Recherche fondamentale

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage cinq jours sur sept pendant vingt-deux jours et une inflammation cutanée provoquée aux oreilles sous anesthésies répétées, le gavage répété pouvant enflammer la trachée et entraîner une perte de poids. Le projet cherche à comprendre le mécanisme par lequel deux bactéries intestinales réduisent une inflammation de type psoriasis. Le porteur affirme qu'aucun test in vitro n'intègre la réaction immunitaire de la peau et des organes associés.

Objectifs

Les maladies inflammatoires cutanées type dermatite atopique, psoriasis et eczema allergique de contact, touchent une trés forte proportion de la population (plus de 20%). Il est largement admis que le microbiote intestinal joue un rôle important dans les maladies allergiques. L’hypothèse de l’axe « intestin-peau » a été proposé et un mécanisme entre eux a été progressivement démontrés. Les probiotiques contribuent à l’amélioration de l’environnement intestinal, l’équilibre des réponses immunitaires et la régulation du métabolisme. La plupart des études suggèrent que les suppléments probiotiques peuvent être une alternative pour la prévention et le traitement notamment de la dermatite atopique. Une premiere expérience a été menée dans divers modèle d'inflammation cutanée (psoriasis, dermatite atopique et eczema allergique de contact). Les résultats de cette premiere étude ont montré, dans le psoriasis, une diminution de la réponse clinique de l'ordre de 30% aprés traitement avec ces bactéries par rapport à des animaux traités uniquement avec le véhicule. Cette nouvelle étude dans le psoriasis aura pour but de mieux comprendre la mécanistique anti inflammatoire de ces bactéries intestinales dans le psoriasis.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux caractériser et de comprendre le mécanismes par lequel des bactéries intestinales sont capables de réguler une inflammation cutanée de type psoriasis, et à long terme de permettre le developpement d'un nouveau traitement probiotique chez l'homme pour améliorer cette pathologie.

Procédures

Le traitement à base de bactéries intestinales sera réalisée par gavage sur animaux vigile. Il sera réalisé 5 fois par semaine pendant 22 jours (durée 30sec). L'application du composés servant à induire l' inflammation, sera appliquée sur les oreilles des animaux sous anesthésie pendant 30min. Pour cela, les animaux seront anesthesiés 3 jours consécutifs sur 2 semaines consécutives (6 injections =30sec). Le traitement utilisé en control sera appliqué sur l'oreille des souris 6h aprés l'application du composé utilisé pour généré l'inflammation, et sur des souris anesthésiés pendant 30secondes. La mesure de la réponse clinique (mesure de l'epaisseur de l'oreille) sera réalisée sous anesthésie 5jours/7 pendant 30secondes. les animaux seront pesé une fois par semaine.

Impact sur les animaux

Le gavage répétée 5j/7 et répété sur plusieurs semaines pourrais induire une inflammation de la trachée et donc une perte de poids. Le modèls de psoriasis est bien connus et est utilisé dans l'equipe quotidiennement, celui çi engendre une inflammation legère au niveau de l'oreille qui ne gènent pas la souris et ne gènere pas de grattage. Les souris seront regulierement anesthesiées (5j/7) durant plusieurs semaines ce qui peux génerer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'étude afin de récuperer les organes ce qui permettra de meiux comprendre les mécanismes anti inflammatoires des deux bactéries testées

Remplacement

Aucun test in vitro ne permet d’intégrer la réaction immunitaire de la peau et des organes immunitaires associés dans leur ensemble dans le cadre de cette pathologie. Celle-ci ne peut donc être conduite qu’in vivo.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. Une seule dose de bactérie sera testée, celle çi ayant deja été validé dans une précedente procédure et pour une autre pathologie.

Raffinement

Des mesures seront mises en oeuvre pour optimiser le bien-être des animaux. A leur arrivée dans l'animalerie, une période d'acclimation d'une semaine sera respectée avant le debut de la procédure expérimentale. Des points limites bien définis et suffisamment précoces et prédictifs pour prévenir tout stress et toute douleur de l’animal ont été mis en place. L’observation des animaux sera effectuée 5jours/7 et nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceuxci. Dans le cas où des animaux perdrait du poids, des aliments réhydratées seraient disposé dans la cage. Pour les gavages, des sondes gastriques souples reconnus pour etre moins irritante pour les animaux seront utilisés et les gavages seront réalisés par une personne expérimentée ayant déjà réalisé des gavages répétés.

Choix des espèces

L’espèce souris est un modèle très utilisé en pathologie immunologique telle que l’allergie et autre inflammation cutanée en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunes. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de cytokines inflammatoires. De plus, l’utilisation de ce modèle, couramment employé dans ce domaine, nous permettra de discuter nos résultats par rapport aux données existantes de la littérature. Les souris entrent dans les procédures à 7-25 semaines, âge auquel les souris présentent un système immunitaire suffisamment mature pour effectuer une sensibilisation efficace.

1 728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales puis jusqu'à huit injections d'un complexe métallique dans le sinus rétro-orbital sous anesthésie, avec un suivi par imagerie, le traitement pouvant provoquer des lésions d'organes et des ulcères tumoraux. Le projet évalue la biodistribution et l'efficacité antitumorale de complexes métalliques présentés comme des alternatives aux sels de platine. Le porteur indique avoir écarté in vitro les formulations les moins prometteuses et décrit la souris comme le meilleur modèle.

Objectifs

L'élaboration de nouvelles/meilleures stratégies thérapeutiques pour lutter contre le cancer et les maladies infectieuses semble être aujourd’hui nécessaire. En effet, la plupart des chimiothérapies induisent des effets indésirables importants et certains traitements impliquent un très mauvais pronostic. La mise en place de traitements thérapeutiques alternatifs est donc un enjeu majeur. L'un des médicaments les plus fréquemment utilisés contre le cancer est un complexe de platine. Ce complexe métallique présente plusieurs inconvénients importants dont celui d’induire des effets secondaires graves. La recherche s’oriente donc vers d’autres complexes métalliques actuellement en essai clinique, comme les complexes de ruthénium ou d’osmium, qui sont devenus des acteurs de premier choix en montrant des résultats extrêmement prometteurs. Cependant la chimiothérapie est un traitement médicamenteux qui s’administre par voie générale, ce qui présente deux principaux inconvénients : - une toxicité sur les cellules non cancéreuses ; - une élimination rapide des molécules donc un effet limité dans le temps. Pour pallier ceci, des formulations galéniques peuvent être utilisées afin d’augmenter la durée d’action des chimiothérapies et de réduire les effets secondaires associés, en ciblant plus spécifiquement les cellules cancéreuses. Ce projet propose d’étudier l’effet de nouveaux complexes métalliques (« principes actifs ») ainsi que l’effet de la formulation (« forme gallénique ») de ces complexes sur leur biodistribution et leur efficacité in vivo (effet antitumoral sur modèles de tumeurs pulmonaires, ovariennes, colorectales, cérébrales ou mammaires) en comparaison aux traitements standards actuellement utilisés. Le but étant de tester in vivo ces complexes qui ont été sélectionnés in vitro sur leur spécificité d’action contre les cellules tumorales et leur importante biodistribution. Enfin, ce projet propose également d’étudier les mécanismes immunitaires induits par la mort des cellules traitées par les complexes métalliques et responsables de la réduction des tailles de tumeurs. La recherche de ce projet sera donc centré sur la mort cellulaire par immunologie qui est le mécanisme clef dans l’effet des chimiothérapies sur la réduction des métastases et des tumeurs distales.

Bénéfices attendus

Les traitements chimiothérapiques actuels présentent une totoxicité et une faible spécificité ayant pour concéquence des effets secondaires graves, ce qui limite leur utilisation et entraine de mauvais pronostics. Il est donc indispensable de trouver des complexes métalliques présentant de meilleures totoxicités, ciblées plus spécifiquement vers les cellules cancéreuses, en proposant des formes galéniques innovantes. Le principal bénéfice de ce projet est de proposer de nouveaux complexes métalliques plus performants (haute toxicité préalablement identifiée sur culture cellulaire), ayant un temps de demi-vie rallongé et ciblant plus spécifiquement les cellules cancéreuses et donc qui présentent une efficacité augmentée sur la réduction des croissances tumorales tout en induisant moins d’effets indésirables. L’objectif de cette étude est de déterminer l’activité antitumorale de ces complexes sur des modèles de tumeurs colorectales, mammaires, ovariennes, cérébrales ou pulmonaires, toutes associées à la luciférase (qui permet une bioimagerie non invasive). Enfin, ce projet propose également d’étudier l’immunité induite par la mort cellulaire immunogénique. Cette immunité qui est induite par certains processus de mort cellulaire résultant du traitement chimio-thérapeutique, permet la mise en place d’une mémoire immunitaire in vivo qui entraine un cercle vertueux de mort des cellules tumorales et donc limite les rechutes et les métastases. Ce projet propose donc d’étudier le potentiel d’induction de la mort cellulaire immunogénique par les complexes métalliques étudiés, en utilisant un protocole récent et standardisé de vaccination. Pour résumer, l’étude des nouveaux complexes métalliques et de leur formulation permettrait la mise en place de traitements chimiothérapiques plus efficaces dans la réduction des tumeurs traitées, présentant moins d’effets secondaires indésirables et prévenant les rechutes et métastases.

Procédures

Pour étudier la biodistribution, les animaux recevront une implantation de tumeur ou une injection de cellules tumorales en sous-cutanée une seule fois. Cette injection est rapide et sans douleur. Puis 4 à 6 jours après cette implantation, les animaux recevront une dose unique de traitement en injection intraveineuse par le sinus rétro-orbital. Cette injection sera réalisée sous anesthésie générale et durera au maximum 6 minutes anesthésie comprise. Pour étudier l'efficacité, les animaux en rémission seront rechallengés par une injection de cellules tumorales en sous-cutanée. Les souris subiront 8 injections en rétro-orbitale de traitement au maximum (injection lundi, mardi, jeudi et vendredi pendant deux semaines). L’injection rétro-orbitale sera réalisée sous anesthésie générale et durera au maximum 6 minutes anesthésie comprise. Pour les souris receveuses de fragments, nous établirons un suivi à différents temps (à partir de J4 (temps minimum requis pour le début de croissance des fragments) et jusqu’à la fin de l’expérience (trois fois par semaine) et une imagerie non invasive de la croissance tumorale sera effectuée par imagerie optique sous anesthésie également 3 fois par semaine. Suivis par bioimagerie : les souris sont anesthésiées à l’isoflurane 5 minutes avant chaque temps d’imagerie puis placées dans l’appareil. L’acquisition de l’image ne dure que 10 minutes, soit une durée d’anesthésie totale de 15 min. Les souris sont ensuite placées en cages thermostatées pour leur phase de réveil (qui représente un risque d’hypothermie chez la souris)10 minutes puis replacées dans leur cage d’origine. Dans le cadre de l'étude de la mort cellulaire immunogénique, les animaux recevront une seule dose de vaccin sous cutané. Ils reçevront une injection de cellules tumorales au minimum et deux injections de cellules tumorales au maximum (pour les animaux en remission). Le suivi de la croissance tumorale sera réalisé par imagerie de la bioluminescence in vivo sur souris sous anesthésie générale. Les souris sont anesthésiées à l’isoflurane 5 minutes avant chaque temps d’imagerie puis placées dans l’appareil. L’acquisition de l’image ne dure que 10 minutes, soit une durée d’anesthésie totale de 15 min. Les souris sont ensuite placées en cages thermostatées pour leur phase de réveil (évite l’’hypothermie) 10 minutes puis replacées dans leur cage.

Impact sur les animaux

L’injection des chimiothérapies peut entrainer une totoxicité donc des effets indésirables chez la souris. En effet, ces complexes présentent une totoxicité importante, principalement dirigé vers les cellules tumorales, mais les études préalable sur lignées cellulaires ne nous permet pas d’estimer la totoxicité sur l’ensemble des cellules saines. Le traitement peut donc entrainer des lésions dans certains organes engendrant plus ou moins d’effets indésirables en fonction de l’importance des lésions. L’implantation de tumeurs sous-cutanées ou de métastases par injection de cellules tumorales peut provoquer des douleurs (ulcères, lésions).

Devenir

Les études mettent à mort les animaux à la fin de l'expérimentation.

Remplacement

Nous avons préalablement évalué, par des expériences in vitro, la totoxicité et le potentiel dans l’induction de la mort cellulaire immunogénique de plusieurs formulations dans de nombreuses lignées cellulaires pour ne tester chez l’animal que les formulations les plus prometteuses.

Réduction

Les différentes expérimentations ont été consciencieusement pensées et élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants. Stratégie statistique : Pour les échantillons de faible taille, les tests non paramétriques sont les tests les plus appropriés. Le choix de ce test a été effectué selon anastat.fr. Le nombre d’animaux doit être de 5 souris par groupe pour les expériences qui présentent une faible variabilité comme la biodistribution. Cependant, pour l’étude de l’efficacité ou de la mort cellulaire immunogénique, nous nécessiterons l’utilisation de 10 souris par groupe car les expériences présentent une variabilité importante. Ce nombre est calculé selon notre expérience et en tenant compte de la variabilité inter-individuelle. De plus dans une demarche de réduction, les formulations ne donnant pas une pharmacocinétique favorable ne seront pas evaluées en procédure 2 ou 3.

Raffinement

Nous nous attacherons à réduire au maximum la souffrance des souris. Les procédures d’administration en rétro-orbitale seront réalisées sous anesthésie générale. Nous utiliserons l’imagerie optique, non invasive et non traumatisante, pour évaluer l’efficacité du traitement, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés au minimum. L’implantation des tumeurs, ainsi que l’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale (isoflurane). Une grille d'évaluation de la douleur adaptée à ce projet a été élaborée pour surveiller l’état général de l’animal, son apparence, son comportement, révélateurs du niveau de douleur. Des antalgiques sont prévus en cas de nécessité et un niveau de douleur trop élevé entraînera la mise a mort anticipée de l'animal. Chez la souris anesthésiée, tout signe de douleur (mouvement soudain, vocalisation) induira un arrêt de l'expérimentation, une analgésie (Buprénorphine) et une nouvelle induction de l’anesthésie dans une boite à l’isoflurane. Une surveillance trois fois par semaine sera assurée après les inductions de tumeurs. Après l’anesthésie, la souris sera placée dans une cage thermostatée le temps du réveil et de la récupération interventionnelle et post examen d’imagerie. Plus généralement, un animal peut être isolé de ses congénères s’il y a présence de blessures. Les blessures seront le cas échéant désinfectées à la vetedine (en deux étapes, pour une action netoyante puis désinfectante).

Choix des espèces

Pour l’étude de la biodistribution, de l’efficacité antitumorale et de la mort cellulaire immunogénique induite par les complexes métalliques, seul un système complexe tel que l’animal peut permettre de répondre à cette question. La souris est le meilleur modèle animal permettant d’étudier la biodistribution, la pharmacocinétique et l’efficacité antitumorale d’un complexe métallique. Ce modèle relativement petit est un ensemble de systèmes biologiques proches de ceux de l’humain, qui permet d’étudier assez précisément les effets antitumlorale mais surtout les effet indésirable potentiels d’une molécule. De plus, un protocole expérimental récent chez la souris permet une étude standardisée de la mort cellulaire immunogénique. Souris BALB/c ou C57BL/6 adultes de 8 semaines donc mature : bonne immunité, pas de tumeur spontanée dans ces lignées syngéniques.

840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux nouveau-nés subissent une chirurgie cérébrale sous anesthésie, dont une électroporation pouvant provoquer un arrêt cardio-respiratoire et la mort, avec un risque de cannibalisme par la mère et un stress lié à la séparation maternelle, avant d'être tués pour des analyses du cervelet. Le projet étudie le rôle des cellules en grain du cervelet dans le traitement des informations sensorielles et motrices. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit ces phénomènes du développement.

Objectifs

Le cervelet est une structure cérébrale qui permet à tout individu de s’adapter à son environnement en contrôlant et corrigeant la posture et les mouvements en fonction des informations qu’il reçoit du monde extérieur et du reste du corps. Une mauvaise transmission de ces informations pourrait être à l’origine de maladies neurologiques et psychiatriques, telles que des ataxies, des dystonies, des formes d'autisme ou de schizophrénie . L’objectif de ce projet est d’identifier comment les différents groupes de cellules en grain du cervelet qui forment la couche de cellules par laquelle les informations arrivent au cortex cérébelleux, influencent le fonctionnement et l'encodage des informations.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de mieux comprendre les bases cellulaires des dysfonctionnements synaptiques dans le cortex cérébelleux chez la souris, en particulier au niveau de la couche d'entrée au cervelet, la couche des cellules en grain. Ces dysfonctionnements pourraient être à l’origine de troubles comportementaux associés à des troubles neurologiques et psychiatriques chez l'homme.

Procédures

Tous les animaux subiront au moins une procédure d'identification et de génotypage sur animal vigile (durée 5 minutes). Un premier groupe d’animaux nouveau-nés subira une seule intervention chirurgicale d'une durée de 20 minutes maximum sous anesthésie et analgésie profonde. Un deuxième groupe d’animaux nouveau-nés subira une intervention chirurgicale d'une durée de 20 minutes maximum sous anesthésie et analgésie profonde .

Impact sur les animaux

Une des chirurgie peut induire un arrêt cardio-respiratoire conduisant à la mort de la souris nouveau-née dans les minutes qui suivent l'électroporation. La séparation maternelle de plusieurs heures peut induire un stress pour la mère et les souris nouveau-nées. La chirurgie sur les souris nouveau-nées peut induire du cannibalisme par la mère. Des injections peuvent induire des sensations désagréables de piqure et des douleurs abdominales modérées. Des pertes de poids, des douleurs et réactions inflammatoires peuvent être induites par la chirurgie.

Devenir

Dans les deux procédures les animaux sont mis à mort afin de réaliser des analyses électrophysiologiques, tissulaires et histologiques.

Remplacement

Pour ce projet, nous souhaitons étudier dans le cerveau de souris adultes des phénomènes biologiques complexes qui se mettent en place dans le cerveau des souris nouveau-nées. Ces phénomènes sont contrôlés à tout moment par différentes parties du cerveau. Il n'existe pas de modèle in vitro ou in silico qui puissent reproduire la complexité des phénomènes biologiques qui se mettent en place dans le cerveau pendant la croissance de la souris ce qui signifie que le modèle animal ne peut pas être remplacé.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement valides. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire et produire des résultats spécifiques de genre. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation de logiciel approprié pour l'évaluation statistique du nombre d’animaux requis. l’utilisation conjointe de plusieurs outils expérimentaux permettra de diviser par deux le nombre d’animaux nécessaires pour le projet.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des animaleries dont le fonctionnement a été conçu pour maximiser le confort et limiter la souffrance des animaux. En particulier, les souris sont hébergées en groupes sociaux. Elles font l’objet d’observations régulières tout au long de l'expérience et l'enrichissement (matériel de nidification et bâton à ronger) est systématiquement appliqué à toutes les cages. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Pour limiter le stress et le cannibalisme plusieurs types de raffinements seront utilisés: (1) les animaux seront rendus à la mère après un délai permettant d'attenuer les odeurs étrangères. (2) Nous ajouterons de la frisure et/ou des carrés de coton en quantité suffisante pour l'élaboration du nid, un tunnel et des barres de bois à ronger. Aucun changement de litière ne sera réalisé dans les 24 h qui précèdent et les 72h qui suivent la chirugie. En cas de perte de poids, nous mettrons à disposition de l'eau gélifié et de la nourriture dans la cage. Enfin, des points limites spécifiques ont été définis et le raffinement s’appliquera selon une grille de score pour une prise en charge adaptée des animaux.

Choix des espèces

Le choix de la souris est justifié par le fait que de nombreux modèles génétiques développés chez la souris ont permis de comprendre les mécanismes physiologiques et moléculaires responsables de pathologies neurologiques humaines. Les voies anatomiques et le traitement réalisé par le cervelet sont similaires chez la souris et chez l'homme. Nous utiliserons des souris transgénique afin de cibler les groupes de cellules que nous allons étudier. Ces groupes de cellules seront manipulées génétiquement très tôt au cours du développement des souriceaux ce qui nous permettra d'étudier leur rôle dans l'encodage des informations pendant le développement du cervelet. Les procédures expérimentales seront donc réalisées chez des souris nouveau-nées (3 à 12 jours après la naissance).

2 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux subissent une ischémie cérébrale provoquée sous anesthésie, puis une série de tests comportementaux évaluant la préhension, la coordination motrice, les réflexes et la mémoire spatiale, du stade juvénile jusqu'à cinq mois, avant d'être tués pour prélever le cerveau. Le projet étudie le rôle d'une protéine dans les lésions cérébrales d'un accident vasculaire du nouveau-né, plus fréquent chez les garçons. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal, aucun modèle in vitro ne reproduisant ces mécanismes.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral est fréquent chez l’adulte et l’enfant. Les lésions de la substance blanche et les déficits moteurs et d'apprentissage sont caractéristiques des troubles neurodéveloppementaux tardifs consécutifs à un accident vasculaire cérébral néonatal. Aujourd’hui encore, l’équipe médicale ne dispose d’aucun traitement pour réduire ces déficits. Le sexe est un facteur influençant le devenir à long terme des enfants, ce qui suggère la nécessité d'une thérapie adaptée au sexe de l’enfant. En particulier, l’accident vasculaire cérébral néonatal survient plus fréquemment et est plus sévère chez les garçons. Les raisons de cette différence liée au sexe sont encore inconnues, mais pourraient être liée à la neuro-inflammation. De plus, l’inflammation consécutive à l’accident vasculaire cérébral néonatal associée à la grande vulnérabilité des cellules cérébrales en développement à ce stress inflammatoire participent à l’apparition des lésions cérébrales. En fonction du sexe, les microglies, chef d’orchestre de la neuro-inflammation, sont différentes en nombre, localisation et fonction dans le cerveau en développement. Ainsi, la réponse neuro-inflammatoire post-ischémique pourrait expliquer les différences de devenir entre les 2 sexes. Suite à son activation, la microglie peut exercer des effets délétères, mais elle peut aussi exercer des effets bénéfiques, et ceci, selon son environnement. De plus, la protéine étudiée, qui est notamment exprimée par la microglie, pourrait être impliquée dans sa fonction bénéfique ou délétère. Cependant, à ce jour, il n’existe aucune donnée sur l’implication de cette protéine à la suite d’un accident vasculaire cérébral néonatal. L'objectif de ce projet est donc d’étudier le rôle de la protéine d’intérêt dans dans la neuro-inflammation microgliale et les lésions de la substance blanche dans un modèle d’ischémie cérébrale néonatale chez le souriceau.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier les mécanismes moléculaires et cellulaires à l’origine du dimorphisme sexuel observé sur l’inflammation, les lésions cérébrales et les déficits moteurs et cognitifs induits par une ischémie cérébrale néonatale. Il pourrait ainsi permettre le développement de nouveaux médicaments, afin de limiter les conséquences d’un AVC chez les bébés.

Procédures

• Ischémie cérébrale néonatale sous anesthésie générale: 15-20 min • Analgésie par voie sous-cutanée sur animal vigile 30 min avant l’ischémie: moins d’1 min • 4 prélèvements de sang chez la souris adulte vigile sur une période de 3 mois : 1 prélèvement

Impact sur les animaux

• Hémorragie pendant la chirurgie = échec de la procédure • Rejet des souriceaux par la mère après la chirurgie • Stress lié à la séparation maternelle pendant les tests comportementaux chez le souriceau • Stress lié à la contention chez la souris adulte pour réaliser les prélèvements de sang

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront mis à mort et leurs cerveaux seront prélevés pour réaliser différentes analyses.

Remplacement

Les mécanismes impliqués dans les lésions cérébrales à la suite d’une ischémie cérébrale mettent en jeu plusieurs types cellulaires dans différentes structures cérébrales qu’il est impossible de reproduire in vitro. Il est donc indispensable d’avoir recours à l’animal, afin de reproduire la pathologie humaine. De plus, les déficits comportementaux et les lésions cérébrales ne peuvent être évalués qu’in vivo

Réduction

Le taux d'échec des gestes pour réaliser l’ischémie cérébrale (hémorragie) et de mortalité liée au rejet par la mère, ainsi que la bonne connaissance du modèle permettront de réduire le nombre d'animaux au minimum. Notre équipe a une longue expérience d’utilisation des modèles d’ischémie cérébrale, nous permettant de bien estimer le nombre d’animaux par groupe nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valides.

Raffinement

Les cages seront enrichies en cotons compactés, afin notamment que les mères puissent réaliser des nids de meilleure qualité pour leurs petits. La durée de séparation maternelle, occasionnée par l’anesthésie et la chirurgie des souriceaux, n’excèdera pas 15-20 minutes. Afin de s'assurer du bien-être animal, l'intervention chirurgicale permettant de réaliser l’ischémie cérébrale sera réalisée sous anesthésie générale et un analgésique sera donné en pré-opératoire, afin de limiter la souffrance des animaux. La mise en place de points limites et l'observation du comportement des animaux permettront d'identifier toute souffrance et douleur, et d'entraîner une mise à mort anticipée, si nécessaire.

Choix des espèces

Au vu de la littérature, la souris est l’espèce la plus utilisée pour pour mimer les lésions post-ischémiques du stade néonatal et offre un large répertoire d’évaluation comportementale. De plus, cette espèce nous permet d’évaluer le rôle de notre protéine d’intérêt grâce à l’utilisation de souris transgéniques. L’ischémie cérébrale néonatale est à l’origine d’une inflammation microgliale présente durant les jours qui suivent l’ischémie cérébrale. Elle sera réalisée sur des souriceaux (9 jours post-natal), car ils possèdent un stade du développement cérébral qui correspond à celui d’un bébé né à terme chez l’Homme. L’ischémie cérébrale néonatale induisant des déficits moteurs et cognitifs au stade adulte, les tests comportementaux seront donc réalisés chez des souriceaux (1 à 21 jours après l’ischémie cérébrale) et des souris adultes (3 à 5 mois après l’ischémie cérébrale).

186 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dans le cerveau sous anesthésie, laissent croître une tumeur intracérébrale suivie jusqu'à quatre mois, passent des IRM sous anesthésie et reçoivent des médicaments, avant une mise à mort par perfusion intracardiaque. Le projet étudie la communication entre cellules cancéreuses et cellules vasculaires dans le glioblastome, une tumeur que le porteur décrit comme incurable chez l'humain, avec une survie médiane de quinze mois. Il affirme n'avoir trouvé aucune méthode in vitro reproduisant ces interactions.

Objectifs

L’agressivité du glioblastome, une tumeur cérébrale de haut grade chez l’homme, est liée à la présence de cellules cancéreuses souches et à leur résistance aux traitements. Ces cellules souches cancéreuses sont situées dans une niche où elles établissent des interactions privilégiées avec les cellules environnantes, notamment les cellules vasculaires. Des données précédentes de notre laboratoire ont permis de montrer que bloquer la communication entre cellules cancéreuses souches et cellules vasculaires réduit la progression tumorale in vitro et in vivo chez la souris. Des études récentes in vitro suggèrent que la communication entre cellules cancéreuses souches et cellules vasculaires dépend d'une part de l’expression de facteurs d’adhésion et d'autre part de la signalisation calcique. Il est nécessaire de valider ces résultats dans un modèle expérimental in vivo qui reproduit au mieux les conditions pathologiques. L'objectif de ce projet est de caractériser in vivo, par imagerie, les conséquences des voies de signalisation identifiées in vitro (adhésion et signal calcique). Dans un second temps, nous souhaitons évaluer une stratégie thérapeutique anti-tumorale s'appuyant sur ces mécanismes moléculaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre la communication entre cellules cancéreuses souches et cellules vasculaires et permettra d'explorer comment la modulation pharmacologique de ces voies de communication favorise la régression tumorale. Cette étude devrait permettre de déterminer si le blocage de la communication entre cellules tumorales et leur environnement réduit la progression des glioblastomes multiformes, des tumeurs cérébrales incurables chez l'Homme (survie médiane actuelle de 15 mois).

Procédures

- greffe intracrânienne de cellules tumorales (sous anesthésie) (animalerie 1) - croissance d'une tumeur intracérébrale (suivi par grille de points limites spécifiques, animaleries 1 et 2) - IRM (sous anesthésie, durée 2h30 maximum, animalerie 2) - administration de médicaments au maximum une fois par jour pendant moins de 14 jours (animaleries 1 et 2) - euthanasie par perfusion intracardiaque sous anesthésie très profonde (animaleries 1 et 2) .

Impact sur les animaux

- La greffe intracrânienne de cellules tumorales, conduite sous anesthésie, engendre une douleur modérée. - La procédure expérimentale d'IRM, utilisée pour caractériser la tumeur, engendre une douleur légère et est conduite sous anesthésie. - La phase terminale est réalisée sous anesthésie profonde (procédures sans réveil) - La croissance tumorale engendre une douleur modérée et fait l'objet d'un suivi et d'une grille de points limites particuliers.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure, à la fin du suivi de croissance tumorale (maximum 4 mois). Les tissus (organes et sang) seront prélevés pour analyse.

Remplacement

Nous nous sommes assurés de l'inexistence d'approches alternatives in vitro qui pourraient être utilisées pour reproduire l'interaction entre cellules tumorales et cellules vasculaires cérébrales. Cette recherche n'a pas identifié de solution in vitro alternative pour notre étude. En effet les méthodes in vitro basées sur la culture cellulaire ne présentent pas les systèmes de communication multicellulaires nécessaires pour ce projet.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats : au final 20 animaux par groupe et 9 groupes sont prévus, pour un total de 180 souris sur 5 ans. Pour obtenir ces 20 animaux par groupe, nous avons pris en compte i) les problèmes d'implantation/croissance tumorale (15%), ii) les problèmes lors de l'imagerie (20%, principalement du au mouvement, risque à compter deux fois puisque l'imagerie est faite avant et après traitement sur chaque animal). Des groupes de 12 animaux complets (i.e. avec toutes les données IRM avant et après) seront suffisant pour obtenir une démonstration statistique. Ce chiffre a été obtenu suite aux calculs effectués dans G-Power (http://www.gpower.hhu.de/) pour un size-effect de 1.25. Pour obtenir ces 12 animaux, et en considérant le risque maximal (12*1.15*1.2*1.2), 20 animaux seront donc commandés par groupe. De plus 6 souris servirtont à la mise au point la procédure d'implantation tumorale.

Raffinement

L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur (critères pris en compte : prostration, renfoncement des yeux, arrêt du nettoyage du pelage). Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance (notamment, suppression de la douleur grâce à l’administration d’antalgiques). Les animaux utilisés pour ce projet sont nés et élevés en Europe. L'environnement sera enrichi selon le programme mis en place par l’animalerie. Suite au transport, qui sera réalisé part un transporteur agréé, les animaux auront une semaine d'acclimatation avant le début des expériences.

Choix des espèces

La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. En effet, le cerveau de souris permet une analyse neuroanatomique de haute résolution concernant les réseaux cellulaires et vasculaires. Sa taille est compatible avec la microdissection d’aires cérébrales d’intérêt permettant des analyses biochimiques ou moléculaires. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans notre projet. Les animaux seront adultes, pour travailler sur un cerveau mature et stable.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses et insulinorésistantes par un régime riche en graisses, elles reçoivent dix injections dont un agent mimant l'exposition au froid, subissent sept prélèvements de sang à la queue et des pesées hebdomadaires pendant dix-huit semaines, avant d'être tuées pour prélever leurs tissus. Le projet cherche à savoir si une protéine, PIEZO1, joue un rôle dans l'apparition de l'obésité, retombée que le porteur formule au conditionnel. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer l'étude sur un "organisme entier".

Objectifs

L’obésité et ses complications métaboliques comme l’insulinorésistance et le diabète de type 2 (DT2) sont des problèmes de santé majeurs. L’obésité résulte principalement d’un déséquilibre entre apport et dépense énergétique. Les adipocytes blancs dans le tissu adipeux blanc sont impliqués dans le stockage du surplus énergétique sous forme de graisse. Les adipocytes bruns présents dans le tissu adipeux brun sont des cellules impliquées dans la dissipation de l’énergie sous forme de chaleur, processus appelé thermogenèse non frissonante. Au sein du tissu adipeux blanc sous-cutané coexistent, avec les adipocytes blancs, des adipocytes beiges qui comme les bruns, sont capables de dissiper de l’énergie sous forme de chaleur et dont le nombre augmente en cas de besoin thermogénique. L’obésité entraine des anomalies de fonctions des adipocytes thermogéniques bruns et beiges et la réactivation de ces adipocytes et/ou l’augmentation de leur nombre permet de corriger les anomalies métaboliques associées à l’obésité. Il existe cependant des lacunes importantes dans la compréhension des mécanismes et dans l’identité des facteurs qui régulent l’activité et/ou la formation des adipocytes thermogéniques bruns et beiges. Il a été récemment montré que ces adipocytes thermogéniques sont des cellules mécanosensibles suggérant que des protéines activées par des stimulations mécaniques puissent contribuer au contrôle des fonctions biologiques de ces cellules. Nous avons récemment découvert que les adipocytes bruns expriment en grande quantité un canal ionique mécanosensible fonctionnel. L'objectif de ce projet est de déterminer le rôle de ce canal ionique mécanosensible dans la fonction et le développement des adipocytes thermogéniques bruns et beiges et d'évaluer si son absence dans ces adipocytes thermogéniques conduit au développement de l'obésité et de ses complications métaboliques. Pour cela nous générerons des souris n'exprimant plus ce canal ionique mécanosensible dans les adipocytes bruns et beiges. Nous étudierons l’impact de l’absence de cette protéine dans ces adipocytes sur le développement de l’obésité induite par un régime riche en lipides et sur le développement de l'insulinorésistance et du diabète. Nous déterminerons si cette protéine contrôle, in vivo, le développement et/ou la fonction de ces adipocytes thermogéniques.

Bénéfices attendus

A l’issue de ce programme, nous espérons comprendre si la protéine PIEZO1 joue un rôle dans l’apparition de l’obésité. Si cette hypothèse est vérifiée, ces connaissances pourraient servir à développer des méthodes de prévention et de lutte contre le surpoids et les troubles métaboliques associés.

Procédures

Tous les animaux (vigiles) sont soumis à : 1) une injection de glucose, une injection d’insuline, 7 injections d’un agent mimant l’exposition au froid, une injection d'anesthésique. Au total 10 injections sur les 18 semaines de la procédure. Chaque injection dure quelques secondes ; 2) sept prélèvements d’une goutte de sang au niveau de la queue (une quinzaine de secondes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Nuisances attendues : 1) obésité et insulinorésistance 2) contraintes des pesées hebdomadaires 3) contention et douleur lors des injections et des prélèvements

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure . Ceci est nécessaire pour prélever les différents tissus et les analyser.

Remplacement

Le diabète et l’obésité sont des maladies d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Ces pathologies affectent la régulation du métabolisme insulino-glucidique et lipidique. De plus, elles s’expriment àl’échelle d’un organisme et font donc intervenir tous les organes susceptibles de stocker ou consommer du glucose et des lipides. Ainsi, son apparition et sa gravité résultent de l’intégration de plusieurs défauts et son étude sur l’animal intact est essentielle et ne peut être remplacée. Il n‘existe pas pour l’instant de modèle in vitro qui pourrait remplacer l‘expérimentation sur un organisme entier pour répondre aux questions posées ici.

Réduction

Réduction: Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été calculé afin d’obtenir des résultats significatifs à partir d’un nombre d’animaux minimum, grâce à l’utilisation d’outils statistiques et de l’expérience d’études précédentes menées dans notre équipe. Nous constituerons des groupes de 10 souris (contrôles et mutées). Le nombre total de souris nous permettra d’obtenir en quantité suffisante tous les échantillons tissulaires nécessaires à notre étude. Ce nombre nous permettra également de réaliser des études statistiques adaptées.

Raffinement

Raffinement : Toutes les expériences et manipulations des animaux seront effectuées avec le souci de préserver le bien-être de l‘animal : hébergement à 30°C correspondant à leur température de confort (thermoneutralité) ; enrichissement de l’environnement (maisonnettes, buchettes, tiges papier), en groupes sociaux et en accord avec la réglementation en vigueur ; surveillance régulière suivie selon une grille d’évaluation prévoyant le recours à des points limites précoces et adaptés; prélèvements sur animaux vigiles effectués par des personnes expérimentées; prélèvements espacés dans le temps au maximum et volumes prélevés correspondant au minimum nécessaire.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris . Ce modèle correspond à l'espèce et à la souche sur laquelle nous travaillons dans notre laboratoire et pour laquelle nous avons plusieurs données de référence pour notre étude. De plus cette souche est connue pour répondre aux régimes riches en graisse en développant une obésité et une insulinorésistance. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 12 semaines. Ces expériences étant d’une durée maximum de 18 semaines, l’âge maximum des souris en fin d’expérience sera d’environ 30 semaines. L’obésité nutritionnelle prend du temps à se mettre en place et nous voulons examiner des sujets adultes. Ces durées de régime et stades de développement ont déjà été utilisés dans notre équipe pour étudier l’obésité induite par le régime. Ceci nous permettra de comparer nos résultats aux études précédentes.