Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
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- Système immunitaire
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- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etude du rôle de MKP1 dans le développement des troubles de l’humeur
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
580 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Un état de type dépressif leur est imposé par deux modèles de désespoir, dont une induction de "désespoir acquis" par une méthode non précisée, suivie du test d'évitement, de la nage forcée cinq jours de suite, de la suspension par la queue et de la préférence au saccharose. Le porteur décrit ces atteintes de façon succincte et encadre les procédures par des points limites. Il affirme qu'il lui est "impossible" de recourir à des méthodes alternatives, seul l'animal vigile permettant selon lui d'évaluer les conséquences émotionnelles.
Objectifs
Le but de ce projet est de comprendre le rôle de MKP1 dans le développement de troubles dépressifs dans le but d'établir des traitements plus adaptés contre la dépression. Nous utiliserons un modèle de dépression induite par de stress aigu (modèle de désespoir acquis) afin d'étudier l'expression de MKP1 par qPCR chez des souris susceptibles et résistantes à ce modèle de dépression en les comparant aux souris contrôles. Dans ce même modèle, nous allons utiliser des souris qui n'expériment pas le gène codant pour la protéine MKP1 ainsi que leurs congénères WT afin de déterminer si la seule absence de MKP1 suffit à empêcher le développement d'un comportement de type dépressif suite à l'induction du désespoir acquis. Avenant: Suite aux résultats obtenus, notre hypothèse principale est que MKP1 semble être nécessaire au développement de troubles de type dépressifs sur le long mais pas sur le court terme. Afin de confirmer ou infirmer notre hypothèse, nous souhaitons étudier le rôle de MKP1 dans un autre modèle de désespoir (MDC), qui est chronique, contrairement au modèle de désespoir acquis qui se base du du stress aigu. Cet avenant servira d'expérience pilote à l'établissement d'une nouvelle saisine utilisant ce modèle, si les résultats sont concluants.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre le rôle de MKP1 dans le développement de troubles de type dépressifs. Avenant: Utiliser un modèle de désespoir chronique nous permettra de savoir si MKP1 est nécessaire au développement de troubles dépressifs sur le long terme, alors que cela ne semble pas être le cas sur le court terme.
Procédures
Les animaux du modèle du learned helplessness subiront (objectif 1 et 2 qui correspondent aux procédures 1, 2 et 3): pour les animaux contrôles: environ 10 min de test d'évitement actif ; pour les animaux LH: 2 séances de 50 min d'induction du modèle + environ 10 min de test d'évitement actif. Avenant: Les animaux de l'avenant seront soumis au test de préférence au saccharose en continu, au modèle de nage forcée 10 min/ jour pendant 5 jours consécutifs + 10 min de nage le 32ème jour, une fois à la pulvérisation d'eau sucrée et une fois au test de suspension par la queue.
Impact sur les animaux
Nous nous attendons à un développement de troubles de type dépressifs pour les souris WT et à une absence de ces troubles pour les souris KO. Avenant: Nous nous attendons à un développement de troubles de type dépressifs pour les souris WT et à une absence de ces troubles pour les souris KO.
Devenir
Procédure 1: n=300 animaux max qui sont maintenus en vie et passent en procédure 2 (n=240 max) ou en procédure 3 (n=60 max). Procédure 2: n=240 animaux max qui sont maintenus en vie passent en procédure 3. Procédure 3: n=300 animaux max mis à mort. Procédure 4: n=40 animaux max mis à mort.
Remplacement
Nous ne pouvons pas avoir recours à des méthodes alternatives pour réaliser un tel projet. Il est nécessaire d’évaluer les effets conséquences émotionnelles sur l’animal vigile. Il nous est donc impossible pour cette étape de travailler sur un modèle autre que l’animal.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous génotypons les animaux avant les expériences afin de n'utiliser uniquement ceux dont nous avons besoin (WT et KO). Nous effectuons également les manipulations par petits lots d'animaux afin d'arrêter les expériences lorsque le nombre d'échantillons de bonne qualité est atteint, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux utilisés à long terme.
Raffinement
Les expériences menées sont encadrées par des points limites adaptés, et construites de manière à ce que les souris subissent le moins de stress/angoisses/souffrances possible (transport via un tunnel, enrichissement dans la cage...).
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, font de la souris un modèle pertinent. De plus, le modèle de la souris nous permettra de pouvoir utiliser une lignée de souris dont le gène codant pour MKP1 a été inactivé (knock-down) afin d'approfondire notre étude. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (critères: début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g).
Ischémie reperfusion en condition hyperglycémique: cardioprotection par l’exercice et rôle du NO
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie court quarante-cinq minutes de tapis roulant cinq jours sur sept pendant cinq semaines, avant une ischémie-reperfusion cardiaque menée in vivo sous anesthésie avec pose d'une sonde de pression dans le ventricule. Le porteur reconnaît que l'exercice "peut être stressant" et prévoit des points limites et une euthanasie décidée avec le responsable de l'animalerie. Il affirme qu'il "n'existe aucun modèle de substitution in vitro" pour évaluer l'effet cardioprotecteur de l'exercice en contexte hyperglycémique.
Objectifs
L’hyperglycémie aigue semble pouvoir être à l’origine de dysfonctions mitochondriales notamment caractérisées par une surproduction d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) au niveau cellulaire, conduisant à l’établissement d’une situation de stress oxydant. Cette surproduction de ROS au cours de l’hyperglycémie serait capable d’impacter la dynamique du réseau mitochondrial en favorisant la fission (ou fragmentation) mitochondriale. A l’échelle du muscle cardiaque, ces phénomènes pourraient contribuer à l’établissement d’un phénotype plus sensible au stress et ainsi à une plus grande vulnérabilité du cœur à un syndrome ischémique. Ceci pourrait ainsi permettre d’expliquer que le niveau de glycémie lors de l’admission à l’hôpital de sujets non diabétiques soit un facteur prédictif de la sévérité des lésions d’ischémie-reperfusion. Nos premiers travaux sur le sujet, conduits ex vivo, tendent à confirmer que l’hyperglycémie au moment de l’infarctus du myocarde favorise la production de ROS ainsi que la fragmentation mitochondriale au cours de l’ischémie reperfusion. Parmi les stratégies de cardioprotection efficace à la fois dans les modèles expérimentaux et chez l’homme, l’exercice physique est reconnu comme permettant de diminuer la taille de la zone nécrosée suite à un infarctus du myocarde, notamment via sa capacité à moduler la production de ROS et stimuler le métabolisme du monoxyde d'azote (NO). Les effets de l’exercice physique sur la dynamique mitochondriale restent à ce jour mal décrit. Par ailleurs, à ce jour, l’impact de l’hyperglycémie aigue sur la capacité de l’exercice physique à pré-conditionner l’organe cardiaque et à limiter les lésions au cours de l’infarctus reste mal décrit et les mécanismes sous-jacents non investigués. En résumé les objectifs de cette étude sont: (1) Evaluer l'impact de l'hyperglycémie aigue sur la production de ROS ainsi que sur la fission mitochondriale au cours de l’ischémie-reperfusion myocardique. ; (2) d’évaluer si le pré-conditionnement par l’exercice physique est toujours efficace en condition d’hyperglycémie et enfin (3) évaluer le rôle du NO dans ces phénomènes.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche fondamental devrait permettre de mieux appréhender les mécanismes cellulaires sous-jacents à la vulnérabilité accrue du cœur à l’ischémie-reperfusion lors de situations transitoires d’hyperglycémie. Ceci pourra peut-être permettre, à plus long terme d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
- Certains animaux (groupe ExTr) seront soumis à un exercice physique de 45 minutes, 5/7j pendant 5 semaines sur tapis roulant. Les rats sont surveillés durant toute la durée de l’entrainement par l’expérimentateur. Certains animaux recevront une injection de L-NAME (50mg/kg, ip) 14h00 avant l'acte expérimental d’ischémie-reperfusion. Ces animaux feront l’objet d’un suivi particulier. Une ischémie-reperfusion sera réalisée in-vivo sur des rats anesthésiés en condition hyperglycémique ou non. Les animaux seront traités ou non au préalable avec un inhibiteur de l’enzyme responsable de la synthèse de NO. La fonction cardiaque sera mesurée au cours de la reperfusion par l’implantation d’une sonde millar de pression dans la cavité ventriculaire (voie artérielle) et par la pose d’électrodes de surface pour l’électrocardiographe (ECG). Au total 120 rats seront nécessaires durant cette étude afin de disposer de l'effectif minimum permettant de mettre en évidence des différences statistiquement significatives sur les paramètres étudiés.
Impact sur les animaux
Certains animaux (groupe ExTr) seront soumis à un exercice physique de 45 minutes, 5/7j pendant 5 semaines sur tapis roulant. Cet acte expérimental peut être stressante pour les animaux. Afin de limiter le stress, les animaux sont acclimatés au tapis de course pendant une semaines, 1h00 par jour. Enfin, les rats sont surveillés durant toute la durée de l’entrainement par l’expérimentateur. Certains animaux recevront une injection de L-NAME, un inhibiteur des NOS, 14h00 avant l'acte exéprimental d’ischémie-reperfusion. Ces animaux feront l’objet d’un suivi particulier. Nous avons déterminé des points limites à ne pas franchir pour respecter le bien-être de l’animal : un contrôle de l'état clinique de ces animaux sera réalisé pour différents critères physiologiques et comportementaux. Si nécessaire, la prise de décision d’euthanasie sera réalisée avec le responsable de l’animalerie. Une ischémie-reperfusion sera réalisée in-vivo sur des rats anesthésiés en condition hyperglycémique ou non. Afin de limiter toute souffrance chez les animaux durant cette procédure sans réveil, une anesthésie chimique sera réalisée (isoflurane 4.5% puis 1.5-2%) associée à une analgésié pré-opératoire (buprénorphine; 0.3mg/kg).
Devenir
A l'issu de l'ischémie reperfusion in vivo" la totalité des animaux sont euthanasiés par injection d'une dose léthale de pentobarbital, afin de permettre le prélèvement de tissus.
Remplacement
Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle de substitution in vitro pour évaluer l'effet cardioprotecteur de l’exercice physique sur la fonction cardio-vasculaire lors d’un stress hyperglycémique. L'animal permet d'étudier des mécanismes cellulaires qui ne peuvent être analysés chez le patient soumis à une hyperglycémie aigue. Basé sur l’expérience du laboratoire dans le domaine, les programmes d'entrainement modéré des animaux seront basés sur les mêmes paramètres physiologiques que chez le patient pour se rapprocher aux mieux des conditions cliniques et valider ou non cette stratégie de cardioprotection en condition hyperglycémique.
Réduction
Nos travaux préalables conduits ex vivo ont déjà permis de réduire considérablement le nombre d’animaux nécessaires à cette étude et d’identifier des conditions particulières nécessitant l’utilisation d’animaux.
Raffinement
Les méthodes utilisées sont soit non invasives (protocole d'entrainement), ou finalement sans réveil (anesthésie létale suivit d’un prélèvement d’organe). Au cours de l'acte expérimental d’ischémie-reperfusion in vivo, les animaux seront anesthésiés (Isoflurane) puis analgésiées (injection sous cutanée de buprénorphine 0.3mg/kg). Enfin, les rats seront logés dans des cages de 3 individus, avec nourriture ad libitum et accès à de l’eau fraiche. Un enrichissement de l’environnement sera présent et régulièrement renouvelé (tunnels, abris, cube de bois, coton). Un animalier formé contrôlera le bien-être des animaux tous les jours et nettoiera les cages une fois par semaine.
Choix des espèces
Le rat est un modèle de choix car la physiologie cardiaque des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l’homme. Le modèle rongeur a l’avantage de permettre des investigations depuis l’étage cellulaire et moléculaire jusqu’aux mesures in vivo. L’utilisation du même animal in vivo puis pour des analyses biochimiques permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours du protocole expérimental. Les animaux seront utilisés à un stade de jeune adulte (rats de 12 semaines)
Evaluation de nouveaux traitements pour le diabète de type 1
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Spontanément diabétiques, elles reçoivent chaque semaine pendant quatorze semaines une injection de protéines à tester, subissent un test de tolérance au glucose et des prélèvements de sang répétés, avant une ponction aortique terminale. Le porteur signale le stress lié aux manipulations, au gavage et aux mesures de glycémie, et rappelle que ces souris résistent tardivement à l'acidocétose. Il affirme qu'il est "nécessaire" de démontrer l'efficacité des composés dans un modèle proche de la maladie humaine avant tout essai clinique.
Objectifs
En 2021, le nombre de diabétiques de type 1 (DT1) dans le monde était de 8,4 millions dont 20% ont moins de 20 ans. Plus de 500 000 nouveaux cas apparaissent chaque année et ce chiffre est en constante augmentation. A ce jour, le seul traitement des DT1 approuvé à ce jour est l’insuline. Néanmoins, des complications sévères peuvent se développer et l’espérance de vie des DT1 est réduite de 10 à 15 ans comparé à un individu non diabétique. Le DT1 survient suite à la destruction auto-immune de la plupart des cellules bêta β. Néanmoins, il persiste un petit nombre de cellules bêta fonctionnelles même 50 ans après le diagnostic. Il a par ailleurs été montré, en particulier dans un modèle de DT1 présentant des caractéristiques proches du DT1 humain, la souris diabétique, qu’activer la prolifération des cellules bêta prévenait l’apparition du DT1 dans ce modèle.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de sélectionner une nouvelle molécule présentant un effet antidiabétique grâce à l’augmentation de la masse des cellules bêta pancréatiques, seul ou en combinaison avec les traitements existants et ainsi ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques chez le patient diabétique de type 1.
Procédures
Chaque animal recevra une fois par semaine pendant 14 semaines une injection des protéines à tester ou du véhicule (14 injections) plus une administration de glucose le jour du test de tolérance au glucose, test qui dure 120 minutes. Des prélèvements de sang seront effectués sur chaque animal vigile : - 1 goutte de sang une fois par semaine pendant 14 semaines pour la mesure de la glycémie (durée de prélèvement 2-5 secondes) - 6 prélèvements de sang le jour du test de tolérance au glucose (durée de prélèvements 2-5 secondes, ou de 30 à 60 secondes pour les 4 temps où l'insuline sera dosée dans le plasma). Un prélèvement de sang sur animal anesthésié : ponction aortique immédiatement avant l'euthanasie.
Impact sur les animaux
Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux avec un diabète de type 1 (DT1), qui apparaît spontanément dans le modèle utilisé. La principale complication du DT1 est l’acidocétose diabétique, résultant de l’accumulation de corps cétonique dans le sang. Cependant, les souris utilisées ont la particularité d’être résistante à l’acidocétose, ou du moins son apparition est tardive (souris de plus d’un an); et leur utilisation dans ce projet est à 6 mois d’âge au maximum. Les nuisances attendues liées aux expérimentations sont: le stress dû aux multiples manipulations et mesures de glycémie, au gavage et éventuellement au point d'injection pour l'administration d'insuline. Les techniques employées dans ce projet pour suivre la glycémie sont des techniques utilisées également chez l’homme, comme le test de tolérance au glucose.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les souris seront euthanasiées afin de prélever les tissus d’intérêt, tels que le pancréas pour mesurer la masse des cellules bêta et évaluer l’infiltration par les cellules immunitaires et le thymus et la rate pour réaliser un profil immunologique.
Remplacement
L’objectif final du projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique de composés sélectionnés au préalable sur des tests in vitro pour le traitement du diabète de type 1. Cependant, avant tout essai clinique, il est nécessaire de démontrer l’efficacité de ces composés dans des modèles physiopathologiques dont les caractéristiques sont proches de la pathologie humaine.
Réduction
Les produits testés dans le projet sont des produits qui auront montré un effet positif significatif dans des tests in vitro (lignées de cellules bêta pancréatiques et îlots de Langerhans). Des études précédentes sur les souris spontanément diabétiques montrent que l’utilisation d’un minimum de 14 à 16 animaux par groupe de traitement est nécessaire pour obtenir une puissance statistique suffisante et donc des effets significatifs sur la glycémie, sachant que l’incidence du diabète est de 60 à 80% chez la souris femelle spontanément diabétique que nous allons utiliser. Pour limiter le nombre d‘animaux utilisés, 3 protéines seront testées par étude, évitant ainsi de multiplier le nombre de groupes contrôles. Par la suite, la protéine d’intérêt sélectionnée sera testée en combinaison avec une seule dose de produit commercial (dose usuelle dans la littérature) afin de limiter le nombre d’animaux par étude.
Raffinement
Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible. Les animaux sont hébergés à au moins 3 par cage, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. De plus, un enrichissement de leur milieu sera effectué par un ajout de tunnels, de matériaux de nidification et de bûchettes de peuplier à ronger. Un suivi quotidien de tous les animaux sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). Les points limites sont les suivants : troubles du comportement; signes d'absence de toilettage (poil hirsute, pelage sale); perte de poids supérieure à 20%. L’ensemble des procédures de ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation.
Choix des espèces
Les souris ont une physiologie métabolique proche de l'homme notamment en ce qui concerne la régulation de la glycémie et sont souvent utilisées comme modèles de pathologie humaine comme le diabète. Nous utiliserons une lignée de souris spontanément diabétique comme le modèle de choix du DT1, de par leur susceptibilité au développement spontané d’un diabète auto-immun avec des caractéristiques similaires au diabète humain de type 1. Il s'agit de jeunes adultes, âgés de 6 à 9 semaines à la livraison, qui seront traités pendant 14 semaines par les molécules à tester ou le placebo. Après acclimatation au sein de notre animalerie pendant au minimum une semaine, les traitements commenceront à l’âge de 9 – 10 semaines. A cet âge les souris sont déjà diabétiques mais sans que la maladie ne soit trop grave et provoque une acidocétose. Chez l'Homme, le diabète de type 1 apparait majoritairement chez les adolescents et jeunes adultes.
Mise au point de la cavitation ultrasonore pour la délivrance de chimiothérapie et le traitement du cancer du pancréas dans un modèle murin.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
739 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une greffe de tumeur du pancréas par chirurgie, puis des injections de chimiothérapie et un traitement par ultrasons de puissance pendant cinq semaines, avec un suivi par imagerie sous anesthésie. Le porteur indique que la croissance tumorale peut causer une perte de poids et des signes de souffrance, pris en charge par analgésie, et qu'une soixantaine d'animaux subissent une chirurgie supplémentaire pour l'implantation de sondes. Il affirme que les cultures cellulaires en 3D ne représentent pas la physiologie tumorale et juge le modèle animal seul capable de la reproduire.
Objectifs
Le cancer du pancréas est une maladie grave avec près de 100% de décès dans les 5 années suivant le diagnostic. La raison principale de ce mauvais pronostic est que l’environnement de la tumeur (appelé stroma) est très dense et empêche la chimiothérapie d’atteindre sa cible. Ainsi modifier cet environnement tumoral pour le rendre moins dense permettrait à la chimiothérapie d’être plus efficace. Les ultrasons de puissance, focalisés, permettent de modifier cet environnement tumoral dans des zones précises, sans impacter les tissus sains. En l’appliquant aux tumeurs du pancréas nous souhaitons savoir si ces ultrasons de puissance permettet d'améliorer l'efficacité de la chimiothérapie. Le projet se déroulera en deux phases : une première phase déterminera les paramètres ultrasonores optimaux augmentant l'efficacité de la chimiothérapie dans des tumeurs greffées. La deuxième phase utilisera ces réglages pour les appliquer dans un modèle génétique de tumeurs du pancréas, plus proche de la maladie humaine, mais pour lequel il est compliqué d’avoir suffisamment de tumeurs comparables en même temps pour réaliser une étude et nécessitant un nombre important d'animaux à élever. Ce projet de recherche translationnelle d’une durée de 3 ans mettra en œuvre un maximum de 739 souris.
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre de valider le système de traitement ultrasonore ainsi que les conditions de son utilisation pour envisager des essais chez les patients pour traiter le cancer du pancréas par endoscopie.
Procédures
Pour la première phase de l'étude, des souris dépourvues de système immunitaire seront utilisées. Parmi ces souris, certaines se verront injecter des cellules tumorales par injection sous-cutanée (210 animaux). La croissance de ces tumeurs peut prendre jusqu'à 6 semaines . Les autres seront opérées sous anesthésie générale et analgésie pour greffer dans le pancréas des fragments tumoraux issus de ces tumeurs sous cutanées (489 animaux). Ces tumeurs mettent 3 semaines à se développer. Ces souris recevront ensuite des injections intra-péritonéales de chimiothérapie ainsi qu'un traitement par ultrasons de puissance pendant 5 semaines. Pour suivre la croissance des tumeurs dans le pancréas et leur réponse au traitement, les souris seront examinées par imagerie non-invasive sous anesthésie générale. Pour mesurer de manière précise les effets des ultrasons de puissance, certains animaux greffés (60) subiront une opération chirurgicale sous anesthésie générale pour appliquer des sondes de mesure directement dans la tumeur, les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience. Pour la deuxième phase de l'étude, des souris génétiquement modifiées seront croisées pour obtenir une mutation conduisant au développement de tumeurs du pancréas. Ces 40 souris voient appraître des tumeurs entre 10 et 20 semaines et seront ensuite traitées 5 semaines par injection intra-péritonéale de chimiothérapie et par ultrasons de puissance sous anesthésie générale. Tous ces animaux seront suivis par imagerie non-invasive pour suivre la croissance des tumeurs, et caractériser l'effet du traitement.
Impact sur les animaux
La croissance des tumeurs dans le pancréas peut entrainer des pertes de poids et des signes de souffrance si celles-ci sont trop importantes, d'où un suivi précis par imagerie non-invasive et une prise en charge de la douleur par analgésiques. La chirurgie du pancréas induit une douleur liée au geste chirurgical, prise en charge par une analgésie adaptée.
Devenir
Tous les animaux de la procédure 1 sont mis à mort et les tumeurs prélevées seront utilisés pour les procédures 2 à 7. Tous les animaux des procédures 2 à 8 sont mis à mort en fin d'étude pour analyser les tumeurs qu'ils portent et caractériser les effets du traitement.
Remplacement
Des études in vitro ont été réalisées pour déterminer la plage de fonctionnement à utiliser pour les ultrasons de puissance et documenter leur impact couplé à la chimiothérapie dans des modèles de culture cellulaire 3D. Toutefois ces techniques ne peuvent représenter correctement la physiologie du développement tumoral (vascularisation, potentiel métastatique, réponse immune), seul un modèle animal le permet.
Réduction
Le nombre de souris suivies est réduit à ce qui est nécessaire pour être significatif à l'aide de test statistiques adaptés. Des outils d’imagerie non invasive seront utilisés pour suivre le développement tumoral, évitant des mises à mort séquentiels et limitant le degré de souffrance des animaux, les tumeurs étant détectées très tôt. Les résultats de cette étude permettront de réduire par la suite le nombre d’animaux sur le modèle de référence.
Raffinement
Le suivi de la douleur et du stress sera réalisé un à deux fois par semaine et des points limites clairs ont été définis, entrainant la mise à mort si nécessaire. Un suivi plus fréquent est prévu en suite opératoire et après injection des traitements. Les procédures d’imagerie et de chirurgie seront réalisées sous anesthésie avec une analgésie adaptée. Dans ce projet de mise au point, les principaux organes seront prélevés afin de déceler d’éventuelles métastases. Les animaux seront hébergés dans des cages disposant d’enrichissement (tubes en carton et cotons compactés).
Choix des espèces
La souris est un bon modèle de tumeurs du pancréas et nous avons besoin de lignées spécifiques n'existant pour certaines que chez la souris. Les animaux utilisés pour les greffes de tumeur du pancréas seront utilisés à l’âge adulte (8 à 10 semaines), les animaux transgéniques développant des tumeurs à partir de l'âge adulte (au delà de 10 semaines).
Maintien d’une banque de tumeurs épithéliales mammaires humaines par des approches de xénogreffes orthotopiques chez la souris immunodéficiente.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
904 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent par chirurgie une greffe de tumeur mammaire humaine, parfois suivie d'une résection, pour entretenir une banque de xénogreffes issues de patientes atteintes de cancer du sein. Le porteur suit la croissance tumorale au pied à coulisse et prévoit des points limites, avant une mise à mort permettant de prélever la tumeur ou de cartographier les métastases sur de nombreux organes. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité tissulaire d'une tumeur, seule la greffe in vivo la restituant selon lui.
Objectifs
Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent et le plus meurtrier chez la femme, à l’origine d’un peu plus de 11 800 décès par an en France. C’est une maladie complexe. Il existe de nombreux sous types de tumeurs mammaires qui ont des profils histologiques, génétiques et génomiques variés expliquant une évolution clinique différente. Cette hétérogénéité constitue à l’heure actuelle un des freins majeurs à une prise en charge thérapeutique optimale des patientes. Le développement de modèles précliniques mimant la complexité de la maladie est donc indispensable pour définir au mieux le traitement de demain. Pour cela, nous avons établi, dans un précédent projet (#01152.03), une banque d’une cinquantaine de xénogreffes (également appelée xénobanque) issues de tumeurs de patientes atteintes de cancer du sein (PDXs : Patient Derivated Xenograft) qui ont été archivées sous forme d’ampoules. Ce modèle a été démontré comme mimant parfaitement la biologie de la tumeur chez la patiente avec des profils histologiques, génomiques et transcriptionnels identiques (Marangoni et al., CCR 2007; Reyal F et al., BCR 2012; Derose et al., Nat med 2011). Il a également été démontré que ces modèles de xénogreffe reproduisent fidèlement la réponse aux thérapies conventionnelles observée chez les patientes (Zhang et al., Cancer Res 2013). Par ailleurs, cette xénobanque a permis d’initier la caractérisation du rôle des cellules souches cancéreuses (CSCs) présentes au sein de la tumeur et qui est à l’origine de 20 % des cancers du sein (Müller et al., 2020 ; Arfaoui et al., 2019, Guégan et al., 2019). Cette xénobanque sera donc au centre de notre projet qui aura 3 objectifs principaux: 1/ La préservation de la xénobanque; 2/ La caractérisation du développement métastatique des échantillons de la xénobanque; 3/ Le déploiement de la xénobanque dans des tests précliniques.
Bénéfices attendus
La préservation de la xénobanque réalisée grâce à ce projet permettra notamment de poursuivre la carctérisation de du développement métastatique des échantillons de cette banque et de mieux comprendre le rôle des CSCs dans ce processus permettrait de développer de nouvelles approches thérapeutiques afin d’améliorer la prise en charge des patientes atteintes de cancer du sein. Le matériel issu de cette xénobanque sera également utilisé pour l’étude des thérapies ciblant les CSCs en combinaison avec des traitements de chimiothérapie conventionnels (#16487-2018082108541206 v3), le développement de traitements ciblant la maladie métastatique (#21988-2019080815368654 v4) et l’étude de l’impact de la radiothérapie seule sur les CSCs ou combinée avec une thérapie capable de radiosensibiliser les CSCs (#26523-2020070810304662 v2). In fine, le renouvellement de cette xénobanque nous permettra d'approfondir nos connaissances sur le cancer du sein, son développement métastatique, sa résistance thérapeutique et plus particulièrement les CSCs pour pouvoir, espérons un jour, proposer une thérapie ciblée pour chaque patiente.
Procédures
L'ensemble des animaux subira une procédure chrirugicale (sous anesthésie) lors de l'implantation des cellules tumorales dans la glande mammaire qui durera approximativement 15 minutes. Dans le cas de la procédures 2, les souris seront soumis à une procédure chirurgicale supplémentaire de résection de la tumeur qui durera 10-15 minutes.
Impact sur les animaux
L'ensemble des animaux subira une procédure chrirugicale lors de l'implantation des cellules tumorales dans la glande mammaire. La nuisance de ces actes chirurgicaux sera prise en compte par l'application d'une anesthésie générale, d'une analgésie post-operatoire et l'utilisation d'un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. Les éventuelles nuisances liées à la croissance tumorale seront détectées au plus tot à l'aide d'une grille de score de la douleur intégrant des points limites les plus précoces possibles.
Devenir
A l'issue de la Procédure 1, les souris seront sacrifiées et les tumeurs seront prélevées, dissociées et soit réinjectées dans des glandes mammaires pour nos autres projets soit pour réaliser des ampoules pour notre xénobanque. Suite à la Procédure 2, les souris seront sacrifiées et différents organes seront prélevées afin de réaliser la cartographie métastatique de chaque souris (coeur, poumons, cerveau, rate, reins, foie, ovaires, cage thoracique, squelette).
Remplacement
Sur le plan physiopathologique, une greffe orthotopique de cellules tumorales obtenue chez un animal présente des caractéristiques, non pas identiques, mais similaires à celles d'une tumeur humaine, avec une complexité tissulaire impossible à reproduire in vitro. De même, la coopération spatiale des cellules, l’importance du stroma, l’angiogenèse péritumorale, le contexte cytokinien, sont des mécanismes cruciaux lors de la croissance tumorale et qui ne peuvent pas être reproduits de façon satisfaisante in vitro.
Réduction
Nous nous limiterons au nombre minimum d'animaux permettant la réalisation d’ampoules et de nos différentes études. De plus, lorsque cela sera possible, les mêmes animaux serviront aux étapes de rafraichissement et d’amplification. Ce projet de maintien d'une banque de xénogreffes nécessitera donc 904 souris immunodéficientes de type NSG.
Raffinement
Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture et eau ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). Le suivi du développement tumoral se fera par des mesures cinétiques utilisant des procédés non invasifs : la mesure du volume tumoral à l’aide d’un pied à coulisse. Les procédures de transplantation seront réalisées sous anesthésie associée à une analgésie afin d’éviter toute douleur. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l’apport d’un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvèlement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour / 12h nuit). Afin de respecter leur instinct grégaire, les souris seront stabulées par petits groupes de 3 à 5 dans des cages dont l’environnement est enrichi à l’aide de copeaux de bois compactés, de lanières de papier et éventuellement d’un dôme. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal.
Choix des espèces
Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. L’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de notre approche, permettant la transplantation de cellules d’un individu d’une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d’une espèce différente (souris). Des souris adultes pubères de 6 à 10 semaines seront incluses dans les procédures expérimentales, après le développement du tissu épithélial mammaire. En effet, le développement de la glande mammaire est un processus postnatal. A la naissance, chez la souris, le rudiment mammaire comprend un canal primaire bien formé et quelques ramifications secondaires. La glande mammaire reste quiescente jusqu’au début de la puberté (4 semaines), puis les canaux mammaires s’allongent et se ramifient intensivement, envahissant progressivement tout le stroma adipeux qui entoure la glande.
Effets thérapeutiques d’extraits de plantes sur les mammites subcliniques chez la vache laitière et conséquences sur les qualités sensorielle et technologique du lait
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
54 vaches laitières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, le porteur prévoyant de les réintégrer au troupeau à l'issue plutôt que de les tuer. Atteintes de mammite subclinique, elles reçoivent des huiles essentielles et subissent cinq prises de sang à la veine caudale par procédure. Le porteur affirme que ces huiles "ne présentent aucun effet indésirable" sur leur santé, sans décrire d'autre contrainte. Il justifie le recours aux vaches par l'objet même de l'étude, une pathologie de la vache laitière, et vise aussi les qualités du lait pour la production.
Objectifs
Au cours des trois dernières décennies, la production mondiale de lait a augmenté de plus de 58%, passant de 522 millions de tonnes en 1987 à 828 millions de tonnes en 2017. Cependant, cette activité, comme toutes les productions animales, est soumise à diverses difficultés. Ces dernières peuvent être d’ordre économique comme l’augmentation des coûts de production ou sanitaire avec les problématiques liées à l’élevage bovin. Du point de vue sanitaire, l’infection la plus importante en élevage bovin laitier est la mammite. Le coût moyen d’une mammite clinique revient à 230€ par vache et par an. Ce coût est composé de 52% de pertes directes (baisse de production, lait écarté, réforme prématurée, traitements, etc.) et de 48% de pertes indirectes (temps consacré aux soins, pénalités sur le paiement du lait, etc.) Le traitement des mammites chez les vaches en lactation s’effectue par l’utilisation d’antibiotiques. Cependant, leur utilisation prolongée développe une résistance antimicrobienne, contamine le lait et les autres productions animales et est à l’origine d’une pollution environnementale liée aux résidus d’antibiotiques. Dans ce contexte, les éleveurs recherchent de nouvelles solutions leur permettant de limiter l’apparition de mammites et l’utilisation des antibiotiques. L’objectif du projet est d’explorer l’utilisation d’huiles essentielles et d’extraits de plantes médicinales avec des activités antibactériennes et antiinflammatoires en thérapie contre les mammites subcliniques qui se traduisent sans symptômes apparents par une augmentation du taux de leucocytes dans le lait et d’évaluer leurs conséquences sur la qualité du lait.
Bénéfices attendus
Ce projet concernera donc des animaux atteints de mammite subclinique c'est à dire ayant une numération cellulaire dans le lait supérieure à 250 000 cellules par ml.
Procédures
Les animaux seront hébergés et logés selon les normes en vigueur dans les élevages laitiers. Les vaches seront nourries à volonté et traitent 2 fois par jour. Pour chaque procédure, 5 prises de sang seront réalisées à la veine caudale (9 ml) au cours des jours suivants la mises en présence d'huile essentielle. J0, J4, J7, J14 et J28 pour la procédure 1 et J0, J7, J21, J28 et J35 pour la procédure 2
Impact sur les animaux
L’utilisation des huiles essentielles ne présente aucun effet indésirable sur la santé des vaches laitières.
Devenir
Suite à l'estimation de l'état général des animaux en fin d'essai, la décision pourra être prise par le responsable de l'installation exprimentale de réintégrer les vaches dans le troupeau non expérimental. Si une alerte au niveau de l'état général d'un animal le justifiait, la cellule bien-être (SBEA) et le vétérinaire seraient consultés.
Remplacement
Il n'est pas possible de remplacer l'utilisation d'animaux pour étudier les effets thérapeutiques des huiles essentielles sur les mammites chez la vache.
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive des animaux tout le long des expériences.
Choix des espèces
Il s’agit d’un travail sur une pathologie chez la vache laitière (mammite). Les bovins sont donc le modèle optimal pour cette étude. La race de vache laitière utilisée sera la Prim' Holstein. Il s'agit de la race de vache laitière la plus répandue dans le monde. Les résultats de ce projet ont vocation à être diffusés au niveau international. Les vaches laitières seront des vaches adultes en lactation et non gestantes
Effet anti-tumoral d’un pro-médicament expérimental
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur dans le coussinet adipeux mammaire sous anesthésie, puis des injections répétées trois fois par semaine pendant un mois d'un pro-médicament expérimental activé par les espèces réactives de l'oxygène. Le porteur ne détaille guère les nuisances liées à la croissance tumorale au-delà de la mention des greffes, et prévoit des points limites précoces. Il affirme qu'il est "absolument nécessaire" d'utiliser un modèle in vivo, le système immunitaire étant selon lui impossible à reconstituer in vitro.
Objectifs
Le mode d'action de la majorité des agents chimiothérapeutiques, qui ont été cliniquement approuvés pour le traitement de cancers hématologiques, reposent sur un ciblage rapide des cellules en croissance. Cependant, en dehors des cellules cancéreuses, certains types de cellules non malignes présentent également une telle propriété. Par conséquent, bien que de grands progrès aient été réalisés dans ce domaine au cours des dernières décennies, la spécificité des chimiothérapies est encore faible. Ce problème peut être approché en utilisant des médicaments anti-tumoraux ciblés. Cependant, les cancers qui dépendent d’un seul récepteur ou enzyme sont rares. Un ciblage plus robuste peut être potentiellement atteint par l’activation de pro-médicaments dans le microenvironnement spécifique du cancer. Il a été démontré que la majorité des cellules cancéreuses surproduisent les ROS (espèces réactives de l’oxygène) alors que dans les cas des cellules non-malignes, leur concentration est extrêmement faible. Étant donné que la production élevée de ROS semble être une caractéristique générale du cancer,, les pro-médicaments activés par les ROS sont potentiellement applicables pour le traitement de nombreux types de cancer différents. Nous nous intéressons particulièrement à un pro-médicament, dérivé du N-alkylaminoferrocene. Cette molécule induit une mortalité cellulaire via la perturbation des lysosomes, l’augmentation de la production de ROS, l’arrêt du cycle cellulaire en phase G0/G1 et d'autres mécanismes. Le traitement avec cette molécule chez la souris greffée nous permettra de confirmer l’effet anti-tumoral constaté in vitro. L’analyse des tumeurs (microenvironnement) après traitement nous informera sur la capacité de cette molécule de stimuler les réponses immunitaires anticancéreuses et donc à rétablir une immunosurveillance défaillante caractéristique des tumeurs.
Bénéfices attendus
Nous nous attendons à une diminution de la croissance tumorale après traitement avec le médicament testé en association aux traitements conventionnels anti-tumoraux comparée aux traitements conventionnels seuls. Cela permettra de proposer de nouvelles combinaisons de traitements anti-tumoraux aux patients par la suite.
Procédures
Les animaux seront soumis à une greffe dans dans les coussinets adipeux mammaires (animal sous anesthésie générale) une fois (durée 15 minutes) puis à des injections intra-peritonéales (anesthésie locale), 3 fois par semaine pendant 1 mois (durée
Impact sur les animaux
Greffes de tumeurs en sous-cutané.
Devenir
Pour chaque procédure, les animaux seront euthanasiés à la fin pour analyses.
Remplacement
Ce projet ayant pour objectif de tester si notre composé induit une réduction de la croissance tumorale et une activation du système immunitaire, il est nécessaire d’utiliser un modèle mimant le plus fidèlement possible l’environnement tumoral et le système immunitaire. Il est actuellement impossible de reconstituer un système immunitaire in vitro/ex vivo du fait de sa complexité. Il est donc absolument nécessaire pour ce projet d’utiliser un modèle in vivo. Nous avons choisi le modèle souris car notre projet s'applique à étudier l'implication du système immunitaire dans la lutte anti cancéreuse chez le mammifère. La souris est le mammifère le plus utilisé en expérimentation animale car suffisamment petit pour en avoir un certain nombre, facile à manipuler et suffisamment grand pour pouvoir recevoir des injections de cellules tumorales.
Réduction
Pour la réalisation de ce projet, nous utiliserons des groupes permettant une évaluation statistique solide des effets analysés. Ceci a été confirmé par des calculs de puissance (puissance à de 80% et risque alpha à 5%). Pour cette expérience, on peut attendre une réduction de 20% de la taille de la tumeur dans les groupes traités par rapport au contrôle, avec une déviation standard d’environ 17%. Nous chercherons à regrouper les expériences dans le but de réduire le nombre d'animaux témoins. Les tests statistiques utilisés pour suivre la croissance tumorale seront des tests longitudinaux de suivi individuel permettant d'augmenter la puissance et de diminuer le nombre d'animaux.
Raffinement
Les animaux seront suivis quotidiennement. Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, au moins une fois par semaine et avant euthanasie lors de l’expérience de croissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux disposeront de nids, de tunnels en carton. Le stress des animaux sera évalué quotidiennement par des échelles d'hétéroévaluation (évaluation des experssions faciales), et examen clinique. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
Le choix de la souris se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques : De par sa petite taille, la souris est un animal facile à manipuler et il est possible d’en héberger un nombre relativement important. C’est aussi un animal suffisamment grand pour pouvoir recevoir des injections de cellules tumorales. La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés au stade adulte (6-9 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé).
Evaluation du potentiel anti-thrombotique d’anticorps anti plaquettaires
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
896 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant du modéré au sévère, une partie menée sous anesthésie sans réveil. Elles subissent plusieurs modèles de thrombose par pincement de l'aorte, chlorure de fer ou ponction de la carotide, un modèle d'accident vasculaire cérébral classé sévère sur vingt-quatre heures, et des modèles d'inflammation cutanée et pulmonaire. Le porteur décrit après réveil une prostration, une activité réduite et des troubles respiratoires, et évoque des souris humanisées pour la protéine GPIb. Il affirme que ces processus sont trop complexes pour des modèles in vitro "pas assez sophistiqués" et teste des anticorps anti-plaquettaires.
Objectifs
Les plaquettes jouent un rôle principal dans l’arrêt du saignement mais elles sont également impliquées dans la thrombose artérielle. Le complexe GPIb-V-IX est le récepteur clé des plaquettes au facteur Willebrand (FW). Cette interaction assure l’adhérence des plaquettes au sous-endothélium lésé. Le complexe GPIb-V-IX joue un rôle important dans la croissance du thrombus il est donc une cible anti-thrombotique reconnue. Il participe également à la formation du clou hémostatique et il est possible que son ciblage entraine un risque hémorragique. Nous avons généré trois anticorps qui bloquent l’interaction entre le complexe GPIb-V-IX humain et le facteur Willebrand. Nous avons montré ces anticorps inhibent in vitro la formation d’un thrombus dans une chambre de perfusion avec du sang humain. L’objectif du projet est d’évaluer le potentiel anti-thrombotique de ces 3 agents en les comparant à d’autres agents déjà validés dans des modèles de thrombose expérimentale. En parallèle nous utiliserons d’autres modèles in vivo pour évaluer le risque hémorragique. Ces modèles seront réalisés dans des souris humanisées pour la GP1b humaine (hGP1b), la GP1b murine étant remplacée par la GP1b humaine. Les plaquettes présentent des microfilaments d’actine impliqués en hémostase. La dynamique du cytosquelette d’actine correspond à un ensemble de processus d’assemblage et de désassemblage, dynamique indispensable pour le bon fonctionnement des cellules. Ces processus sont notamment régulés par les protéines de la famille des MICAL responsable d’oxydations, dont MICAL1 présent au niveau plaquettaire. De plus, il a été mis en évidence que ces oxydations sont importantes au niveau cardiovasculaire. Le rôle de MICAL1 plaquettaire sera évalué en thrombose artérielle grâce aux modèles de lésion mécanique suite au pincement de l’aorte abdominale ; lésion chimique suite à l’application d’un tampon imbibé de chlorure de fer sur la carotide ; lésion de la carotide par une piqure d’aiguille.
Bénéfices attendus
Le complexe GPIb-V-IX joue un rôle important dans la croissance du thrombus il est donc une cible anti-thrombotique reconnue. Il participe également à la formation du clou hémostatique et il est possible que son ciblage entraine un risque hémorragique. Nous avons généré trois anticorps qui bloquent l’interaction entre le complexe GPIb-V-IX humain et le facteur Willebrand. Nous avons montré que ces anticorps inhibent in vitro la formation d’un thrombus dans une chambre de perfusion avec du sang humain. L'évaluation de ces 3 agents pourrait conduire à l'identification d'un nouvel antiplaquettaire n'induisant pas de risque hémorragique, pouvant ainsi déboucher sur des essais cliniques afin d'en tester la sécurité et l'efficacité chez l'Homme. D'autre part, MICAL1 (responsable d'oxydations) est impliqué dans la dynamique du cytosquelette d'actine indispensable au bon fonctionnement des cellules. Il a été mis en évidence la présence de nombreuses oxydations au niveau cardiovasculaire. L'évaluation du rôle de MICAL1 plaquettaire en thrombose artérielle pourrait faire progresser les connaissances scientifiques et notamment mieux comprendre les mécanismes impliqués en thrombose artérielle.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - Un modèle de thrombose par pincement mécanique sur l'aorte de la souris anesthésiée, une procédure classée sans réveil. 432 souris y seront soumises. La procédure dure 30 minutes - Un modèle de thrombose au chlorure de fer sur carotide de souris anesthésiée, une procédure classée sans réveil. 112 souris y seront soumises. La procédure dure 30 minutes. - Un modèle de thrombose par ponction d'une carotide de souris anesthésiée, une procédure classée sans réveil. 112 souris y seront soumises. La procédure dure 30 minutes. - Un modèle d'AVC (procédure chirurgicale) classé sévère auquel 80 souris seronts soumises. La procédure dure 24h. - Un modèle d'inflammation cutanée par formation de complexes immuns (rpA d'Arthus) induit par injections intradermiques et rétro-orbitale, classé modéré auquel 80 souris seronts soumises. La procédure dure 4h. - Un modèle d'inflammation pulmonaire induite par l'innoculation intranasale de LPS, classé modéré auquel 80 souris seronts soumises. La procédure dure 24h.
Impact sur les animaux
Les 3 modèles de thrombose sont des procédures sans réveil réalisées sous anesthésie. On pourra s'attendre à un impact sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée). Pour le modèle d'AVC ischémique, durant l'anesthésie on peut également s'attendre à un impact sur le rythme respiratoire. Au moment du réveil, on s'attend à un impact sur le comportement (activité réduite voire prostration), sur l'apparence physique (apparence des poils, paupières fermées), sur la nutrition, sur la température et également sur la motricité (rotation). Pour le modèle d'Arthus, durant l'anesthésie on peut également s'attendre à un impact sur le rythme respiratoire. Au moment du réveil, on s'attend à un impact sur le comportement (prostation) et sur l'oeil (fermeture de la paupière). Pour le modèle de saignement pulmonaire, durant l'anesthésie on peut également s'attendre à un impact sur le rythme respiratoire. Au moment du réveil, on s'attend à un impact sur le comportement (prostration) et la respiration (accélération, sifflements).
Devenir
Tous les animaux seront sacrifiés à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Le but de ce projet est d’évaluer le rôle d’un récepteur antiplaquettaire humain dans des processus complexes et intégrés que sont la thrombose, l’AVC hémorragique ou encore les saignements en conditions inflammatoires. Ces processus sont particulièrement complexes et font intervenir plusieurs types cellulaires ainsi que des conditions hémodynamiques (vaisseaux, pression artérielle, flux sanguin), les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués pour reproduire toute la complexité de ce processus.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude sera réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 16 souris/groupe au maximum pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Nous utiliserons des tests de Mann-Whitney pour la comparaison de 2 groupes et un test Kruskal-Walis post-test Dunn pour les comparaisons multi-groupes.
Raffinement
Les conditions d’hébergement des animaux sont optimisées par l’enrichissement des cages avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet de compartimenter leur environnement selon leurs besoins. Les animaux, entre 2 et 6 par cage, ont un accès permanent à l’eau de boisson et à la nourriture. Les conditions de travail pour l’utilisation de modèles animaux ont été raffinées au maximum afin de limiter leur angoisse, stress et douleur lors des manipulations. Pour ce faire, des points limites spécifiques ont été établis pour chaque procédures. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter la souffrance et l’inconfort de l’animal. Lors des procédures, les animaux sont anesthésiés, maintenus à une température de 38°C par l’utilisation d’une plaque chauffante (tout au long de la procédure) et un traitement approprié contre la douleur leur est administré. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles d’étude in vivo sont largement répandus et maitrisés. Les techniques de mutagénèse dirigée ont permis de générer des souris exprimant la GPIb humaine (hGPIb) et des souris déficientes en MICAL1 spécifiquement au niveau mégacaryocytaire et plaquettaire. Ces lignées sont parfaitement adaptées à cette étude et constitue un outil original et unique. Des souris hGPIb, MICAL1-/- et WT âgées de 8 à 24 semaines seront utilisées dans les procédures 1,2,4,5,6. Cet âge correspond à la période où les souris pubères et ne présentant pas encore de modifications biologiques dues au vieillissement. Pour la procédure 3, le vaisseau doit être strictement calibré. L’écart d’âge entre les individus sera restreint entre 8 et 10 semaines.
Le test d’observation d’Irwin
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 3600
7 200 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des candidats-médicaments puis passent le test d'observation d'Irwin, une batterie d'évaluations comportementales et neurologiques destinée à repérer la toxicité avant tout essai chez l'humain. Le porteur indique qu'un animal atteignant un point limite est "immédiatement mis à mort", et qu'un prélèvement de sang intracardiaque sous anesthésie précède le prélèvement du cerveau. Il affirme qu'il "n'existe pas" de modèle sans animaux ni de méthode moins sévère fournissant des informations équivalentes.
Objectifs
Les directives réglementaires recommandent des évaluations pharmacologiques de sécurité spécialisées pour caractériser les effets induits par les médicaments sur le système nerveux central (SNC) avant leur administration chez l’humain et tout au long du développement clinique. Le test d’observation d’Irwin, couramment utilisé par l'industrie pharmaceutique, est une batterie d'observations contenant plusieurs paramètres pour évaluer l'état global comportemental, neurologique et autonome d'un animal (rat ou souris). Cela implique l'évaluation systématique de plusieurs paramètres à l'aide d'une échelle de notation détaillée. Le but de ce projet est d’évaluer les effets induits par les médicaments sur le SNC avant leur administration chez l’homme.
Bénéfices attendus
Les résultats du test d'Irwin sont utilisés pour déterminer la toxicité potentielle d’une nouvelle substance (aigüe et chronique) et peuvent aider à déterminer la gamme de doses à tester dans d'autres tests. Par ailleurs, ce test d’observation peut également fournir une première orientation, qui peut être pertinente, vers une indication thérapeutique spécifique, un mécanisme d'action spécifique ou une fonction physiologique spécifique. Il permet également d'éviter toute expérimentation inappropriée, en orientant les études d'efficacité postérieures, voire même d'interrompre celles-ci en cas d'effets secondaires.
Procédures
La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal. Selon les directives du donneur d’ordre le prélèvement de sang est réalisé en intracardiaque sous isoflurane pour un prélèvement sanguin compris pour les rats entre 1 ml à 4 ml maximum et pour les souris entre 0.5 ml à 1ml. A la suite, du prélèvement sanguin, le cerveau de l’animal est prélevé.
Impact sur les animaux
Lors de l'administration d'un nouvel agent thérapeutique, certains effets indésirables peuvent apparaître. Ainsi pour vérifier une éventuelle toxicité et en limiter les risques, l'état général des animaux est évalué selon notre grille. De ce fait, si un animal atteint, à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.
Devenir
A la suite de la procédure "d'administration des produits", tous les animaux passent en test. Puis, à la fin du test d’observation d’Irwin, les animaux seront soumis à un prélèvement de sang en intracardiaque sous anesthésie générale puis à un prélèvement de cerveau.
Remplacement
Il n'existe pas à ce jour de modèle n'utilisant pas d'animaux ou ayant un degré de sévérité inférieur permettant d'obtenir des informations équivalentes à celles obtenues par le présent modèle.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Il correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p < 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles. Ces analyses statistiques ont montré qu’un nombre de 12 animaux par groupe est nécessaire pour l’obtention de résultats fiables et reproductibles.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des locaux appropriés et dans des cages contenant des enrichissements conformément aux standards réglementaires. Leur état sanitaire sera évalué quotidiennement selon notre grille de surveillance. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l’expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Les lignées de rats utilisées (selon les protocoles) sont : Wistar ou Sprague Dawley Les lignées de souris utilisées (selon les protocoles) sont : C57Bl/6 J et SWISS. D'autres lignées de souris peuvent également être utilisées (C57Bl/6 N, BALB/c, DBA/2...) Stade de développement : 6-7 semaines au moment du test (âge adulte). Les produits testés sont destinés à des patients adultes.
Rôle du récepteur à l’ocytocine dans les cellules contrôlant la reproduction et les comportements
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une partie menée sous anesthésie sans reprise de conscience. Elles reçoivent des composés et une puce, et une délétion sélective du récepteur à l'ocytocine réduit selon le porteur leur sociabilité et leur bien-être. Après des tests comportementaux, une perfusion cardiaque termine les procédures. Le porteur affirme qu'il "n'y a aucune méthode de remplacement" pour l'étude des comportements sociaux et de la reproduction, et travaille sur des souris jeunes adultes.
Objectifs
L’ocytocine contrôle les grandes fonctions physiologiques permettant la survie des mammifères, depuis la reproduction, la mise-bas, la lactation jusqu’aux comportements sociaux. La libération de l’ocytocine au niveau du cerveau, permet de réguler tous les comportements sociaux, comme les comportements sexuels et parentaux, la mémoire sociale ou l’interaction sociale entre individus. Pour cela, l’ocytocine, en tant que neurotransmetteur, se fixe sur son récepteur exprimé dans différentes populations de neurones du cerveau. En tant qu’hormone libérée dans le sang, l’ocytocine est bien connue pour agir sur son récepteur situé dans les muscles de l’utérus et des glandes mammaires, pour la mise-bas et l’éjection du lait maternel. Le récepteur OXTR est aussi présent dans un sous-type de cellules des testicules, les cellules de Leydig, dont la fonction reste inconnue à ce jour. Récemment, nous avons mis à jour in vitro dans deux lignées transformées de neurones et de cellules de Leydig que le récepteur à l’ocytocine contrôlait directement l’expression et la traduction des gènes impliqués dans l’adaptation cellulaire au sein de ces deux types de cellules. Ayant fait la preuve de concept in vitro, nous voulons mettre en évidence 1) le rôle exact du récepteur OXTR dans les neurones et les cellules de Leydig dans un organe naturel au sein d’un organisme entier et 2) son impact sur les fonctions de reproduction et des comportements sociaux in vivo en l’inactivant spécifiquement dans chacune de ces cellules.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de comprendre le rôle du récepteur à l'ocytocine, un des cibles thérapeutiques majeurs de l’interaction sociale chez la souris. Ces expériences vont significativement contribuer à l’augmentation des connaissances scientifiques des troubles de l'interaction sociale , et également à plus long terme de développer une nouvelle approche pharmacologique pour soulager ces troubles.
Procédures
administration de composés (1 fois, 5 sec), puçage des animaux (1 fois, 10min par animal)
Impact sur les animaux
administration de composés et puçage des animaux : légère inflammation des tissus localement au site d'injection. délétion sléective du récepteur à l'ocytocine : diminution légère de la sociabilité entre congénères et du bien-être des animaux. Tests de comportement: léger stress des animaux dans un nouvel environnement.
Devenir
administration de composés, puçage des animaux, délétion spécifique du récepteur à l'ocytocine : les animaux sont gardés en vie afin de pouvoir réaliser les tests de comportement. Après les tests de comportement et perfusion cardiaque, les animaux sont euthanasiés.
Remplacement
Nous avons montré par des études préliminaires in vitro dans des cellules immortalisées et transformées en culture, la faisabilité de notre étude. Il n’y a aucune méthode de remplacement pour l’étude des comportements sociaux et la reproduction des animaux.
Réduction
Nous avons mis au point in vitro dans nos lignées de cellules les conditions expérimentales permettant de mettre en évidence des effets statistiquement significatifs, tout en minimisant le plus possible le nombre d’animaux utilisés. De plus, les différents tissus sont utilisés afin de pouvoir faire plusieurs méthodes d’analyse avec le même tissu d’un seul animal, réduisant le nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux sont gardés dans des conditions classiques d’élevage avec deux types d’enrichissement, un igloo en carton et des frisures de papier kraft pour diminuer le stress des animaux et améliorer leur thermorégulation. Les procédures expérimentales, majoritairement des tests de comportements, sont les plus brèves possibles (< 1 heure par animal) et réalisées dans le calme et sous des éclairages faibles afin de minimiser l’inconfort et l’anxiété des animaux. De plus, la plupart des tests de comportement mettent en jeu des interactions avec d’autres animaux et/ou des odeurs sociales dans les appareils de comportement ou cage, différents de leur cage d’élevage, satisfaisant leur curiosité naturelle envers leurs congénères et l’exploration spatiale de leur environnement. Ainsi, les tests de comportement permettraient de renforcer l’enrichissement des animaux. Les tests de fertilité consistent à mettre des animaux mâles avec des femelles de génotype sauvage en reproduction et ne varient pas des conditions d’élevage classique des animaux. Le suivi des animaux sera quotidien et assuré par les soigneurs et expérimentateurs habilités.
Choix des espèces
Les souris sont des petits animaux sociaux qui se reproduisent bien et vite et dont les comportements sont mesurables par des tests bien décrits. Les expériences seront réalisées chez la souris jeune adulte (7-12 semaines) à un stade post-pubère.
Ocytocine-vasopressine dans les déficits d’interaction sociale chez la souris
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
3 424 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Un déficit de sociabilité leur est imposé par invalidation de gènes ou par isolement, avant une longue batterie de tests comportementaux dont le test de la nage forcée, l'enfouissement de billes, l'exposition à des odeurs de prédateur et le test d'intrusion. Le porteur décrit ces atteintes comme "légères" et une perfusion intracardiaque terminale clôt les procédures. Il affirme qu'il "n'y a pas de méthode de remplacement" du comportement animal in vitro, seul l'animal vivant permettant selon lui d'évaluer l'interaction sociale.
Objectifs
L’ocytocine, plus communément appelée « l’hormone de l’amour » est un petit peptide qui régule les comportements sociaux chez les mammifères. Bien qu’elle soit bien connue pour son rôle dans la lactation et l’accouchement, l’ocytocine est également sécrétée dans le cerveau pour moduler les interactions sociales (parent-enfant, fraternel, avec un congénère inconnu, …). Le système ocytocine est en réalité beaucoup plus complexe et encore mal connu. En effet, l’ocytocine, et la vasopressine, un peptide apparenté, se lient sur les récepteurs à l’ocytocine et à la vasopressine, et l’ensemble de ces acteurs contrôle les interactions sociales. L’administration d’ocytocine comme de la vasopressine restaure l’interaction sociale chez les mammifères souffrant de déficits d’interaction sociale, dont l’Homme (autisme, schizophrénie, addiction). De plus, il semblerait que les déficits d’interaction sociale soient liés à des dysfonctions dans le système ocytocine-vasopressine. L’objectif de cette étude est de 1) déterminer les dérégulations (communes) du système ocytocine-vasopressine dans des modèles de souris souffrant de déficits d’interaction sociale (fraternel et avec un congénère inconnu) et 2) d’identifier quels récepteurs de ce système restaure l’interaction sociale.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de déterminer quelle est la cible thérapeutique la plus importante au sein de la famille ocytocine-vasopressine permettant d'améliorer l’interaction sociale chez la souris. Dans un second temps, le meilleur agent pharmacologique va être identifié sur cette cible. Ces expériences vont significativement contribuer à l’augmentation des connaissances scientifiques des troubles de l'interaction sociale, et de développer des nouvelles approches thérapeutiques pour soulager ces troubles.
Procédures
Les procédures sont : induction d'un déficit de sociabilité par invalidation de gènes ou par isolement; administration de composés (1-14 fois, 5 sec) par voie intranasale, intrapéritonéale ou sous-cutanée, puçage des animaux (1 fois, 10min par animal), tests de comportements (1-14 fois, 5 à 40 min), perfusion intra-cardiaque (1 fois, procédure sans réveil, 30 min). Le comportement social sera évalué en utilisant le test d’interaction sociale directe et le test des trois chambres pour la sociabilité, le test de monte pour le comportement socio-sexuel et le test de déplacement du nid et l'agression maternelle pour le comportement maternel. Enfin, la préférence et la détection olfactives seront mesurées pour la préférence des odeurs sociales. Les comportements stéréotypés, persévérants et répétitifs sont évalués par le scorage des stéréotypies motrices, et en mesurant les alternations dans un petit labyrinthe en Y. Les comportements de type anxieux sont mesurés dans le test de l’enfouissement de billes, le test de suppression de prise de nourriture induite par la nouveauté, le test de reconnaissance des odeurs de prédateurs et le test de la nage forcée. L’agressivité et la dominance seront évalués en utilisant le test d’intrusion d’un mâle résident et le test du tube.
Impact sur les animaux
administration de composés et puçage des animaux : légère inflammation des tissus localement au site d'injection. Modèles de déficit de sociabilité (génétique ou par isolement) : diminution légère de la sociabilité entre congénères et du bien-être et éventuellement une augmentation légère du stress de ces animaux. Tests de comportement: léger stress des animaux dans un nouvel environnement.
Devenir
Les animaux à l'issu des procédures sont euthanasiés pour prélèvement des organes.
Remplacement
Il n’y a pas de méthode de remplacement du comportement animal in vitro. Le comportement animal et les conséquences fonctionnelles de l’interaction sociale ou des déficits ne peuvent être évalués que sur des animaux vivants. Bien que les déficits d’interaction sociale ne menacent pas la durée de vie, ils entravent la qualité de vie et la capacité à concevoir des animaux d’élevage et pour l’homme.
Réduction
Notre étude vise à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés et le temps d’expérimentation. Les expériences en aigu (jour 1) et en chronique (jour 8) sont réalisées sur les mêmes groupes expérimentaux. Tous les cerveaux des animaux sont conservés et utilisés afin de ne pas sacrifier de nouveaux animaux. Des conditions de réussite sont appliquées à l’utilisation de certains groupes. En effet, le nombre d’animaux sera réduit de moitié si aucun effet genre n’est mis en évidence.
Raffinement
Pour la procédure nous amenant à isoler certains animaux, les animaux auront plus d'enrichissement (matériau de nid) à leur disposition et seront élevés en contacts visuels, olfactifs et sonores avec les autres animaux pour minimiser leur inconfort. Les animaux sont très vite habitués aux procédures, menées dans les délais les plus courts possibles, dans le calme et sous des éclairages faibles afin de minimiser la contrainte et l’anxiété des animaux. Les animaux sont surveillés avant et après chacune des procédures et quotidiennement par les expérimentateurs et le personnel de l'animalerie. De plus, les tests de comportement permettent de satisfaire les comportements de curiosité naturelle des souris à explorer leur environnement et interagir avec leurs congénères. D’après notre expérience, les animaux ne subissent aucune altération de leur état de santé. Si un animal est blessé ou atteint un point limite (pelage négligé, posture anormale, diminution de poids ou diminution d'activité), l'animal sera traité (antiseptique et/ou analgésique) en accord avec le vétérinaire référent et sa surveillance sera renforcée. Si l'animal atteint des signes cliniques inquiétants ou une combinaison de points limites, l'animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux sociaux et hiérarchisés. Les souris expriment les mêmes déficits d’interaction sociale et de comportement stéréotypés que les mammifères de plus grosse taille ou les humains. De plus, leur comportement social est régulé par l’ocytocine et la vasopressine et leurs récepteurs qui sont extrêmement bien conservés chez tous les mammifères. Cette espèce est donc un très bon modèle pour étudier les conséquences moléculaires et les effets de composés sur l’interaction sociale. De plus, la souris est un petit mammifère, une taille compatible avec l’utilisation de petites quantités de composés. Les études seront menés chez le jeune adulte (7-10 semaines), le souriceau nouveau-né (0-1 semaine) ou l’animal après sevrage (3-4 semaines).
Effet de la Photobiomodulation sur des modèles murins mimant la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 056 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Modèles transgéniques de la maladie d'Alzheimer, elles subissent une injection virale intracérébrale à la naissance, des injections d'un inhibiteur et des tests comportementaux dont la piscine de Morris où elles sont contraintes de nager. Le porteur qualifie la photobiomodulation d'"absolument indolore" et présente l'isolement en actimétrie comme sans conséquence, tout en reconnaissant que la nage est un "environnement stressant". Il affirme que ces tests de comportement ne peuvent pas être remplacés in vitro, ses analyses moléculaires étant menées en parallèle sur cellules.
Objectifs
Les patients souffrant de la maladie d’Alzheimer (MA) présentent dans leur cerveaux des plaques séniles dont le composant majeur est le peptide amyloïde (Ab). Chaque individu produit et dégrade de manière physiologique ce peptide Ab mais une accumulation anormale de ce peptide pourrait être à l'origine de la maladie. Nos résultats montrent que le fragment C99, le précurseur direct du peptide Ab, pourrait être tout aussi pathogène. Au laboratoire, nous avons mis en évidence une accumulation très précoce du C99 dans un modèle de souris triple transgéniques 3xTgAD modèle de la MA. Cette accumulation précoce du C99 induit un dysfonctionnement cellulaire au niveau de la dégradation lysosomale et autophagique et contribue au phénotype de type apathique et au deficit cognitif des souris. Plus recemment nous avons montré que le fragment C99 est aussi responsable d'un dysfonctionnement mitochondrial au niveau de la structure, de la fonction et de la dégradation des mitochondries. La photobiomodulation (PBM) qui consiste à exposer des souris à la lumière infrarouge est connue pour ses vertues protectrices en activant notamment la fonction mitochondriale. Cette approche sûre et non invasive a déjà prouvée son efficacité dans plusieurs essais cliniques dédiés au traitement de lésions cérébrales chroniques, à la réparation de la moelle épinière ou à la maladie de Parkinson. Concernant la maladie d'Alzheimer plusieurs études précliniques sont en cours et l'objectif de ce projet est d'étudier dans plusieurs modèles murins de MA, le mécanisme moléculaire par lequel la PBM peut protéger spécifiquement contre la toxicité précoce médiée par le C99.
Bénéfices attendus
Mon projet a pour but pricipal d'étudier l'effet protecteur et bénéfique de la photobiomodulation sur des modèles murins de maladie d'Alzheimer. Ce projet de recherche fondamentale devrait apporter des informations importantes concernant la toxicité mitochondriale médiée par le fragment C99 et permettre une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la maladie d'Alzheimer. Il devrait également fournir des perspectives cruciales pour une future application de la photobiomodulation dans le traitement clinique de la maladie d'Alzheimer.
Procédures
Les animaux subiront au plus 5 interventions: La photobiomodulation (procédures 1 à 5) : 90s à 670 nm 2 fois par jour pendant 2 mois; L'actimetrie (procédures 1 à 5): 2 passages dans l'actimètre (avant et après la photobiomodulation) pendant 2jours et 2nuits consécutives; La piscine de Morris (procédures 2, 3 et 5): 5 jours d'apprentissage avec 4 essais par jour, 2 tests 24h et 72h après le dernier jour d'apprentissage et un test visible comportant 3 essais le même jour; L'administration du D6 (procédures 4 et 5) par injection intraperitonéale (30mg/kg/jour) d'environ 150µl par jour pendant 18 jours; L'injection virale (procédures 5) par injection intracérebroventriculaire à la naissance (4μL de particule virale à 5. 10puissance12 en 15 sec)
Impact sur les animaux
La photobiomodulation est absolument indolore et inoffensive pour les souris. Au cours du test de la piscine de Morris, les souris sont contraintes à nager dans l’eau, un environnement stressant. Le test d'actimétrie consiste à isoler les souris dans des cages individuelles 2 jours et 2 nuits consécutives pour comptabiliser les mouvements de chaque souris. Ce test peut éventuellement générer un léger état d’anxiété lié à l’isolement social mais nous estimons que la durée n'est pas suffisament longue pour avoir une quelconque conséquence pour le bien être des animaux. L'injection de virus se fait avec une aiguille qui pénètre dans la peau et le crâne du souriceau sans aucune douleur apparente et sans réaction inflammatoire. L'injection intrapéritonéale de l'inhibiteur D6 sera surveillée de près pour prévenir toute eventuelle inflammation du péritoine.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront sacrifiés afin de récupérer leur cerveau et effectuer les analyses biochimiques et histologiques nécéssaire au projet scientifique.
Remplacement
Les expériences de comportement de souris telles que la piscine de Morris ou l'actimétrie ne peuvent malheureusement pas être remplacées par des expériences in vitro. Cependant toutes nos expériences biochimiques, immunohistologiques et nos analyses des mécanismes moléculaires sont au préalable étudiées sur des modèles cellulaires exprimant les mêmes mutations (cellules SH-SY5Y-APPswe) ou les mêmes fragments (C99) que nos modèles murins. De plus, actuellement dans notre laboratoire, nous mettons en place l'utilisation de fibroblastes ou d'iPSC de patients Alzheimer atteints de formes sporadiques ou familiales. Ceci constituera aussi un bon modèle in vitro de la maladie d'Alzheimer qui viendra compléter nos modèle murins.
Réduction
Nous utiliserons des tailles d’échantillons garantissant une puissance statistique suffisante tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés dans le respect éthique de la règle des 3R (remplacement, réduction et raffinement). Le nombre de souris pour chaque procédure est ainsi déterminé avec le logiciel G*power. Les tests de comportement que nous utilisons ont déjà été testés sur nos modèles de souris et nous avons déjà établi un protocole bien déterminé ce qui évitera de réaliser des expériences préliminaires de mise au point. Notre étude comportementale requière des groupes de 30 à 45 animaux minimum. Cependant, pour réduire le nombre d’animaux, les mêmes groupes de souris seront utilisés pour plusieurs test comportementaux et pour les analyses biochimiques et immunohistochimiques.
Raffinement
Nos modèles de souris sont utilisés en routine dans notre laboratoire et sont désormais très bien caractérisés. Ainsi pour chaque modèle, nous connaissons très bien la cinétique d'apparition et d'évolution de la pathologie pour déterminer les âges adéquats et pouvoir traiter nos souris en préventif (4 mois) ou en curatif (12mois). Pour atténuer au maximum le stress causé par le test de la piscine de Morris pour lequel les souris sont contraintes de nager dans l'eau, une phase d’habituation sera réalisée avant le début du test. La température de l'eau est fixée à 22°C et permet un bon équilibre entre motivation et bien-être de l'animal et dès la sortie de l'eau, les souris seront séchées sur un papier absorbant. Après l'injection de virus, les souriceaux sont replacés avec leur mère le plus rapidement possible pour éviter tout rejet de la mère. Pour limiter le stress, les souris sont hébergées dans des cages comportant une maisonnette ainsi que de la ouate favorisant la nidification. L'injection intrapéritonéale de l'inhibiteur D6 sera surveillée de près pour prévenir toute eventuelle inflammation du péritoine. Pour définir le plus objectivement possible le bien être des souris et assurer au mieux leur survaillance tout au long de chaque procédure, nous utiliserons une grille de scores (voir annexe) et nous nous référons aux points limites.
Choix des espèces
Pour déterminer in vivo si la PBM est bénéfique dans le traitement contre la maladie d'Alzheimer au niveau de la cognition, nous sommes contraints d'utiliser des modèles de souris mimant la maladie et présentant des déficits cognitifs comme les souris 3xTgAD. Les souris 2xTgAD et les souris AAV-C99 seront ensuite utilisées pour étudier in vivo les mécanismes moléculaires impliqués dans l'effet neuroprotecteur de la PBM et pour vérifier que la PBM agit bien sur la toxicité liée au fragment C99 et non pas sur le peptide Ab. Cette information est importante pour déterminer la meilleure cinétique de traitement étant donné que le C99 intervient de manière beaucoup plus précoce que l'Ab. En tenant compte de nos résulats antérieurs, nous avons choisi de tester l'effet neuroprotecteur de la PBM chez les souris 3xTgAD à 2 âges : un âge précoce (4mois) où seule l'accumulation du fragment C99 est présente pour voir si la PBM est capable d'améliorer le comportement de type apathique déjà visible (actimétrie); et un âge plus tardif (12mois) où la pathologie associée au peptide Ab s'ajoute à l'accumulation du C99 pour voir si la PBM est capable de restaurer les déficits cognitifs et le retard d'apprentissage spatial présent à cet âge (Piscine de Morris). Concernant les souris AAV-C99 nous avons choisi de tester l'effet neuroprotecteur de la PBM à 6 mois puisqu'un déficit d'apprentissage spatial a déjà été observé à cet âge.