Recherche fondamentale

1 820 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, pour renforcer un traitement anticancéreux en modifiant l'environnement de la tumeur. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales, puis jusqu'à six prélèvements de sang et douze séances de suivi, les tumeurs sous-cutanées réduisant l'appétit. Une partie des souris est immunodéficiente pour accepter des cellules humaines, l'autre immunocompétente. Les bénéfices pour les patients restent au conditionnel, face à un effectif de 1 820 animaux justifié par des références publiées.

Objectifs

Ce projet vise à améliorer l’efficacité d’un traitement innovant contre certains types de tumeurs. Bien qu’il soit déjà utilisé avec succès pour certains cancers, son efficacité reste limitée pour d’autres formes. L’objectif est donc de tester une approche qui pourrait renforcer l’action du traitement en modifiant l’environnement de la tumeur.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer l’efficacité de traitements innovants contre certaines formes de cancer qui restent aujourd’hui difficiles à soigner. Il repose sur l’idée que la tumeur n’agit pas seule, mais qu’elle évolue dans un environnement biologique complexe qui peut freiner l’action des traitements. En modifiant cet environnement, par exemple en réduisant les mécanismes de protection de la tumeur ou en facilitant l’accès des médicaments aux cellules cancéreuses, cette approche pourrait lever certains blocages responsables de l’échec thérapeutique. À terme, elle pourrait renforcer la réponse aux traitements existants, améliorer les résultats pour les patients et ouvrir la voie à de nouvelles options thérapeutiques.

Procédures

Nuisances liées à l'administration des cellules tumorales ou de traitements sur animal vigile avec anesthésie locale, douleur légère et transitoire possible . Nuisances liées aux prélèvements sanguins (maximum 6) : douleur légère et transitoire, après anesthésie générale. Nuisances liées à la présence de tumeurs sous-cutanées : gêne mécanique légère, possibilité de diminution modérée de l'appétit.

Impact sur les animaux

Tous les animaux seront soumis aux interventions suivantes : • Administration des cellules tumorales : une intervention par animal, associée à une douleur légère, réalisée sur animal vigile avec anesthésie locale, d’une durée inférieure à 1 minute. • Traitement tumoral : une intervention par animal, associée à une douleur légère, réalisée sous anesthésie générale, d’une durée inférieure à 2 minutes. • Administration de cellules : une intervention par animal, associée à une douleur légère, réalisée sur animal vigile avec anesthésie locale, d’une durée inférieure à 1 minute. • Prélèvements sanguins : jusqu’à 6 interventions par animal, associées à une douleur légère, à raison d’une par semaine, réalisées sous anesthésie générale, chacune d’une durée inférieure à 1 minute. • Suivi de la croissance tumorale et pesée : jusqu’à 12 séances par animal sur la durée de l’étude, réalisées sur animaux vigiles, chacune d’une durée inférieure à 1 minute.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser les prélèvements nécessaires à l'étude et les étudier au laboratoire.

Remplacement

Des études préliminaires ont montré qu’il est possible de modifier l’environnement autour d’une tumeur pour renforcer l’effet d’un traitement innovant contre certains cancers difficiles à traiter. L’utilisation de modèles animaux reste essentielle pour confirmer ces observations dans des conditions proches de la pratique clinique. Les approches in vitro et in silico, bien qu’utiles pour certaines analyses mécanistiques ou pour la modélisation, ne permettent pas de reproduire l’ensemble des interactions complexes entre la tumeur, le système immunitaire et le traitement dans un organisme entier. Pour cette raison, deux types de modèles animaux sont utilisés afin de comparer l’effet de cette approche dans différents contextes biologiques et d’évaluer son potentiel pour une application future chez l’humain.

Réduction

Un suivi régulier de la taille des tumeurs sera réalisé afin de recueillir des données longitudinales chez les mêmes animaux, permettant d’analyser la cinétique de croissance tumorale et d’éviter la répétition d’expérimentations distinctes à différents temps d’analyse, contribuant ainsi à limiter le nombre total d’animaux nécessaires. Les différentes conditions expérimentales seront testées en parallèle, ce qui permet de limiter le recours à des groupes témoins supplémentaires et d’éviter des expérimentations redondantes. Le nombre d'animaux par groupe a été défini pour permettre de tester plusieurs approches sur différents types de tumeurs, tout en assurant la reproductibilité et la robustesse des résultats. Cette organisation permet de vérifier l’efficacité des méthodes testées, d’évaluer leur impact sur la croissance tumorale et de garantir une analyse fiable des données. Le dimensionnement des groupes repose sur des résultats antérieurs et sur des références publiées. Les variations observées seront analysées à l’aide de tests statistiques appropriés,, selon le type de comparaison.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement enrichi, avec un maximum de cinq souris par cage. Les interventions, telles que les injections intratumorales et les prélèvements sanguins, seront réalisées sous anesthésie à l’isofluorane (induction à 4 %, maintien à 2 %) et les animaux seront placés sur une plaque chauffante pour maintenir leur température corporelle. Les injections de cellules, qu’elles soient sous-cutanées dans le flanc ou intraveineuses dans la veine caudale, seront effectuées sur des animaux vigiles après anesthésie locale de la peau à la lidocaïne. Une surveillance quotidienne des animaux sera mise en place tout au long des expérimentations. Celle-ci comprendra l’évaluation de leur comportement, de leur activité, de leur état général et de tout signe clinique anormal. Conformément à la grille de scoring établie, des points limites précoces ont été définis, et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est le modèle de référence pour ce projet car elle permet d’étudier de manière intégrée les réponses antitumorales des cellules étudiées dans des conditions in vivo. Les souris immunodéficientes sont utilisées pour évaluer l’activité de ces cellules humaines sur des tumeurs humaines implantées, sans rejet immunitaire, tandis que d'autres souris immunocompétentes permettent d’étudier l’efficacité de ces cellules murines dans un contexte immunocompétent. L’utilisation de la souris garantit ainsi la pertinence préclinique des résultats et leur transposabilité pour optimiser les stratégies thérapeutiques étudiées dans ce projet dans les tumeurs solides Les souris utilisées seront âgées de 7 à 12 semaines, une tranche d’âge correspondant au jeune adulte, qui est idéale pour les études de réponse aux traitements antitumoraux en raison de leur forme physique optimale et de l’absence de biais potentiels dus aux changements physiques et hormonaux liés au développement, ainsi qu’au vieillissement.

1 740 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, pour étudier le rôle de certaines cellules immunitaires dans le cancer de la bouche. Selon le modèle, elles ingèrent un cancérigène dans l'eau de boisson pendant seize semaines ou reçoivent une greffe de cellules cancéreuses dans la langue, les lésions gênant l'alimentation et faisant perdre du poids. Le suivi passe par des injections répétées et de l'imagerie sous anesthésie. Le porteur présente ce modèle comme un "outil indispensable" et pose ces travaux comme la base d'une future étude chez l'humain, encore hypothétique.

Objectifs

Le cancer de la cavité buccale est une maladie de la bouche assez fréquente, difficile à soigner car il peut ré-apparaître après traitement et devenir résistant. On sait aujourd’hui que la tumeur n’évolue pas seule : elle est entourée de nombreuses cellules, notamment des cellules du système immunitaire, qui peuvent soit la combattre, soit au contraire l’aider à se développer. Parmi ces cellules, les macrophages sont des cellules capables de s’adapter à leur environnement et de changer de rôle. Dans ce cancer, une protéine appelée tenascine C est présente en grande quantité autour de la tumeur. Cette protéine, qui joue normalement un rôle dans l’organisation des tissus, semble ici favoriser le développement du cancer et perturber les défenses de l’organisme. Nous pensons que le tenascine C agit en modifiant le comportement des macrophages, en les maintenant dans la tumeur et en réduisant leur capacité à lutter contre les cellules cancéreuses. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre ce phénomène pour identifier de nouvelles pistes de traitement contre ce cancer.

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront d’identifier les types des contacts entre la tenascine C et les macrophages et les conséquences de ces contacts sur le comportement des macrophages et de leurs cellules voisines, et sur la croissance du cancer. A terme, ces travaux permettront d’identifier des pistes nouvelles de traitement des cancers de la bouche afin de stimuler la défense anti-cancéreuse. Le modèle sur souris de développement de cancer de la bouche représente un outil indispensable pour réaliser une étude des interactions entre les cellules immunitaires et l’environnement du cancer. Ces études chez la souris poseront les bases indispensables d'une future étude chez l'Homme.

Procédures

Modèle d'induction chimique: Administration d’un carcinogène pendant 16 semaines dans l’eau de boisson avec ou sans injection d’agents thérapeutiques (5 injections, 1 par semaine, 30sec/injection). Modèle de greffe orale : préparation des animaux et injection de cellules cancéreuses sous anesthésie générale (30 minutes), puis injections d’une molécule (3 injections, 30sec/injection) permettant de suivre les cellules cancéreuses par imagerie sous anesthésie gazeuse générale (durée max. : 5 min.) avec ou sans injections d’agents thérapeutiques (2 ou 3 injections selon condition en 14 jours, 30sec/injection).

Impact sur les animaux

Modèle d'induction chimique : lésions au niveau de la langue allant de l’épaississement du tissu de langue au cancer invasif, générant une douleur modérée avec impact sur l’alimentation conduisant à une perte de poids. Stress lié à la contention lors des injections d’agents thérapeutiques. Douleur légère liée à la répétition des injections d’agents thérapeutiques (5). Modèle de greffe orale : 1 lésion à l’extrémité de la langue côté droit pouvant produire une douleur modérée avec impact sur l’alimentation conduisant à une perte de poids. Stress lié à la contention lors des injections (anesthésie/molécule pour suivre les cellules cancéreuses/injection d’agents thérapeutiques). Douleur modérée liée à la répétition des injections des molécules en deux semaines pour suivre les cellules cancéreuses (3 injections) et d’agents thérapeutiques (2 ou 5 injections selon condition).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour réaliser les analyses sur les tissus cancéreux.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative qui reproduit l’ensemble des interactions entre un cancer et le système immunitaire dans un organisme vivant. Les modèles plus simples testés (cultures sur boite ou mini-structure biologique qui reproduit certaines fonctions d’un organe) permettent d’étudier certains mécanismes, mais ne reflètent pas la complexité des interactions ni l’évolution de la maladie dans le corps. Les modèles informatiques apportent également des informations partielles, sans représenter la réponse immunitaire globale. Ainsi, l’utilisation de modèles animaux reste nécessaire pour mieux comprendre comment le système immunitaire interagit avec les tumeurs dans des conditions proches de la réalité biologique.

Réduction

Les effectifs expérimentaux ont été déterminés avec un logiciel d’analyse de statistiques prédictives afin d’assurer une forte validité statistique avec un minimum d’animaux. Les analyses statistiques des résultats seront basées sur la comparaison de groupes expérimentaux indépendants 2 à 2 garantissant ainsi une exploitation optimale des résultats tout en réduisant le nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

Les procédures susceptibles d’induire une douleur ou un stress (injection des cellules tumorales, imagerie) seront réalisées sous anesthésie générale. Un antidouleur sera administré si nécessaire, notamment en cas de perte de poids supérieure à 10 % en 7 jours témoignant d’une douleur. Afin de faciliter l’alimentation et prévenir une perte de poids, du gel nutritif sera mis à disposition dans la cage. Le suivi du bien-être animal reposera sur une pesée bi-hebdomadaire des animaux. Une grille de score sera utilisée pour évaluer l’état général (poids, prise alimentaire, activité, posture, pelage, croissance de la tumeur) et détecter précocement tout signe de souffrance. Des points limites éthiques prédéfinis seront appliqués afin d’éviter toute souffrance inutile, notamment en limitant la croissance tumorale à un volume inférieur au seuil établi. Le suivi de la croissance tumorale sera réalisé par imagerie, permettant d’observer l’évolution de la tumeur chez un même animal au cours du temps. Cette approche améliore la précision du suivi expérimental tout en contribuant à la réduction du nombre d’animaux utilisés, conformément au principe des 3R.

Choix des espèces

Les modèles de tumeurs buccales chez la souris permettent d’étudier le rôle de certaines cellules du système immunitaire, appelées macrophages, dans le développement du cancer. Ces modèles reproduisent des situations proches de celles observées chez l’être humain, ce qui aide à mieux comprendre comment ces cellules peuvent soit freiner, soit favoriser la progression de la maladie. Ces travaux sont nécessaires pour identifier de nouvelles cibles de traitement, en particulier en lien avec une protéine appelée tenascine C, et pour développer de nouvelles approches thérapeutiques, notamment en immunothérapie. Les souris utilisées seront des mâles et des femelles âgés de 8 semaines, un âge auquel leur système immunitaire est pleinement fonctionnel.

Opérées de l'abdomen pendant la gestation, greffées de cellules humaines chez l'embryon puis injectées dans le cerveau à la naissance ou à l'âge adulte, 1 470 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Les chirurgies durent environ une heure, suivies d'injections d'analgésique toutes les huit heures pendant vingt-quatre heures. Le projet construit un modèle dit "humanisé" de la maladie d'Alzheimer pour en étudier les mécanismes précoces, avec une ouverture affichée vers des collaborations avec des start-ups. Les bénéfices thérapeutiques sont renvoyés au long terme, quand les atteintes chirurgicales sont immédiates.

Objectifs

Le projet à caractère scientifique a pour objectif de décrypter les mécanismes conduisant aux pathologies neurodégénératives, comme la maladie d’Alzheimer (MA), et impliquant certains récepteurs cellulaires. Le rôle important de ces récepteurs dans la mémoire et les processus cognitifs, progressivement altérés lors de l’évolution de la MA est démontré. L’avantage d’un modèle de greffe de cellules humaines ou selon l’appellation de « souris humanisée » est de fournir un contexte permettant de mieux appréhender les mécanismes de la dégénérescence neuronale évolutive, à des phases bien plus précoces que celles utilisées pour le diagnostic de la maladie, c’est-à-dire ceux de l’apparition des premiers symptômes chez les patients. Les nouvelles approches d’analyses sur cellule unique permettront de mieux caractériser et comparer les mécanismes moléculaires impliqués dans les formes familiale et sporadique de la MA, qui à ce jour sont suspectés différents mais encore non clairement identifiés dans les deux cas.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la pathogénèse des deux formes sporadique et familiale de la maladie d’Alzheimer (MA). A court terme, le projet devrait permettre de démontrer le potentiel des méthodes in-vivo utilisées pour décrypter ces mécanismes. Enfin, un transfert des compétences acquises et extension de l’étude sur cellules issues de patients devraient aussi permettre d’autres avancées. A plus long terme, le projet devrait pouvoir s’orienter vers l’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour la MA et offrir la possibilité de collaborer avec des start-ups déjà identifiées pour tester des molécules candidates pour traiter la MA.

Procédures

MODIFICATIONS texte en majuscules - 3 INJECTIONS SOUS-CUTANE (CHIRURGIES UNIQUEMENT), DUREE DE 15 SECONDES PAR INJECTION. - INJECTIONS SOUS-CUTANE SUR POUR TRAITEMENT POST-CHIRURGICAL : TOUTES LES 8 HEURES PENDANT 5 JOURS SOIT 15 REPETITIONS, DUREE DE 15 SECONDES PAR INJECTION. - UNE NJECTION INTRAPERITONEALE SUR L’ENSEMBLE DES ANIMAUX POUR ANESTHESIE LETALE EN FIN DE PROTOCOLE, 15 SECONDES / INJECTION. - CHIRURGIE ABDOMINALE CHEZ LA SOURIS GESTANTE). CHAQUE CHIRURGIE DURE ENVIRON 60 MIN, EN EXCLUANT LES TEMPS DE PREPARATION DE L’ANIMAL ET LES TEMPS POST-OPERATOIRES. -GREFFE DE CELLULES CHEZ L’EMBRYON DE SOURIS AU DERNIER TIERS DE GESTATION : DE 30 SECONDES CHACUNE. - INJECTION DANS LE CERVEAU CHEZ LA SOURIS NOUVEAU-NE: INJECTION 45 SECONDES PAR INJECTION DANS LE CERVEAU, UNE OU DEUX INJECTIONS. - INJECTION DANS LE CERVEAU CHEZ LA SOURIS ADULTE : INJECTION 30 MIN AU TOTAL /2 INJECTIONS PAR SOURIS.

Impact sur les animaux

MODIFICATIONS texte en majuscules Les effets indésirables chez les souris nouveau-nés comprennent le stress d’une courte séparation de leur mère (et réciproquement pour la mère par rapport à la portée), et une douleur modérée à l’injection difficile à évaluer à ce stade néonatal, mais bien anticipée par des antalgiques (injection s.c. de buprénorphine 30 min avant les chirurgies puis toutes les 8 heures pendant 24h (dose de 0.1 mg/kg). Pour les souris adultes subissant une chirurgie pour injection stéréotaxique sous anesthésie, les effets indésirables sont une douleur post-opératoire modérée contrôlée et gérée par des antalgiques (buprénorphine en s.c. 30 min avant la chirurgie et toutes les 8 heures pendant 24h à la dose de 0.1 mg/kg et metacam en forme injectable 5mg/kg en s.c. et en forma buvable dans l’eau de boisson pendant 5 jours). Pour les souris devant subir une laparotomie, les nuisances sont une douleur modérée post-opératoire du fait de la chirurgie abdominale contrôlée, anticipée et contrôlée par des antalgiques : injection s.c. de buprénorphine 30 min avant la chirurgie puis toutes les 8 heures pendant 24h (dose 0.1 mg/kg). L’ADMINISTRATION UNIQUE DE SUBSTANCE CHEZ LA SOURIS INDUIT UNE NUISANCE DE NIVEAU MODERE, DU FAIT DU STRESS DE CONTENTION, DE LA DOULEUR BREVE LIEE A LA PONCTION, DE L’INCONFORT ABDOMINAL TRANSITOIRE ET SURTOUT DE L’INDUCTION D’UN ETAT INFLAMMATOIRE GENERAL TRANSITOIRE. CELUI-CI PEUT SE TRADUIRE PAR UN ABATTEMENT, UNE DIMINUTION DE L’ACTIVITE, UNE PILOERECTION, UNE REDUCTION DE LA PRISE ALIMENTAIRE ET HYDRIQUE, UNE PERTE DE POIDS TRANSITOIRE ET UNE HYPOTHERMIE. LES ANIMAUX SERONT SUIVIS ETROITEMENT APRES INJECTION SELON UNE GRILLE DE SCORE CLINIQUE PREDEFINIE ET DES POINTS LIMITES SERONT APPLIQUES SANS DELAI EN CAS D’ALTERATION MARQUEE DE L’ETAT GENERAL.

Devenir

MODIFICATIONS LES SOURIS AYANT SUBI UNE OPERATION CHIRURGICALE ET TOTALEMENT CICATRISEES PEUVENT ETRE UTILISEES POUR PRELEVEMENTS DE CERVEAUX (APPRENTISSAGE DE COUPES TISSULAIRES). TOUS LES ANIMAUX INTEGRES DANS L’ETUDE SERONT MIS A MORT A LA FIN DE CHAQUE PROCEDURE DU FAIT DES ANALYSES PREVUES EXCLUSIVEMENT EX-VIVO. ILS NE PEUVENT ETRE NI REUTILISES, NI REPLACES, NI ADOPTES.

Remplacement

MODIFICATIONS texte en majuscules L’évaluation des processus associés à la maladie d’Alzheimer (MA) ne peut être réalisée autrement que sur animaux vivants, présentant des niveaux de développement cognitif et de capacités mnésiques suffisants et démontrés pour représenter un modèle d’étude pertinent. LA MA IMPLIQUE DES PROCESSUS DYNAMIQUES ET INTEGRES QUI NECESSITENT UN CERVEAU ENTIER VIVANT POUR ETRE RELIES CAUSALEMENT A DES ALTERATIONS COMPORTEMENTALES. LES MODELES IN VITRO/HUMAINS EX VIVO DECRIVENT UNIQUEMENT DES MECANISMES MAIS NE REPRODUISENT PAS TOUS LES SYMPTOMES, ET L’ETABLISSEMENT DE RELATIONS CAUSE‑EFFET ET L’EVALUATION PRECLINIQUE D’INTERVENTIONS SUR LA PROGRESSION ET LA COGNITION REPOSENT DONC ESSENTIELLEMENT SUR DES MODELES ANIMAUX. Les protocoles décrits ne peuvent s’effectuer que chez les rongeurs (rat ou souris) du fait des outils disponibles (taille des appareillages, atlas des régions cérébrales pour le repérage des structures en stéréotaxie), et de la manipulation plus aisée. Le modèle souris est un modèle de choix permettant de travailler sur des animaux manipulés génétiquement et est de ce fait celui retenu. Ce projet représente actuellement le seul modèle « humanisé » pour la MA permettant à terme une avancée thérapeutique ciblant les cellules humaines in-vivo et principaux acteurs en interaction constante dans l’évolution de la maladie.

Réduction

Puisqu’il s’agit d’un renouvellement de projet, les nombres d’animaux ont été optimisés par les études antérieures et sont réduits à leur minimum. Aucune étude pilote est nécessaire. Tous les protocoles d’injection sont largement maitrisés et chaque souris utilisée conduira à des résultats interprétables. Selon les résultats et leur interprétation, il est possible que la méthodologie soit à terme simplifiée sur un mode de chirurgie unique sans impact sur les objectifs scientifiques. Les analyses prévues sur cellule unique se feront selon un protocole déjà mis au point. Elles permettent d’obtenir une masse de données à partir de peu d’échantillons de tissus cérébraux. Les tissus non utilisés seront conservés à -80°C. Pour les greffes des souris dans l’utérus, les portées sont très larges, permettant de réduite à son strict minimum le nombre de souris gestantes. Le stade de greffe retenu a été optimisé lors de précédentes études, permettant une très bonne survie des nouveau-nés. Mâles et femelles seront utilisés en pourcentages les plus équivalents possibles et identifiés. Les animaux greffés seront mis à mort en fin d’expérience et non réutilisables. Le projet met en œuvre une collaboration avec un bio-informaticien possédant l’expertise des modes d’analyses transcriptomiques sur cellule unique et des tests statistiques associées. Pour les études relevant des analyses anatomiques/morphologiques, nous nous baserons sur nos études publiées selon des protocoles similaires.

Raffinement

MODIFICATIONS texte en majuscules Les chirurgies seront réalisées dans un laboratoire dédié exclusivement à la chirurgie L’élevage sera en cage individuelle par portée et des mesures seront prises pour éviter tout animal isolé au-delà d’une période de 24h. Les animaux seront placés sur dispositif chauffant pour maintenir une bonne température corporelle avant, pendant et après l’expérience et seront étroitement surveillés après chirurgie. Dans les procédures expérimentales, les souris feront l’objet d’une surveillance accrue ET RENFORCEE, de soins pré- et post-opératoires, des mesures de gestion de la douleur seront entreprises pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des souris. CES MESURES COMPRENNENT UN RENFORCEMENT DE L’ANALGESIE, EGALEMENT LE MAINTIEN DES SOURIS A UNE BONNE TEMPERATURE SUR DISPOSITIF CHAUFFANT AU REVEIL DES CHIRURGIES, UNE LITIERE DOUCE. POUR LES FEMELLES GESTANTES, ELLES SERONT MAINTENUES AVEC UNE AUTRE FEMELLE POUR EVITER TOUT ISOLEMENT ET STRESS ASSOCIE. Pour les souris immunodéficientes, des conditions maximales d’asepsie seront appliquées. De façon générale et pour l’ensemble des protocoles de chirurgies sous anesthésie, nous rechercherons à minimiser la douleur par antalgiques, ajout de diet gel, par un réchauffement continu des animaux, et par des solutions de réhydratation maintenues à la température corporelle. Nous renforcerons également l’enrichissement des cages. Nous surveillerons l’utilisation des cotons, et l’état de la nidification le cas échéant sous les dômes en carton. Durant les chirurgies, nous assurerons l’absence d’autres manipulations d’animaux dans la pièce de chirurgie et la préparation de tout le matériel sera réalisée en amont pour réduire les temps de manipulation. Deux expérimentateurs seront présents pour réduire les temps d’action. Tous les points limites seront contrôlés pour chaque procédure et anticipés par traitements analgésiques (injection s.c. de buprénorphine 30 min avant la chirurgie et toutes les 8 heures pendant 24h (0.1 mg/kg) pour un effet visible au plus tard dans un délai de 24 heures. En absence d’effets, l’animal est mis à mort.

Choix des espèces

L’évaluation du rôle du système nicotinique et d’un récepteur particulier chez l’homme dans les processus associés à la maladie d’Alzheimer ne peut être réalisée autrement que sur animaux vivants, présentant des niveaux de développement cognitif et de capacités mnésiques suffisants pour représenter un modèle d’étude pertinent. Les protocoles décrits ne peuvent s’effectuer que chez les rongeurs (rat ou souris) du fait des outils disponibles (taille des appareillages), et de la manipulation plus aisée. La souris représente un des meilleurs modèles, jusqu’à présent, sur lesquels on peut étudier les comportements liés à la psychiatrie, dont l’élevage et le maintien en bonnes conditions reste pratique à réaliser en laboratoire, et dont on sait également analyser et manipuler le génome (pour étudier notamment le rôle des sous-unités nicotiniques dans le cadre de ce projet). Les animaux seront utilisés à trois stades de développement distincts : embryonnaire, néonatal et adulte. Pour la gestation, des femelles de 8-10 semaines seront utilisées. Les souris greffées seront sevrées à 4 semaines après naissance, en séparant mâles et femelles. Tous les animaux sevrés et injectés avec des vecteurs, seront utilisés à partir de 8 semaines et testés en groupe d’âge et protocoles indépendants jusqu’à 9 mois (3, 4, 5, 7 et 9 mois). Une condition de greffe de cellules sans vecteur sera initiés dès 1 mois. Le projet vise à étudier le développement de cellules humaines dans un contexte in-vivo, se rapprochant de conditions physiologiques et pathophysiologiques et mimant au mieux ce qui se passe dans la pathogénèse de la maladie d’Alzheimer chez les patients avant l’apparition des signes cliniques et également avant celle des premiers évènements cellulaires. Mieux comprendre les interactions entre les cellules greffées et celles de l’hôte présentant des stades de maturation différents, représente également un enjeu important pour le futur et les approches de médecine régénérative à venir.

Rendues immunodéficientes pour accepter la greffe de cellules humaines sans rejet, 216 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent une injection de cellules de myélome ou d'amylose, puis des prises de sang deux fois par semaine pendant trente jours et jusqu'à huit administrations de composés, la croissance tumorale pouvant les rendre léthargiques et leur faire perdre du poids. Les molécules testées visent, à terme, un traitement chez l'humain, mais l'étape présente reste la caractérisation de leur effet sur des tumeurs greffées. Le porteur justifie le recours à l'animal par la nécessité d'un "organisme entier" pour analyser tous les organes cibles.

Objectifs

Le myélome multiple (MM) et l’amylose (AM) sont des pathologies associées à des anomalies des plasmocytes, cellules du système immunitaire produisant les anticorps. L'introduction de nouvelles approches thérapeutiques de chimiothérapies basées,entre autres, sur le blocage de complexes cellulaires qui assurent l’élimination des déchets protéiques dans les cellules a considérablement amélioré la survie des patients atteints. Cependant, ces traitements induisent souvent des effets indésirables graves ou des résistances aux traitements et les patients traités rechutent systématiquement Ces pathologies restent donc incurables et entrainent dans la majorité des cas le décès des patients. Il est donc essentiel de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant de vaincre la résistance aux chimiothérapies et de réduire leur toxicité. Il a été montré qu’une toxine bactérienne capable d’inhiber la synthèse et l’expression de certaines protéines secrétées ou exprimées à la surface des cellules induisait un stress cellulaire associé à la production accrue de déchets protéiques qui, s’il est maintenu, évolue vers un suicide cellulaire. Cette inhibition permet à cette toxine de potentialiser l’efficacité thérapeutique des traitements du MM et permet de réduire efficacement la croissance tumorale dans un modèle animal murin immunodéficient. Ces résultats ont permis de démontrer l’intérêt thérapeutique de ce type d’inhibiteur dans le MM, et éventuellement pour l’AM car il bloquerait la production de la protéine responsable de la pathologie de l’amylose. Cependant la synthèse de cette toxine n’est pas compatible avec le développement de médicaments et ne peut donc pas être utilisée comme telle en tant que molécule thérapeutique. Le but de notre de projet est donc de caractériser de petites molécules possédant les propriétés inhibitrices de la toxine bactérienne mais facilement synthétisable, peu toxique et facilement administrable. Ces molécules seront sélectionnées par des tests in vitro sur leur capacité inhibitrice de la synthèse de protéines et plus particulièrement de la chaine légère anormale des immunoglobulines responsable de la pathologie de l’amylose et de leur capacité à induire la mort cellulaire sélective de cellules cancéreuses du MM tout en ne présentant pas ou peu d’effets secondaires délétères.

Bénéfices attendus

Dans son ensemble, le projet devrait aboutir à l’identification de médicaments permettant de traiter l’amylose et le myélome multiple chez l’homme qui sont aujourd’hui, dans la plupart des cas, incurables. Le projet consiste au développement de molécules thérapeutiques contre ces pathologies et l’obtention de résultats positifs dans le cadre du traitement chez la souris selon les critères définis devraient permettre de valider la stratégie de l’approche thérapeutique basée sur l’inhibition de la sécrétion et l’expression de protéine. Les molécules donnant les résultats les plus prometteurs seront alors testées lors d’essais cliniques chez l’homme permettant d’aboutir à un développement de médicaments pour traiter ces maladies.

Procédures

Prises de sang (quelques secondes) 2 fois par semaine pendant 30 jours. Injection de cellules humaines, 30 secondes pour une injection, une injection de cellules par animal. Effet indésirables liés à la croissance/ au développement de la masse tumorale. Administration de composés par injection ;10 secondes par administration ; maximum 8 administrations / animal.

Impact sur les animaux

Les souris seront injectées avec des lignées humaines de myélome multiple ou d’amylose en sous cutané ou par voie intraveineuse. L’injection des cellules pourra occasionner une douleur de courte durée au niveau du site d’injection. La croissance de ces cellules sera suivie et les souris dont la croissance aura atteint un point limite seront mises à mort. Ainsi la croissance de ces cellules dans les limites imposées dans le projet ne devrait pas générer de douleur particulière mais les souris pourraient subir une gêne dû à la croissance des cellules et devenir léthargiques et subir une perte de poids. La croissance des cellules pourrait être associée à des pathologies particulières, telles que celles observées chez l’homme et pourraient générer inconfort, stress et douleur. Les souris seront donc suivies périodiquement et si des symptômes révélateurs de souffrance, d’inconfort ou de stress étaient observés, les animaux seront mis à mort afin de réduire la souffrance en accord avec les points limites définis. Les traitements, quant à eux, ne devraient pas induire de souffrance particulière car ils auront été sélectionnés sur des critères d’absence de toxicité et d’effets secondaires. Mais la manipulation fréquente et périodique des souris pour l’administration des traitements et du suivi pourrait aussi générer un stress plus ou moins important en fonction de la voie d’administration choisie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car nous devrons prélever en fin de procédures certains organes vitaux pour analyse (effets des traitements sur la croissance tumorale et sur les pathologies étudiées).

Remplacement

Il s’agit ici de tester différentes molécules de synthèses possédant les propriétés inhibitrices de la sécrétion et de l’expression de protéine similaire à la toxine bactérienne. Toutes les questions pouvant être apportées par l’utilisation de lignées cellulaires sur cette inhibition seront réalisées in vitro pour les caractériser et définir leurs propriétés biologiques. Cependant, le projet a pour objectif d’utiliser finalement ces molécules dans le traitement de pathologies chez l’homme et viseront donc à caractériser les effets thérapeutiques de ces molécules sur la prévention et le développement de ces pathologies. Il doit être réalisé dans un modèle expérimental physiologique de ces pathologies et doit donc être analysée et validée sur un organisme entier permettant d’analyser tous les organes cibles.

Réduction

Le nombre d’animaux que nous estimons nécessaire repose sur la forte expérience de nos conceptions d’études de ce type et validée par des biostatisticiens. Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux strictement nécessaire pour atteindre l’objectif fixé. Les expériences passées ont montré que le nombre d’animaux par groupe utilisé ici (6) est le minimum requis pour obtenir des résultats pertinents et statistiquement significatifs. Un nombre inférieur d’animaux pourrait conduire à une expérience non interprétable du fait d’un manque de puissance des données générées. La répétition de l’expérience pourrait être nécessaire pour la robustesse des données établies. Par ailleurs, nous utiliserons des techniques expérimentales nous permettant d’analyser sur un seul individu de multiple facteurs caractérisant la pathologie pour obtenir le maximum d’information pour chaque animal utilisé. Les groupes expérimentaux de souris seront mélangés dans les cages afin de minimiser au maximum les conséquences de l’effet cage sur les résultats, permettant ainsi d’utiliser moins d’animaux et de réduire le nombre de répétition des expériences. Si possible, les molécules seront testées au sein d’une même expériences afin d’utiliser les mêmes groupes contrôles pour plusieurs molécules et donc réduire le nombre de souris.

Raffinement

Les souris immunodéficientes seront maintenues dans un environnement protégé sans pathogène opportuniste sous armoires ventilées et hébergées en groupe, avec une litière appropriée, des matériaux de nidification, et une nourriture adaptée. La nourriture sera irradiée, l’eau de boisson autoclavée et le matériel en contact avec l’animal sera autoclavé ou décontaminé. La durée et les doses des traitements sont calculées pour ne pas induire d’effet indésirable, tout en atteignant les objectifs scientifiques. Pendant la durée de l’expérience, les animaux restent dans leur environnement habituel. La plupart des gestes opératoires susceptibles d’être douloureux ou nécessitant un temps de plus d’une minute générateurs de stress seront effectués sous anesthésie. Des observations régulières des animaux seront effectuées tout au long des expériences pour détecter les animaux qui seront en éventuellement souffrance. Dès que le point limite sera atteint, les animaux concernés seront mis à mort.

Choix des espèces

La souris présente le meilleur compromis éthique entre modèle mammifère, résultats le plus proches de l’humain tout en utilisant un nombre suffisant pour l’obtention de résultats fiables. Les métabolismes sont bien caractérisés et largement comparables à ceux de l’homme. En conséquence, les connaissances acquises seront vraisemblablement transférables à l’homme. D’autre part, la disponibilité de souris immunodéficientes nous permet d’envisager la greffe de cellules humaines sans rejet de celles-ci par le système immunitaire nous permettant d’analyser l’effet du traitement seul. Nous étudions des pathologies de l’adulte, des individus adultes de 6 à 8 semaines seront donc utilisés. Pour les xénogreffes des animaux immunodéficients, cet âge est requis car au-delà de 8 semaines une irradiation est nécessaire avant implantation des xénogreffes.

Quatorze prélèvements sanguins en vingt-quatre heures, répétés sur un maximum de seize journées de cinétique : 20 mini-porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chaque animal subit d'abord une chirurgie de trois heures pour la pose de cathéters permanents et d'une canule jéjunale, puis reste hébergé seul pendant toute l'étude pour contrôler sa prise alimentaire. L'objectif est d'évaluer des formulations pharmaceutiques humaines et de caler des modèles in vitro sur les données animales. La mise à mort sert un prélèvement terminal de muqueuse intestinale.

Objectifs

Nous abordons la mise au point et le développement de formes pharmaceutiques spécifiques (forme galénique) et la biopharmacie de manière intégrée, depuis la conception des formulations et la libération des principes actifs jusqu’à leurs effets sur l’absorption, la biodisponibilité et le microbiote intestinal, dans une perspective d’optimisation des stratégies thérapeutiques et nutritionnelles. Le projet vise à évaluer l’impact de formulations galéniques innovantes humaines sur la biodisponibilité de substances actives modèles. L’objectif est de démontrer le rôle de ces formulations dans l’amélioration de différents paramètres pharmacocinétiques. Les résultats obtenus chez l'animal (in vivo) permettront d’établir des corrélations in vitro–in vivo, entre des données obtenues sur un animal vivant par rapport à des données obtenues par des techniques de laboratoire dans un environnement artificiel (in vitro), afin d’identifier les outils in vitro les plus prédictifs de la performance in vivo pour ces formulations innovantes. Par ailleurs, les données générées in vivo serviront de base à la construction de modèles pharmacocinétiques de modélisation informatiques (in silico),destinés à mieux comprendre et prédire le comportement in vivo à partir des expérimentations in vitro.

Bénéfices attendus

Le projet vise à développer et évaluer de nouvelles formes galéniques innovantes, en démontrant leur efficacité à l’aide d’un modèle préclinique adapté, le mini-porc. Les bénéfices attendus sont multiples : (i) contribuer à la mise au point de formulations améliorant la biodisponibilité des substances actives, (ii) renforcer la transférabilité entre les données in vitro et in vivo, en améliorant la prédictivité des modèles in vitro, (iii) identifier les outils expérimentaux les plus pertinents pour évaluer la performance des formulations et, à terme, de réduire le nombre d’expérimentations animales nécessaires au développement galénique.

Procédures

Chaque animal subira une seule demi-journée (3h) d’intervention chirurgicale pour la pose de cathéters permanents et de canule jéjunale (1h de préparation pré-opératoire, et 2 h entre l’incision cutanée et le réveil de l’animal). Une période de récupération de 15 jours sera observée , entre la chirurgie et la première journée de prélèvements. Chaque animal participera au final à 8 cinétiques maximum par étude avec un maximum de 2 études, d’une durée de 24 h suivie d’une période de récupération de 3 jours minimum entre chaque cinétique. Lors d’une journée de prélèvement, les animaux recevront le matin comme seul aliment une des formes à tester. Des prélèvements de sang seront réalisés dans le cathéter selon la cinétique de 14 prélèvements sanguins étalés sur une journée de 24 heures. Pour chacune des journées de prélèvements, 2,7 ml de sang seront prélevés pour chaque point de cinétique. Le volume total prélevé sera de 37,8 ml par cinétique (moins de 7,5% du volume sanguin de l'animal).

Impact sur les animaux

Les substances actives utilisées dans le cadre de ce projet sont des composés déjà commercialisés chez l’Homme, ne présentant aucun effet néfaste connu, comme cela a été démontré lors de leur utilisation clinique. En effet, ils sont autorisés par les différentes autorités de santé. De plus, l’ensemble des excipients employés dans ces études sont reconnus comme sûrs et ne présentent aucun risque pour la santé ou le bien-être des animaux utilisés lors des expérimentations. La piqûre d’aiguille pour l’injection de la pré-anesthésie avant l’intervention chirurgicale peut provoquer une douleur légère et de courte durée. La procédure chirurgicale elle-même entraîne une douleur abdominale modérée, prise en charge par des antalgiques et limitée dans le temps. Enfin, l’hébergement en cages individuelles après la chirurgie entraîne un isolement temporaire des animaux et restreint certains comportements sociaux. L’isolement dure toute la durée du projet (habituation, post-op et prélèvement), les animaux étant appareillés ainsi que pour maitriser et contrôler leur prise alimentaire individuellement, il n’est pas possible de les héberger collectivement.

Devenir

En fin d’expérimentation ou en cas d’atteinte d’un point limite grave, les animaux seront mis à mort par injection intraveineuse d’une surdose de barbiturique intracardiaque sur animaux anesthésiés conformément à la réglementation en vigueur. Cette mise à mort est justifiée afin de réaliser des prélèvements terminaux de muqueuse intestinale pour compléter les résultats sanguins de l'étude.

Remplacement

La biodisponibilité des molécules actives contenues dans des formulations galéniques innovantes fait intervenir de nombreux processus biologiques et chimiques complexes (digestion, absorption, métabolisation), qui, à ce jour, ne peuvent pas être entièrement reproduits in vitro. Le porc présente un certain nombre de similitudes anatomiques et physiologiques avec l’homme, ce qui en fait un modèle fréquemment utilisé pour les études pharmacocinétiques. Le mini-porc, en particulier, permet de travailler sur des adultes à stabilité pondérale et d’une taille compatible avec l’expérimentation animale. Il présente également l’avantage de posséder un système digestif très proche de celui de l’homme.

Réduction

Dans le cadre de la règle des 3R, le recours à 10 mini-porcs par étude permet de garantir la puissance statistique tout en minimisant le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux utilisés a été réduit au minimum, dans la mesure où cela ne compromet pas les objectifs scientifiques du projet. L’effectif prévu dans le schéma expérimental (10 animaux) tient compte de la variabilité du principal paramètre mesuré, à savoir l’apparition de la substance active dans le sang, estimée à partir d’études antérieures. Cette variabilité est liée non seulement aux différences interindividuelles entre les animaux, mais également à la qualité des prélèvements et à la précision des analyses biochimiques. Ces aspects sont parfaitement maîtrisés par les expérimentateurs du projet, qui possèdent une longue expérience dans ce domaine. L’utilisation d’un schéma expérimental permet de diminuer significativement le nombre d’animaux, chaque animal servant de témoin pour lui-même. L’équipe de recherche dispose d’une expertise reconnue dans l’utilisation d’animaux porteurs de canules digestives et de cathéters sanguins, ce qui permet de réduire au maximum le nombre d’animaux et de limiter les processus douloureux.

Raffinement

L’approche développée sera peu invasive et vise à réduire au maximum la douleur et le stress des animaux. La douleur ressentie pendant l’expérimentation est principalement liée à l’acte chirurgical, qui se déroule sous anesthésie générale avec surveillance des constantes vitales. Les animaux recevront un traitement analgésique et spasmolytique, et après la période de récupération, la gêne reste mineure. Pendant cette phase, les animaux sont surveillés régulièrement tout au long de la journée. L’évaluation de la douleur et de l’inconfort est réalisée par observation du comportement des animaux, notamment la reprise de l’alimentation, du transit intestinal, la posture, les vocalises, la réactivité et la température corporelle. Durant toute la période expérimentale, les animaux seront hébergés dans des cages de taille réglementaire, avec des parois latérales en plexiglas permettant aux animaux de se voir et d’interagir entre eux. Leur environnement sera enrichi avec des jouets en caoutchouc adaptés aux porcs, la pièce sera à température régulée, et les animaux auront un libre accès à l’eau.

Choix des espèces

Le porc présente de nombreuses similitudes anatomiques et physiologiques avec l’homme, ce qui en fait un modèle fréquemment utilisé pour les études de biodisponibilité. Le mini-porc permet de travailler sur des adultes à stabilité pondérale et d’une taille compatible avec l’expérimentation animale. Il présente également l’avantage de posséder un système digestif très proche de celui de l’homme. Ce modèle est reconnu par la communauté scientifique comme pertinent pour les études de biodisponibilité, avec une bonne transférabilité vers la physiologie humaine. La procédure expérimentale est réalisée sur des animaux en fin de croissance (âge>10 mois), afin de bénéficier d'une stabilité pondérale pendant la totalité de la période d'expérimentation.

Pour mettre au point des implants d'optogénétique sans fil, 70 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Une chirurgie de deux heures place un dispositif dans leur cerveau, suivie de séances de stimulation lumineuse à distance. Le projet met en avant un meilleur confort des animaux, grâce à la suppression des câbles. Les 70 rats sont malgré tout tués à la fin pour des analyses du cerveau.

Objectifs

Le cerveau fonctionne grâce à des milliards de neurones qui communiquent entre eux. Comprendre comment ces cellules contrôlent nos comportements (comme apprendre ou prendre des décisions) est essentiel pour mieux comprendre certaines maladies, notamment les troubles psychiatriques et neurologiques. L’optogénétique est une technique récente qui permet d’agir directement sur l’activité de certains neurones à l’aide de la lumière. Concrètement, des cellules du cerveau sont rendues sensibles à la lumière, ce qui permet de les activer ou de les désactiver de manière très précise. Les chercheurs peuvent ainsi observer comment ces modifications influencent le comportement de l’animal. Cette approche permet de mieux comprendre les liens de cause à effet entre l’activité du cerveau et les comportements. Pour réaliser ce type d’étude, il est nécessaire de travailler sur des animaux vivants, afin d’observer le comportement suite à la manipulation de l’activité des neurones. Cela implique généralement l’implantation d’un dispositif très fin dans le cerveau, permettant d’envoyer de la lumière dans une zone ciblée. Dans ce projet, nous utilisons un nouvel équipement innovant qui fonctionne sans fil. Il s’agit de très petits implants, légers et sans batterie, qui peuvent être activés à distance. Cette technologie présente un avantage important : elle évite l’utilisation de câbles, ce qui simplifie les expériences et améliore le confort des animaux. L’objectif de ce projet est de mettre en place la technique chirurgicale permettant d’installer ces implants et de vérifier que le système fonctionne correctement chez l’animal. À terme, cet outil permettra d’étudier plus précisément le rôle de certaines zones du cerveau dans des comportements complexes, notamment ceux liés à des troubles psychiatriques.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider un nouvel outil permettant de stimuler le cerveau sans fil, afin de faciliter les expériences et d’améliorer la liberté de mouvement des animaux. En supprimant les câbles, les animaux peuvent se déplacer plus librement, ce qui permet d’observer des comportements plus naturels et de réduire les contraintes techniques. Ce dispositif offrira de nouvelles possibilités pour mieux comprendre le rôle de certaines zones du cerveau, notamment dans les comportements liés à la récompense et à l’addiction. Enfin, cette technologie contribue à améliorer le bien-être des animaux en limitant le stress et les contraintes physiques, tout en permettant d’obtenir des données scientifiques de meilleure qualité.

Procédures

Sur animaux anesthésiés : - chirurgie d’implantation de dispositif d'activation cérébrale (durée : 2 heures par animal). Sur animaux vigiles : - 2 sessions de locomotion (1 session / jour, 1 heure par session,). - 7 sessions de stimulation cérébrale dans les cages de type 1 (1 session / jour, 1 heure par session). - 7 sessions de stimulation cérébrale dans les cages de type 2 (1 session / jour, 1 heure par session).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour cette procédure sont : -Chirurgies : inconfort transitoire au réveil - implantation d'un dispositif à demeure : risques d’infection ou démangeaisons - Les injections peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de procéder à des analyses moléculaires sur le cerveau

Remplacement

L’utilisation d’animaux est indispensable pour ce projet, car il s’agit d’étudier la relation causale entre l’activité de circuits neuronaux spécifiques et des comportements (locomotion, comportement opérant) dans un organisme intact. Ces phénomènes ne peuvent être reproduits de manière fiable avec des modèles in vitro ou informatiques. Le projet permettra de valider le fonctionnement du dispositif optogénétique sans fil et son déclenchement contingent aux comportements, ce qui nécessite l’observation directe du comportement des animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux est limité au strict nécessaire. Chaque animal est étudié dans plusieurs conditions afin de maximiser les données obtenues, ce qui permet de réduire le nombre total d’animaux utilisés. Les effectifs sont calculés et optimisés de manière à utiliser un minimum d’animaux tout en conservant une grande puissance statistique. Ainsi, nous utiliserons un maximum de 70 animaux sur 5 ans pour répondre à nos objectifs.

Raffinement

Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape grâce à une surveillance régulière, basée sur une grille de suivi dédiée. Celle-ci permet d’évaluer des points limites gradés et de définir des critères d’intervention ou d’arrêt, notamment à partir d’indicateurs tels que la perte de poids, l’apparence générale et le comportement. Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien- être des animaux est pris en compte à chaque étape avec une évaluation basée sur la grille de suivi. Dès leur arrivée à l’animalerie et pour toute la durée du projet, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) et en cycle inversé avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger ; tunnel pour se cacher). Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum, pendant laquelle les animaux seront manipulé par l’expérimentateur principal 3 fois par semaine.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce la plus adaptée pour l’étude expérimentale des circuits neuronaux impliqués dans la motivation, la récompense et l’addiction. Les rats présentent des réponses comportementales et neuronales aux drogues et récompenses naturelles comparables à celles de l’Homme et peuvent apprendre à s’auto-administrer de manière fiable différentes substances, ainsi qu’à effectuer des réponses opérantes complexes. Leur taille et leur neuroanatomie permettent l’implantation d’équipements optogénétiques miniaturisés et la réalisation de chirurgies stéréotaxiques précises. Nous utiliserons des rats présentant une faible consanguinité. Cette variabilité génétique interindividuelle importante reflète mieux celle observée chez l’Homme, ce qui renforce la pertinence translational de nos résultats. Cette espèce permet donc de combiner de manière optimale les exigences de manipulations optogénétiques précises et l’évaluation de comportements complexes, dans un modèle pertinent pour l’étude des circuits neuronaux impliqués dans des troubles psychiatriques. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet, ce qui correspond au stade de développement utilisé dans la vaste majorité de nos projets.

Pour comprendre comment le cerveau arbitre entre faim et soif, 520 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Leur accès à l'eau et à la nourriture est limité à huit heures par jour, et ils reçoivent des implants d'électrodes et de fibres optiques dans le cerveau, ce qui impose ensuite un isolement pour éviter que les congénères ne rongent le matériel. Tous sont tués pour vérifier la position des implants. Le porteur retient le rat parce que c'est l'espèce la mieux étudiée pour ce comportement.

Objectifs

Pour rester en vie et en bonne santé, un animal doit répondre à des besoins vitaux : manger, boire, se reproduire ou fuir un danger. Mais dans la nature, il ne peut pas tout faire en même temps. Il doit donc classer ses priorités en permanence. Si certains circuits du cerveau responsables de la faim ou de la soif sont déjà connus, on ignore encore comment le cerveau arbitre entre ces besoins. Par exemple : si un animal a faim ET soif en même temps, quel circuit neuronal permet de guider son choix ? L'objectif est d'étudier les circuits cérébraux qui reçoivent les signaux du corps (faim, soif) et les transforme en une décision d'agir. Pour comprendre ce mécanisme, nous allons observer des rats placés face à un choix : manger ou boire. Nous réaliserons deux approches : (1) des enregistrements électrophysiologiques qui permettent d’observer l'activité électrique des neurones en temps réel pendant que le rat choisit et (2) des manipulations optogénétiques qui permettent d’activer ou d’inactiver précisément certains neurones afin de voir si cela modifie la décision du rat.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des bénéfices scientifiques majeurs en éclairant les mécanismes cérébraux qui permettent aux animaux de hiérarchiser leurs besoins vitaux. Au cours des dernières décennies, la recherche a considérablement progressé dans la compréhension des processus permettant de sélectionner les actions les plus à même de maximiser la probabilité de satisfaire un besoin spécifique. Il a ainsi été mis en évidence que le striatum dorsal joue un rôle majeur dans la décision de l’action à réaliser. Cependant, très peu de travaux de neurosciences ont cherché à comprendre comment le cerveau choisit parmi différents besoins primaires. Ces travaux permettront de déterminer si le striatum ventral et ses connections participent à la sélection des besoins à l’image du rôle du striatum dorsal dans la sélection des actions.

Procédures

Chacun des animaux de ce projet sera soumis à une ou plusieurs sédation à l'aide d'un anesthésique gazeux afin de procéder à des injections intra-péritonéales et sous-cutanées, ainsi qu'à un acte chirurgical, réalisé sous anesthésie générale. Ces interventions permettront une injection intracérébrale ainsi que l'implantation de fibres optiques et d'électrodes.

Impact sur les animaux

En condition normale, les animaux mangent et boivent pendant la période nocturne de 12h. L’accès limité à 8h par jour dans la journée, pour l’eau et la nourriture, peut entraîner une perte de poids transitoire de quelques jours avant que le cycle des animaux ne se recale sur le nouveau rythme. Une seconde nuisance possible correspond aux conséquences à court terme des interventions chirurgicales. Durant les jours suivant l’opération, les animaux peuvent perdre un peu de poids, présenter une activité réduite. Dans le cas de l’implantation de fibres optiques, de même que celle des électrodes, les animaux peuvent ressentir une gêne due au poids du chapeau protecteur fait en ciment dentaire. Plus rarement, les animaux peuvent présenter un saignement au niveau des cicatrices. Une dernière nuisance concerne l’isolement des animaux après avoir été implantés avec des électrodes/fibres optiques qui est indispensable car en groupe, les animaux rongent le matériel implanté sur la tête de leurs congénères.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de vérifier que les injections virales, implantations de fibres optiques et d’électrodes d’enregistrement aient été correctement localisées. Cela est nécessaire afin de confirmer que les effets observés sur les comportements des rats soient liés aux structures cérébrales ciblées.

Remplacement

Les méthodes in vitro ne peuvent pas reproduire le fonctionnement d’un organe aussi complexe que le cerveau en raison de l’isolement des cellules du contexte physiologique.

Réduction

En maintenant notre animalerie dans le respect des bonnes pratiques, nous nous efforçons de minimiser la variabilité induite par le stress ou par la présence de pathogènes. Afin de limiter le nombre d’animaux au strict nécessaire, ne connaissant pas la taille de l’effet et la variabilité des mesures au préalable, nous ne pouvons pas utiliser un calcul de puissance pour déterminer l’effectif. L’expertise acquise dans l’équipe sur ce type d’expérience nous a permis de fixer a priori le nombre d’animaux nécessaires. Par expérience nous avons déterminé pour les expériences d’electrophysiologie que des effectifs comprenant 20 animaux (mâles et femelles) nous permettent de mettre en évidence des différences significatives entre les groupes expérimentaux et d’anticiper de possibles mauvais placements des fibres, électrodes et de sites d’injection. Ceci prend donc en compte les problèmes susceptibles de survenir aux différentes étapes de l’expérimentation et qui peuvent amener à écarter des animaux. Les analyses statistiques appropriées seront réalisées. Enfin, pour utiliser tous les animaux produits, l’étude porte sur les mâles et les femelles.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation à l’animalerie ainsi qu’au contact des expérimentateurs avant le début des procédures expérimentales, afin de limiter autant que possible le stress lié à la manipulation. Leur environnement sera enrichi et cet enrichissement sera renouvelé régulièrement afin de diversifier les stimulations et de favoriser l’expression des comportements naturels. Lors des chirurgies, un anesthésique volatil sera utilisé en raison de sa rapidité d’induction et de réveil, ainsi que de la meilleure stabilité du niveau d’anesthésie qu’il procure par rapport aux anesthésiques injectables. Cette approche permet une récupération post-opératoire plus rapide et réduit la mortalité. La surveillance post-opératoire sera renforcée afin de s’assurer de la bonne récupération des animaux et de permettre une intervention rapide en cas de complication. L’évaluation de la douleur reposera sur une grille prenant en compte l’aspect général (pelage, posture, ouverture des yeux), le poids corporel, le comportement spontané et le comportement induit. Tout animal présentant des signes de douleur (pelage terne, poils hérissés, dos voussé, yeux mi-clos, apathie) recevra un traitement antalgique toutes les 24 heures et sera observé deux fois par jour. Si aucune amélioration n’est constatée, une nouvelle injection d’analgésique sera effectuée. En l’absence d’amélioration supplémentaire, l’animal sera euthanasié afin de prévenir toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

L’utilisation du rat est justifiée par la richesse de données collectées par la communauté scientifique chez cette espèce, tant au niveau anatomique que comportemental. Au niveau anatomique, les afférences au noyau accumbens ont été mieux détaillées chez le rat que chez n’importe quelle autre espèce. Au niveau du comportement de prise alimentaire, le rat a également été l’espèce la mieux étudiée. Enfin, le récent développement de vecteurs viraux permet désormais de manipuler sélectivement des populations neuronales spécifiques chez cette espèce. Afin d'améliorer la précision de nos chirurgies, et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous réaliserons nos expériences chez des rats adultes (>7-8 semaines), un stade du développement cérébral en adéquation avec notre question scientifique.