Recherche fondamentale

864 souris dites humanisées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules humaines, des prélèvements de moelle osseuse et de sang sous anesthésie, des injections répétées et un gavage, puis une irradiation qui provoque une anémie d'une dizaine de jours, pour tester une molécule censée limiter les dommages sanguins des rayonnements. Les retombées annoncées, augmenter la survie de patients exposés à des doses aiguës d'irradiation, restent au conditionnel et à long terme. Le porteur affirme que le projet n'a "pas d'alternative non animale" et qualifie l'étape in vivo d'"indispensable", ces souris immunodéficientes étant présentées comme les "outils de référence" du développement sanguin humain.

Objectifs

Les chimiothérapies et radiothérapies peuvent altérer la production des cellules sanguines et immunitaires par la moelle osseuse (appelé myelosuppression). Les recherches menées depuis 2013, par une partenaire, portent sur le développement d'une molécule X1 pour l'indication de la myélosuppression induite par la chimiothérapie et par irradiation. Notre projet se base sur des données préliminaires, qui démontrent un effet positif de X1, en combinaison avec des facteurs stimulant la formation de cellules impliquées dans l'immunité anti-bactérienne et virale et dans la formation de plaquettes sanguines, améliorant ainsi la survie des animaux traités après une myélosuppression induite par irradiation. Le présent projet vise à valider si le traitement par X1 peut améliorer la récupération fonctionnelle des cellules sanguines humaines après irradiation. Cette étude nécessite d’explorer les effets de l’irradiation par des études d’efficacité sur des rongeurs dits "humanisés" (souris ayant reçu une greffe des cellules humaines) traités ou non avec X1. Ces modèles murins sont les seuls à l'heure actuelle à récapituler le développement sanguin normal humain. Notre projet a plusieurs objectifs: L'Objectif 1 consiste en l'étude thérapeutique de X1 dans laquelle nous allons mesurer l’effet de X1, seul ou combiné aux facteurs décrits plus haut, sur l’atténuation de la toxicité des radiations sur les cellules sanguines humaines lorsque X1 est donné à partir de 2 heures après irradiation aux souris humanisées. L'Objectif 2 consiste en l'étude thérapeutique de X1 dans une moelle osseuse humaine. Dans cet objectif, nous testerons l’efficacité de X1 comme dans l'objectif 1, mais cette fois dans des souris portant une niche de moelle osseuse humanisée contenant une production sanguine humaine active. L'Objectif 3 consiste en l'étude prophylaxique de X1 dans laquelle nous étudierons si X1 peut aussi être utilisé pour atténuer la toxicité des radiations sur les cellules hématopoïétiques humaines dans les modèles de souris humanisées en apportant X1 avant l'irradiation. Cette étude permettra de prédire au mieux la réponse sanguine humaine à ce nouvel agent thérapeutique.

Bénéfices attendus

1-Atténuation de la myélosuppression et des séquelles associées (infections, hémorragies) chez les patients à des doses myélosuppressives de irradiation aiguë. Par conséquent, augmenter la survie des patients exposés de manière aiguë à des doses de irradiation (syndrome aiguë de rayonnement). 2-Augmenter la survie des patients exposés de manière aigüe à des doses myélosuppressives d’irradiation. Les cytokines aident à la récupération des lignées granulocytaire et macrophagique, mais sont sources d’effets indésirables graves. De plus, elles sont très couteuses à produire. Il y a donc un besoin de développement de nouvelles contre-mesures médicales. Celles-ci devront se caractériser par leur efficacité à améliorer les séquelles post-myelosuppression induite par une irradiation, par une atténuation complémentaire ou plus large de la myélosuppression associée. Ces nouvelles contre mesures devront également avoir un profil d'innocuité et de tolérabilité, un stockage facile et pouvoir être administrées rapidement dans un scénario de pertes massives. X1 est une bio-molécule administrée par voie orale. Elle a été initialement développée pour le traitement des infections virales respiratoires et de la neutropénie induite par la chimiothérapie. Son utilisation est justifiée en tant qu'agent de radioatténuation pour le syndrome hématopoïétique d’irradiation. En effet, les lésions induites par la chimiothérapie et la radiothérapie ont des voies communes qui entraînent une myélosuppression aigüe et des lésions résiduelles de la moelle osseuse. La gravité des lésions des organes dépend de la dose de rayonnement et de la durée d'exposition. Les lésions par rayonnement sensibilisent les organes et les cellules cibles entraînant le syndrome d'irradiation aigüe (ARS). Ces dommages multiples nécessiteront probablement plus d'une seule thérapie pour atténuer et améliorer la récupération. Par conséquent, une approche polypharmaceutique est justifiée, en particulier lorsque les sujets sont exposés à des doses plus élevées d’irradiations aiguës.

Procédures

Nous aurons recours à un prélèvement de sang et de moelle osseuse, 3 mois après transplantation de cellules souches et de progéniteurs humains du sang. Ces deux actes, d’une durée inférieure à 2 minutes chacun seront réalisés sous anesthésie générale sur un tapis chauffant. Nous utiliserons du gel ophtalmique pour prévenir le déssèchement des yeux. Pour l’injection des molécules, via 2 actes en sous-cutané et un acte en intrapéritonéale, ils se feront sur animal vigile, une fois et pendant 4 semaines pour l’hormone parathyroïdienne. Cet acte prendra 1 minute. Il y aura un acte de gavage durant 4 jours sur animal vigile prenant une minute. Suite à ces prélèvements et injections/gavages, il sera ajouté de l’hydrogel et des cupules de nourritures enrichies dans les cages afin d’aider les animaux à récupérer. Les souris seront irradiées en 1 fois pendant une période d'environ 2 minutes.

Impact sur les animaux

Nous aurons recours à un prélèvement de sang et de moelle osseuse, 3 mois après transplantation des cellules souches/progénitrices humaines du sang, pour vérifier que nos souris sont bien humanisées ce qui induira une douleur pour les souris. L’irradiation utilisée dans ce projet est subléthale mais provoque une anémie qui dure une dizaine de jours. Les souris recevront la molécule X1 par voie orale pendant 30 jours, dans le protocole thérapeutique. Le traitement en lui-même n’induit pas d’effet secondaire notable selon les expériences préliminaires réalisées par la compagnie qui produit X1. Les souris recevront transitoirement plusieurs injections de facteurs de croissance/hormonaux ce qui induit un risque d'inflammation locale temporaire ou des douleurs osseuses à courte durée.

Devenir

Afin de mesurer la récupération en cellules sanguines humaines après traitement, nous devons euthanasier les souris. Des organes hématopoïétiques (moelle osseuse, rate et thymus) sont prélevés et les cellules qui y sont contenues sont soumises à une caractérisation cellulaire et à des tests fonctionnels in vitro. Ces protocoles sont importants pour pouvoir juger de la réussite ou pas du traitement effectué après ou avant l'irradiation.

Remplacement

Ce projet n'a pas d'alternative non animale. Nous allons réaliser des expériences in vitro en parallèle, mais ces tests ne récapituleront jamais l'hétérogénéité organique des réponses in vivo, étape indispensable pour l’évaluation des effets potentiels de radio-atténuation de X1 (seul ou combiné) pour le syndrome hématopoïétique aigue lié aux radiations. En effet, notre projet nécessite une étape indispensable in vivo afin d'étudier les effets de X1 en suivant la récupération et la production hématopoïétique humaine dans un modèle préclinique capable de mimer la réponse thérapeutique chez l’homme. Nous utiliserons des souris sans système immunitaire qui représentent les outils de référence internationaux pour l’analyse fonctionnelle du développement sanguin humain d'après la littérature scientifique. Ces souris immunodéficientes sont appelées souris NSG; elles combinent une série de mutations génétiques qui altèrent leur système immunitaire dans sa globalité, les rendant aptes à ne pas rejeter les xénogreffes de cellules humaines d'origine sanguine.

Réduction

Nous avons à coeur de réduire au maximum le nombre de souris utilisées. Pour celà, lorsque les effets de différents traitements seront testés en utilisant la même procédure expérimentale, les expériences seront combinées et réalisées en même temps afin de comparer les différents groupes testés à un seul et unique groupe contrôle (qu'il est inévitable de faire pour que le résultat soit validé). Aussi, nous avons choisi de réaliser des expériences préliminaires (objectif 1) de choisir une dose d'irradiation et une seule souche de souris, pour réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux impliqués dans la réalisation des différents objectifs du projet seront surveillés régulièrement par l'expérimentateur et les animaliers afin de détecter toutes modifications comportementales et éviter autant que possible les souffrances, douleurs et angoisses inutiles. Afin d’améliorer le bien-être des souris, vis-à-vis des potentiels souffrances et angoisses liées aux manipulations expérimentales, les souris affaiblies seront supplémentées avec de l’hydrogel et de la nourriture humidifiée déposée directement sur la litière en plus de leurs nids en coton et des tubes en cartons. Un analgésique sera donné lors du prélèvement de moelle osseuse réalisé pour mesurer le niveau de reconstitution du système sanguin humain avant irradiation et traitement avec X1. Les injections de cellules et les prélèvements sanguins et médullaires seront réalisés sous anesthésie générale

Choix des espèces

La souris domestique Mus Musculus est un mammifère de petite taille à l'âge adulte qui peut être facilement élevé et reproduit en captivité. De plus, la génétique et le comportement de cette souris étant parfaitement connus, cela permet de mesurer très facilement le bien-être, la souffrance et l'angoisse des animaux élevés en captivité et de pouvoir y remédier le cas échéant ; ce qui en fait un très bon modèle pour atteindre les objectifs scientifiques du projet proposé. Enfin, la souris reproduit de nombreux mécanismes fondamentaux existant chez l'homme ; les résultats des expériences réalisées chez la souris pourraient à terme améliorer l'étude des pathologies humaines ainsi que leurs thérapeutiques. Nous utilisons plus particulièrement un modèle de souris dépourvu de système immunitaire fonctionnel permettant les études sur le développement des cellules sanguines humaines normales et pathologiques.

588 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection d'anticorps déclenchant une maladie rénale, des injections répétées et des prélèvements sanguins, dont des prélèvements dans l'orbite de l'œil que le porteur reconnaît associés à un risque de lésions oculaires. Il fixe comme points limites une perte de poids importante et des saignements urinaires, déclenchant la mise à mort. Il affirme que les conditions de circulation sanguine ne peuvent être reproduites in vitro, les biopsies humaines étant rares et limitées.

Objectifs

Les vascularites humaines (maladies inflammatoires des petits vaisseaux sanguins) sont associées avec le développement de maladies rénales. Celles-ci sont induites par des anticorps dirigés contre les petits vaisseaux du rein et provoquent des lésions, de l'inflammation, de l'activation des plaquettes et le remodelage du tissue. La chronicité de cette lésion vasculaire rénale provoque une perturbation des fonctions rénales (insuffisance rénale), et peut nécessiter une greffe d'organe pour remplacer le rein défaillant. Nous avons montré récemment que l'inflammation rénale provoque la production de molécules qui stimulent la production de plaquettes et de cellules immunitaires dans la moelle osseuse. Les objectifs de ce projet sont : 1/de comprendre quelles molécules stimulent la production de plaquettes et de cellules immunitaires au cours de la maladie. 2/ d'identifier les cellules immunitaires qui participent à l'inflammation rénale au cours de la maladie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont multiples : 1- mieux comprendre le rôle de l'inflammation dans la maladie rénale. 2- cibler l'inflammation pour prévenir le développement de la maladie rénale et améliorer la santé des patients. 3- Proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour le développement de médicaments plus spécifiques ayant moins d'effets secondaires.

Procédures

Nous effectuerons des prélèvements d'urines à l'aide d'un dispositif de collecte (pendant la nuit) permettant de ne pas changer les animaux d'environnement (adaptation à la cage), et les animaux recevront une injection de liquide contenant les anticorps dans une veine (5 minutes); cette injection se fera au niveau de la queue sur animal vigile. 3 injections dans l'abdomen seront effectuées par semaine, pendant 2 semaines (3 x 2 minutes) pour les traitements pharmacologiques. Des prélèvements sanguins sous anesthésie seront effectués sur une période de 3 semaines (3 prélèvements, 5 min par prélèvement). Les prélèvements seront effectués sous l'oeil . Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de chaque procédure afin d'étudier les organes d'intérêts avec différentes techniques.

Impact sur les animaux

Le protocole expérimental a un effet modéré sur le bien-être de l'animal. Une injection en intraveineuse de sérum contenant les anticorps qui induisent la maladie sera réalisée à la veine caudale sur animaux vigils. La collection d'urine se fera sur la nuit, pendant une période de temps restreinte (

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure pour une utilisation post-mortem (prélèvement d'organes).

Remplacement

Les pièces opératoires (biopsies rénales) chez l’homme sont limitées en nombre et en nature (petite quantité de tissue, une seule biopsie/patient). De plus, l'étude des facteurs de croissances produits par le rein et agissant sur la moelle osseuse, et l'étude du role des cellules immunitaires pendant la maladie rénale nécessite la présence des conditions mécaniques et fluidiques caractéristiques de la circulation. Ces conditions ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux au strict minimum, tout en garantissant l'obtention de résultats fiables, une étude statistique a permis de determiner que 12 animaux/groupe seraient necessaire pour obtenir une différence significative entre 2 groupes. Pour confirmer ces résultats, une étude cinétique sera effectuée par la suite, et nécessitera 5 animaux/groupe.

Raffinement

Pour prévenir la souffrance et détecter les points limites les animaux seront pesés et observés de façon journalière, du lundi au vendredi (suivi de poids). Si douleur avérée un analgésique sera injecté jusqu'à la disparition des signes de douleur. Ce modèle de maladie rénale est caractérisé par une perte d’appétit, une réduction de l'activité et du sang dans les urines. Les points limites que nous avons identifiés sont: une perte de poids importante, et des saignements urinaires associés à une réduction importante du nombre de globules rouges circulants. Pour prévenir l’apparition de ces signes, plusieurs approches sont en place: nourriture humidifiée dans la cage, injection de liquide pour hydrater, mesure des fonctions rénales (bandelettes urinaires) et prélèvement de sang pour évaluer le nombre de globules rouges. L'atteinte des points limites entrainera la mise à mort des animaux. Une phase d'habituation aux insert de collection d'urine sera effectuée la semaine précédant l'induction de la maladie afin de réduire le stress des animaux. Afin de réduire l'angoisse, les prélèvements sanguins seront effectués sous anesthésie. Afin de prévenir la douleur, les prélèvements sanguins seront effectués en alternant les sites de prélèvements. Conditions d'hébergement: les animaux ont accès à la nourriture/eau ad libitum, alternance jour/nuit (12h/12h), accès à du matériel pour se nicher (coton, petite maison en plastique), litière classique, en portoir ventillé (système Techniplast). Lors de la collection d'urine, les animaux seront placés dans un système adapté aux cages d'hébergement, pendant la nuit, avec accès à de la nourriture/eau sous forme de gelée (CLEARH2O). Les animaux sont replacés dans leur environement après chaque periode de collection.

Choix des espèces

Les modèles murins de maladie rénale induits par des anticorps sont préférables aux modèles utilisant d'autres animaux dans le cas de ce projet car : - Ce modèle est déjà en place dans le laboratoire et maitrisé. -Les outils pour étudier ce modèle murin sont aussi maitrisés au laboratoire, en particulier les anticorps neutralisants et capable de supprimer les cellules immunitaires in vivo. -Nous avons montré avec ce modèle que la production de plaquettes et de cellules immunitaires contribuent au développement de la maladie rénale. Chez l'Homme, cette maladie se développe chez l'adulte, donc nous utiliserons des souris adultes.

2 268 souris vont être utilisées, toutes tuées par dislocation cervicale à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par voie orale avec des salmonelles ou des Klebsiella, gavées, prélevées et génotypées, pour cartographier les cellules B mémoires de la muqueuse intestinale. Le porteur indique que les souris mal protégées peuvent développer diarrhée et perte de poids. Il affirme que l'expérimentation animale est "inévitable" et que les bénéfices attendus pour de futurs vaccins "justifient amplement" ces expériences sur le plan éthique.

Objectifs

Notre système immunitaire met en place des réponses protectrices pour contrer la menace exercée par les agents pathogènes lors d'une infection. Heureusement, ces réponses laissent une mémoire immunologique, une stratégie qui permet à notre organisme de se souvenir des agents pathogènes précédemment rencontrés. Les lymphocytes B mémoires sont un élément essentiel de cette stratégie : en cas de réinfection, ils peuvent se différencier rapidement en cellules plasmatiques sécréteurs d'anticorps et neutraliser l'envahisseur récurrent ou pénétrer à nouveau dans les centres germinaux, jusqu'à un certain point, et diversifier le répertoire des lymphocytes B mémoires. Malgré l'importance des lymphocytes B mémoires dans la lutte contre les expositions récurrentes aux agents pathogènes, la dynamique de ces cellules au niveau des barrières tissulaires, et en particulier dans la muqueuse intestinale, reste mal comprise. L'objectif principal de ce projet est de découvrir la cinétique, le positionnement spatial et la diversité tissulaire des cellules B mémoires dans le tractus gastro-intestinal lors d'une infection par Salmonella et Klebsiella. Dans cette optique, les objectifs spécifiques sont les suivants : 1. Faire la lumière sur la dynamique spatio-temporelle des cellules B à mémoire intestinale dans les compartiments inductifs et effecteurs au cours de l'infection par Salmonella. 2. Découvrir le positionnement spatial des cellules B à mémoire dans les tissus intestinaux à l'aide de techniques d'imagerie de pointe. 3. Identifier les différents programmes génétiques des lymphocytes B mémoires dans un même organe ou dans différents organes.

Bénéfices attendus

Plusieurs lignes de recherche ont montré que l'immunité des cellules B contre Salmonella est remarquablement différente de celle suscitée contre d'autres agents pathogènes. Dans le cas de Salmonella, les réponses des cellules B se produisent massivement à l'extérieur des follicules de cellules B pendant le premier mois de l'infection. Il est remarquable que cette réponse primaire puisse établir une immunité à long terme composée de cellules productrices d'anticorps et de lymphocytes B mémoires. Alors qu'une étude récente a dévoilé la biologie du compartiment des cellules productrices d'anticorps, la dynamique des lymphocytes B à mémoire intestinale à la suite d'une infection par Salmonella reste inexplorée. Comme la plupart des vaccins humains homologués reposent sur l'induction de lymphocytes à mémoire de longue durée, la compréhension des mécanismes impliqués dans la génération et le maintien des lymphocytes B à mémoire intestinale est d'un intérêt capital pour la conception de vaccins protecteurs contre Salmonella et d'autres infections d’origine bactérienne se trouvant dans les intestins.

Procédures

- Infection oral de Salmonella typhimurium : 1134 souris (au jour 0 ou/et au jour 35) - Infection oral de Klebsiella pneumoniae : 1134 souris (au jour 0 ou/et au jour 35) - Gavage oral de Tamoxifen dans de l'huile de maïs : 168 souris (aux jours 6, 8 et 10) - Prélèvement sanguin avec anesthésie gazeuse : 1134 souris (aux jours 7, 14, 21, 28 et 35). - Genotypage avec biopsie de la queue et marquage des oreilles: 504 souris (252 souris CD23Cre Bcl6 flox/flox et 252 sourisCD19Cre Tgfbrii flox/flox). - Creation d'une lignée de souris transgéniques: 126 souris (souris KO pour la charnière IgA).

Impact sur les animaux

Nous utiliserons des souches de type sauvage pour le nouveau défi. Comme les souris ont déjà généré une mémoire contre les agents pathogènes, nous nous attendons à ce qu'elles soient protégées contre la réinfection. Cependant, comme l'induction de la mémoire peut varier entre les différentes souches de souris transgéniques que nous utiliserons, les souris qui ne sont pas bien protégées peuvent présenter de la diarrhée et une perte de poids.

Devenir

Les animaux seront mis a mort par dislocation cervicale a la fin de chaque experience. Nous prélèverons les organes (intestin, rate et ganglions lymphatiques mésentériques) pour la cytométrie de flux, une technologie qui permet d'analyser rapidement des cellules lorsqu'elles passent devant plusieurs lasers, et la microscopie de cellules productrices d'anticorps.

Remplacement

La recherche sur les animaux est effectuée lorsqu'aucune autre approche ne permet d'obtenir les avantages scientifiques escomptés. Dans cette étude, nous analyserons le positionnement spatial de cellules B mémoires spécifiques dans la muqueuse intestinale lors d'une infection. Malheureusement, cet objectif ne peut être atteint autrement qu'en utilisant un modèle in vivo. En raison de la nature et de la complexité des interactions cellulaires au cours des réponses immunitaires, les expériences basées sur un organisme modèle sont inévitables pour développer nos connaissances sur les réponses des cellules B intestinales et ne peuvent pas être imitées par des modèles in vitro ou in silico. Nous utiliserons des souches de souris génétiquement modifiées, en raison des similitudes entre la physiologie de la souris et celle de l'homme et de la large gamme de réactifs immunologiques disponibles chez cette espèce. Les résultats escomptés permettront non seulement d'accroître les connaissances médicales, mais aussi de fournir des indications médicales pour le développement de vaccins contre les microbes intestinales. Par conséquent, les avantages potentiels de ce projet à des fins médicales humaines justifient amplement, d'un point de vue éthique, la réalisation d'expériences sur des animaux.

Réduction

Dans la mesure du possible, nous réduirons le nombre d'animaux au minimum nécessaire. Nous utiliserons des tests statistiques lors de la planification des expériences afin de nous assurer que le nombre minimum d'animaux est utilisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Il serait utile d'utiliser les mêmes souris pour les expériences d'imagerie et de cytométrie de flux, mais cela n'est pas possible dans notre cas. Tout d'abord, les organes lymphatiques ne peuvent pas être coupés au milieu car nous perdons la structure. Deuxièmement, l'intestin héberge un nombre limité de cellules B mémoires, de sorte que nous avons besoin de tout l'intestin pour le passer en cytométrie de flux afin d'obtenir une centaine d'événements dans le compartiment mémoire.

Raffinement

L'utilisation d'animaux génétiquement modifiés et préalablement caractérisés est une bonne approche pour affiner les études sur les animaux, car elle évite l'utilisation de médicaments pour bloquer un processus biologique qui pourrait avoir des conséquences inattendues. Les souris seront hébergées dans des cages appropriées à raison de 5 souris/cage maximum. La nourriture et l’eau seront à volonté. Des dômes et du papier absorbant seront mis à disposition dans chaque cage pour enrichir le milieu. Nous fournirons également des aliments semi-solides aux animaux au cours de l'infection.

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle d’étude des maladies inflammatoires de l’intestin car l’obtention d’animaux génétiquement modifiés est bien contrôlée et les modèles expérimentaux bien calibrés. Or ces modèles sont les seuls permettant de tester la contribution génétique de modifications de certains gènes de susceptibilité au développement de ces pathologies. Afin de limiter les variations dues à des différences d’âge, des souris adultes de 6 à 14 semaines seront utilisées.

Greffées sous la peau de cellules tumorales, les souris reçoivent une injection intrapéritonéale chaque jour pendant environ quatorze jours, trois gavages et une irradiation de leur tumeur sous anesthésie générale. 1 100 souris vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour l'examen de leurs tissus. Le projet teste contre des cancers bronchiques une triple combinaison de radiothérapie, d'inhibiteur et d'immunothérapie, qui "pourrait constituer un traitement de référence dans certains cancers". Le porteur décrit une gêne quand la tumeur grossit et une "douleur légère et temporaire" due aux injections et aux gavages, puis affirme que les protocoles d'exposition aux agents anticancéreux "ne donnent pas lieu à des manifestations de gêne ou de douleur chez les animaux".

Objectifs

Le but du projet consiste en l’étude de l’efficacité antitumorale de la radiothérapie associée à un médicament inhibiteur ainsi qu’à une immunothérapie. Le rôle de la ferroptose dans les effets observés précédemment et comment mieux exploiter cette mort cellulaire afin de potentialiser les effets de la triple combinaison de traitement. L'immunnothérapie permet d'inhiber une molécule qui induit une polarisation des lymphocytes T du microenvironnement tumoral vers un phénotype anti-inflammatoire et pro-tumoral. De récentes études montrent que l’association de la radiothérapie et d’une immunothérapie ciblant cette voie est susceptible d’améliorer la réponse antitumorale en comparaison avec l’immunothérapie seule. De plus, d’autres études ont montré que l’utilisation de cet inhibiteur combiné avec la radiothérapie, entrainait une réponse antitumorale

Bénéfices attendus

Les résultats de ces expériences pourraient, en expliquant le mécanisme d’action des interactions des traitements, ouvrir la voie à de nouveaux schémas thérapeutiques, dans lesquels la triple combinaison thérapeutique pourrait constituer un traitement de référence dans certains cancers. De plus, l’utilisation d’inducteur ou d’inhibiteur pourront nous permettre (i) d’exploiter cette mort cellulaire dont les cellules sont particulièrement dépendantes et (ii) d’élucider la proportion que représente la ferroptose dans les effets observés en réponse à notre triple combinaison de traitement.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection sous-cutanée (anesthésie locale) de cellules tumorales, à des injections intrapéritonéales quotidienne (anesthésie locale) durant environ 14 jours ainsi qu'à trois gavages lors des différentes procédures. Pour finir les souris subiront également sous anésthésie générale une irradiation localisée de la tumeur.

Impact sur les animaux

Le developpement de tumeurs sous-cutané chez la souris peut entrainer une gêne chez ces dernières lorsque la tumeur sous-cutané va grossir. De plus, les diférentes injections sous-cutanées, intra-péritonéales ainsi que les gavages sont suscetibles d'entrainer chez l'animal un stress du a la manipulation de l'animal et aux différents traitements appliqués ainsi qu'une douleur légère et temporaire. Il en est de même pour l'irradiation des tumeurs des souris qui va déclencher un stress chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédures, pour examens sur tissus post-mortem.

Remplacement

L’utilisation d’un modèle animal est indispensable car les interactions au sein du microenvironnement immunitaire tumoral est au centre des effets de la triple combinaison, impliquant des composantes cellulaires et moléculaires impossibles à reproduire actuellement dans des modèles ex-vivo. Nous allons donc procéder à des expériences in vivo utilisant des modèles murins, mais aussi des expériences in vitro complémentaires en utilisant le modèle de culture d’organoïdes murins.

Réduction

Pour chaque point expérimental nous utiliserons le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats significatifs d’un point de vue statistique. Nous comptons utiliser 4 lignées cellulaires tumorales (génétiquement modifié pour les différentes voies de signalisation étudiées). Le nombre mnimal d'animaux, nécessaire et suffisant, a été déterminé grâce à un calcul de puissance.

Raffinement

Les animaux seront élevés en groupe, avec un équipement et des conditions sanitaires adéquates. Pendant la durée de l’expérience, ils restent dans leur environnement habituel. Les animaux seront en groupes sociaux de 5. Les protocoles d’exposition aux agents anticancéreux ont déjà été utilisés chez les souris et ne donnent pas lieu à des manifestations de gêne ou de douleur chez les animaux. Les animaux seront suivis quotidiennement pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, ils recevront un antiinflammatoire non stéroïdien ou un analgésique. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne). Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Dans ce type de combinaison thérapeutique, le recours à l’utilisation d’un modèle animal (organisme vivant entier), est indispensable car les interactions entre radiothérapie et immunothérapie au sein d’une tumeur obéissent à des processus cellulaires complexes impliquant de multiples voies immunitaires et métaboliques impossibles à reproduire in-vitro.

320 souris mdx, modèle de la myopathie de Duchenne, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs muscles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit jusqu'à quinze séances de microlésions musculaires sur quatorze jours et jusqu'à dix-huit anesthésies, ainsi que des injections, pour provoquer une fibrose et tester une molécule stabilisant les vaisseaux. Le porteur affirme que le muscle lésé étant petit, la locomotion et le comportement ne sont pas affectés, la contention répétée restant une source de stress. Il justifie le recours à l'animal par la nécessité d'analyser tissus et cellules, les cultures cellulaires ne suffisant pas selon lui.

Objectifs

Les myopathies dégénératives comme la myopathie de Duchenne induisent des lésions permanentes des fibres musculaires qui épuisent les capacités de régénération du muscle, entraînent une inflammation chronique et l'installation d'une fibrose conduisant à la perte de fonction de l'organe, et finalement à la mort de l'individu. Le projet vise à utiliser un modèle permettant l’installation d’une fibrose musculaire afin d’en étudier les mécanismes. Une deuxième procédure vise à étudier l’effet d’une molécule stabilisant les vaisseaux sanguins sur l’évolution de la pathologie.

Bénéfices attendus

Le projet vise à améliorer les connaissances sur des myopathies dégénératives, et éventuellement, d’identifier de nouveaux processus biologiques comme cibles thérapeutiques potentielles.

Procédures

Contention pendant 6-10 secondes lors de l’anesthésie (18 anesthésies au maximum par individu). Injections intrapéritonéales de 5 secondes (5 au maximum par souris) sous anesthésie gazeuse Innjection intraveineuse de 30-45 secondes (1 au maximum par souris) sous anesthésie gazeuse Microlésions intramusculaires de 8-12 secondes (15 x 14 jours) sous anesthésie gazeuse

Impact sur les animaux

Le protocole de microlésions induit une perte de force du muscle traité uniquement. Ce muscle étant petit et le seul traité de toute la patte, la locomotion et le comportement de l'animal ne sont pas affectés. La contention en vue des anesthésies multiples engendre un stress chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en vue de préèvement des muscles.

Remplacement

Des analyses in vitro, utilisant des cultures cellulaires sont déjà réalisées afin d’établir une évidence des processus biologiques. Afin de démontrer la pertinence des résultats, l'analyse des tissus ou des cellules de l’animal est indispensable.

Réduction

Le même animal est utilisé pour plusieurs analyses. Les deux pattes de l'animal sont traitées afin de réduire le nombre d'animaux par deux.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans les conditions standard. Ils bénéficient de l’anesthésie générale lors de l'entièreté des manipulations afin d'éviter le stress des injections. Malgré une survenue très peu probable d’évènements indésirables, une surveillance est réalisée pendant toute la procédure et en particulier après les anesthésies, afin de prendre les mesures appropriées selon des points limites définis.

Choix des espèces

La souris mdx est un des modèles disponibles de la myopathie de Duchenne qui mime la plupart des aspects cellulaires et tissulaires de la pathologie. Deux lignées permettant l'analyse d'un gène dans les cellules immunitaires dans cette souris mdx seront utilisées. Les animaux sont utilisés à partir de 8 semaines, c’est-à-dire à l’âge adulte, au stade chronique de la pathologie. Les animaux utilisés sont des mâles car cette pathologie ne touche que les garçons.

1 182 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, cette autorisation ne couvrant que les séances d'IRM, à l'issue desquelles les animaux repartent dans un autre établissement pour la suite du projet. Porteurs de tumeurs cérébrales greffées et irradiés dans le cadre d'autres procédures, ils subissent ici des examens d'IRM répétés sous anesthésie, jusqu'à huit sessions sur un an, pour suivre les effets d'une radiothérapie à mini-faisceaux. Le porteur décrit l'IRM comme non invasive, les effets attendus se limitant à l'anesthésie et à une légère perte de poids. Il présente le suivi longitudinal d'un même animal comme une réduction du nombre d'individus et juge le recours au modèle animal "indispensable".

Objectifs

Le principal défi de la radiothérapie est de parvenir à déposer une dose curative dans la tumeur tout en s’assurant que les tissus sains environnants soient préservés dans leur intégrité. Pour certains types de tumeurs radiorésistantes comme les gliomes (tumeurs cérébrales), la radiothérapie ne peut être que palliative. Pour parvenir à une dose de radiation curative, le risque de dommages graves aux tissus sains est trop élevé pour pouvoir être considéré. Dans ce contexte, notre objectif principal s’inscrit dans l’amélioration des traitements de radiothérapie. Le but de ce projet est d’utiliser l’IRM (Imagerie par Résonance Magnétique, technique non invasive et atraumatique utilisée en clinique chez l’homme) chez le modèle rongeur pour étudier le mode de fonctionnement et les conséquences morphologiques de nouveaux modes d’irradiation, et notamment la Radiothérapie avec Mini-Faisceaux (MBRT).

Bénéfices attendus

La radiothérapie avec mini-faisceaux (MBRT) étant une technique novatrice, il est primordial de très bien comprendre les mécanismes microscopiques et macroscopiques intervenant lors de son utilisation, pour pouvoir optimiser les conditions d’utilisation : pour ce faire, la réaction de différentes lignées de cellules cancéreuses plus ou moins agressives doit être étudiées et ce, avec différentes géométries et puissances de faisceaux. Par le suivi IRM des animaux implantés (différentes lignées cancéreuses) et irradiés (différentes conditions d’irradiations), nous espérons pouvoir établir les meilleures conditions de MBRT en vue d’applications futures en clinique.

Procédures

Pour les sessions d’ IRM (objet de la présente DAP) permettant de suivre les effets de la radiothérapie, les animaux recevront une anesthésie gazeuse. Ce suivi sera d’un an maximum et comportera une session IRM à plusieurs moments après irradiation (2, 7, 14, 21, 30, 40 jours, 3 et 6 mois après irradiation). Chaque session IRM n’excédera pas 1 heure.

Impact sur les animaux

L’examen IRM étant une modalité de neuroimagerie totalement non-invasive et non-irradiante, les potentiels effets indésirables sont liés au fait que l’examen est réalisé sous anesthésie générale légère. Afin de vérifier que cette dernière n’a pas d’effet néfaste sur la respiration du sujet anesthésié, la fréquence respiratoire est surveillée en permanence tout au long de l’examen. Il est également possible d’observer une légère perte de poids le lendemain de l’examen, suite au stress potentiellement induit par la combinaison transport/examen entre les deux animaleries.

Devenir

Après l’examen IRM, tous les animaux retourneront dans l’autre établissement utilisateur pour continuer le projet (utilisation continue).

Remplacement

Nous désirons valider un potentiel nouveau mode de traitement par radiothérapie dans le cadre du cancer du cerveau. Pour évaluer l’efficacité de la technique, nous allons étudier la préservation des tissus sains environnants de la tumeur et contrôler la croissance des tumeurs irradiées. Les mécanismes biologiques activés impliquent très probablement des effets vasculaires et immunologiques. Aussi, le recours à des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans ce projet et il nous est indispensable de développer des modèles animaux. En effet, une culture in vitro de tissus ne permettrait pas d’apprécier l’effet des traitements, ni un modèle in silico.

Réduction

L’IRM permettant un suivi longitudinal des animaux, et chaque animal étant observé à 8 stades différents, nous utiliserons 8 fois moins d’animaux que par une méthode classique d’histologie. Le nombre d’animaux (1182 rats au total) a été statistiquement défini pour permettre l’obtention de résultats fiables avec le moins d’animaux possible. Une analyse de puissance a été effectuée comme décrite et validée par le projet précédent.

Raffinement

Que ce soit durant leur transport sur le lieu de l’examen IRM, ou lors de l’examen lui-même, une grande attention est apportée au bien-être des animaux, et tout est mis en œuvre pour éviter les sources potentielles de stress. Transports : Les animaux sont transportés dans leur boîte habituelle (enrichie), avec leurs partenaires habituels et manipulés par les personnes assurant leur suivi quotidien. Les boîtes sont protégées du froid ou du chaud éventuel. Manipulations/anesthésie avant/après examen IRM : Ces actes sont réalisés par les personnes qualifiées assurant le suivi quotidien des animaux. Examen IRM : Il est réalisé sous anesthésie, dans un berceau chauffé uniquement dédié à ces animaux, avec contrôle de la respiration et de la température. Manipulations après examen IRM : Le réveil naturel de l’animal se fait au calme en cage individuelle sur un matelas chauffant. Lors de l’examen IRM, si la respiration sort des limites prévues, l’examen est immédiatement interrompu et l’animal est mis sous surveillance accrue jusqu’à sa récupération. Par ailleurs, le temps de l’examen IRM a été réduit à son minimum. En dehors des sessions d’examen IRM, une grille de scoring et des points limites ont été définis pour suivre le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Les rongeurs sont particulièrement utilisés en cancérologie et dans les études de radiothérapie car il s’agit d’espèces génétiquement caractérisées et pour lesquelles les références bibliographiques sont très nombreuses dans la littérature ayant trait au domaine de la radiothérapie. Notre projet va nécessiter de travailler sur des rats chez lesquels la taille plus importante du cerveau va être plus adaptée aux types d’irradiations proposées dans le cadre des procédures expérimentales que celle des souris. De nombreux articles ont déjà été déposés avec le modèle « rat », nous poursuivons donc nos études avec ce modèle. Les procédures seront réalisées sur des animaux adultes de 6-7 semaines, âge compatible avec un développement suffisant et la possibilité de garder les animaux assez longtemps pour permettre une étude des effets à long terme de l’irradiation.