostiques ou thérapeutiques, ce qui ouvre de nouvelles perspectives pour la médecine personnalisée. En résumé, notre technologie représentent une avancée majeure dans la lutte contre les cancers de la prostate, en offrant une approche plus ciblée, efficace et personnalisée pour le traitement de cette maladie complexe.
Procédures
Les interventions sont les suivantes : a) Xénogreffe sous-cutanée : Les 1530 animaux de ce projet seront injectés sous-cutanément avec des cellules tumorales prostatiques sous anesthésie. Cette procédure dure environ 3 minutes par animal. b) Castration : Cette procédure concerne un groupe de 180 souris. Elle sera réalisée directement après la xénogreffe pour les animaux concernés, sous anesthésie. La durée maximale de la castration est de 30 minutes par souris. c) Suivi par imagerie : Cette procédure sera effectuée pour un groupe de 180 souris. La fréquence des imageries dépendra de la vitesse de croissance tumorale : une fois par semaine les deux premières semaines, puis une imagerie tous les 15 jours pendant 11 semaines de traitement. Le temps d'imagerie sera adapté à chaque modèle de tumeur. d) Traitement : L'administration des composés thérapeutiques se fera pendant 7 jours consécutifs pour les 450 souris dans la procédure d'évaluation de la spécificité des composés, et 3 fois par semaine pendant 11 semaines pour les 1080 souris dans la procédure d'évaluation de l'efficacité thérapeutique. Nous utiliserons l'injection intrapéritonéale, qui ne durera que quelques secondes par souris et ne nécessitera pas d'anesthésie. À la fin de l'étude, ainsi qu'en cours d'étude si nécessaire en fonction des critères limites, les souris seront euthanasiées et le sang ainsi que les tumeurs de tous les individus seront collectés.
Impact sur les animaux
L'injection de cellules tumorales chez les souris peut causer des effets indésirables tels que des douleurs, une faiblesse générale et une perte de poids. De même, l'injection d'oligonucléotides peut également provoquer des réactions indésirables telles que des inflammations et des douleurs au site d'injection. En outre, la castration peut également avoir des effets négatifs sur le comportement et la santé des souris, tels que des changements hormonaux et des modifications de l'activité locomotrice. Les modalités d'imagerie choisi n'entrainent pas d'algie chez l'animal. Cependant, l'induction anesthésique est une source de stress potentiel avant et pendant l'imagerie et l'acte chirurgical.
Devenir
À la fin de l'étude, les souris seront euthanasiées. Le sang et les tumeurs de tous les individus seront collectés pour des analyses post-mortem afin de contrôler la toxicité de nos composés et de valider la spécificité de chaque composé testé.
Remplacement
Afin de vérifier la pertinence des composés développés dans le laboratoire, le premier criblage sera effectué in vitro sur des modèles cellulaires en culture. Seules les composés positives démontrant leur efficacité in vitro seront utilisées dans les études in vivo du présent projet. Cependant, le projet nécessite l'utilisation d'une espèce de la classe des mammifères proche de l'homme pour sa physiologie. La souris immunodéficiente est un modèle de choix puisqu'elle permet le développement et le suivi de lignées tumorales humaines, de mimer la maladie observée en clinique. L'induction des tumeurs par xénogreffes chez la souris est une technique maîtrisée et documentée. Il n'existe actuellement aucune autre méthode satisfaisante qui pourrait se substituer à l'expérimentation animale durant cette étape préclinique.
Réduction
Pour chacun des composés, nous nous limiterons au nombre minimum d'animaux tout en restant une statistique fiable permettant de caractériser leur efficacité sur les modèles de xénogreffes de cellules tumorales de cancer de la prostate. Nos approches pour évaluer l'efficacité de chaque composé étudié comprendront des groupes témoins. Afin de réduire au minimum le nombre d'animaux et dès que cela sera possible, ces groupes témoins seront communs à plusieurs tests d'efficacité. Par ailleurs, nous réaliserons des études pilotes sur un petit nombre d'animaux par groupe afin de garantir une bonne tolérance aux molécules et d'adapter les doses à administrer avant de passer aux tests d'évaluation d'efficacité thérapeutique sur un nombre plus important d'animaux.
Raffinement
Nos études in vivo seront réalisées de manière séquentielle pour déterminer l'action des drogues sur le développement tumoral. Des études pilotes seront menées sur un petit nombre d'animaux afin de vérifier leur tolérance aux molécules et d'ajuster les doses à administrer à notre souche de souris. De plus, le suivi du développement tumoral se fera par des mesures cinétiques utilisant des méthodes non invasives sur les animaux. Enfin, nous améliorerons les conditions d'hébergement des animaux en proposant de la litière enrichie (copeaux de bois compactés et/ou coton) et en maintenant les souris en groupe de 4 à 5 individus pour éviter le stress lié à l'isolement. Les souris seront hébergées dans des cages ventilées, dans une pièce avec des cycles de lumière obscurité de 12 heures, où la température et l'hygrométrie seront constamment contrôlées. Elles auront un accès libre à la nourriture et à l'eau. Le bien-être des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel qualifié, ce qui nous permettra d'intervenir rapidement dès le moindre signe de souffrance. Pour minimiser la souffrance et le stress des animaux, les manipulations pourront être effectuées sous anesthésie gazeuse pour un endormissement et un réveil rapides, et une analgésie sera administrée en cas de signes de douleur. Tout signe ou comportement anormal tels que des difficultés respiratoires, une souris prostrée ou en retrait, ou une perte de poids supérieure à 20% du poids initial des animaux entraînera la fin de l'expérimentation et leur euthanasie immédiate afin d'éviter toute souffrance.
Choix des espèces
Le projet nécessite l'utilisation d'une espèce de la classe des mammifères proche de l'homme pour sa physiologie (ici le cancer de la prostate). Sur cette base, en adéquation avec nos objectifs, le modèle murin apparaît le plus pertinent. La xénogreffe désigne la transplantation d'un greffon d'un individu ou d'une lignée d'une espèce donnée chez un individu hôte d'une espèce différente. L'accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de nos approches. En effet, un contexte immunitaire permissif est essentiel pour favoriser la prise tumorale et éviter la réaction de l'hôte vis-à-vis du greffon. Pour la réalisation de xénogreffes de lignées tumorales humaines, cette espèce constitue le modèle in vivo le plus adapté : la maîtrise zootechnique (élevage/confinement); la praticabilité chirurgicale (technicité, accessibilité du site sous-cutané ou orthotopique); les connaissances actuelles et la diffusion dans le domaine scientifique (littérature, collaborations). Les animaux utilisés dans ce projet sont des souris mâles âgées de 6 semaines qui ont atteint leur maturité sexuelle, afin de garantir la sécrétion d'hormones masculines qui ont une influence sur le développement du cancer de la prostate chez l'homme.
Evaluation du potentiel immuno-modulateur d’extraits de plantes et de probiotiques et de leur capacité à renforcer et à stimuler la réponse immunitaire anti-infectieuse au cours du vieillissement.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
232 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent pendant quinze jours des extraits de plantes et des probiotiques par voie orale, une vaccination antigrippale sous anesthésie, puis des prélèvements sanguins répétés à la mâchoire ou en rétro-orbital jusqu'à trois mois, avant l'euthanasie et le prélèvement de la moelle, de la rate et du foie. L'objet réel est de tester si ces compléments renforcent la réponse au vaccin chez des souris âgées de 18 à 20 mois, les retombées pour les personnes âgées restant présentées comme une validation à venir. Sur le remplacement, le porteur affirme que la culture cellulaire ne peut pas mimer la réponse vaccinale et conclut au recours aux souris âgées.
Objectifs
Le vieillissement croissant de la population impose de prévenir les infections sévères et fréquentes par des vaccins. Néanmoins le vieillissement altère l’intensité et la qualité des réponses vaccinales, limitant ainsi la portée des recommandations vaccinales dirigées contre la grippe, le pneumocoque, la coqueluche mais également le tétanos ou le zona après 65 ans. Toutes les étapes des réponses vaccinales sont altérées par le vieillissement du fait de l’altération du système immunitaire appelés l’immunosénescence. Ce projet nous permettra d’une part de mieux comprendre les mécanismes de l’immunosénescence et les raisons de ces limitations. Le second objectif sera donc de définir des stratégies de renforcement de la réponse immunitaire via l’administration d’extraits de plantes et de probiotiques. Ainsi, nous avons montré dans une étude précédente la capacité d’extraits de plantes à renforcer et à stimuler la réponse immunitaire anti-infectieuse au cours du vieillissement. Ces données nous amènent à investiguer leur impact en association de souches probiotiques sur la réponse immunitaire à la vaccination antigrippale au cours de l’âge. L’objectif étant de déterminer in vivo le potentiel adjuvant d’extraits de plantes et d’une association de souches probiotiques à renforcer et /ou prolonger la réponse immunitaire antigrippale au cours du vieillissement.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d’une part de mieux comprendre les mécanismes de l’immunosénescence et les raisons du défaut de réponse vaccinale chez le sujet âgé. D’autre part, cette étude permettra de valider la pertinence scientifique d’utiliser des extraits actifs de plantes et des probiotiques pour renforcer le système immunitaire et améliorer la réponse vaccinale.
Procédures
Afin de définir des stratégies de renforcement de la réponse immunitaire antigrippale au cours du vieillissement, nous administrerons pendant 15 jours des extraits de plantes et des probiotiques quotidiennement par voie orale à des souris jeunes (5 mois) et âgées (18-20 mois) . Après 15 jours de traitement, ces souris seront vaccinées contre la grippe saisonnière par voie intra-dermique au niveau de la patte sous anesthésie générale ou par voie intrapéritonéale. Le choix du mode d’injection sera fait sur l’étude « pilote ». Le traitement sera poursuivi 7 jours post-vaccination. Sur l’ensemble des souris, des prélèvements sanguins seront réalisés 1 jour avant la vaccination, puis à 15 jours, 30 jours, 60 jours et 90 jours après vaccination, pendant 3 mois afin d’évaluer l’apparition d’anticorps au cours du temps. Une numération de la formule sanguine sera réalisée, ainsi que le dosage des anticorps IgG anti-HA dans le sérum. Ces prélèvements sont prévus au niveau mandibulaire et seront alternés d’un côté et de l’autre et pourront être remplacé par un prélèvement retro-orbital. Le sang sera prélevé en rétro-orbital sous anesthésie générale et analgésie locale. Ensuite après une injection intra-péritonéale de l’antigène viral, l’efficacité vaccinale sera déterminée en étudiant différents paramètres immunologiques sur les organes prélevés après euthanasie des souris. Pendant toute la durée du protocole, un suivi journalier de l’état général et un suivi hebdomadaire du poids des animaux seront effectués.
Impact sur les animaux
L’administration quotidienne des extraits de plantes et l’association de souches probiotiques pourrait altérer la prise alimentaire des souris. Afin d'éviter le stress de la manipulation aux animaux, le suivi du poids se fera de manière hebdomadaire. Les prélèvements de sang peuvent entrainer des lésions. Ces prélèvements sont prévus au niveau mandibulaire seront alternés d’un coté et de l’autre et pourront être remplacé par un prélèvement retro-orbital.
Devenir
A la fin de la procédure les animaux seront euthanasiés ce qui permettra de réaliser différents prélèvements d’organes (moelle osseuse, rate, foie…)
Remplacement
Les mécanismes de la réponse vaccinale sont complexes et nécessitent la mobilisation de différents effecteurs cellulaires de l’immunité et ne peuvent pas être mimés par une approche de culture cellulaire. Les souris âgées nous permettront d’étudier ces mécanismes dans leur contexte pathologique et physiologique de vieillissement que nous ne pouvons pas réaliser par d’autres approches.
Réduction
Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, en tenant compte des expériences déjà réalisées au laboratoire. Les groupes d’animaux seront constitués de 6 à 10 individus pour permettre une étude statistique. Les extraits ou probiotiques évalués ont recut des autorisations d'utilisation pour l'homme. L’innocuité et la toxicité des extraits ou probiotiques seuls ou en association seront déterminées in vitro par l’évaluation de leur cytotoxicité. Le choix des extraits ou probiotiques est effectué avant administration aux animaux.
Raffinement
A l’arrivée des souris, l’enrichissement de leur cage d’arrivée est maintenu pour minimum 15j d’acclimatation. Des igloos ou tunnel seront disposés au fond de la cage. Du papier sera disposé dans les cages afin de permettre la formation de nid. L’hébergement est en cage collective sur portoir ventilé (atmosphère contrôlée, avec alternance jour/nuit) avec accès illimité à l’eau et à l’alimentation standard. Les procédures font l’objet d’un suivi du bien-être des animaux adapté à l’expérience et aux potentiels effets indésirables des procédures sur l’état de santé global des animaux. Afin de diminuer le stress et la douleur, des anesthésiques et analgésiques seront utilisés pour les actes pouvant présenter de la douleur. Les souris seront surveillées quotidiennement (prostration, apathie, ventilation, comportement, aspect des poils, piloérection) et le suivi du poids une fois par semaine ou quotidiennement si une perte de poids est constatée. Une grille d'évaluation permet au personnel en charge de la surveillance et/ou du suivi des procèdures d'évaluer de manière objective ces critères permettant de déterminer les points limites précis et des critères d’arrêt des souffrances . L'étude sera conduite par des personnes qualifiées et formées au respect des conditions de bien-être des animaux.
Choix des espèces
Les mécanismes de la réponse vaccinale sont complexes et nécessitent la mobilisation de différents effecteurs cellulaires de l’immunité et ne peuvent pas être mimés par une approche de culture cellulaire. Les souris âgées nous permettront d’étudier ces mécanismes dans leur contexte pathologique et physiologique de vieillissement que nous ne pouvons pas réaliser par d’autres approches. Souris jeune (adulte) minimum 5 mois et souris âgées (15/18mois) afin d'étudier l'impact des extraits de plantes et des probiotiques sur la réponse immunitaire au cours du vieillissement
Interaction entre les neurones sensoriels et le système immunitaire pendant l’infection par le virus herpès
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
4 651 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité légère à modérée, dont 2 479 individus en gravité modérée. Leur peau est abrasée puis infectée par le virus de l'herpès, avec des injections cutanées répétées et une molécule les rendant insensibles à la chaleur, pour étudier le rôle des neurones sensoriels dans la réponse immunitaire. Le porteur précise qu'aucun analgésique ne pourra être administré sans compromettre les résultats, alors que les procédures peuvent provoquer des douleurs modérées. Il affirme que ces interactions entre système nerveux et système immunitaire ne peuvent pas être reproduites in vitro.
Objectifs
Les neurones sensoriels permettent à un organisme de détecter le danger grâce à une sensibilité aux stimuli mécaniques, thermiques et chimiques. Ces neurones sensoriels sont impliqués dans la perception de la douleur à ces différents stimuli. Il est de plus en plus évident que les neurones sensoriels et le système immunitaire interagissent pour réguler la douleur, l'inflammation et les défenses de l'hôte contre les pathogènes. Lors d’’une infection, des molécules inflammatoires activent les neurones dont les terminaisons nerveuses sont présentes dans les tissus, permettant ainsi la transmission de signaux au cerveau et la sensation de douleur. Ces neurones libèrent également des neuropeptides au niveau de la lésion, qui peuvent en retour moduler les cellules immunitaires présentes localement. Les neurones sensoriels innervant la peau sont hétérogènes : certains sont impliqués dans la détection de la chaleur et d’autres dans la détection du toucher. Ces différences sont dues à l’expression de différents marqueurs qui nous permettent de modifier génétiquement des animaux afin qu’ils ne soient plus capables de détecter ces sensations. Ainsi, l’objectif de notre projet de recherche est de comprendre comment les neurones sensoriels de la peau régulent l’inflammation et la réponse immunitaire au cours d’une infection par le virus herpès.
Bénéfices attendus
L'influence des neurones sensoriels sur la régulation de la réponse immunitaire inflammatoire lors d'une infection virale par le virus herpès reste inexplorée. Outre son aspect fondamental, la compréhension des mécanismes sous tendant cette régulation permettrait d'identifier de nouvelles approches thérapeutiques basées sur l'inhibition ou l'activation locale des neurones sensoriels dans le cas d'infections virales, ou pour aller plus loin, lors de pathologies inflammatoires très invalidantes, telles que la polyarthrite rhumatoïde.
Procédures
L’infection cutanée par le virus herpès nécessite une légère altération de la peau, celle-ci étant réalisée par une légère abrasion de la couche superficielle de la peau pendant 20 secondes réalisée sous anesthésie générale (par injection intrapéritonéale d’un anesthésiant). Les animaux subiront également des injections intradermiques quotidiennes de traitements immunomodulateurs afin d'évaluer leurs rôles potentiels dans la régulation de la réponse immunitaire et donc dans la résolution de l'infection. Pour évaluer le rôle des neurones sensoriels qui détectent la chaleur, les animaux seront injectés en sous-cutanée avec une molécule spécifique qui rend les animaux insensibles à la chaleur. Les injections intrapéritonéales (ip), intradermiques (id) et sous-cutanées (sc) n’excédant pas 10 secondes. Les ip seront réalisées 1 seule fois par animal, les id seront réalisées quotidiennement pendant 4 jours et les sc 3 fois pendant 3 jours. Toutes les injections seront réalisées sous anesthésie gazeuse légère.
Impact sur les animaux
Les animaux seront infectés par le virus herpès après une légère abrasion de la peau. L’infection va déclencher une réponse immunitaire inflammatoire et une plaie cutanée se développera à partir du point d’infection. En revanche, cette plaie se résout spontanément chez une souris sauvage, ainsi que chez les souris qui n’ont plus de neurones sensoriels. Nos expériences sont susceptibles de déclencher des douleurs modérées chez les animaux. Compte tenu de la nature même du projet qui propose d'explorer l'effet des neurones impliqués dans la perception de la douleur, aucun analgésique ne pourra être utilisé sans compromettre les résultats expérimentaux. Après l'infection, un pansement sera appliqué au niveau du flanc des souris pendant 2 jours. Cela peut induire des difficultés pour se mouvoir. Le suivi de la taille des plaies cutanées ainsi que les procédures incluant des injections cutanées peuvent induire du stress chez l’animal liées aux contentions. Les injections de molécules immunomodulatrices sont connues pour induire des démangeaisons légères sans induire d'auto-blessure de l'animal. Les tests comportementaux peuvent induire une douleur légère si le génotype de l'animal fait qu'il développe une hypersensibilité accrue suite à l'infection par le virus herpès.
Devenir
Mise à mort des animaux à la fin des procédures expérimentales pour récupérer les organes d'intérêts (peau et ganglions).
Remplacement
Nous proposons que les neurones sensoriels régulent l'évolution de la réponse immunitaire locale au niveau de la peau au cours de l'infection par le virus herpès. Seuls les modèles animaux permettent d'étudier le développement de l'activation simultanée du système immunitaire et du système nerveux sensoriel. En effet, ce sont des événements progressifs et multifactoriels qui dépendent des interactions tissulaires, cellulaires et moléculaires, localement sur le site inflammatoire mais également à distance dans les ganglions qui innervent la peau infectée. Ces interactions ne peuvent pas encore être modélisées in vitro ou in silico. Cependant, pour la recherche du mécanisme de l'interaction neurone/cellule immunitaire ou des molécules produites par ces neurones sensoriels après infection, nous veillerons à utiliser dès que possible des techniques ex vivo déjà maitrisées au laboratoire, telles que la culture cellulaire de neurones et de cellules immunitaires.
Réduction
Le plan de nos expériences est construit de sorte à limiter le nombre de souris. Le modèle d'infection par abrasion du flanc est un modèle très bien décrit et maitrisé au sein du laboratoire permettant à l'infection de se développer dans quasiment 100% des souris infectées. Nos données obtenues dans un projet précédent nous ont permis de déterminer le nombre de souris nécessaires par expérience, en limitant ainsi le nombre d'animaux utilisés. Pour une différence clinique et statistiquement significative, nous avons estimé que la taille d’un groupe était de 11 souris pour les infections par le virus herpès en considérant des moyennes de taille de lésion de 2,5 mm2 pour les souris contrôles, une différence significative de 1,5 mm2 et un écart-type commun de 1,2 mm2. Ainsi, des lots de 11 souris seront constitués pour chaque condition testée afin de répondre aux exigences de test statistique de rang non paramétrique. Pour chaque groupe d'animaux utilisés, tous les paramètres quantifiables seront vérifiés (poids, taille de la plaie, comportement) et tous les organes nécessaires à notre étude seront prélevés (peau, rate et ganglions) afin d'éviter de répéter inutilement les expériences inutiles. Pour minimiser l'impact du microbiote intestinal sur le développement de l'infection et donc la variabilité de nos expériences, nous avons choisi de comparer les groupes de souris génétiquement modifiées avec les souris provenant de la même portée mais non génétiquement modifiées.
Raffinement
Pour réduire le stress des animaux, un temps d'acclimatation d'au minimum une semaine sera respecté après un transfert d'une animalerie à l'autre ainsi qu'avant toute procédure expérimentale. Les souris seront hébergées en cage standard avec toit filtrant au nombre de 5 souris par cage, avec de la sciure de bois utilisée comme litière, des lanières de papier kraft comme matériau de nidification et des maisons en dôme. Eau et nourriture seront fournies ad libitum et les animaux seront libres de leur déplacement. Pour réduire la souffrance : une surveillance quotidienne sera réalisée. Les points d’observation seront réalisés quotidiennement suivant l’infection et consisteront en une vérification du poids, de la vivacité et de l'état du pelage des animaux. Au besoin et au moindre signe de dégradation de l'état général, d'autres points d'observation intermédiaires seront assurés. Une souris qui aura perdu 20% de son poids initial sera systématiquement mise à mort. De la nourriture humide sera déposée systématiquement dans la cage des animaux pendant 2 jours suivant l'infection pour faciliter au maximum l'alimentation.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle idéal pour notre étude. Le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme (dans notre cas, les schémas des systèmes immunitaires et neuronaux sont très similaires entre l’homme et la souris), l’état actuel des connaissances, les outils et structures disponibles pour sa manipulation et un temps de génération court font de la souris le modèle idéal à l’étude des systèmes immunitaire et nerveux. De plus, le modèle murin est un modèle de choix par l'existence de souris génétiquement modifiées. Des souris d'âge minimum de 7-8 semaines seront utilisées afin d'avoir un système immunitaire et sensoriel mature.
Etude préclinique de la récupération fonctionnelle et de la plasticité cérébrale après accident vasculaire cérébral ischémique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, dont 960 individus en gravité sévère. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par injection de thrombine ou occlusion au chlorure de fer, suivi d'examens IRM et de tests moteurs, cognitifs et émotionnels répétés sur soixante jours. Le porteur décrit un affaiblissement de la patte, des douleurs post-opératoires et une mise à mort si la perte de poids dépasse 15 % ou si le score de douleur est trop élevé. Il rappelle que les traitements neuroprotecteurs efficaces chez l'animal ont échoué chez l'humain, tout en affirmant que les méthodes sans animaux n'apportent pas le même niveau d'information.
Objectifs
A l’échelle mondiale, l’accident vasculaire cérébral (AVC) est l’une des causes majeures de décès, d’invalidité et de perte socioéconomique. Face à ce fardeau, le seul traitement pharmacologique approuvé consiste en l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA). Néanmoins, il existe des critères d’éligibilité stricts qui excluent une grande majorité des patients. Il est donc indispensable de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes. Lors d’un AVC ischémique (i.e. dû à une occlusion vasculaire), le débit sanguin cérébral (DSC) diminue drastiquement et les tissus cérébraux alentours sont altérés de manière plus ou moins définitive. Selon différents facteurs tels que la durée et l’ampleur de la diminution du DSC, l’étendue de la lésion cérébrale et sa localisation, les handicaps résiduels post-AVC peuvent être de différentes natures (moteurs, cognitifs et/ou émotionnels) et extrêmement invalidants. Plusieurs agents thérapeutiques ont été développés et ont montré un bénéfice en termes de neuroprotection chez l’animal. Cependant, la transposition des effets neuroprotecteurs des modèles animaux à l’Homme reste un échec. En effet, alors que la récupération fonctionnelle est au cœur des préoccupations humaines, les études précliniques se sont principalement concentrées sur l’évaluation du volume de lésion cérébrale pour évaluer l’efficacité d’un traitement. Par ailleurs, l’’étude comportementale après un AVC chez les modèles expérimentaux est encore peu utilisée, incomplète voire inadaptée. En effet, la majorité des études ayant travaillé sur les déficits fonctionnels n’ont examiné que les déficits à court terme et particulièrement les déficits moteurs. L’objectif de ce projet consiste donc à caractériser les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent la plasticité cérébrale et les déficits fonctionnels chroniques de l’accident vasculaire cérébral ischémique, afin de mettre au point de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de ces troubles.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes de plasticité cérébrale et de récupération fonctionnelle après un AVC ischémique. Elle permettra également de proposer des pistes pour caractériser de nouvelles stratégies thérapeutiques en combinaison ou non avec le tPA, afin d’améliorer de manière optimale la récupération des patients.
Procédures
Chaque animal fera l'objet d'une pose de cathéter intraveineux pour l'injection de traitements (15 minutes). 1 - Le modèle d'ischémie par injection de thrombine sera réalisé (1.5 heures) et les lésions cérébrales seront évaluées par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) (30 minutes) 24h après l'intervention chirurgicale. L'évolution du tractus de fibres (plasticité cérébrale) sera évaluée par IRM de manière longitudinale (24h, 7 jours, 30 jours et 60 jours post-AVC) (50 minutes). La récupération fonctionnelle sera également évaluée de manière longitudinale (48h, 7 jours, 30 jours et 60 jours post-AVC) à travers l'étude de différentes fonctions (sensorimotrices, cognitives et émotionnelles ; 10 jours). 2 - Le modèle d'ischémie par occlusion au chlorure de fer sera réalisé (1.5 heures) et les lésions cérébrales seront évaluées par IRM (30 minutes) 24h après l'intervention chirurgicale. L'évolution du tractus de fibres (plasticité cérébrale) sera évaluée par IRM de manière longitudinale (24h, 7 jours, 30 jours et 60 jours post-AVC ; 50 minutes). La récupération fonctionnelle sera également évaluée de manière longitudinale (48h, 7 jours, 30 jours et 60 jours post-AVC) à travers l'étude de différentes fonctions (sensorimotrices, cognitives et émotionnelles ; 10 jours). 3 - La totalité des animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque.
Impact sur les animaux
Certains animaux peuvent montrer des signes de douleurs quelques heures après la chirurgie. Un affaiblissement transitoire de la patte avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée lors de l’AVC) qui disparait dans la première semaine après l’AVC. Une perte de poids, des douleurs post-opératoires ou un stress pourraient être observés les jours suivants. Lors des tests comportementaux, les animaux peuvent être soumis à un stress dû à la manipulation, l’isolement (
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Les organes prélevés post mortem permettront de réaliser des analyses protéomiques et transcriptomiques.
Remplacement
Les expériences in vitro ou ex vivo ne permettent pas de mimer parfaitement la pathologie en raison de multiples interactions cellulaires et tissulaires au sein du système nerveux central. De plus, les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants. Des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d’apporter le même niveau d’information pour évaluer une récupération fonctionnelle et cognitive de manière longitudinale. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale, la récupération fonctionnelle et la plasticité cérébrale. La physiologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux utilisés est prévue par une limitation aux seules expériences considérées comme absolument indispensables, et déterminée selon la sensibilité des méthodes utilisées et l’expertise nécessaire à la bonne réalisation des techniques. Le nombre d’animaux nécessaire a été déterminé grâce à nos expériences antérieures et selon les données disponibles dans la littérature. Les analyses statistiques seront réalisées avec le logiciel GraphPad Prism (version 9). Nous vérifierons en premier lieu si les échantillons suivent la loi normale (hypothèse gaussienne) à l’aide de tests de Shapiro-Wilk. Le cas échéant, des tests paramétriques seront utilisés (ANOVA suivi de tests post-hoc en cas de différence significative) ; dans le cas contraire, des tests non paramétriques seront réalisés (comparaisons intergroupes : test de Kruskal-Wallis suivi de tests U de Mann-Whitney en cas de différence significative ; comparaisons intragroupes : test de Friedman suivi de tests de Wilcoxon en cas de différence significative).
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le transport des animaux en salle d’expérimentation sera réalisé en limitant les secousses, le bruit et la lumière selon le cycle. La température en salle d’expérimentation sera contrôlée et adaptée au bien-être des animaux. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs, soigneusement nettoyés et désinfectés. Au cours de l’intervention chirurgicale, les paramètres vitaux de l’animal seront surveillés et optimisés tout au long de la procédure. Après l’intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil. Pour optimiser le réveil de l’animal, la cage de réveil sera disposée de manière à avoir une partie sur un tapis chauffant, laissant le choix à l’animal de la température dans la cage. De la nourriture humidifiée sera déposée dans la cage pour un accès plus simple à l’alimentation après la chirurgie. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront mis à mort si une perte de poids de plus de 15 % est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (grimace scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose (petites maisons), des carrés de cotons et des paillettes seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront mis en place jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la récupération fonctionnelle et la plasticité cérébrale suite à un AVC ischémique. Les souris C57BL/6 utilisées dans cette étude seront âgées de 8 semaines car cela correspond au stade de développement jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature dans l’étude des AVC.
Rôle de l’homéostasie chlorure spinale dans l’hypersensibilité nociceptive induite par une séparation maternelle néonatale
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
176 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée, pour étudier l'hypersensibilité à la douleur induite par une séparation maternelle précoce. La moitié des nouveau-nés est séparée de leur mère, puis soumise à des tests de douleur et à des injections dans la moelle épinière, l'autre moitié subit une chirurgie sans réveil avec ablation d'une vertèbre pour enregistrer la moelle jusqu'à huit heures. Le porteur indique aussi que toutes les mères sont mises à mort après le sevrage, au motif que la séparation altère leur système nerveux. Il affirme que la nociception est un processus intégré, impossible à étudier sans sujets vivants dotés d'un cortex développé.
Objectifs
Pendant très longtemps, la douleur du nouveau-né a été ignorée et négligée lors de sa prise en charge. Ce n’est qu’au début des années 90 que ce problème a commencé à être pris en compte en clinique humaine et de nombreux progrès restent à faire. Les nouveaux nés ressentent non seulement la douleur mais sont extrêmement sensibles aux stimulations aversives. Ceci est d’autant plus vrai pour les enfants nés prématurés dont la prévalence mondiale était de 9.6 % en 2005. La prématurité conduit ces enfants à développer parfois des troubles moteurs et comportementaux et une hypersensibilité douloureuse pouvant perdurer à l’âge adulte. La séparation maternelle néonatale (SMN) est un modèle reflétant la prématurité humaine et des études ont montré que les animaux exposés à la SMN présentent des déficit de comportements et une hypersensibilité douloureuse. Des études récentes suggèrent également un déréglement de l'expression de certaines molécules pouvant ainsi contribuer aux altérations comportementales observées suite à la SMN. Dans ce contexte, nous chercherons à évaluer le rôle de certaines de ces molécules exprimées par les neurones de la moelle épinière impliqués dans la transmission de l'information douloureuse. L’objectif du projet sera d’étudier l’effet du bumétanide (BTD), qui pourrait rétablir a) les seuils de douleur chez l’animal SMN adulte et b) la transmission de la douleur par des neurones dans la moelle épinière d'animaux SMN.
Bénéfices attendus
Le modèle de séparation maternelle a permis de décrypter nombre des mécanismes d’altération du système nerveux qui sont retrouvés chez les enfants prématurés humains. Dans ce cadre, l’étude permettra de mieux comprendre les voies et mécanismes impliqués dans la douleur qui sont altérés lors d’un stress néonatal non douloureux, et plus particulièrement une séparation précoce avec la mère. Ce projet vise aussi à caractériser l’action potentiellement bénéfique du bumétanide sur le comportement modifié des animaux séparés et sur les modifications moléculaires observées dans ce modèle.
Procédures
La moitié des animaux seront soumis au protocole de séparation maternelle néonatale, tandis que l'autre moitié des nouveau-nés resteront avec leur mère. Des tests d'évaluation de la douleur (durée 10min/animal), n'induisant pas de stress accru chez les animaux seront effectués une fois chacun du jour 30 au jour 60 postnatal pour la moitié des animaux. Ceux-ci recevront un total de 4 injections sous anesthésie générale 30 minutes avant chaque test comportemental. Une chirurgie durant 45 minutes sera effectuée sur l'autre groupe d'animaux puis des enregistrements de la moelle épinière seront effectués. Ces enregistrements dureront 8 heures maximum.
Impact sur les animaux
Le modèle de séparation maternelle néonatale chez le rat est un modèle de stress psycho-social et a donc des conséquences sur le comportement des animaux. Après sevrage, la mère ne réintègrera pas le processus de reproduction mais sera euthanasiée puisque la séparation altère le fonctionnement de son système nerveux, induisant potentiellement une anxiété accrue au niveau comportemental. Les nuisances possibles liées à l'injection intrathécale seront le stress lié à l’anesthésie ainsi qu'une inflammation ou infection potentielle du site d’injection. Les tests comportementaux induisent un changement d’environnement pour les animaux et donc un stress.
Devenir
Toutes les mères de cette étude seront mises à mort après sevrage de leurs petits (P21) puisque la séparation altère le fonctionnement de son système nerveux, induisant potentiellement une anxiété accrue au niveau comportemental. En fin d’expérience, tous les animaux seront aussi mis à mort. Pour la moitié des animaux, la chirurgie subie est sans réveil puisqu'une vertèbre est ôtée lors de celle-ci et que leur moelle épinière est manipulée. Les animaux y prenant part seront mis à mort par excès d'anesthésie.
Remplacement
La nociception étant un processus intégré, ce projet nécessite l’étude d’un système intégré et mature. De plus, l’étude vise à caractériser les propriétés et le mode d’action d’une molécule d’intérêt dans notre modèle, et il est donc impossible de se passer de sujets vivants dotés d’un cortex développé. Il n’existe pas encore de modèles alternatifs in silico ou in vitro capable de restaurer les réseaux neuronaux impliqués dans les comportements observés.
Réduction
Chaque groupe de rats requiert 2 portées différentes (comportant chacune minimum 10 animaux) pour une bonne analyse statistique et confirmation des tests comportementaux. L’intégralité des animaux de chaque portée sera analysée à chaque fois, permettant également de préciser les différences mâles-femelles si elles sont observées. Les résultats obtenus sont alors statistiquement robustes et exploitables.
Raffinement
Durant la SMN, les ratons sont placés sous lampes chauffantes afin d’éviter toute hypothermie. Leur prise de poids sera contrôlée 2 fois par semaine. Les animaux sont hébergés en cages collectives afin de préserver les interactions sociales avec leurs congénères et ont constamment à disposition de la frisure pour un nid, un bâton à ronger et un tunnel. Les animaux sont suivis quotidiennement par les zootechniciens de l’animalerie et par les expérimentateurs afin d’être alertés dès les premiers signes de dégradation du bien être animal en portant une attention particulière à tout changement de l’état général ainsi qu’à l’état comportemental. Si des changements sont observés, le vétérinaire sera contacté pour décider de la procédure. Pour l’appréciation de la perte de poids, si lors d’une pesée hebdomadaire, il est observé qu’un animal ne prend pas de poids ou en perd par rapport à la pesée précédente, des aliments humides seront mis à disposition dans les cages pour faciliter la prise alimentaire. Si l’un de ces changements persiste plus de trois jours et est observé par un zootechnicien ou l’expérimentateur, le vétérinaire sera contacté et l’animal sera retiré de l’étude. Les injections seront effectuée sous anesthésie générale profonde (isoflurane 3%) pour limiter le stress des animaux. Les tests comportementaux sont realisés après une semaine d’habituation (manipulation par l'expérimentateur 5 minutes par animal chaque jour) afin de réduire le stress.
Choix des espèces
Le rat est un standart en tant que modèle expérimental pour ce type d’expérience impliquant des processus intégrés. Nos précédentes études étant réalisées sur le rat, nous conserverons ce modèle bien caractérisé sur le plan comportemental. Le modèle de SMN a déjà été bien caractérisé chez cette espèce, permettant de confirmer la robustesse des résultats obtenus. De plus, ce modèle chez le rat nous permet de modéliser l’état de développement d’un fœtus lors du 3ème trimestre de gestation, puisqu’à la naissance le système nerveux du rat est au même niveau de maturation que celui du fœtus au début du 3ème trimestre de gestation. Les évènements de maturation ayant lieu lors du 3ème trimestre de gestation chez l’Homme, correspondent à ceux qui ont lieu lors des 2 à 3 premières semaines de vie postnatales chez le rat. Le protocole de SMN intervient au stade nouveau-né, entre le jour 2 et le jour 12 postnatal. Cependant, les conséquences de ce stress seront observées à l’âge adulte (45 jours postnatal).
Exploration des effets vasculaires de l’apolipoprotéine A-I et de composés mimant son action
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
704 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, dont 320 individus en gravité sévère. Elles sont soumises à un régime gras, à des chirurgies pour poser des cathéters dans les vaisseaux des pattes et du cou, puis à des mesures prolongées de la fonction cardiovasculaire sur animal conscient. Le porteur décrit des douleurs, de la fièvre, des blessures possibles des vaisseaux et une gêne pour s'alimenter après les actes sur les carotides. Il affirme que la coordination in vivo de signaux nerveux, hormonaux et cardiovasculaires ne peut être remplacée, tout en prévoyant quelques études sur cellules en culture.
Objectifs
Dans le cadre de la recherche fondamentale, ce projet permet d'étudier, le rôle de certains récepteurs ou cibles sur les vaisseaux dans le maintien de la fonction vasculaire et l'amélioration de la perfusion des tissus. Il permet en particulier d'évaluer leur contribution dans la régulation de la glycémie ce qui est d'un intérêt pour la prise en charge des sujets diabétiques. Nos résultats préliminaires obtenus sur des souris saines explorant le rôle de ces cibles au niveau du vaisseau, montrent que leur activation induit une vasodilatation. Des travaux publiés suggèrent que ces récepteurs auraient un rôle protecteur au cours des maladies métaboliques dans le sens qu'il induiraient une diminution de la formation de l'athérome au sein des parois des vaisseaux. D'autres études discutent aussi un rôle potentiel dans l'amélioration de la sensibilité périphérique à l'insuline.
Bénéfices attendus
Sur nos modèles expérimentaux, il est attendu une amélioration des paramètres vasculaires et métaboliques chez les animaux transgéniques sains ou malades avec un fond génétique dit contrôle. Cet effet sera mesuré sous l'action d'un traitement et, ce bénéfice sera mesuré par comparaison aux animaux transgéniques invalidés pour les cibles moléculaires étudiées. Il est aussi attendu l'absence d'amélioration voire une aggravation de la maladie (athérome, diabète, ...) chez les animaux transgéniques invalidés pour les cibles moléculaires d'intérêt. Ce projet permet aussi dans le cadre de la recherche translationnelle de pré-établir des données expérimentales pour la mise au point de futurs médicaments.
Procédures
Nous avons estimé un besoin de 704 animaux dans le projet de recherche. Les souris seront placées sous un régime gras favorisant le développement de l’obésité et du diabète (352 souris vigiles). Leur statut diabétique sera évalué lors d’un test de tolérance au glucose. Ce dernier sera administré dans l’abdomen lors d’une injection puis la glycémie sera mesurée sur du sang prélevé à la queue à différents temps à l’aide de bandelettes et d’un lecteur de glycémie. Les souris seront par la suite soumises à des interventions chirurgicales au cours desquelles elles seront anesthésiées afin de poser un cathéter intraveineux dans un vaisseau de la patte (durée: 15 minutes, 384 souris anesthésiées). Cette chirurgie est suivie quelques jours après, d'une autre chirurgie permettant la pose, sur un vaisseau de la seconde patte arrière, d'un dispositif de mesure du débit sanguin et du rythme cardiaque (durée: 30min, 384 animaux anesthésiés). Ces deux chirurgies permettront par la suite d’étudier sur l’animal vigile, les effets de l'insuline sur le système cardiovasculaire, et, la sensibilité des tissus à son action antidiabétique (durée: 3h, 384 souris vigiles). Sur une autre série d'animaux, un cathéter sera posé dans un vaisseau du cou (carotide) de la souris anesthésiée afin de mesurer la pression artérielle sur les animaux vigiles (durée: 90min, 320 animaux vigiles).
Impact sur les animaux
Les expérimentations peuvent induire des effets indésirables ou des nuisances sur les animaux. La peur et le stress sont des nuisances qui peuvent survenir lors de la manipulation des animaux, leur isolement dans certaines procédures, ou lors de l'administration au niveau de l'abdomen d'un produit anesthésiant avant un acte chirurgical. Une nuisance de l'anesthésie est d'induire une hypothermie, une sensation de fatigue en période de réveil, une petite douleur au point d'injection. D'autres nuisances peuvent survenir à l'occasion de procédures chirurgicales comme une blessure du vaisseau lors de l'introduction du cathéter. Il est aussi possible d'induire une blessure d'un organe lors de l'injection dans l'abdomen de substances (anesthésiant, par exemple). D'autres nuisances possibles, sont la sensation de fatigue, la douleur ou de la fièvre qui peuvent être observées au cours des actes chirurgicaux où l'expérimentateur pose à demeurre une cathéter intraveineux ou une sonde à ultrasons de mesure du débit sanguin. Les actes chirurgicaux portés sur les vaisseaux du cou (carotides) peuvent induire au réveil, une douleur locale gênant les mouvements de la tête en particulier pour la prise alimentaire. L'animal peut aussi ressentir au réveil, de la fatigue et développer une fièvre.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés. Ceci est nécessaire afin de prélever les tissus et organes à des fins d'histologie ou d'autres analyses. Ces examens donnent des informations complémentaires aux données mesurées sur l'animal vivant. Ils permettent de comprendre les mécanismes biologiques mis en jeu dans un tissu ou organe, le développement des lésions au cours du temps, et, les cellules impliquées. Ces prélèvements permettent aussi de réduire le nombre d'animaux dans les expérimentations.
Remplacement
Nos travaux visent à étudier dans un tissu ou organe, au sein d'un organisme vivant, les mécanismes biologiques qui favorisent le développement des maladies métaboliques. Il s'agit d'études fondamentales bien en amont d'un transfert à l'homme. Il s'agit de mesurer in vivo des mécanismes biologiques en considérant la participation de mécanismes nerveux, endocriniens et les adaptations mises en jeu par le système cardiovasculaire. Pour ces explorations spécifiques coordonnant l'action de multiples signaux in vivo, l'animal ne peut pas être remplacé. Par contre, il peut-être envisagé des études in vitro sur des cellules cultivées afin d'étudier des mécanismes précis portant sur des intéractions pures mises en jeu entre cibles et composés étudiés. Ainsi, des études, in vitro, sur des lignées de cellules endothéliales commercialisées sont prévues pour comprendre les réactions biochmiques immédiates à l'échelle de la cellule et limiter pour ce champ d'exploration précis, dans la mesure du possible, l'utilisation des animaux à cette fin.
Réduction
1/Plusieurs données peuvent être obtenues avec un même animal : la mesure de la tolérance au glucose, la mesure de la sensibilité périphérique à l'insuline, la vasodilatation, des prélèvements de tissus, le prélèvement de plasma pour l'étude des lipoprotéines (profils), le prélèvement de foie ,... 2/ Une réflexion biostatique (recherche bibliographique et examen de travaux similaires avec le nombre d'animaux nécessaires pour démontrer une différence statistiquement significative) est réalisée en amont de la procédure/expérience, pour limiter le nombre d'animaux. Il est aussi prévu d'utiliser des tests statistiques comme le t de Student et l'ANOVA (logiciel Graphpad) pour estimer le nombre d'animaux nécessaires au cours de nos expérimentations. 3/La formation et l'encadrement des expérimentateurs dans les procédures permet d'optimiser l'obtention de mesures/données fiables et interprétables sur un faible nombre d'animaux. 4/ Les animaux seront utilisés dans les expériences/procédures jugées indispensables en fonction de l'avancée du projet.
Raffinement
Pour optimiser la fiabilité des résultats, des mesures visant à réduire voir supprimer la douleur et le stress, et, améliorer le bien-être des animaux sont mises en oeuvre: - les animaux seront élevés et hébergés dans une animalerie agrée. - les moyens pour limiter le stress aux animaux sont appliqués: enrichissement des cages, animaux manipulés avec delicatesse dans les procédures ce qui facilite les prélèvements et les mesures (par exemple: en laissant l'animal libre dans la cage et en assurant un geste délicat, naturel, lors du passage de la main sur la queue pour le prélèvement de sang lors du test de tolérance au glucose), expériences réalisées dans une pièce calme en présence d'un faible nombre d'expérimentateurs - les expérimentateurs seront encadrés dans les protocoles par un sénior et rompus aux procédures expérimentales ce qui permet de limiter le stress et la douleur - en cas de transport de l'animal, un transporteur agrée pour transport d'animaux sera réquisitionné (par exemple, une navette qui permet d'acheminer des animaux depuis l'établissement éleveur vers l'établissement principal) - des points limites (ou critères d’arrêt anticipé) de la procédure seront établis - dans la mesure du possible et en fonction de la statistique, les animaux prévus dans les mesures invasives seront réduits. - des soins adéquats seront prévus avant, pendant et après l’opération (anesthésie/analgésie), - la réduction de la durée de certaines études (surtout toxicologiques), - la mise en place de procédures d’euthanasie appropriées.
Choix des espèces
Nous souhaitons d'utiliser la souris pour plusieurs raisons: Nous disposons d'une grande expertise de l'utilisation de cet animal (manipulation, procédures chirugicales, expérimentations spécifiques). Nous disposons aussi d'outils d'exploration des effets vasculaires des molécules étudiées appliqués aux vaisseaux de souris. Dans la littérature, les effets vasculaires de l'apoA-I sont pour beaucoup décrits avec les souris (sauvages et transgéniques) ce qui constitue une base pour notre recherche. Des souris transgéniques, porteuses de mutations sur des gènes qui nous interessent, sont disponibles, et, nous permettent de réaliser le projet. Les souris sont utilisées à partir de 8 semaine de vie. A cet âge elles pourront débuter le régime gras, ce qui est classique dans les études explorant la mise en place de l'athérome au cours du développement de l'animal. Le régime gras sera maintenu sur 30 à 40 semaines maximum. Les différentes explorations sont prévues sur des animaux âgés de 8 semaines à 50 semaines maximum.
Etude de l’impact du polymorphisme N363S du gène NR3C1 codant le Récepteur Glucocorticoïde sur le rétrocontrôle négatif de l’axe corticotrope par les glucocorticoïdes exogènes
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
Les souris d'une nouvelle lignée, porteuse d'une mutation du récepteur des glucocorticoïdes, passent deux fois dans leur vie un test comportemental de stress de cinq minutes, destiné selon le porteur à l'évaluation du "bien-être" de la lignée. Une partie des adultes reçoit une injection sous anesthésie locale, d'autres sont opérées sous anesthésie générale pour la pose sous la peau d'un dispositif qui délivre un traitement pendant cinq semaines, et repassent cinq semaines plus tard un test de stress de cinq minutes, sans que le texte précise lequel. 240 souris vont être utilisées, la déclaration en comptant 132 en souffrance légère et 108 en souffrance modérée, certaines passant par plusieurs procédures. La déclaration ne prévoit aucune souris gardée vivante, et le texte annonce leur mise à mort à la fin des procédures, lorsque les analyses de sang et d'organes l'exigent.
Objectifs
Les hormones glucocorticoïdes sont sécrétées par la glande surrénale. Elles sont sécrétées pour permettre à l’organisme de s’adapter en cas de stress et de diminuer la réponse inflammatoire. C’est pourquoi les glucocorticoïdes sont largement utilisés comme traitement. Ils sont utilisés notamment dans le traitement des maladies inflammatoires, des allergies, de l’asthme ou de nombreux cancers. Les glucocorticoïdes n’agissent pas seulement sur la réponse inflammatoire mais sur de nombreux autres organes. C’est pourquoi, lorsqu’il y a un déséquilibre, ils peuvent entrainer des effets secondaires. Lors d’un traitement prolongé par glucocorticoïdes, il n’y a plus de production par l’organisme de glucocorticoïdes. Lorsqu’on arrête le traitement, la production de glucocorticoïdes par l’organisme ne reprend pas chez 40% des patients. Cela entraine un manque de glucocorticoïdes qui peut entrainer des complications graves et s’appelle l’insuffisance corticotrope. Pour le moment, il est difficile de prédire chez quels patients surviendra cet effet secondaire. C’est pourquoi nous essayons de mieux comprendre cette maladie pour améliorer la prise en charge des patients. Les glucocorticoïdes agissent par l’intermédiaire du récepteur glucocorticoïde. Chez 2% de la population mondiale, il existe une mutation de ce récepteur qui entraine une augmentation de l’effet des corticoïdes et donc, théoriquement, une augmentation du risque de complications. Pour étudier si cette mutation augmente le risque d’insuffisance corticotrope, l’utilisation de modèles cellulaires est insuffisante. En effet, ils ne permettent pas de reproduire la complexité de la sécrétion de glucocorticoïdes ainsi que les différents niveaux de régulation. Aussi, il est nécessaire de générer un modèle murin afin d’évaluer les différents acteurs impliqués dans la régulation de l’axe corticotrope. Ce modèle murin permettra d’étudier l’effet de la mutation sur la sécrétion de glucocorticoïdes et d’évaluer si elle constitue un facteur de risque d’insuffisance corticotrope.
Bénéfices attendus
La variabilité inter-individuelle dans la sensibilité aux corticoïdes est un enjeu important en médecine, en effet on considère que près de 2% de la population mondiale reçoit un traitement par glucocorticoïdes exogène. La mise en évidence du variant N363S, retrouvé chez 2-4% de la population, comme facteur de risque pourrait permettre d’adapter de façon personnalisée leur prescription afin de limiter la survenue d’effets indésirables.
Procédures
Pour l’évaluation du bien-être d’une nouvelle lignée génétiquement modifiée, les animaux seront soumis à un test comportemental d’évaluation du stress, d’une durée de 5 minutes, 2 fois au cours de leur vie. Une partie des souris adultes recevront une injection après anesthésie locale. D’autres souris seront opérées par anesthésie générale pour mise en place d’un système de délivrance de traitement par perfusion pour une durée de 5 semaines. Ce dispositif permet de ne faire qu’un geste chirurgical, sans avoir à faire plusieurs injections. De plus, les souris seront soumises 5 semaines plus tard à un test comportemental d’évaluation du stress, d’une durée de 5 minutes.
Impact sur les animaux
La modification génétique des animaux ne devrait pas entrainer de souffrance spécifique puisqu’il n’existe pas chez l’être humain de pathologie liée à cette mutation. Cependant, les personnes ayant cette mutation ont tendance à avoir plus de troubles métaboliques et à être plus à risque d’obésité, ces aspects seront donc recherchés et pris en charge le cas échéant chez les animaux génétiquement modifiés. Les nuisances des procédures proposées sont faibles à modérées pour les animaux. L’injection de traitement peut entrainer une douleur au niveau du point d’injection et la pose d’un dispositif sous cutané peut entrainer des douleurs. Ces douleurs sont prévisibles et prises en charge par l’anesthésie.
Devenir
Dès que possible, les animaux seront utilisés dans plusieurs procédures, afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaire. Les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures quand cela sera nécéssaire pour permettre les analyses de sang et des organes post-mortem.
Remplacement
Les corticoïdes agissent sur l’ensemble de l’organisme et sont sous le contrôle de l’axe corticotrope, composé de plusieurs niveaux, comprenant une partie du cerveau, la glande hypophyse et la glande surrénale. Leurs effets sont très finement contrôlés car un excès de corticoïdes entraine des complications métaboliques, psychiatriques et cardiovasculaires et un manque de corticoïdes entraine le décès. Pour permettre cet équilibre, leur sécrétion est contrôlée à différents niveaux, qui est difficile d’étudier de façon dissociée. C’est pourquoi il est nécessaire d’avoir recours à un modèle vivant permettant de reproduire le dialogue entre les différents organes impliqués. L’utilisation de modèles cellulaires in vitro est compliqué, d’une part car il existe un seul modèle de cellules corticotropes immortalisées hypophysaires, issu de cellules tumorales ne réagissant pas forcément de la même façon que des cellules saines aux corticoïdes. D’autre part, car la culture cellulaire ne permet pas de rendre compte de la dynamique de l’axe corticotrope au cours du temps.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé en utilisant un calcul de puissance afin d'inclure uniquement le nombre d'animaux nécéssaire pour répondre à la question posée dans chaque procédure. Le nombre minimal d’animaux a été choisi pour l’ensemble des procédures. Dès que possible, les animaux seront utilisés dans deux procédures pour permettre la réduction du nombre d'animaux nécéssaires.
Raffinement
Les conditions d’élevage et d’hébergement seront appropriées pour réduire la douleur, la souffrance, l’angoisse ou les dommages durables que pourraient ressentir les animaux : cages adaptées à l’animal et à sa taille en maintenant les animaux par deux minimums dans chaque cage, et par enrichissement du milieu par copeaux de bois/tunnel en carton et cabanes. * Souris : 5 animaux par cage au maximum (nombre susceptible de varier en fonction de la taille des animaux) - Les animaux seront observés quotidiennement par les membres qualifiés de l’animalerie et les responsables du projet afin de ne pas méconnaître les points limites. - Les mesures des animaux (poids, taille) seront couplés afin de réaliser l’analyse de plusieurs paramètres pour limiter au maximum le stress des animaux. - Une anesthésie générale ou locale de courte durée sera réalisé pour chaque procédure entrainant une douleur.
Choix des espèces
Les animaux utilisés sont des souris, en effet, les souris sont souvent utilisées dans la recherche car les manipulations génétiques sont bien connues et maitrisées dans cette espèce. De plus, la séquence du gène chez la souris est très proche de celle de l’être humain, ce qui permettra d’extrapoler les données obtenues. Les souris étudiées seront des souris adultes, car les effets attendus de la mutation s’expriment à l’âge adulte.
Rôle d’un régulateur dans la production d’oestrogènes au cours du cycle hormonal chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
Entre deux et six frottis vaginaux, les premiers sous anesthésie gazeuse, puis une ponction du cœur sous anesthésie en prélèvement terminal : 30 souris femelles vont subir ces actes dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour la récolte de leurs tissus. Le but est de mesurer leur taux d'œstrogènes au fil du cycle hormonal, une protéine régulatrice de la peau n'ayant montré d'effets que chez les femelles dans des résultats préliminaires obtenus sur une lignée développée pour l'étudier. Le porteur choisit la souris pour une organisation des organes qu'il dit "très semblable à l'Homme" et des étapes du cycle hormonal conservées. Sur l'effectif, il écrit seulement que le nombre a été "défini a minima" pour des résultats interprétables, sans calcul ni chiffre par groupe.
Objectifs
L'objectif du projet est de mieux comprendre le rôle d'un protéine régulatrice impliquée dans la physiologie de la peau. Pour cela, un modèle de souris spécifique a été développé, ce qui permet l'étude du rôle de la protéine au sein de la peau. Des résultats préliminaires obtenus sur ce modèle, ont montré son implication dans le développement des vaisseaux sanguins ainsi que dans le métabolisme des lipides, mais cela uniquement chez les souris femelles. Ce rôle sexe-dépendant pourrait être expliqué par les hormones sexuelles, notamment les oestrogènes qui sont des hormones importantes chez les femelles. De plus, un article récent a montré l'expression de la protéine d'intérêt dans l'hypophyse, petite glande située sous le cerveau qui contrôle la sécrétion d'hormones responsables de la production d'oestrogènes. Pour cela, le taux d’œstrogènes dans le sang sera exploré dans le modèle d'intérêt.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des connaissances sur le contrôle de la production d'oestrogènes chez la souris. L’apport de connaissances fondamentales est un prérequis pour comprendre la physiopathologie des maladies vasculaires et permettre le développement de thérapies à plus long terme.
Procédures
Entre 2 et 6 frottis vaginaux seront réalisés, geste qui dure une 15aine de secondes par souris. La ponction cardiaque en prélèvement terminal sera réalisé sur souris anesthésiées 1 fois et durera environ 1 minute par souris.
Impact sur les animaux
Le frottis vaginal réalisé pour vérifier le stade hormonal dans lequel les souris sont peut causer un léger stress momentané chez l’animal et sera donc réalisé sous anésthésie gazeuse au début pour diminuer ces effets.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour la récolte des tissus.
Remplacement
Les expérimentations in vitro on déjà été réalisées et ont donné des résultats concluants quant au rôle de la protéine dans la peau. Il est nécéssaire aujourd'hui de confirmer son rôle dans un modèle plus intégré comme la souris. Le recours aux modèles animaux s’avère donc indispensable.
Réduction
Dans la procédure, le nombre d’animaux a été défini a minima afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables.
Raffinement
Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée entre l’arrivée des souris dans l’animalerie et le début des expérimentations sur celles-ci. Les animaux bénéficieront tous d’une surveillance rapprochée au moins trois fois par semaine grâcfe à des points limites précoces et prédictifs qui ont été définis.
Choix des espèces
La souris représente un modèle de choix car elle présente une organisation des différents organes qui nous intéressent très semblable à l'Homme et les différentes étapes du cycle hormonal sont conservées. Les souris utilisées dans ce projet seront âgées de 6-20 semaines pour rester cohérent avec les expériences déjà réalisées sur ce projet.