Recherche fondamentale

13 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de trois à quatre heures pour l'implantation d'un substitut vasculaire tissé posé en pontage entre carotide et jugulaire, puis des contrôles échographiques répétés sous anesthésie et une ponction à l'aiguille simulant l'hémodialyse. Le porteur mentionne parmi les nuisances l'absence de traitement anti-inflammatoire, un risque d'hémorragie et de déchirement du greffon, et prévoit la mise à mort à quatre et huit semaines pour prélever le vaisseau. Il affirme qu'une implantation "chez le gros animal" est "indispensable" et que la brebis est la seule espèce dont les cellules produisent les feuillets recherchés.

Objectifs

Les substituts vasculaires entièrement biologiques d’origine humaine issus d’une approche basée sur la synthèse de matrice par les cellules in vitro dite de « Cell-Assembled extracellular Matrix-CAM » ont été implantés chez l'Homme avec succès. Pour pallier les limites des prothèses vasculaires synthétiques, l’approche CAM permet la production de feuillets entièrement biologiques grâce à des cellules extraites à partir de peau humaine adulte saine. Des greffons de vaisseaux sanguins obtenus par roulage de ces feuillets ont été implantés avec succès chez des patients montrant une remarquable biocompatibilité. Cependant, leur méthode d’assemblage est longue pour permettre la fusion des différentes couches du vaisseau. Pour réduire le temps de production, ces feuillets sont transformés en fils qui, une fois montés sur un métier à tisser, permettent l’obtention d’un substitut vasculaire par tissage. Une implantation dans un modèle de gros animal ayant une anatomie proche de celle de l’humain est indispensable pour évaluer le comportement mécanique des produits d’ingénierie tissulaire tissés issus de l’approche CAM. Ainsi, l’objectif de ce projet est d’étudier le comportement mécanique ainsi que le remodelage in vivo de nos substituts vasculaires biologiques tissés à partir de fils de CAM face à une hémodynamique propre à l’hémodialyse, un contexte clinique pertinent, et ce dans un contexte de greffe allogénique, c’est-à-dire dans un contexte où un tissu d’un individu d’une espèce est implanté chez un autre individu d’une même espèce. Cela permettra d’étudier les réactions immunitaires innées et adaptatives, et de mettre en évidence que notre substitut peut être implanté en tant qu’accès vasculaire artérioveineux et subir/s’adapter à une hémodynamique importante et subir un remodelage adapté. Cela permettra également de mettre en évidence la faible réponse immunitaire à court terme de l’hôte suite à l’implantation. Ces résultats permettront d’envisager la réalisation d’une étude à plus long terme (jusqu’à 1 an) pour évaluer la viabilité à long terme du greffon et ce à terme pour utiliser cette technique chez les patients.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont multiples. Ce projet permettra de mettre en avant la possibilité d’utiliser des substituts vasculaires tissés à partir de CAM allogénique. En effet, ce projet permettra de mettre en avant la faible réponse immunitaire de l’hôte à notre substitut allogénique. Ces réponses supporteront l’idée que des vaisseaux allogéniques tissés dévitalisés peuvent être utilisés avec efficacité et peuvent pallier à la limite des substituts autologues. Également, les études du comportement mécanique et du remodelage du substitut apporteront des réponses essentielles qui permettront de modifier les paramètres de tissage des substituts afin d’adapter leurs propriétés mécaniques et structurelles de l'organisme. Les adaptations mises en place suite à ces résultats permettront ainsi d’obtenir un substitut dont les propriétés répondront au mieux à une situation clinique donnée.

Procédures

Toutes les interventions dans cette étude seront faites sur des animaux anesthésiés. Premièrement, les implantations d’un substitut vasculaire tissé ainsi que d’un contrôle avec une prothèse synthétique commercialisé et actuellement utilisée en clinique, seront effectués dans un modèle bilatéral sur chacune des huit brebis, après anesthésie et avec des protocoles pré, per et post opératoires adaptés. Cette procédure chirurgicale est prévue une fois par animale pour une durée estimée à 3 à 4 heures. Les animaux seront soumis à des contrôles échographiques post-implantation et à des temps de 2 et 4 semaines (pour le groupe de 4 semaines), et post- implantation et à des temps de 2, 4, 6 et 8 semaines (pour le groupe 8 semaines). Chaque échographie sera réalisée sur animal anesthésiée pour réduire le stress des animaux. Chaque échographie ne durera pas plus d’une heure et chaque animal sera anesthésié pour une durée maximale d’une heure. Pour le groupe de 8 semaines, une ponction de l’abord vasculaire sera effectuée avec une aiguille 16G afin de simuler un contexte d’hémodialyse. Cette ponction sera réalisée à 4 semaines, lors de l’échographie de contrôle, sur animal anesthésié. La ponction et l’échographie ne dureront pas plus d’une heure et chaque animal sera anesthésié pour une durée maximale d’une heure.

Impact sur les animaux

La phase déterminante pour le bien-être de l’animal repose sur un temps d’intervention court. En effet, chaque brebis sera sous anesthésie générale pour effectuer la chirurgie d’implantation du greffon. Plus le temps passé sous anesthésie est court, mieux c’est pour le bien-être de l’animal et la réduction des effets indésirables de l’anesthésie. Nous estimons la durée de la chirurgie de 3 à 4 heures. Une fois implanté, des effets indésirables liés au greffon pourraient apparaître. Si des problèmes d’hémorragie ou d’écoulement à travers le greffon apparaissent, le protocole d’anticoagulation pourra être revu et adapté. Un autre effet indésirable potentiel est le déchirement du greffon, suite à un mouvement brusque de la brebis ou un coup porté sur l’implant par un autre animal. Si un déchirement est observé et est attribué directement au greffon, le design de ce dernier pourra être adapté pour les brebis suivantes. Afin de gérer le stress des animaux et d’éviter un endommagement du greffon et/ou une blessure de l’animal, les contrôles échographiques se feront sous anesthésie générale. De plus, cela permettra d’analyser le greffon avec plus de précision que si la brebis est vigile et en mouvement. Ces contrôles et l’anesthésie générale dureront une heure maximum. Une des nuisances pour l’animal au sein de cette étude est également l’absence de traitement anti-inflammatoire en post-opératoire. En effet, ce projet repose sur l’étude de la réaction inflammatoire de l’hôte suite à l’implantation des substituts vasculaires. Ainsi, aucun traitement anti-inflammatoire ne sera administré suite à l’implantation Au cours de cette étude, un protocole précis de prémédication, d’analgésie et d’anesthésie sera mis en place et le bien-être des animaux sera suivi constamment par le personnel dédié.

Devenir

A l’issu des contrôles terminaux, tous les animaux seront mis à mort aux différents temps définis (4 et 8 semaines). En effet, nous étudierons la réponse immunitaire ainsi que le remodelage des allogreffes par les cellules ; cette étape nécessitant le prélèvement du substitut vasculaire préalablement implanté entre la carotide et la veine jugulaire, la mise à mort de celui-ci est inévitable.

Remplacement

Un modèle de vaisseau humain peut être largement étudié in vitro d’un point de vue mécanique grâce à des bancs d’essais. Cependant, ces plateformes de tests ne permettent pas d’étudier la réponse immunitaire ou l’intégration d’un greffon dans des conditions réelles d’utilisation. Il ne sera donc pas possible de remplacer l’utilisation d’animaux. Ainsi l’utilisation d’un modèle animal de grande taille possédant un système cardiovasculaire proche de l’homme (porcin, ovin, canin ou primate) est souhaitable pour ce projet. En effet, l’objectif du projet est d’évaluer la fonctionnalité, la réponse immunitaire et l’intégration du substitut vasculaire dans l’organisme vivant et entier et ce, dans un contexte clinique pertinent (pontage artérioveineux), afin d’envisager à terme une utilisation chez les patients.

Réduction

Ces expérimentations sont conçues pour avoir recours à un nombre minimal d’animaux permettant l’obtention de résultats exploitables sur le plan statistique. Huit brebis seront implantées avec le même nombre de conditions expérimentales. Un modèle bilatéral sera utilisé ; ainsi, chaque animal sera son propre contrôle, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux impliqués dans l’expérimentation.

Raffinement

Le raffinement sera pris en compte tout au long du projet. Le projet sera mis en place dans des locaux agréés avec du personnel dédié et expérimenté. De l’enrichissement sera mis en place pour répondre au besoin des animaux (pierre à sel, foin, hébergement en groupe sociaux, paille). Un protocole précis de prémédication, d’analgésie et d’anesthésie sera mis en place lors des différentes phases et le bien-être des animaux sera suivi constamment par le personnel dédié et formé à l’espèce étudiée. Si nécessaire, des actions adaptées seront appliquées et le vétérinaire désigné de l’établissement sera sollicité.

Choix des espèces

Ces expérimentations chez le gros animal sont nécessaires pour évaluer la faisabilité et la durabilité de greffons vasculaires de diamètres qui correspondent à ceux utilisés en clinique, notamment en pontage artérioveineux. Le modèle ovin a été choisi car il fait partie des modèles animaux couramment utilisés dans le domaine vasculaire (comme le modèle canin et le modèle porcin). En revanche, d’après nos études menées au laboratoire, ce modèle est le seul dont les cellules permettent la production de feuillets de CAM qui ressemblent à ceux produits avec des cellules humaines. Les animaux seront implantés à partir de 13 mois d’âge afin d’avoir des brebis adultes, à ce stade les brebis possèdent un système immunitaire et un système vasculaire mature.

400 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux incisions dans le dos permettent de glisser sous la peau un biomatériau à base d'acide polylactique, dont on veut évaluer la biocompatibilité en vue d'applications de régénération osseuse dentaire chez l'humain. Le porteur indique une inflammation de la zone opérée, une possible désunion de la plaie et un risque d'infection inférieur à 10 %, et précise que les prélèvements de peau ne sont faits qu'après la mise à mort. Il affirme qu'il "n'existe pas d'alternative" ni de méthode in silico pour vérifier la biocompatibilité dans un organisme vivant.

Objectifs

La pose d'un implant dentaire est généralement entravée par un volume osseux limité au niveau de l'os de la machoire. Afin d'augmenter ce volume osseux et assurer la pose efficace de l'implant, la greffe osseuse , technique de référence, est utilisée. Cependant cette technique présente des inconvénients. La nécessité de procéder à deux actes chirurgicaux (prélèvement et greffe), la faible quantité d'os disponible lors du prélèvement ainsi que les suites post-opératoires et les complications potentielles nous pousse à l'innovation et au développement de nouvelles techniques de régénération osseuse moins invasives. La régénération osseuse guidée (ROG) utilise des matériaux sous forme de membranes qui ont pour rôle de séparer le défaut osseux à régénérer des tissus mous périphériques (peau, muqueuse et muscle). Ces membranes barrières vont donc empêcher la colonisation du défaut osseux par ces tissus indésirables et favoriser la prolifération et la migration des cellules d'origine osseuse dans le défaut osseux. De nombreuses membranes sont actuellement commercialisées, mais leur manque de propriétés régénératrices, leur manque de tenue mécanique ainsi que leur résorption rapide pousse la recherche à dévelloper de nouvelles générations de membranes afin d'améliorer leurs propriétés. Ce projet de recherche vise (1) à étudier la compatibilité et (2) à évaluer la dégradation de nouvelles membranes fabriquées au laboratoire. Les études in vitro préalablements effectuées ont permis de sélectionner des membranes avec un potentiel thérapeutique important (dégradation, régénératrice et antimicrobien). Leur innocuité a été évaluée, mais les études in vitro ne peuvent modéliser la complexité des systèmes physiologiques mis en place lors de la réponse inflammatoire et lors de la cicatrisation in vivo. Le recours a un modèle animal est donc un préalable préclinique essentiel pour envisager une plausible application en clinique humaine. Pour ce projet, nous choisissons de travailler avec le rat, car l'enssemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font de cet animal, le modèle préférentiel pour mener à bien cette étude. Nous étudierons la biocompatibilité et la résorption de différentes membranes fabriquées à partir de polymères secondairement fonctionnalisées. Ces membranes seront implantées sous la peau dans le dos des animaux.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet à court terme sont : (1) la vérification de la bonne tolérance biologique et tissulaire (absence de réaction inflammatoire exacerbée et absence de fibrose cicatricielle au contact des membranes, (2) le développement de biomatériaux à dégradation tissulaire contrôlée pour une utilisation en ROG. Les bénéfices attendus à long terme sont de pouvoir proposer en clinique chez l’homme, des dispositifs médicaux innovants doués de propriétés cicatrisantes, ossifiantes, antibactériennes et biomécaniques améliorées par rapport aux dispositifs médicaux actuellement disponibles sur le marché dans le but de répondre à des impératifs cliniques élargis et adaptées à des situations pathologiques spécifiques (médecine régénératrice personnalisée). La réalisation de ce projet d’expérimentation animale sur le rat permettrait de confirmer la pertinence de la stratégie thérapeutique de vouloir améliorer les propriétés de membranes actuellement commercialisées destinées à la ROG.

Procédures

Les animaux seront sousmis à une seule procédure chirurgicale consistant à réaliser 2 incisions dans le dos, une de chaque côté de 1,5 - 2 cm afin de glisser sous la peau un biomatériau. La durée de la procédure chirurgicale n'excédera pas 5 minutes. Les analyses thermique seront pratiquées sur des animaux anesthésiés. Les prélèvements tissulaires (peau) ne seront réalisés qu'après la mise à mort des animaux.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances attendues d'après la littérature occasionnées lors de cette procédure sont : une inflammation aigüe et subaigüe de la région opérée suite au décollement sous-cutanée et la mise place du biomatériau, une désunion des berges de la plaie et un risque d'infection de la plaie cutanée (

Devenir

A la fin de l'expérimentation, tous les animaux seront anesthésiés puis mis à mort afin de pouvoir procéder au prélèvements tissulaires et biologiques sans souffrance.

Remplacement

Les études in vitro permettent d'évaluer la cytotoxicité et la réponse inflammatoire induites par les biomatériaux. Pour une utilisation en clinique humaine la biocompatibilité d’un dispositif médical (DM) candidat doit être vérifiée par une implantation dans un organisme vivant. A ce jour il n’existe pas d’alternative ni de méthode in silico permettant de répondre aux objectifs du projet.

Réduction

Nous utiliserons au minimum 6 rats et au maximun 10 rats par lot, nombre calculé pour permettre d'obtenir des résultats scientifiques probants et staristiquement significatifs. Dans l'optique d'une réduction maximale du nombre d'animaux à inclure, des analyses intermédiaires à 6 et 8 animaux/lot seront réalisées avant d'augmenter le nombre d'individus le cas échéant afin d'obtenir la puissance statistique nécessaire (Stratégie go - no go).

Raffinement

A leur arrivée à l'animalerie les rats subiront une phase d'acclimatation de 14 jours aux conditions d'hébergement du laboratoire. Les animaux seront hébergés dans des cages plastiques adaptées à la taille des animaux (surface : 800 cm2 et hauteur : 18 cm) dans un environnement monitoré (20-24 °C ; cycle 12h lumière - 12h obscurité) avec un nombre de 2 à 3 animaux par cage (en respectant une surface minimum de 250 cm2 par animal). La nourriture et l'eau seront mis à disposition ad libitum et la litière sera changée régulièrement. Les cages seront enrichies de tubes en carton avec lesquels les animaux construiront un nid et du sizzle-dry kraft. Après la procédure chirurgicale, les animaux seront placés dans des cages individuelles jusqu'au retrait des fils (dépose des sutures prévues à 7 jours post-opératoires pour les lots concernés). Une analgésie préventive par injection de buprénorphine (0.05 mg/kg, en sous-cutanée dans la région abdominale) en post-opératoire immédiat (avant réveil des animaux) sera pratiquée et poursuivie pendant 72h à la demande en fonction du obtenus à partir d'une grille d'évaluation de la souffrance et du Bien-être animal reconnue (Morton et Griffiths, 1985). Une surveillance clinique biquotidienne au minimum durant les 4 premiers jours post-opératoires sera mise en place. A partir du 5ème jour, une surveillance uni-quotidienne pourra être envisagée si le score clinique le permet (score inférieur ou égal à 3), dans le cas contraire une surveillance biquotidienne sera maintenue jusqu'à l'obtention d'un score inférieur ou égal à 3. En cas d'atteinte d'un niveau défini de points limites, la mise à mort de l'animal sera anticipée. Après la dépose des fils, les animaux seront réunis par 2 ou 3 par cage jusqu'à la fin de l'expérimentation afin de garantir leur bien être et leur vie sociale.

Choix des espèces

Le modèle d’implantation sous-cutanée est considéré comme une référence pour évaluer la réponse biologique (inflammation, cicatrisation et remodelage) vis-à-vis d’un biomatériau. Différentes espèces animales peuvent être utilisées mais le rat reste l’espèce de référence de par sa taille (en comparaison de la souris) favorisant une acte opératoire reproductible et rapide. Le rat immunocompétent est choisi car il permettra d’apporter une réponse vis-à-vis de la réaction immunitaire induite par l’implantations des membranes en PLA fonctionnalisées. Plusieurs souches de rats ont été utilisées dans la littérature, notamment les rats Sprague-Dawley et Wistar. L’animalerie dispose de l’agrément pour l’espèce et la souche choisie (Wistar). Les animaux utilisés dans cette étude sont des rats adultes âgés de 8 à 12 semaines pesant entre 200-300g. Des rats juvéniles ne seront pas adaptés pour l’implantations des différentes membranes (1cm x 1cm). Généralement, des rats âgés de 8 à 12 semaines sont habituellement utilisés dans la littérature.

10 000 rongeurs, 5 000 souris et 5 000 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un candidat médicament par gavage ou injection puis subissent des prélèvements de sang et de tissus, parfois multiples, aux veines rétro-orbitaire, mandibulaire, saphène ou caudale, pour analyser la pharmacocinétique de molécules. Le porteur indique que l'effectif et le stade des animaux sont fixés par le "donneur d'ordre". Il conclut qu'aucune méthode alternative ne permet ces analyses et juge le recours à l'animal "nécessaire".

Objectifs

La collecte de sang et de tissu sur rongeur est une étape nécessaire lors de recherches concernant un nouveau candidat médicament. En effet, elle permet l’analyse de la pharmacocinétique d’un composé concernant son absorption / résorption, sa distribution, son métabolisme et son élimination. L’objectif de la présente étude est de déterminer les méthodes de prélèvements sanguins et / ou tissulaires qui vont être nécessaires pour ces analyses.

Bénéfices attendus

Lors du développement d’un candidat médicament il est essentiel, au-delà de la recherche d’efficacité dans l’aire thérapeutique ciblée, de connaitre ses propriétés concernant sa pharmacocinétique. Cela permet d’obtenir des informations sur différentes caractéristiques comme son absorption / résorption, sa distribution, son métabolisme et son élimination. Afin d’obtenir ces informations, il est nécessaire de réaliser des dosages à partir d’échantillons sanguins et / ou tissulaires.

Procédures

La collecte de sang et de tissu sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements sont réalisés soit à la suite d’un test comportemental soit sur des animaux ayant seulement reçus le traitement du candidat médicament (prélèvement unique ou multiple); ils sont réalisés sur tout l’effectif de tous les groupes expérimentaux.

Impact sur les animaux

1- Les administrations - Elles sont réalisées une seule fois avant le prélèvement. Lors de l’administration d’un nouvel agent thérapeutique, différents effets indésirables peuvent être observés : inconfort dû à l’injection, des effets secondaires dus aux produits (comme la sédation par exemple) 2- Les prélèvements - Ils sont réalisés après l'administartion des produits. Les prélèvements de fèces sont réalisés sur des animaux vigiles, les autres prélèvements sont réalisés exclusivement sous anesthésie générale (à l’isoflurane).

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post mortem.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas de méthode alternative pour permettre l’analyse de la pharmacocinétique d’un candidat médicament à la suite d’un traitement, le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire pour étudier l’efficacité de nouvelles molécules.

Réduction

Le nombre total d'animaux utilisés pour une étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d'animaux par groupe nécessaire pour l'obtention de résultats statistiquement interprétables lors des bioanalyses. Compte tenu de la variabilité interindividuelle des variables mesurées, ce nombre a été fixé à 10 animaux par groupe. L'utilisation d'un nombre inférieur d'animaux a une probabilité importante d'entraîner la non-validité des analyses, conduisant à les refaire, et par conséquent à utiliser un nombre d'animaux plus élevé. Les données sont exprimées sous forme de moyenne et d'erreur standard de la moyenne (SEM). La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA) suivi du test de Tukey. Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des locaux appropriés et dans des cages contenant des enrichissements conformément aux standards réglementaires. Dans le cas de prélèvements multiples (sang par sinus rétro-orbitaire, mandibulaire, saphène ou caudale), un suivi approfondi est effectué après chaque ponction pour vérifier : 1) que l’animal se réveille correctement; 2) qu’il y a bien un arrêt du saignement et 3) qu’il n’y a pas d’effets secondaires suite au prélèvement. Leur état sanitaire sera évalué quotidiennement selon notre grille de surveillance. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l’expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. De plus, la proximité clinique entre les modèles rongeurs et les maladies humaines rendent ces analyses de pharmacocinétiques fiables pour l’étude des caractéristiques de candidats médicaments. Les lignées de souris utilisées (selon les protocoles) sont : C57Bl/6 J ou SWISS. D'autres lignées de souris peuvent également être utilisées : C57Bl/6 N, BALB/c, DBA/2, BTBR... Les lignées de rats utilisées (selon les protocoles) sont : Wistar et Sprague-Dawley. D'autres lignées de rats peuvent également être utilisées : SHR... Le stade de développement est déterminé par le donneur d’ordre en fonction de l’âge auquel est destiné le candidat médicament chez l’homme. Selon les études : 3 à 52 semaines au moment du prélèvement.

40 agneaux vont être utilisés, accompagnés de 20 brebis non comptées comme cibles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous gardés vivants. Ils subissent des tests comportementaux, la pose répétée de ceintures à capteur cardiaque, deux prises de sang et des prélèvements de laine, pour évaluer l'effet d'un enrichissement du milieu sur leur bien-être et leur développement. Le porteur décrit un stress de courte durée lié aux manipulations et aux isolements. Il inscrit cette étude sur le bien-être dans une visée d'élevage "durable" et de recommandations pour l'élevage commercial.

Objectifs

L’objectif scientifique de ce projet est de tester l’effet d’un enrichissement multimodal des agneaux, dès le plus jeune âge et jusqu’à 2 mois après sevrage sur le bien-être des agneaux, le développement de leurs capacités cognitives et leur réactivité à une phase d’élevage classique source de stress pour les agneaux : le sevrage. L’hypothèse est que l’enrichissement du milieu de vie des agneaux sera pertinent (induisant donc bien un bénéfice comportemental pour les agneaux, selon la définition de Bloomsmith, 1991), qu'il les placera dans un état émotionnel positif leur permettant de mieux affronter une situation stressante (le sevrage), tout en leur offrant une diversité d’activités possibles pouvant détourner leur attention de l’absence de la mère, et qu’il entraînera un meilleur développement cognitif leur permettant d’être plus efficace lors d’un test de type labyrinthe (test de flexibilité comportementale). Pour ce faire, deux lots d’animaux seront constitués : un lot témoin (T) avec des animaux élevés classiquement, avec leurs mères jusqu’au sevrage, et un lot enrichi (E) avec en plus de l’élevage classique appliqué au lot témoin l’apport de différents objets d’enrichissement afin d’offrir aux agneaux une diversité de stimulations, touchant plusieurs de leur sens, dont le toucher et l’olfaction, et couvrant différents types d’enrichissements. Les objets d’enrichissements prévus sont au nombre de 8 : une brosse en L avec ressort, une brosse fixe simple, une plateforme multi-niveaux, un ballon suspendu, une boîte diffusant des odeurs à valence positive pour les agneaux accompagnée d’une barrière de séparation, et trois objets suspendus pour des manipulations orales.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra, le cas échéant, de faire la preuve de concept que l’enrichissement multimodal dès le plus jeune âge des agneaux est pertinent, permettant d’améliorer le bien-être des agneaux tout au long de leur croissance, et notamment au cours de phases d’élevage stressantes comme le sevrage, en favorisant leurs émotions positives, en stimulant et en développant leurs capacités cognitives et en améliorant leur robustesse. Ce projet permettra aussi de formuler des recommandations pour la mise en place d’objets d’enrichissement du milieu pour les agneaux en élevage commercial.

Procédures

Les 20 brebis ne seront soumises à aucune intervention. Les 40 agneaux seront soumis à : - 3 tests comportementaux, impliquant de les manipuler pour les sortir du parc d’élevage et de les isoler, au moins partiellement, de leurs congénères - 5 mises en place et 5 retraits des ceintures nécessaires pour maintenir le capteur de l’activité cardiaque, impliquant de les manipuler pour les sortir du parc d’élevage et de les isoler, au moins partiellement, de leurs congénères, de les mettre en contention pour la pose / retrait du matériel. - 2 prises de sang, réalisées à l’occasion de la mise en place du matériel de mesure de l’activité cardiaque, évitant ainsi des manipulations supplémentaires sur les animaux, hormis bien sûr la prise de sang. - 3 prélèvements de laine, réalisés pour 2 d’entre eux à l’occasion de la mise en place du matériel de mesure de l’activité cardiaque, évitant ainsi des manipulations supplémentaires sur les animaux, hormis bien sûr la tonte de la zone concernée. Le 3e prélévèment implique de les manipuler pour les sortir du parc d’élevage et de les isoler, au moins partiellement, de leurs congénères, et de les mettre en contention pour réaliser la tonte de la zone concernée.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir un stress de courte durée dans quelques phases du projet : manipulation par l'homme pour mesures physiologiques, tests de réactivité émotionnelle, test de flexibilité comportementale du fait d'une brève contention, d'une exposition à un environnement nouveau et/ou d'un isolement social. Les enrichissements du milieu peuvent éventuellement être source de compétition pour les animaux (et donc d’une augmentation des comportements agonistiques), mais dans le cas de cette étude le nombre d’objets d’enrichissement (8 pour 20 agneaux) mis à disposition des animaux est suffisant pour que ce phénomène de compétition ne soit pas négatif pour les animaux.

Devenir

A l’issue de chacune des 2 procédures les animaux sont maintenus en vie et poursuivent l’expérimentation.

Remplacement

Ce projet a pour vocation de déterminer l'influence de l'apport d'enrichissements multimodaux sur le bien-être et sur le développement du comportement. Il est donc nécessaire d’étudier les animaux cibles, dans notre cas des agneaux, pour pouvoir appréhender leur comportement. NB : Le manque de connaissances scientifiques sur l’enrichissement multimodal dès le plus jeune âge chez les agneaux empêche la construction de modèles in silico pour cette étude.

Réduction

Au total 40 agneaux accompagnés de leurs mères, soit 20 brebis, sont utilisés dans l’expérimentation. Notre effectif statistique est donc de 20 agneaux par lot (les mères n’étant pas la cible de l’expérimentation). Cet effectif est nécessaire pour appréhender la variabilité inter-individuelle du comportement et des paramètres physiologiques (activité cardiaque et cortisolémie) ainsi que l’effet maternel (agneaux appairés à leur frère/sœur). Les modèles statistiques (modèles de regression linéaires et non linéaires généralisés mixtes) tiendront compte de l’effet du traitement (avec ou sans enrichissments), de l’effet de la mère et de l’effet de la période/répétition des mesures. Afin de minimiser le nombre d’animaux en expérimentation, les agneaux de ce projet serviront aussi à la mise au point méthodologique de dosage de cortisol dans la laine. Cette méthode de dosage n’est pas encore complétement au point et plutôt que de réaliser une expérimentation supplémentaire les prélèvements réalisés dans ce projet serviront à affiner la méthode d’extraction et de dosage. Si la méthodologie se révèle être réalisable et fiable au niveau des résultats, ces derniers seront utilisés pour répondre aux objectifs de l’étude. Si ce n’est malheureusement pas le cas, les prélèvements réalisés sur les agneaux auront permis de faire avancer le développement méthodologique sans avoir à faire appel à d’autres animaux expérimentaux. NB : L’absence d’études préexistantes similaires (enrichissement multimodal dès 15 jours d’âge chez l’agneau et jusqu’à 130 jours d’âge) ne permet pas de s’appuyer sur des données de variablité préexistantes pour affiner le nombre d’individus afin de maximiser les chances de voir des différences significatives entre nos deux lots (témoin vs. enrichi).

Raffinement

L’objet même de l’étude est de valider la possibilité de raffiner par l’enrichissement multimodal du milieu de vie des animaux en comparant deux lots : un lot témoin (environnement classique d’élevage) et un lot enrichi. Dans tous les cas, les agneaux vivent en groupe social (avec la mère jusqu'au sevrage). Le sol est paillé pour améliorer leur confort. De même, les animaux sont hébergés dans des salles chauffées dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés. La surveillance des animaux (brebis et agneaux) des deux lots sera quotidienne afin de détecter le plus précocément possible tout problème de santé, indépendant de notre protocole. Les prises de sang seront réalisées sur des agneaux déjà habitués à la manipulation et à la contention par l’homme (via les trois périodes d’habituation à la pose des ceintures et capteurs pour les mesures d’activité cardiaque), ce qui permettra de minimiser le stress des agneaux et d’avoir ainsi des cortisolémies pertinentes pour l’étude. Le stress induit par les tests en environnement nouveau sera réduit par un passage avec un congénère connu lors de la prémière exposition. A terme, les analyses de cortisol dans la laine, si leur mise au point au cours de cette expérimentation se révèle faisable et pertinente, permettra de réduire le stress subi par les agneaux dans de futurs projets en limitant le recours aux prises de sang.

Choix des espèces

L'objectif est de contribuer à améliorer les connaissances et les recommandations sur l'élevage des ruminants, plus particulièrement en bâtiment, via l'apport d'enrichissements. Ceci dans une optique d’élevage durable et d'amélioration du bien-être. Le projet s’intéresse aux agneaux allaités par leurs mères, ce qui correspond à la très grande majorité des agneaux élevés en France en élevage ovin allaitant. Les ovins apparaissent donc comme étant à la fois une espèce cible (représentant une part importante de l’économie agricole française avec plus de 3,7 millions de brebis allaitantes en 2019 et environ le double d’agneaux) et une espèce modèle pertinente pour l’étude sur les ruminants. Le projet vise à déterminer l'influence de la présence d'enrichissement au jeune âge sur le développement comportemental et le bien-être des individus. Au regard de cet objectif, nous suivrons 40 agneaux de leur naissance jusqu'à la fin de la période d’engraissement (environ 130 jours).

35 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de glioblastome dans le cerveau puis des nanoparticules par voie intraveineuse et des irradiations, une partie étant tuée précocement pour l'analyse des tissus, afin de tester une thérapie photodynamique activée par rayons X. Le porteur relie le passage en gravité modérée aux anesthésies et transports répétés vers le site d'imagerie. Il conclut que le remplacement n'est "clairement pas possible" pour reproduire une tumeur cérébrale.

Objectifs

ll s'agit de valider le bénéfice d'une thérapie photodynamique activée par des rayons X sur un modèle de tumeurs cérébrales orthotopiques implantées chez la souris. Ce projet permettra de renforcer les effectifs et les résultats issus d'une étude préliminaire afin d'avoir une meilleure robustesse statisitique. L'utilisation de souris satellites (souris mises à mort précocémment pour l'observation des tissus au microscope pour observer l'effet précoce du traitement) permettra de caractériser par histologie les effets du traitement X-PDT régulièrement après l'adminitration du traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet mené en recherche préclinique permettra d'estimer si cette approche expérimentale est applicable par la suite chez l'Homme. Il permettra à long terme de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de ce type de tumeurs cérébrales très aggressives (glioblastome) en médecine humaine.

Procédures

Procédure 1 : Xénogreffe intracérébrale : implantation de cellules tumorales dans le tissu cérébral (35 souris au total pour une durée d'1h environ par animal, répété une seule fois en début d'étude) Procédure 2 : Administration intra-veineuse des nanoparticules sur souris vigiles 1h avant les irradiations : cette procédure ne nécessite pas d'anesthésie, la technique étant parfaitement maitrisée par les membres du laboratoire (durée 1min, 19 souris concernées avec 2 réitérations)

Impact sur les animaux

Anésthésie chimique ainsi que transport sur site d'imagerie répétés d'où passage de la saisine en classe modérée.

Devenir

Procédure 1 "xénogreffe intracérébrale" (implantation de cellules tumorales dans le tissu cérébral) : tous les animaux sont gardés en vie (implantation tumorale étant l'étape clé indispensable du projet) Procédure 2 "administration des traitements" : tous les animaux sont gardés en vie (pour permettre par la suite d'évaluer l'efficacité des traitements) Procédure 3 "suivi par imagerie" : tous les animaux sont gardés en vie sauf si un animal a atteint un des points limites décrit précédemment, il sera dans ce cas mis à mort à l'issue de la procédure. En outre, les animaux satellites (souris mises à mort précocémment pour l'observation des tissus au microscope pour observer l'effet précoce du traitement) pour lesquels le temps cinétique prévu est atteint (Jn+4, Jn+11, Jn+18) seront mis à mort à l'issue de la procédure en vue d'analyses histologiques.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement et la réponse au traitement in vivo de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes (intravasation, extravasation, envahissement du parenchyme cérébral, angiogénèse...). De plus, la mise en place d’une tumeur est un phénomène multifactoriel impliquant différents types cellulaires (cellules tumorales, cellules endothéliales, stroma...). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal. L’évolution de l’intensité de bioluminescence sera un indicateur d’efficacité des traitements. De plus, chaque groupe sera caractérisé par une courbe de survie. Les survies moyennes seront comparées par test de Kruskal-Wallis suivi d’un test post-hoc si la différence entre tous les groupes est significative.

Réduction

Les données issues d'une étude antérieure nous ont permis de réaliser un premier suivi en imagerie de la croissance des cellules U251 -Luc implantées en stéréotaxie (procédure chirrugicale permettant d'implanter les cellules tumorales directement dans une région bien précise du cerveau), en traitant par la voie X-PDT. Les résultats étant prometteurs, il est cependant nécessaire de compléter les effectifs pour avoir une meilleure fiabilité statistique mais les données générées par cette première étude seront exploitées permettant ainsi de réduire le nombre d'animaux utilisés dans cette étude complémentaire. L'estimation de l'efficacité de la thérapie par imagerie par Bioluminescence nécessite un suivi longitudinal des souris. Chaque animal sera son propre témoin ce qui constitue une stratégie permettant une utilisation judicieuse des animaux et assure une rigueur scientifique

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux d'une part après l'implantation de la tumeur (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) . L'atteinte d'un point limite décrit précédemment dans le descriptif des procédures conduira à la mise à mort de l'animal. Une attention toute particulière sera également portée lors du transport des animaux sur le site d’imagerie à NancycloTEP, notamment par le maintien d'une température optimale (par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages). Ce transport se fera toujours sous conditions éveillées. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de sopalins et de bâtonnets en bois à ronger. De plus, une analgésie sera administrée lors des procédures invasives (chirurgie d'induction tumorale)

Choix des espèces

Souris : pour nos expérimentations, nous travaillerons sur des modèles de tumeurs humaines implantées chez des rongeurs immunodéprimés. Ces modèles sont très largement décrits dans la littérature et sont très pertinents dès lors qu'il s'agit d'évaluer de nouveaux agent diagnostiques ou thérapeutiques Des souris âgées de 6 semaines sont utilisées, à un stade où leur conformation crâniale correspond à celle de l’atlas de stéréotaxie de Paxinos et Franklin.

26 veaux de quatre à huit semaines vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 20 tués à l'issue et 6 gardés en réserve, réaffectés s'ils ne servent pas. Une injection de lipopolysaccharide provoque une inflammation, puis 20 prélèvements sanguins sur 72 heures retirent jusqu'à 262 mL de sang par animal, pour tester l'association d'un anti-inflammatoire et d'un antibiotique. Le porteur prévoit une mise à mort par tige perforante et exsanguination, les produits testés n'ayant pas d'autorisation de mise sur le marché. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit la diffusion des principes actifs et juge "indispensable" le recours à l'animal entier.

Objectifs

Ce projet présente 4 différents objectifs: 1- Étudier les symptômes cliniques après une stimulation par LPS par administration sous cutannée 5.0 µg/kg par animal. 2- Évaluer la sécurité et l'efficacité d'une injection sous-cutanée d'un AINS en association avec un antibiotique longue action après une provocation expérimentale au Lipopolysaccharide (LPS) en comparaison avec l'antibiotique longue action seule (sous-cutané) et l' AINS seul (sous-cutané) en tant que monoproduits et une solution saline. 3- Évaluer les propriétés pharmacocinétiques des doses sélectionnées de l'AINS en association avec l'antibiotique longue action. 4- Évaluer l'évolution de certains marqueurs inflammatoires pertinents après le traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en avant les bénéfices de l'association de l'AINS avec l'antibiotique longue action, l'efficacité et la sécurité de cette administration conjuguée. Cela permettra de mettre en avant l'action de ce complexe sur les marqueurs de l'inflammation.

Procédures

La première étape est de créer le modèle inflammatoire. Pour cela, les 20 animaux sélectionnés recevront une administration de LPS ( Lipopolysaccharide provenant des bactéries Escherichia Coli) à la dose de 5.0 µg/kg soit 1 mL/50 kg. Puis les animaux seront répartis en 4 groupe de 5 animaux. Ils auront une administration sous cutanée de formulations tests c'est à dire d'une injection sous-cutanée d'un AINS en association avec un antibiotique longue action en comparaison avec l'AINS seul, l'antibiotique longue action seule en tant que monoproduits et une solution saline. Volume administré: 1 mL/40 kg. Puis Des prélèvements de sang seront également réalisés, 20 temps de prélèvements sur 72h (T0, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 9, 12, 18, 24, 28, 32, 48, 56, 72 h aprés administration. La collecte de sang sera effectuée à l'aide d'un vacutainer avec des tubes d'héparine de lithium (LiHe) et d'héparine de sodium (SoHe) et des aiguilles stériles de taille appropriée. Les aiguilles seront remplacées entre chaque veau et chaque prélèvement. Les échantillons de sang seront prélevés au niveau des veines jugulaires. Les sites de prélèvement seront alternés autant que possible. Volume total prélevé: 262 mL de sang par animal sur 72h. La création du modèle inflammatoire se fait le jour des administrations des produits tests et consiste à faire une administration en sous cutannée. Toutes les administations se font sur une seule journée. Les prélèvements sanguins seront réparti sur 3 jours. La phase animale de ce projet se terminera 72h aprés l'administration des éléments tests.

Impact sur les animaux

Il est possible d'observer des effets indésirables. Il peut s'agir d'une forte fièvre, modification de la respiration, modification du comportement général des animaux ( exemple déambulation, toux...), présence éventuelle d'écoulement occulaire ou nasal.

Devenir

A la fin de ce projet, tous les animaux traités seront euthanasiés selon les bonnes pratiques vétérinaires et la réglementation en vigueur, car ces animaux auront reçu des éléments tests sans AMM. Méthode physique: étourdissement à l'aide d'une tige perforante suivi de l'exsanguination. L'exsanguination consiste à la section des veines jugulaires et/ou artères carotides. Il est prévu 6 animaux réserves. Si les 6 animaux réserves ne sont pas utilisés ils pourront dans ce cas être replacés. La décision sera prise par le vétérinaire responsable.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire la diffusion d'un ou de plusieurs principes actifs dans le sang et leurs effets sur l'animal, il est donc indispensable de recourir à l'animal entier.

Réduction

Dans cette étude, il est prévu d'inclure 26 animaux ( 20 animaux administrés et 6 animaux de réserve). C'est le nombre d'animaux minimum requis pour avoir des résultats interprétables.

Raffinement

Les animaux auront une période d'acclimatation d'au minimum 2 semaines. De leur arrivée à la fin de l'étude, les veaux seront logés en groupes de 5 animaux. Les veaux seront couchés sur de la paille dans un système de litière profonde, de la paille propre étant fournie si nécessaire. Une attention particulière sera portée au raffinement et à l’enrichissement du milieu autant que possible. La thermorégulation et la ventilation des logements des animaux ne seront pas contrôlées puisque les logements sont ouverts sur l'environnement extérieur. L'éclairage naturel sera utilisé. La température et l'humidité du logement des veaux seront enregistrées pendant la phase animale.

Choix des espèces

Les veaux sont particulièrement sensibles aux LPS, et constituent donc une espèce de choix pour créer un modèle de l'inflammation. Les jeunes veaux sont très sensibles aux maladies respiratoires et constituent donc un modèle approprié à utiliser pour tester l'efficacité des produits contre les maladies respiratoires. Ils constituent également l'espèce cible de ce produit. Les veaux auront 4 à 8 semaines le jour de l'administration

30 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des psychostimulants ou des opiacés par gavage ou injection pour induire une sensibilisation comportementale, puis subissent un test comportemental avant un prélèvement de sang et de cerveau, afin d'évaluer des candidats médicaments contre l'addiction. Le porteur signale des effets indésirables possibles comme des crampes abdominales ou une sédation. Il affirme qu'aucun test in vitro ni modèle informatique ne peut rendre compte du comportement et conclut à l'absence d'alternative.

Objectifs

Les psychostimulants, tels que la D- amphétamine et la cocaïne, et les opiacés, tels que la morphine et l'héroïne, ont en commun la capacité de provoquer une dépendance chez l'homme et d'augmenter la libération de dopamine (DA) dans le noyau accumbens. Les mêmes médicaments induisent également une hyperactivité locomotrice chez les rongeurs et déclenchent une sensibilisation comportementale après des injections répétées. L'objectif de cette étude sera : 1) de mettre en place, chez la souris, un modèle de sensibilisation comportementale induite par une drogue et 2) de tester l’efficacité de médicament candidat dans ce modèle.

Bénéfices attendus

Les études animales précliniques reposent sur des modèles de rongeurs bien validés pour faciliter la compréhension des mécanismes et ainsi améliorer sa prise en charge. Ainsi, ce modèle animal peut être utile pour tester de nouvelles molécules candidates pour améliorer la prise en charge des patients pour une addiction et leur procurer une meilleure qualité de vie.

Procédures

La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Lors de l’administration d’un nouvel agent thérapeutique, certains effets indésirables tels que les crampes abdominales ou la sédation, peuvent apparaitre. Les administrations sont réalisées avant le test. Le mode et le nombre d’administrations des solutions sont déterminés en fonction des caractéristiques pharmacologiques des produits. La voie orale (gavage) est généralement privilégiée pour administrer le ou les produits étudiés parce que c’est celle qui sera prescrite chez l’homme. Le cas échéant, par exemple si le produit administré est destiné à être administré par d’autres voies chez l’homme, ou si sa biodisponibilité nécessite un autre mode d’administration, les voies intrapéritonéale, sous cutanée, intraveineuse ou intranasale peuvent être choisies.

Devenir

Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à la fin de l’étude à un prélèvement sanguin et de cerveau.

Remplacement

L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement des médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet de molécules sur le comportement est la conséquence de leur action au niveau de l’ensemble de l’organisme et en particulier sur le système nerveux. La mise en évidence de ces effets est réalisée sur un organisme vivant entier. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou modèle informatique ne permet de rendre compte de l’ensemble de ces phénomènes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent pas donc être remplacés par des méthodes alternatives. Pour le présent projet : il n’existe aucun modèle de sensibilisation comportementale induit par une drogue ou un médicament induisant une dépendance alternatif à l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Il correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne et d’erreurs standard de la moyenne (SEM). La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux seront pesés et leur état général quotidiennement évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle de souris et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur cette maladie dans toute sa complexité. La lignée de souris utilisée est : C57Bl/6 5-20 semaines au moment du test. Les molécules développées sont destinées à des adultes.