Recherche fondamentale

48 ouistitis vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une à plusieurs craniotomies avec injection de traceurs, dont un virus rabique, lors de chirurgies de quatre à six heures, puis sont tués pour l'analyse histologique du cerveau, afin de cartographier les réseaux neuronaux du mouvement oculaire. Le porteur reconnaît que ces chirurgies "peuvent être douloureuses" et que l'isolement des animaux infectés induit du stress. Il justifie le recours au primate par sa proximité anatomique et sociale avec l'humain, pour une visée de connaissance fondamentale.

Objectifs

Nous utiliserons différentes stratégies de traçage neuroanatomique pour décrire de façon détaillée l'organisation des réseaux neuronaux qui contrôlent les mouvements oculaires de saccade et de poursuite lisse chez le marmouset. Ces stratégies viseront à identifier les afférences mono et disynaptiques du colliculus supérieur et du DLPN de marmousets avec des objectifs scientifiques multiples. Tout d'abord, une description détaillée de ces réseaux est nécessaire pour guider des études fonctionnelles ultérieures. Les aires préfrontales et pariétales qui projettent vers colliculus supérieur et/ou le DLPN sont mal connues chez le marmouset. Ensuite, notre projet vise à compléter nos connaissances de l'anatomie des réseaux oculomoteurs qui a été forgée essentiellement par des travaux chez le macaque. En effet, cette étude permettra de comparer ces réseaux chez 2 espèces de primates (le macaque, déjà connu, et le marmouset) et offrir ainsi des indices sur l'évolution du contrôle oculomoteur. Par ailleurs, nous utiliserons des outils viraux de traçage neuroanatomique qui permettront de disséquer l'organisation de réseaux, plus finement que ce qui a été fait chez le macaque, en particulier en identifiant les connexions spécifiques relatives à des sous-ensembles neuronaux distincts. En plus, nous réaliserons des traçages depuis le colliculus supérieur et le DLPN chez des mêmes animaux (ce qui à notre connaissance n'a jamais été fait) afin de mieux déterminer les degrés de ségrégation et de recouvrement des zones cérébrales qui contrôlent les saccades de celles qui contrôlent les mouvements de poursuite. Enfin, ce projet vise à compléter et étendre notre autre projet (déjà validé) de traçage des afférences aux aires corticales 25 et 32, qui ont été impliquées dans l'expression des comportements sociaux. Ici, nous proposons de tracer conjointement (chez les mêmes animaux) les réseaux des aires 25 et 32 avec ceux de contrôle des mouvements oculaires. Nous espérons ainsi pouvoir identifier des régions cérébrales pouvant participer au contrôle du regard lorsque celui-ci a une fonction sociale.

Bénéfices attendus

Ce projet nous donnera accès à des données nouvelles et permettra de mieux comprendre le fonctionnement du système oculomoteur et les interactions sociales. Les bénéfices sont liés à des apports de connaissance fondamentale.

Procédures

anesthésie lors de procédures d'Imagerie par résonance magnétique. 1/animal. 1 heure Chirurgie: craniotomie, injection de traceurs. 2 à 3 par animal. 4 à 6 heures.

Impact sur les animaux

Tous les animaux subissant les procédures 2 à 4 seront mises à mort (procédure 5). Les chirurgies d'injections (impliquant une ou des craniotomies) peuvent être douloureuse. L'isolement des animaux suite aux injections de RV (sain ou deltaG) peut induire du stress chez les animaux concernés.

Devenir

Révéler les traceurs nécessite d'effectuer l'histologie des tissus ce qui ne peut être effectué sans la mise à mort des animaux.

Remplacement

Aucune méthode non invasive ne permet une description des réseaux nerveux aussi fine que par traçage neuroanatomique. Ainsi ce projet nécessite un modèle animal. D'une manière générale, les modèles pnh sont nécessires en neurosciences intégratives pour des raisons de proximités anatomiques, physiologiques et comportementales avec l'humain.

Réduction

La réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet découlera de l'injection conjointe, à l'aide de traceurs différents, d'au moins 2 aires distinctes.

Raffinement

A l'exception de animaux infectés avec le RV, les animaux resteront hébergés dans leur groupes sociaux. Pour les animaux infectés au RV, et donc nécessitant un hébergement spécifique, nous essayerons de regrouper les injections d'animaux appartenant aux mêmes groupes sociaux, pour les héberger ensemble. Lorsque l'isolement des animaux est nécessaire, nous fournirons des peluches de ouistiti (ce qui semble avoir un effet bénéfique sur le stress des animaux isolés dans les zoos).

Choix des espèces

D’une manière générale le modèle primate non humain est nécessaire en neurosciences pour des raisons de proximité anatomiques, physiologiques et éthologiques avec l’Homme. Nous avons choisi le marmouset qui présente un fort développement du cortex préfrontal présentant beaucoup de similitudes au niveau neuro-anatomique avec celui des humains. De plus, les interactions sociales des marmousets, pour lesquelles le regard joue un rôle important, sont multiples et complexes et, comme chez les humains, elles participent à la structure sociale du groupe et aux coopérations entre les individus. Ainsi, le marmouset est un modèle de choix pour ce projet. Marmousets : Ages : 18 mois-10 ans (matures) Poids : 200-450 gr.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections virales et une fibre optique implantée dans le cerveau sous anesthésie, subissent une stimulation magnétique répétée puis une inhibition optogénétique, avant une perfusion intracardiaque, pour étudier les effets de la stimulation transcrânienne sur la dépression. Le porteur qualifie les effets indésirables de "faibles" et décrit une chirurgie à "impact léger", alors que la procédure est classée en gravité modérée. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne peut répondre à la question posée.

Objectifs

Les troubles dépressifs sont la principale cause d’invalidité dans le monde. Cependant l’efficacité des antidépresseurs est insuffisante chez un grand nombre de patients, ce qui nécessite une meilleure caractérisation des mécanismes neurobiologiques de la maladie ainsi que l’investigation de thérapies alternatives. La stimulation cérébrale magnétique transcrânienne répétée (rTMS) permet de modifier durablement l’activité cérébrale d’une région corticale ciblée via l’application d’une série d’impulsions magnétiques. Ses mécanismes d’action restent peu connus. L’objectif du projet est dans un premier temps de caractériser les effets de la rTMS par photométrie de fibre dans le cerveau de la souris (technique expliquée dans le déroulé du projet). Cette technique permet de suivre en direct l’activité d’une population neuronale à l’échelle d’une région cérébrale. La région d’intérêt à stimuler est le cortex préfrontal médian (mPFC), car il a été montré dans notre équipe que la rTMS du mPFC permet l’amélioration de certains phénotypes dépressifs dans un modèle murin de dépression. Cependant, le rayon d’action de la sonde que nous utilisons pour la rTMS n’a pas été décrit systématiquement in vivo, d’où la nécessité de caractériser la rTMS avec une technique permettant de suivre en direct les modifications de l’activité neuronale. Dans un second temps, l’objectif sera de caractériser plus en détail l’effet thérapeutique des stimulations. Une fois que nous aurons mieux caractérisé la stimulation et ciblé avec plus de précision le mPFC par rTMS, nous allons investiguer quelle projection du mPFC est impliquée dans l’amélioration des phénotypes dépressifs après rTMS. En particulier, le mPFC projette directement vers l’amygdale et le striatum ventral, et indirectement vers l’hippocampe. Ces trois régions et le mPFC étant dérégulées dans la dépression, il est important de déterminer le rôle de chacune de ces projections dans la réponse thérapeutique à la rTMS. Pour cela, nous allons d’abord caractériser la connectivité fonctionnelle au repos 3 jours après la fin d’un traitement de 5 jours consécutifs de rTMS du mPFC. En s’appuyant sur ces résultats, nous allons ensuite étudier l’impact d’une inhibition optogénétique des projections du mPFC vers l’amygdale, l’hippocampe, et le striatum ventral. L’inhibition de ces projections une à une pendant le traitement par rTMS nous permettra d’identifier quelle(s) projection(s) est impliquée dans la réponse thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet pourra permettre une meilleure utilisation de la stimulation magnétique dans les modèles précliniques de maladies neuropsychiatriques murins grâce à une caractérisation plus détaillée de la seule sonde disponible pour les rongeurs (initialement mise au point pour le modèle rat). En se basant sur ce meilleur contrôle de la stimulation, cette étude pourra permettre d’identifier la (ou les) projection du mPFC ayant un effet dans le rétablissement des phénotypes anxieux et/ou dépressifs. Cela est important pour mieux comprendre les effets de la rTMS chez l’homme et l’animal, mais aussi pour développer de potentielles approches thérapeutiques plus spécifiques dans une approche translationnelle.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à des injections virales et à l’implantation de fibre optique sous anesthésie générale (isoflurane), l’intervention durant environ 90 min. Une seconde intevention sous anesthésie générale est la rTMS, qui n’est pas invasive et consiste à placer la sonde magnétique à proximité du crâne de l’animal. 640 animaux au total suivront cette procédure, qui dure environ 10 min et est répétée sur 5 jours consécutifs. Une dernièree intervention sous anesthésie générale également est l’inhibition de l’activité neuronale par optogénétique, qui se fera pendant la rTMS (sur la même durée, 10min) via la fibre optique préalablement implantée et connetée à générateur délivrant des pulses de lumière (10Hz, 10ms) sur une durée de 500ms pendant 20s.

Impact sur les animaux

Peu d’effets indésirables sont à prévoir dans le projet. Le modèle de dépression que nous envisageons d’utiliser a un impact faible sur le bienêtre des animaux. La rTMS n’a pas d’impact sur le bien-être. La chirurgie permettant l’injection du vecteur viral puis l’implantation de la fibre optique pour la photométrie et l’optogénétique a un impact léger sur le bienêtre animal, les animaux récupérant rapidement de ce type de chirurgie, et l’encombrement et le poids de l’implant (canule, et fibre pendant les enregistrements) étant faibles : de nombreux laboratoires ont déjà utilisé ce type d’approche sans encombre sur l’animal mobile et éveillé sans gêne majeure.

Devenir

Tous les animaux seront mis à morts lors de la perfusion intracardiaque . Cette procédure est nécessaire pour la caractérisation histologique de l’expression des vecteurs viraux et du placement des fibres optiques.

Remplacement

Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale à la rTMS nécessite également l’utilisation d’animaux.

Réduction

Les effectifs sont optimisés, les analyses tissulaires nécessitent une taille d’effectifs suffisante compte tenu de la variabilité inter-individuelle (n=20 sujets par groupe expérimental en tenant compte du taux de succès des chirurgies évalué à ~70%). De plus, la rationalisation des procédures permet d’optimiser l’utilisation des échantillons cérébraux prélevés. Les phases de mise au point des chirurgies (étapes 1) et 2) dans la description du projet) font partie de cette optimisation afin de réduire le nombre d’animaux dans les étapes ultérieures, et seront arrêtées une fois la technique mise au point.

Raffinement

Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (cabanes plexiglass et cartons, tubes). Les animaux recevront un traitement analgésique avant, juste après et 24 à 48h suivant l’intervention, puis si nécessaire un traitement antibiotique. Chaque animal est placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie. Les cornées sont protégées de la déshydratation. L’anesthésie gazeuse est ici privilégiée pour mieux contrôler la profondeur d’anesthésie et pour une meilleure récupération post-opératoire. Une surveillance post-opératoire d’une semaine est réalisée pour suivre chaque souris et intervenir si nécessaire.

Choix des espèces

Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, l’implémentation d’un modèle de dépression et de neurostimulation, ainsi que la possibilité d’utiliser des vecteurs viraux permettant l’utilisation de l’optogénétique font de la souris le modèle le plus pertinent. Les animaux seront adultes (âgés d’environ 8 semaines ou plus) au début de l’étude. Justification : il s’agit de comprendre ces phénomènes dans un cerveau adulte (8 semaines correspondant au début de l’âge adulte chez la souris.

4 995 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par des bactéries, greffées de cellules tumorales ou exposées à des substances cancérigènes, puis traitées par antibiotiques, immunothérapies ou phages, pour étudier la réponse immunitaire de la vessie. Le porteur reconnaît que l'infection peut causer des douleurs et qu'une tumeur à croissance rapide peut obstruer l'urètre. Il décrit ces travaux comme visant une "meilleure compréhension" des mécanismes immunitaires et affirme le recours à l'animal "absolument nécessaire", faute d'alternative.

Objectifs

Notre objectif est de comprendre la réponse immunitaire à l'infection, au cancer et aux immunothérapies dans la vessie. Cette compréhension nous permettra d'identifier des cibles pour les futures imunothérapies afin d'améliorer le traitement des infections, des cancers et d'autres maladies de la vessie.

Bénéfices attendus

Nous espérons avoir une meilleure compréhension du fonctionnement de la réponse immunitaire dans la vessie et comprendre les mécanismes par lesquels les approches thérapeutiques, telles que la vacciantion ou la phagothérapie, améliorent l'immunité contre la maladie.

Procédures

les animaux seront infectés par des bactéries, ou implantés avec des cellules tumorales, ou recevront des substances cancérigènes pour développer des tumeurs. Ensuite, les animaux seront traités avec des médicaments, tels que des antibiotiques, des immunothérapies ou des phages.

Impact sur les animaux

Bien que nous ayons mis en place un plan pour éviter les effets néfastes, il est possible que les animaux ressentent des douleurs dues à une infection, comme c'est le cas chez l'homme, ou que des tumeurs à croissance rapide provoquent une obstruction urétrale. Nous pouvons surveiller ce scénario pour éviter cette possibilité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de toutes les procédures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est absolument nécessaire pour ce projet puisqu’il n’existe aucune autre alternative pertinente pour ce genre de projet. En outre, ces études doivent être effectuées in vivo, parce qu’il est nécessaire que les organes et les systèmes impliqués soient intacts afin de bien comprendre la migration cellulaire et la réponse immunitaire (innée et adaptative).

Réduction

Réduction : Le nombre de souris a été calculé pour utiliser le nombre minimum d'animaux nécessaires à l'analyse statistique, sur la base d'expériences antérieures. Dans la mesure du possible, un seul groupe témoin sera utilisé pour plusieurs groupes expérimentaux afin de réduire le nombre total de souris nécessaires, sans compromettre l'intégrité de l'expérience.

Raffinement

Raffinement : Tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress, l'inconfort et la douleur des animaux. Cela comprend une surveillance régulière, l'administration de médicaments antidouleur approuvés si les souris souffrent (aspect voûté, piloérection) et la détermination de points limites avant de commencer l'expérimentation (perte d'un pourcentage prédéterminé de poids, par exemple) (le tout conformément à la réglementation européenne).

Choix des espèces

Les souris sont un bon modèle pour étudier les réponses immunitaires contre les bactéries. Il a été démontré empiriquement que les infections des voies urinaires chez la souris reflètent, dans de nombreux aspects essentiels, l'état de la maladie observée chez l'homme. Il a été démontré que la voie utilisée par les pathogènes identifiés comme uropathogènes chez la souris est également utilisée chez l'homme, ce qui justifie l'utilisation de la souris comme un modèle approprié pour l’infection des voies urinaires. Des travaux précédents de notre laboratoire ont démontré que la réponse des souris traitées par BCG-thérapie pour le cancer de la vessie est très similaire à celle observée chez l'homme, justifiant à nouveau la souris comme un modèle utile pour l'étude de l'immunothérapie dans la vessie. On va utiliser les souris de 6 à 24 semaines. Cet âge chez la souris équivaut à l’âge adulte chez l’homme. Dans un très petit nombre d'observations, nous analyserons la vessie de souris néonatales non manipulées qui n'ont pas encore été sevrées, âgées de 0 à 28 jours, afin d'identifier spécifiquement le moment où les populations de macrophages résidents dans la vessie divergent en deux populations distinctes et si cela dépend du passage de l'allaitement à l'alimentation solide. Nous pensons avoir besoin de 8 à 10 souris par point temporel, 4 points temporels étant prévus. Donc, 40 souriceaux femelles et 40 souriceaux mâles

520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie de la patte leur inflige une douleur neuropathique chronique, suivie de tests du seuil mécanique aux filaments de von Frey, de préférence de place conditionnée et d'observation en IntelliCage, pour étudier l'anxiété et la dépression liées à la douleur chez les femelles. Le porteur précise qu'aucun anti-inflammatoire ni opiacé ne peut être administré, ces molécules interférant avec la douleur qu'il cherche à maintenir. Il affirme qu'il lui est "impossible" de remplacer ce modèle par une approche in vitro ou in silico.

Objectifs

La douleur neuropathique est consécutive à une lésion ou une pathologie du système nerveux somatosensoriel. Généralement chronique, avec une prévalence de 5 à 7% dans la population, elle s’accompagne d’un fort risque de développement de troubles de l’humeur. En effet, environ 50% des patients présentent cette co-morbidité. Ceci constitue un enjeu important de santé publique. Malgré les données cliniques, les mécanismes sous-jacents de cette co-morbidité restent encore inconnus et nécessitent des études précliniques. Une modélasation chez la souris mâle des conséquences affectives à long terme d’une douleur neuropathique existe. De plus, les données d’imagerie neuroanatomique et fonctionnelle chez l’homme, ainsi des résultats obtenus par des approches lésionnelle, ,d’optogénétique et imagerie, chez la souris montrent que la dépression majeure mais aussi les situations douloureuses s’accompagnent de changements dans des structures limbiques comme le cortex cingulaire antérieur (CCA), l’Habénula laterale (HBl), le noyau basolatéral de l’amygdale (BLA) et l’aire tegmentale ventrale (VTA). Le but de ce projet est de caractériser les comportements anxio-dépressifs dans un modèle de douleur neuropathique chez les femelles et comparer les changements moléculaire et physiologique entre mâles et femelles.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est double : 1) caractériser pour la première fois chez la femelle l’établissement de la douleur chronique neuropathique et le développement progressif des comportements de type anxieux et dépressif et 2) en étudier les changements moléculaires au cours du développement de cette comorbidité dans 4 structures cérébrales d’intérêt, le cortex cingulaire antérieur (CCA), l’Habénula laterale (HBl), le noyau basolatéral de l’amygdale (BLA) et l’aire tegmentale ventrale (VTA). A l’issue de ce projet, nous serons en mesure de détailler pour la première fois l’apparition de cette comorbidité chez la femelle, en comparaison avec les données déjà connues chez le mâle, et pourront de plus décrire les adaptations moléculaires liées au développement des comportements de type anxieux et dépressif chez les deux sexes. Cette avancée pourrait permettre de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques, potentiellement différentes chez le mâle et la femelle.

Procédures

Les animaux seront soumis à une douleur chronique avec développement de troubles anxio-dépressifs. Chirugie patte droite de l'animal et pose de puce d’identification.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie "cuff" et / ou à la chirurgie stéréotaxique, toute perte de poids qui atteindrait 15 % sans récupération, ou une plaie ouverte seront considérées comme point limite. Tout animal montrant un de ces points limites et dont l'état ne s'améliore pas sur une période raisonnable (48 h pour une blessure et 5 jours pour la perte de poids) sera mis à mort par inhalation de dioxyde de carbone. Après chaque chirurgie, des croquettes ainsi que de l'eau gélifiée sont disposés dans les cages. Une fiche individuelle de suivi est utilisée afin de suivre le bon rétablissement de chaque animal. Cette fiche présente en annexe 3 est basée sur une évaluation numérique (scoring). Pour la chirurgie « cuff », chaque animal est scoré le lendemain de la chirurgie, puis deux fois par semaine jusqu'à la fin du protocole expérimental. Pour la chirurgie stéréotaxique, chaque animal est scoré quotidiennement pendant les 3 jours suivants la chirurgie puis deux fois par semaine jusqu'à la fin du protocole expérimental. » Points limites : - si le poids est inférieur à 80 % du poids initial (avant chirurgie) pendant 48 h - si, après anesthésie, l’animal présente des signes d'abdomen gonflé pendant 48 h - si l'animal présente une vocalisation spontanée ou une automutilation - si l’animal présente deux scores de 2 ou un score supérieur à 6 sur la grille de suivi-post-chirurgical (annexe 2). - Pour la procédure 1: problèmes moteurs, difficulté à se déplacer ou paraplégie - Pour les procédures 8 et 9 : rougeurs ou signes d’infection autour de l’implant crânien Remarque : l'utilisation d'antidouleur de type anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et opiacés n'est pas possible en post-chirurgie dans notre cas. Les AINS tout comme les opiacés bloqueraient (ou interfèreraient avec) les processus inflammatoires nécessaires au développement et au maintien de la douleur neuropathique.

Devenir

• P1 : Modèle de douleur neuropathique (TOUS les animaux sont gardés en vie pour les procédures suivantes soit 520 animaux) • P2 : Evaluation du seuil de sensibilité mécaniques filaments de von Frey (TOUS les animaux sont gardés en vie pour les procédures suivantes soit 520 animaux) • P3 : Evaluation de l’état anxieux/dépressif (TOUS les animaux sont mis à mort par CO2 soit 160 animaux) P4: Evaluation de la douleur spontanée par le test de préférence de place conditionnée (CPP) (TOUS les animaux sont mis à mort par CO2 soit 120 animaux) • P5 : Pose de puce pour analyse du comportement spontané dans une IntelliCage (TOUS les animaux sont mis à mort par CO2 soit 80 animaux) • P6 : Evaluation de l'état anxieu/dépressif des animaux pour analyses moléculaires (TOUS les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale soit 160 animaux)

Remplacement

Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, la caractérisation de la douleur et de sa composante émotionnelle et affective nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.

Réduction

Afin de réduire l’angoisse des animaux, les souris seront hébergées à 4-5 par cage. Chaque cage sera enrichie avec de la frisure et du coton pour favoriser les comportements de nidation et un barreau bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Au regard de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle, les groupes expérimentaux explorant les comportements de type anxio-dépressif liés aux douleurs chroniques seront constitués d’au moins 20 souris. Les animaux étant consanguins, la variabilité phénotypique est considérablement diminuée, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux tout en mettant en évidence un effet statistiquement significatif. Un calcul statistique « power analysis » a également été réalisé pour s’assurer que les résultats obtenus sont valides au plan statistique (multiple ANOVA).

Raffinement

Les animaux sont hébergés en animalerie dont la température, l’humidité et le cycle jour/nuit sont contrôlés, nourriture et boisson sont disponibles ad libitum. Ils seront hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Nous travaillerons en cycle jour/nuit inversé (lumière allumée de 21h à 9h), pour éviter les manipulations durant le temps de sommeil des animaux et ainsi diminuer le stress. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont systématiquement utilisées. Les signes de mal-être suivants seront recherchés : perte de poids, blessure ou plaie ouverte, dégradation de l'état du pelage, dos arqué. Un exemplaire du « mouse grimace scale » sera disponible (annexe 1) pour aider à la détection des signes de douleurs aiguës. En cas de signes de souffrance de l’animal, des soins (désinfection, suture de plaie), une administration d’antalgique ou d’anti-inflammatoire, une séparation (blessures entre congénères) seront réalisés après concertation avec le vétérinaire, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux (SBEA) et/ou le personnel zootechnique de l’institut. Enfin, des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la SBEA de l’institut pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Le modèle de douleur neuropathique utilisé dans cette étude a été caractérisé et validé pharmacologiquement chez la souris et non dans une autre espèce comme le rat par exemple. De plus, de nombreuses lignées de souris transgéniques existent et sont disponibles ce qui nous permettra de répondre de façon précise aux questions scientifique posées. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g).

4 770 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de lipopolysaccharide bactérien pour induire un état de type dépressif, puis passent le test de la nage forcée avant un prélèvement de sang et de cerveau, afin d'évaluer des candidats médicaments. Le porteur indique que le produit provoque une hypoactivité et une perte de poids, et retire du bécher toute souris qui met la tête sous l'eau. Il affirme qu'il "n'existe pas de méthodes alternatives" pour modéliser la dépression et conclut au caractère "nécessaire" du recours à l'animal.

Objectifs

De plus en plus d’études démontrent que l’inflammation joue un rôle dans la physiopathologie du trouble dépressif majeur (MDD). En effet, il a été montré que les patients déprimés présentaient un taux plus élevé de cytokines pro-inflammatoires par rapport à des témoins sains. Des symptômes dépressifs ont également été détectés chez des patients traités par immunothérapie pour des cancers ou des maladies virales. L’administration périphérique de l'endotoxine bactérienne lipopolysaccharide (LPS) induit des symptômes de type dépressif chez les rongeurs dans le modèle de la nage forcée (ou forced swimming test, FST). L’objectif de ce projet sera dans un premier temps la mise en place de ce modèle puis l’étude, chez la souris ayant reçu du LPS, d’une potentielle efficacité de plusieurs candidats médicaments dans le test de la nage forcée.

Bénéfices attendus

Les études animales précliniques reposent sur des modèles de rongeurs bien validés pour faciliter la compréhension des mécanismes et ainsi améliorer sa prise en charge. Ainsi, ce modèle animal peut être utile pour identifier le lien entre l’inflammation et l’état dépressif afin de tester de nouveaux candidats médicaments.

Procédures

La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

L’administration de LPS induit chez la souris une hypoactivité et une baisse de masse corporelle durant les heures qui suivent l’injection et l’administration de nouveaux candidats médicaments peut également entraîner des effets indésirables. Les animaux sont donc suivis après administration. L’état général des animaux est évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort. Des paramètres supplémentaires ont été rajoutés, il concerne les effets indésirables potentiels qu’un traitement pourrait provoquer. L’expérimentateur doit alors noter l’intensité de chacun de ces paramètres. Durant le test de nage forcée, si la souris met la tête sous l’eau, elle est immédiatement retirée du bécher et placée dans une cage contenant un linge pendant 10 minutes pour retourner ensuite dans sa cage d’origine.

Devenir

Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à la fin de l’étude à un prélèvement sanguin et de cerveau.

Remplacement

A ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la dépression. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire pour l’étude de la physiopathologie et l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Le nombre total d'animaux utilisés pour une étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d'animaux par groupe nécessaire pour l'obtention de résultats statistiquement interprétables. Compte tenu de la variabilité interindividuelle des variables mesurées dans ce test, ce nombre a été fixé à 15 animaux par groupe. L'utilisation d'un nombre inférieur d'animaux a une probabilité importante d'entraîner la non-validité de l'étude, conduisant à la refaire, et par conséquent à utiliser un nombre d'animaux plus élevé. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p < 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux seront pesés et leur état général quotidiennement évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des souris correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle de souris et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur cette maladie dans toute sa complexité. Les lignées utilisées sont : la souris Swiss et la C57Bl/6 13 semaines au moment du test. Les molécules développées sont destinées à des adultes.

225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par chirurgie stéréotaxique une greffe intracérébrale de cellules de gliome pédiatrique du tronc cérébral, tumeur incurable, pour tester l'effet de l'inhibition du gène VRK3 sur sa progression. Le porteur indique que les animaux développeront des troubles neurologiques et une ataxie liés à la tumeur. Il décrit ces modèles, suivis par bioluminescence, comme un "outil indispensable" faute de pouvoir reproduire l'infiltration tumorale hors de l'animal.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales constituent la première cause de mortalité et de morbidité par cancer chez l'enfant et l'adulte jeune. Les gliomes malins infiltrants du tronc cérébral (ou DIPG), qui représentent 10 à 15% des tumeurs cérébrales pédiatriques, sont les formes les plus graves et les plus mal connues sur le plan biologique. Ces tumeurs sont universellement incurables et constituent le plus grand défi thérapeutique de l'oncologie pédiatrique à ce jour. Nous avons initié un programme de recherche pour caractériser ces tumeurs et montrer qu’elles sont très différentes des gliomes de l’adulte et des tumeurs corticales de l’enfant. Des mutations originales de l’histone H3, quasi-constantes dans les DIPG et jamais décrites dans aucun autre type de cancer, ont été découvertes. Il s’agit donc d’un mécanisme oncogénique complètement inédit et intimement lié au développement de cette partie du cerveau. Par ailleurs, les DIPG ne forment jamais de masse tumorale, mais infiltrent les structures cérébrales normales puis se disséminent dans la totalité du cerveau. Nous avons récemment réussi à développer des modèles expérimentaux de tumeurs cérébrales issus de tumeurs de patients atteints de DIPG. Ces modèles que l'on peut suivre par bioluminescence, développent des signes cliniques neurologiques entre deux et quatre mois post-greffe, et histologiquement la tumeur se développe en infiltrant le tronc cérébral. Ces modèles sont encore très rares et sont un outil indispensable pour l'exploration de thérapies prometteuses. Afin d’identifier les gènes nécessaires à la survie cellulaire du DIPG, une étude de screening par shARN ciblant l’ensemble des kinases humaines a été réalisé sur quatre lignées in vitro. Plusieurs gènes ont été identifiés dont VRK3. Les résultats de ce crible ont été confirmés in vitro par shARN et Crispr/Cas9 sur un plus grand nombre de lignée cellulaire de DIPG. Pour les études vivo, des constructions spécifiques de shRNA et Crispr/Cas9, dirigées vers le gène VRK3, inductibles par la doxycyline ont été réalisés afin d’éteindre le gène dans les cellules tumorales après la greffe.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la réduction ou le ralentissement du volume ou de la croissance tumorale dans le cerveau de souris, comme modèle de la maladie humaine, après inhibition du gène VRK3 par induction de 845mg/kg de doxycycline dans l'alimentation. En effet, in vitro, nous avons pu voir que l'inhibition du gène VRK3 était létal sur les cellules. Nous nous attendons à cette létalité sur les cellules tumorales in vitro ou bien un ralentissement de leur croissance.

Procédures

Chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale (durée 30 minutes). Injection de luciférase en IP 10ml/kg sous anesthésie locale à raison d'une injection tous les 15 jours pour observer la bioluminescence (durée 1 minute).

Impact sur les animaux

L’inhibition de VRK3 sera spécifique aux cellules tumorales, car les constructions seront intégrées uniquement dans ces dernières en amont de la greffe, nous ne nous attendons donc pas à observer des signes de toxicité systémique chez la souris. Les nuisances attendues chez les animaux sont celles liés aux symptômes tumoraux (trouble neurologiques perceptibles; ataxie).

Devenir

Mise à mort de tous les animaux pour prélèvements des cerveaux et analyses ex-vivo.

Remplacement

Une singularité des gliomes du tronc cérébral résulte dans leur phénotype systématique d’infiltration des structures normales, l’absence de masse tumorale et l’importante capacité d’invasion du tronc cérébral dans un premier temps, puis plus largement du cerveau au décours de la maladie. Ces particularités résultent des interactions des cellules tumorales avec leur stroma qui ne peuvent être appréhendées que dans des modèles vivo, où la variété et complexité du microenvironnement tumoral peut être reproduite.

Réduction

Nos xénogreffes intracérébrales de DIPG que nous pouvons suivre par bioluminescence, développent des tumeurs avec un temps de survie des animaux de façon reproductible. Le nombre minimal nécessaire et suffisant a été calculé au plus juste par calcul de puissance (GPower). Les contrôles ont tous été vérifiés et validés ou supprimés.

Raffinement

Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale (injections). Les animaux seront pesés deux fois par semaine et examinés trois fois par semaine au début de la maladie, puis quotidiennement avec des tumeurs au stade avancé. Ils seront hébergés au minimum par 2 avec un enrichissement de la cage type sizzlenest et recevront des anti-douleurs dès l’arrivée des premiers symptômes neurologiques ou de douleur. L'eau et la nourriture seront donnés ad libitum. La nourriture sera adaptée en cas de symptômes (DietGel).

Choix des espèces

L'utilisation de modèles de souris immunodéprimées (Swiss/Nude) permet la greffe de tumeurs humaines. Les animaux utilisés auront entre 4 et 6 semaines correspondant à l’âge du jeune adulte. Nos études préalables nous ont montrées qu'il n'y avait pas de différences de prise de greffe chez des animaux juste sevrés (3 semaines) et des animaux adultes (plus de 6 semaines). Cependant, le développement de la tumeur étant lent (entre 2 mois et 1 an selon les modèles), nous utiliserons des animaux jeunes afin de ne pas avoir un état général dégradé qui pourrait être dû à la dégénérescence du modèle en fin de protocole.