Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Traitement innovant du diabète de type 2 : preuve de concept en pré-clinique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Jusqu'à trente-six prélèvements sanguins par animal et quatre mois de régime gras à volonté: 664 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue. Rendues obèses et diabétiques, elles reçoivent une protéine testée seule ou avec des traitements existants, par injection ou pompe implantée sous anesthésie. Le porteur indique que l'obésité induite peut entraîner des troubles cardiovasculaires et un diabète. Les organes sont prélevés après la mise à mort.
Objectifs
Nous avons découvert une protéine naturellement présente chez les mammifères, dont le rôle principal connu concerne l’organisation du cytosquelette des cellules, notamment dans les muscles et le coeur. Elle participe aussi à certains mécanismes de sécrétion cellulaire, comme la libération d’insuline ou de neuromédiateurs. Il existe une forme circulante de cette protéine dans le sang, mais ses fonctions restent encore mal comprises. Nos travaux, menés dans des modèles murins d’obésité et de diabète, ont montré qu’après chirurgie bariatrique, l’expression de cette protéine est fortement modifiée au niveau intestinal. Par ailleurs, sa concentration sanguine est diminuée chez les patients atteints de diabète de type 2. Nos résultats expérimentaux indiquent que son administration augmente la sécrétion d’insuline de manière dépendante du glucose, améliore la glycémie chez des souris diabétiques, et potentialise l’effet de certaines molécules. L’objectif du projet est donc de mieux comprendre le rôle de cette protéine dans la régulation de la glycémie et de la sécrétion d’insuline, seule ou en association avec des traitements déjà utilisés dans le diabète, et d’évaluer son intérêt potentiel dans une perspective thérapeutique pour le diabète de type 2.
Bénéfices attendus
Le diabète de type 2 est une maladie chronique en forte progression dans le monde. On estime qu’il touche plus de 500 millions de personnes à l’échelle mondiale et plusieurs millions en France. Sa fréquence augmente avec le vieillissement de la population et la progression de l’obésité. Cette maladie expose à de nombreuses complications graves, notamment cardiovasculaires, rénales, neurologiques et ophtalmologiques. Elle représente un coût sociétal majeur, lié aux soins médicaux, aux hospitalisations, aux traitements au long cours et à la perte de productivité. À l’échelle mondiale, le coût du diabète est estimé à plusieurs centaines de milliards d’euros par an. Sur le plan scientifique, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes biologiques qui régulent la glycémie, en particulier le rôle d’une protéine encore peu étudiée dans ce contexte. Mieux comprendre ces mécanismes est essentiel pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et améliorer les connaissances fondamentales sur la régulation du métabolisme. Pour l’être humain, les résultats attendus pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques. Si nos résultats confirment son rôle bénéfique sur la sécrétion d’insuline et le contrôle de la glycémie, cette protéine pourrait, à terme, contribuer au développement de nouveaux traitements, seule ou en association avec des médicaments déjà utilisés dans le diabète de type 2. L’objectif final est d’améliorer la prise en charge des patients, de limiter les complications et d’alléger le poids humain et économique de cette maladie.
Procédures
Les animaux seront soumis à un régime riche en gras à volonté pendant la durée du projet, soit 4 mois maximum par prise spontanée. Des challenges métaboliques seront effectués : un test de tolérance au glucose (animal vigile, 3 fois maximum, 2 heures) et un test de tolérance à l'insuline (animal vigile, 3 fois maximum, 2 heures). Chaque test nécessitera une administration (animal vigile, 6 fois maximum sur l'ensemble du projet, quelques secondes). Ces tests nécessiteront aussi des prélèvements sanguins de faible volume répétés (animal vigile, 36 micro prélèvements maximum au total répartis ainsi : 6 sur une journée puis 6 une semaine après et cela répété 3 fois sur la durée du projet, l'acte dure quelques secondes). Pour certains animaux, 4 prélèvements sanguins supplémentaires seront réalisés pour effectuer un dosage (animal vigile, l’acte dure quelques secondes). Des traitements seront administrés par injection unique (animal vigile, 1 minute) ou par pompe de diffusion (animal vigile, 7 jours ou 28 jours). L’implantation de la pompe sera réalisée sous anesthésie et analgésie (1 fois, 10 minutes). Enfin, certains animaux subiront une chirurgie sous anesthésie et analgésie (1 fois, 45 minutes). Enfin, la composition corporelle (taux de gras, de muscle et d'eau) des animaux sera évaluée de manière non invasive (animal vigile, 1 fois par semaine soit 6 fois maximum, 5 minutes).
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis à plusieurs actes techniques qui pourront engendrer les nuisances suivantes : 1) Les régimes alimentaires spéciaux pourront entraîner une prise de poids pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux (4 mois maximum). 2) L'obésité peut conduire à des problèmes cardiovasculaires et du diabète (toute la durée du projet soit 4 mois maximum). 3) Les différentes administrations peuvent induire une douleur, une infection ou une gêne légère de courte durée (1 minute par geste). 4) Les challenges métaboliques induisent un stress et une douleur de courte durée en raison des administrations et des quelques prélèvements d’une goutte de sang ainsi que des effets physiologiques tels qu’une hypo- ou une hyperglycémie durant quelques heures (durée de 2h par test). Une sensation de faim et un léger stress peuvent également être ressentis lors des mises à jeun (6 ou 12h maximum). 5) Les prélèvements sanguins pourront induire une douleur de courte durée aux animaux, une infection ainsi qu’un risque d’hématome (quelques secondes par prélèvements). 6) Les différents traitements pourraient induire des effets indésirables comme la diarrhée et une perte de poids (28 jours maximum de délivrance). 7) Les mesures de la composition corporelle peuvent induire un stress léger chez les animaux dû à l'immobilisation nécessaire pour réaliser la mesure (5 minutes). 8) L'anesthésie peut induire une hypothermie et un risque cardiovasculaire (45 minutes maximum). 9) Enfin, les chirurgies peuvent induire des difficultés post-opératoires comme des douleurs et une mauvaise cicatrisation (période de surveillance renforcée post-opératoire de 7 jours).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de prélever des organes pour analyses. Ces analyses sont indispensables pour comprendre précisément les effets des traitements étudiés.
Remplacement
Des approches in vitro ont déjà été mises en œuvre en amont du projet, notamment l’étude d’îlots pancréatiques, c’est-à-dire des groupes de cellules du pancréas responsables de la production d’insuline, incubés avec la protéine étudiée afin d’analyser certains mécanismes cellulaires. Ces travaux ont permis d’explorer des effets directs au niveau des cellules. Cependant, ces modèles ne permettent pas d’évaluer les effets à l’échelle de l’organisme entier, ni d’étudier l’impact d’une chirurgie bariatrique ou d’une administration prolongée de la protéine dans un contexte pathologique complexe comme le diabète de type 2. Les phénomènes étudiés reposent en effet sur des interactions étroites entre plusieurs organes, notamment l’intestin, le pancréas, le foie, le tissu adipeux et le muscle, impliquant des régulations hormonales, nerveuses et circulatoires intégrées. À ce jour, aucun modèle in vitro ou méthode alternative ne permet de reproduire de manière fiable cette régulation systémique. Au regard des connaissances scientifiques actuelles et des objectifs translationnels du projet, le recours au modèle animal ne peut donc pas être remplacé. L’utilisation du modèle murin constitue une étape nécessaire et scientifiquement justifiée pour répondre aux questions posées.
Réduction
Cette étude nécessitera 664 souris maximum. Le nombre d'animaux par groupe a été établi avec l’utilisation d’outils statistiques permettant d’optimiser la puissance de l’étude tout en prenant en compte les risques liés aux procédures expérimentales. Par ailleurs, plusieurs mesures contribuent à la réduction du nombre d’animaux : 1) Les mêmes animaux pourront être suivis longitudinalement lorsque cela est scientifiquement pertinent, afin d’obtenir plusieurs paramètres sur un même individu. 2) Les données issues d’études préliminaires et de la littérature ont été utilisées pour affiner les hypothèses et éviter des groupes exploratoires inutiles. 3) Les expérimentations in vitro ont été réalisées en amont pour limiter les investigations in vivo aux questions nécessitant impérativement un modèle animal. Ainsi, le nombre d’animaux a été strictement ajusté au minimum nécessaire pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Un bâton à ronger est systématiquement mis en place pour les animaux sous régime alimentaire spécifique mou. Ce régime est renouvelé régulièrement pour éviter son oxydation. Des temps de récupération sont toujours respectés entre les différents actes techniques. Les chirurgies sont toujours réalisées sous analgésie et anesthésie. Les animaux sont maintenus sur tapis chauffant pour éviter l'hypothermie et les yeux sont protégés du désèchement grâce à un gel ophtalmique. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus adapté pour ce projet. Elle est largement utilisée dans l’étude de l’obésité et du diabète de type 2 et permet d’obtenir des résultats fiables grâce à l’homogénéité génétique des lignées. De nombreuses données de référence existent dans ce modèle, ce qui facilite l’analyse et la comparaison des résultats. Toutes les techniques nécessaires au projet sont déjà développées et maîtrisées chez la souris. Cette expertise garantit la faisabilité du projet, limite les complications et optimise l’utilisation des animaux. Enfin, les mécanismes de régulation de la glycémie chez la souris sont proches de ceux de l’homme, ce qui confère à ce modèle une forte pertinence dans une perspective translationnelle. Les animaux sont utilisés à partir de 8-10 semaines de vie. Cet âge correspond à l'âge optimal de la maturation métabolique.
Efficacité in vivo de nouveaux composés dérivés du GDC-0152 dans le glioblastome
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Anesthésiées par hypothermie sur la glace, puis soumises à une électroporation du cerveau pour y faire naître une tumeur, 410 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent quatre injections de composés dérivés du GDC-0152 pour tester leur effet sur le glioblastome. La tumeur provoque perte d'appétit et perte de poids avant la fin. Le porteur justifie ces essais par un "besoin médical non pourvu" depuis 2005, faute d'innovation thérapeutique.
Objectifs
Le glioblastome est une tumeur cérébrale très agressive, avec une survie de seulement 15 mois pour les patients, malgré des traitements combinant chirurgie, chimiothérapie et radiothérapie. Aucun nouveau médicament testé ces 15 dernières années n’a donné de résultats cliniques intéressants, en partie en raison de modèles animaux utilisés en recherche qui reflètent mal la complexité du glioblastome humain. L’objectif ici est de tester in vivo l'efficacité de nouveaux composés anticancéreux sur la progression de la tumeur, sur des souris portant des tumeurs particulièrement similaires aux tumeurs humaines. La validation in vivo de l'efficacité de ces composés pourrait permettre la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le glioblastome.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de mettre en place un modèle animal de glioblastome pertinent et de tester l’efficacité thérapeutique de nouveaux composés anticancéreux. Les retombées de ce projet pourraient permettre de répondre à un besoin médical non pourvu dans le traitement de cette tumeur cérébrale qui n’a pas bénéficié d’innovation thérapeutique depuis 2005.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une électroporation intracérébrale (410 animaux, une seule intervention de 1 minute maximum). L’électroporation du cerveau est une procédure chirurgicale. Elle consiste à modifier des cellules normales du cerveau afin de générer une tumeur. Tous les animaux recevront des injections intraveineuses rétro-orbitaires de composés ou du solvant (410 animaux, intervention de 1 minute maximum, 4 interventions / animal). Tous les animaux seront anesthésiés par hypothermie sur la glace pour la procédure d’électroporation du cerveau (410 animaux, une seule intervention de 15 minutes environ). Tous les animaux seront anesthésiés (anesthésie gazeuse) pour les traitements rétro-orbitaires (410 animaux, intervention de 4 minutes environ, 4 interventions /animal).
Impact sur les animaux
La manipulation, la contention et les injections sont générateurs de stress pour les animaux. Les injections entrainent également une douleur légère de courte durée. La progression tumorale induite par la maladie (glioblastome) provoque à terme une perte d'appétit, donc une malnutrition et finalement une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés dans le cadre des études d'efficacité, ou pour les analyses de marqueurs biologiques.
Remplacement
L'efficacité thérapeutique des composés sur la croissance de tumeurs cérébrales nécessitent une approche expérimentale in vivo. En effet, il n’existe pas à ce jour de système suffisamment robuste pour mimer toute la complexité biologique et physiologique de ces tumeurs. Ce travail sur l'animal vivant s'inscrit dans la continuité d'expériences et de résultats que nous avons obtenus in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux a été estimé en nous appuyant sur notre expérience de plus de 15 ans et sur des tests statistiques appropriés adaptés aux petits échantillons. Cela nous permet de calculer au plus juste le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats reproductibles et statistiquement relevants.
Raffinement
Le bien-être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose, de dômes autoclavables et de morceaux de bois à ronger, dans toutes les cages, au sein d’une animalerie exempte de pathogènes et dont les paramètres physiques et sanitaires sont strictement contrôlés. Les souriceaux d'une portée seront élevés tous ensemble avec leur mère. Au-delà de 3 semaines, les mâles et les femelles seront séparés et placés dans de nouvelles cages (par groupes de 5) avec enrichissement (coton, cylindre en carton…). Ils ne seront jamais isolés. Les animaux seront sous observation quotidienne. L'évaluation clinique sera effectuée au moyen de grilles de scores. En fonction des scores obtenus, des mesures appropriées seront mises en place pour éviter et atténuer leur souffrance.
Choix des espèces
Les données bibliographiques démontrent que le modèle murin est le plus adapté pour aborder les questions relatives aux tumeurs cérébrales. Il a été démontré que le modèle animal de tumeur utilisé ici (obtenu par éléctroporation de nouveaux-nés), était des plus pertinents pour tester l’efficacité thérapeutique de nouveaux médicaments, car il mime les différentes caractéristiques biologiques des tumeurs humaines.
Thérapie génique par AAV pour le traitement du syndrome de l’X fragile
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour amener une thérapie génique vers un essai chez l'humain, 180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, douze étant opérées sans réveil. Elles reçoivent une injection dans le cerveau, sous anesthésie, d'un vecteur viral censé corriger le syndrome de l'X fragile. Le porteur écrit espérer combler le fossé entre sa preuve de concept et l'autorisation d'un essai clinique. Les cerveaux sont prélevés après la mise à mort pour mesurer correction et toxicité.
Objectifs
Le syndrome de l’X fragile est l’une des principales causes de handicap intellectuel héréditaire et de troubles liés à l’autisme. Il concerne environ 1 garçon sur 4 000 et 1 fille sur 8 000 dans le monde. Cette maladie, qui affecte le développement du cerveau, est grave, incurable et nécessite un accompagnement médical et social tout au long de la vie. L’objectif de ce projet est de développer un traitement innovant basé sur la thérapie génique pour le syndrome de l’X fragile. Les chercheurs ont découvert qu’un dysfonctionnement dans la régulation de certains signaux chimiques du cerveau joue un rôle clé dans cette maladie. En ciblant ce mécanisme, il pourrait être possible de corriger certains symptômes. Des études préliminaires sur des souris atteintes d’une forme similaire de la maladie ont montré que ce traitement expérimental, administré directement au cerveau, permettait d’améliorer durablement les symptômes comportementaux et biologiques. Le projet vise maintenant à franchir une étape supplémentaire : adapter ce traitement pour qu’il puisse être testé chez l’humain, en vérifiant son efficacité et sa sécurité. L’objectif final est de proposer une nouvelle approche thérapeutique pour les personnes atteintes du syndrome de l’X fragile.
Bénéfices attendus
Le syndrome de l'X fragile (FXS) est une maladie très invalidante qui touche environ 150 000 personnes en Europe, dont environ 12 000 en France (https://www.xfra.org/). À ce jour, aucune option thérapeutique n'a été validée pour le FXS. En l'absence de traitements efficaces, il existe un besoin important non satisfait de solutions pour cette maladie très invalidante. Le projet vise à trouver un traitement pour le FXS, plus précisément à tester un traitement par thérapie génique dans un modèle préclinique souris de la maladie. Ce projet vise à tester une nouvelle option thérapeutique pour le FXS en ciblant un mécanisme clé dérégulé dans la maladie et en fournissant une alternative avantageuse à la correction du gène FMR1, un gène difficilement exploitable en raison de sa toxicité et de la difficulté à le doser. Nous espérons que ce projet permettra de combler le fossé qui subsiste entre notre preuve de concept initiale d'une approche de thérapie génique dans le modèle murin de la maladie et l'autorisation pour un essai clinique. Nous espérons notamment démontrer la validité préclinique du traitement par vecteur viral (virus adeno-associé) pour corriger les principaux déficits comportementaux du modèle murin FXS en l'administrant de manière efficace et sûre au cerveau de la souris à l'aide d'une voie d'injection applicable à l'homme. À la fin de ce programme, nous espérons proposer une solution prête à être testée sur des modèles animaux plus grands. Les innovations dans le système d'administration développé pour le FXS pourraient être adaptées et utilisées pour d’autres maladies génétiques.
Procédures
225 souris recevront une injection intracérébrale d’un vecteur viral ou d’une solution contrôle saline sous anesthésie générale. La durée des injections sera de 25 minutes pour les injections intra-thalamiques ou intra-striatales et 50 minutes pour les injections intra-striatales et intra-hippocampales combinées. La durée des anesthésies sera de 30 minutes pour les injections intrathalamiques et intra-striatales ou 55 minutes pour les injections intra-striatales et intra-hippocampales combinées.
Impact sur les animaux
Contention de l’animal suivie d’une injection sous la peau avec une seringue, ce qui entraine un stress léger et une douleur légère de courte durée. Lors du réveil en fin de session de chirurgie, les souris peuvent être désorientées et stressées. L’injection intracérébrale d’un vecteur viral (AAV) peut induire une inflammation.
Devenir
Afin de caractériser l'effet de nos traitements; notamment l'effet biologique, nous devons récupérer en fin d'expérience les cerveaux des animaux traités et non traités. Nous devons pour cela procéder a euthanasie de l’ensemble des animaux du projet. L'étude moléculaire des tissus, est indispensable pour évaluer les effets de correction neurologique mais également la toxicité des traitements testés.
Remplacement
Un modèle d'organoïde humain de cerveau antérieur existe pour le syndrome de l'X fragile et le présent projet comporte d’ailleurs une partie où ce modèle sera utilisé en collaboration. Cependant l’utilisation de ce modèle est limité et ne permet pas actuellement d’investiguer les aspects neurologiques complexes (déficience intellectuelle, troubles du comportement) sur lesquelles une action du traitement est recherchée. Le modèle organoïde humain est cependant utilisé en complément du modèle souris pour valider les aspects de correction moléculaire et electrophysiologique dans un modèle humain, permettant ainsi de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés (altérations comportementales du modèle et leur correction par un traitement de thérapie génique aux AAV). Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d'animaux nécessaire en utilisant nos données préliminaires.
Raffinement
Pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Afin de diminuer l'effort en convalescence, de la nourriture gelifiée est placée dans les cages pendant 48h. Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état clinique des souris utilisées sera assurée pour décider l'arrêt des expériences avec l’utilisation de points limites adaptés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est oriente vers la souris car c’est le modèle actuellement le mieux validé et le plus robuste pour tester un nouveau traitement visant une correction comportementale. Les animaux, âgés de 5 semaines, seront utilisés pour réaliser la procédure d’injection car ils correspondent au stade enfant/jeune adolescent humain visé par la preuve de concept de ce projet de thérapie génique. Après 4 semaines, correspondant au temps nécessaire à l’action du virus AAV les animaux seront soumis à des batteries de tests comportementaux pendant 2 semaines. Une proportion des animaux (n=10 par cohorte) sera conservée pour surveiller le comportement normal des animaux 2 mois après le début du traitement, pour démontrer l’innocuité du traitement à long terme, puis seront euthanasiés pour réaliser les prélèvements de tissus nécessaires à des analyses moléculaires et cellulaires.
Mise en place d’une méthode alternative pour le suivi longitudinal du passage d’anticorps dans le cerveau, visant à réduire l’utilisation de souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Opérées puis soumises à cent minutes de tests d'activité locomotrice, 88 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une puce mesure leur température pour suivre le passage d'anticorps vers le cerveau. Le projet s'intitule mise en place d'une méthode alternative pour réduire l'utilisation de souris, et annonce jusqu'à 80 % d'animaux en moins que les méthodes classiques. Il tue malgré tout 88 souris, dont les ovaires et le cerveau sont prélevés, et sert de base à un projet plus large.
Objectifs
Dans cette étude pilote, nous voulons savoir si les anticorps que nous développons peuvent atteindre leur cible dans le cerveau chez la souris. L’objectif est de mettre en place une méthode alternative qui permet de suivre en temps réel le passage de ces anticorps grâce à une puce mesurant la température sur plusieurs heures, sans devoir sacrifier des animaux à chaque mesure. Cette étude permettra de tester si la technique fonctionne, quel anticorps est le plus efficace, quelle dose utiliser et quelle voie d’administration est la meilleure.
Bénéfices attendus
Le bénéfice de cette étude pilote est de mettre en place une nouvelle méthode qui réduit le nombre d’animaux utilisés tout en permettant de mesurer plus efficacement si les anticorps atteignent le cerveau. Cette étude servira de base pour un projet plus large visant à montrer les effets bénéfiques de ces anticorps sur les troubles du spectre autistique et la maladie d’Alzheimer.
Procédures
Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale (une fois, 15 minutes par animal) et effectueront des tests de comportement (100 minutes par animal) pour mesurer leur activité locomotrice. Une administration (1 min) sera réalisée. Les animaux recevront une dose d’antalgiques et d’anesthésiques (1 min) avant leur mise à mort.
Impact sur les animaux
La contention, l’injection des anticorps et le test de comportement peuvent entraîner un léger stress pour l’animal. Les souris seront soumises à des procédures chirurgicales pouvant entraîner une diminution transitoire de leur bien-être et, très rarement, des infections.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés et les organes prélevés pour l’étude directement (ovaires) mais aussi pour des études ultérieures (cerveau).
Remplacement
Les anticorps sont d’abord développés et testés sur des cellules en laboratoire. Seuls les 5 plus prometteurs seront évalués dans cette étude pilote chez la souris. Il n’existe pas de méthode alternative pour mettre en place cette technique, car elle nécessite un organisme vivant entier, depuis l’injection des anticorps jusqu’à l’observation de leurs effets sur la température, afin de démontrer leur passage dans le cerveau.
Réduction
Cette étude pilote consiste justement à mettre en place une méthode alternative pour réduire le nombre d’animaux utilisés (jusqu’à 80 %) par rapport aux méthodes classiques. Nous avons optimisé le nombre d’animaux pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement valides.
Raffinement
L’environnement des souris est enrichi et renouvelé régulièrement pour optimiser le maintien de leur chaleur corporelle et de leur bien-être. Les injections et les tests de comportement seront réalisés dans une pièce calme et faiblement éclairée, et seront les plus brefs possibles afin de minimiser l’inconfort et l’anxiété des animaux. De plus, les animaux seront habitués à cette pièce et au contact des expérimentateurs, notamment afin de vérifier leur état de santé. Les souris soumises aux procédures chirurgicales seront traitées avec des antidouleurs jusqu’à leur rétablissement pour limiter leur douleur et, comme pour tout changement chez un animal, feront l’objet d’une surveillance renforcée. Des points limites adaptés à chaque procédure ont été mis en place et seront appliqués.
Choix des espèces
Les souris sont de petits animaux sociaux, et dont les comportements sont proches de ceux de l’homme. Notre but est d’étudier les effets bénéfiques des anticorps dans les modèles de souris des troubles autistiques et la maladie d’Alzheimer, qui impactent fortement la qualité de vie chez l’homme. À l’heure actuelle, les quantités d’anticorps produites dans notre laboratoire sont compatibles avec une utilisation chez la souris adulte âgée de 2 mois, ayant un cerveau mature.
Role postnatal de Usp28 dans les muscles squelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Pour savoir si un gène répare les micro-lésions du muscle adulte, 96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le gène est éteint par un vecteur viral injecté sous anesthésie, puis les souris sont poussées à courir sur un tapis incliné jusqu'à soixante minutes d'effort intense provoquant des lésions musculaires, avec des stimulations pour les relancer si elles s'arrêtent. Chez chaque souris, une patte part en histologie et l'autre en biochimie, et toutes sont tuées pour prélever les muscles. Les applications annoncées, mieux soigner les blessures sportives ou la faiblesse liée à l'âge, sont repoussées au long terme.
Objectifs
Les muscles squelettiques nous permettent de bouger, respirer et maintenir notre posture. Ils contiennent des unités contractiles appelées sarcomères, qui génèrent la force nécessaire au mouvement. Lors d’activités normales ou d’exercice, ces sarcomères peuvent être endommagés. En général, le muscle répare rapidement ces micro-lésions pour maintenir sa force. Si ce processus de réparation échoue, cela peut entraîner une faiblesse musculaire, une mobilité réduite et un risque accru de blessures. Nous avons précédemment identifié un gène d’intérêt comme un régulateur potentiel de ce mécanisme de réparation. Les souris dépourvues de ce gène dès la naissance présentent des muscles plus faibles et davantage de dommages après l’exercice, mais nous ne savons pas si cela est dû à des effets développementaux ou à un rôle direct dans la réparation du muscle adulte. Pour répondre à cette question, nous allons supprimer ce gène spécifiquement dans les myofibres adultes en utilisant un vecteur viral inoffensif. Nous évaluerons ensuite la capacité de ces muscles à se réparer après un exercice contrôlé. Cela nous permettra de déterminer si notre gène d’intérêt joue un rôle direct dans la réparation des dommages aux sarcomères.
Bénéfices attendus
Cette étude fournira des informations importantes sur la manière dont les muscles squelettiques adultes maintiennent leur structure et leur fonction sous stress mécanique. En clarifiant le rôle de notre gène d’intérêt dans la réparation des sarcomères, nous visons à identifier les mécanismes moléculaires qui soutiennent l’entretien normal du muscle. À long terme, ces connaissances pourraient informer des stratégies pour améliorer la réparation musculaire chez les personnes souffrant de blessures sportives, de maladies musculaires ou de faiblesse musculaire liée à l’âge. Améliorer la capacité de réparation des muscles pourrait contribuer à une meilleure mobilité, une récupération plus rapide et une qualité de vie améliorée.
Procédures
Injection d’analgésique, d’anesthésique et d'antidote à l'anesthésique: ces injections sont très rapides, elles ne durent que quelques secondes chacune. Injection d’un vecteur viral chez des souris âgées d’au moins 10 semaines : Les injections seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie afin de minimiser l’inconfort. L’injection est rapide, elle ne dure pas plus de 30 secondes. Protocole d’exercice excentrique: Le programme d’exercice réalisé par les animaux est un modèle d’activité physique intense. Il s’agit d’une procédure qui induit des lésions musculaires pouvant provoquer un niveau d’inconfort musculaire important passager. Cet exercice est réalisé une seule fois, il comprend 3 jours de 15 à 20 min de course d’habituation sur tapis roulant légèrement incliné suivi d’un jour de course de 60 min maximum comparable à un exercice physique intense. L’animal reçoit des stimulations légères et brèves pour le motiver à courir s’il s’arrête. Si l’animal ne court pas pendant plus de 5 secondes le test est arrêté.
Impact sur les animaux
Les souris déficientes pour le gène d'interêt dans les muscles (mutant injecté avec le vecteur viral) devraient être en bonne santé et ne devraient pas présenter de phénotype visuellement apparent. Toutefois, d’après nos études précédentes, elles peuvent présenter une légère faiblesse musculaire et une susceptibilité accrue aux dommages induits par l’exercice. Néanmoins, ces effets n’entraînent pas de détresse significative ni d’altération des fonctions de base. Les injections intramusculaires de vecteurs viraux seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie afin de minimiser l’inconfort et un antidote à l'anesthésique sera administré pour accélerer et améliorer le reveil. Cette procédure peut provoquer une douleur locale légère et transitoire au site d’injection. Le protocole d’exercice excentrique induit des dommages modérés aux sarcomères physiologiques, pouvant entraîner une gêne musculaire temporaire, sans provoquer de détresse durable.
Devenir
Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d'animaux utilisés, nous collecterons les biopsies musculaires de tous les animaux à la fin de chaque procédure. Par conséquent, nous ne réutiliserons pas, ne remplaçons pas et ne ferons pas adopter les animaux.
Remplacement
Les mécanismes de dommage et de réparation des sarcomères impliquent des forces mécaniques complexes ainsi que des réponses coordonnées des myofibres pleinement développées. Ces processus ne peuvent pas être reproduits in vitro à l’aide de cellules musculaires en culture, qui ne possèdent pas une organisation sarcomérique mature, ni modélisés de manière fiable in silico. Par conséquent, des études in vivo chez la souris adulte sont indispensables pour atteindre les objectifs de recherche de ce projet.
Réduction
L’injection intramusculaire de vecteur viral permet d’induire la délétion génique chez les souris adultes, évitant ainsi la nécessité de croiser des lignées mutantes supplémentaires et réduisant considérablement le nombre total d’animaux utilisés. Les deux membres d’une même souris seront utilisés pour différentes analyses (un muscle pour l’histologie et le controlatéral pour un test biochimique) afin de maximiser les données obtenues à partir de chaque animal. Nous utiliserons des groupes composés de 8 femelles et 8 mâles, ce nombre d’animaux (n = 8) est fondé sur des expériences antérieures ayant démontré une puissance statistique suffisante pour détecter des différences physiologiques dans les processus de lésion et de réparation musculaires. Nous utiliserons 6 groupes de 16 individus (8 mâles et 8 femelles) par groupe soit un total de 96 souris comprenant les animaux contrôles et les expérimentaux (traités avec un vecteur viral vide ou traités avec le vecteur expérimental), 2 points temporelles après exercice ainsi que des animaux sans exercice. Les resultats seront analysés en utilisant les statistiques appropriées.
Raffinement
Les souris sont hébergées dans des conditions réglementaires, conformes à la réglementation en vigueur relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. Les injections intramusculaires seront effectuées sous anesthésie générale et analgésie. La profondeur de l’anesthésie sera contrôlée par l’absence du réflexe en pinçant des orteils. Les souris seront placées sur un tapis chauffant pendant la phase de réveil, et leurs yeux seront protégés à l’aide d’un gel ophtalmique. Un antidote à l'anesthésie sera administré pour accéler et améliorer le reveil. Une surveillance post-injection sera effectuée quotidiennement pendant les 3 premiers jours, puis 2 à 3 fois par semaine par la suite. La surveillance comprend l’observation de l’état de santé général (motricité, apathie, aspect du pelage, aspect physique, vigilance, interaction sociale, toilettage). Le niveau de douleur sera évalué grâce à la fiche d'évaluation de la douleur fournie en annexe. Les manipulations seront réalisées à l’aide de tunnels afin de réduire le stress, et du matériel de nidification sera fourni pour l’enrichissement environnemental. L’exercice excentrique devrait provoquer uniquement un inconfort léger et transitoire. Les souris seront étroitement surveillées après la séance d’exercice pour détecter toute démarche anormale, boiterie ou réduction de l’activité. En cas de douleur de niveau 1 (légère boiterie), d'un anti-inflammatoire sera administré une fois par jour. Pour une douleur de niveau 2 (altération marquée de la mobilité), la dose d'anti-infammatoire sera augmentée. En cas de douleur de niveau 3 ou de détresse sévère, les animaux recevront une injection combinée d'anti-inflammatoire et d'analgésique et si leur état dne s'améliore pas sous 48h, alors ils seront immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Les souris constituent le modèle le plus approprié pour ce projet. Nos études précédentes sur notre gène d'interêt ont été réalisées chez la souris, fournissant une base de référence bien définie pour l’interprétation des phénotypes. Les outils génétiques utilisés dans cette étude, notamment la lignée mutante d'interêt et les vecteurs viraux utilisés, sont déjà établis et optimisés chez cette espèce. De plus, la physiologie du muscle squelettique de la souris est bien caractérisée et présente de fortes similitudes structurelles et fonctionnelles avec celle du muscle humain, ce qui en fait un modèle largement reconnu pour l’étude de la réparation des sarcomères et de la biologie musculaire. L’utilisation de la souris permet de combiner une manipulation génétique précise avec des analyses physiologiques et éthiquement maîtrisable. Toutes les injections seront effectuées sur des souris mutantes âgées de 10 à 12 semaines, correspondant à l’âge adulte. À ce stade, les muscles squelettiques sont pleinement développés et physiologiquement stables, ce qui permet d’étudier la réparation des sarcomères dans un contexte mature, plutôt que pendant la croissance développementale. L’utilisation d’animaux adultes garantit également une anesthésie sûre et efficace et réduit la variabilité de l’efficacité de la transduction virale, puisque des titres de vecteurs viraux plus faibles sont suffisants à cet âge. De plus, cette tranche d’âge est cohérente avec les études précédentes, permettant une comparaison directe des résultats avec les données de référence existantes.
Greffes de hépatocytes primaires murins ou humains dans le foie afin de corriger un phénotype et de raffiner le processus d’humanisation
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Rendues immunodéficientes pour éviter le rejet des greffes, 933 souris vont être utilisées pour fabriquer un foie partiellement humanisé, dans des procédures d'un niveau de souffrance allant de léger à sévère, toutes tuées à l'issue. Les nouveau-nés reçoivent une injection de cellules hépatiques dans le foie, après tatouage d'un orteil et biopsie d'oreille pour le génotypage. Les animaux sont tués entre quatre et six mois pour prélever sang et organes, ceux gardés pour la reproduction étant tués plus tard, en fin de période reproductive. Le porteur reconnaît l'existence de modèles in vitro, mais les juge insuffisants pour reproduire un foie humain fonctionnel.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de développer une souris dont une partie des cellules du foie est remplacée par des cellules humaines. Ce type de modèle est essentiel pour mieux comprendre certaines maladies du foie qui ne peuvent pas être correctement étudiées sur des souris normales, comme les infections par certains virus, des maladies métaboliques ou encore des troubles touchant spécifiquement les cellules du foie. Cette souris permettra aussi de mieux évaluer comment des traitements ou des médicaments sont transformés par un foie fonctionnant de façon proche de celui de l’être humain. Pour rendre cette humanisation possible, une lignée de souris a été développée afin de créer, à un moment précis, un espace dans le foie permettant l’implantation de cellules humaines. Cependant, chez les animaux homozygotes (portant cette modification génétique sur les deux chromosomes), ce mécanisme se déclenche trop tôt, entraînant une dégradation du foie qui cause leur mortalité avant l’âge de 4 semaines. Actuellement, seules les souris hétérozygotes (qui portent cette modification génétique seulement sur un chromosome), qui sont en bonne santé, peuvent être utilisées. Pour produire ces animaux, un schéma d’élevage hétérozygote × souris « sans modification » est utilisé, ce qui génère des portées contenant environ 50 % de souris sans modification qui ne peuvent pas être utilisées pour l’humanisation du foie et sont ensuite mises à mort. Le projet vise à corriger le problème observé chez les animaux homozygotes en greffant des cellules de foie saines chez les nouveau nés, afin de rétablir un foie fonctionnel et de permettre à ces animaux fragiles de rester en bonne santé. S’ils survivent et se reproduisent normalement, ils pourraient remplacer les schémas d’élevage actuels et éviter la production de souris sans modification et non utilisables. Si la greffe réalisée chez les nouveau nés fonctionne, le projet examinera également si la greffe des cellules humaines peut être faites à cet âge. Cette approche serait une avancée importante, car elle remplacerait des méthodes plus lourdes appliquées chez l’adulte par une procédure simple et peu invasive pratiquée chez le nouveau né. À terme, ce travail permettra de créer un modèle plus fiable pour la recherche, tout en améliorant le bien être animal et en réduisant le nombre total de souris nécessaires.
Bénéfices attendus
Le développement d’une souris possédant un foie partiellement humain permettra d’étudier un large ensemble de maladies du foie qui ne peuvent pas être correctement reproduites chez les souris normales. Ce modèle pourra notamment servir à mieux comprendre les infections provoquées par certains virus qui n’infectent que les cellules humaines du foie, mais aussi des maladies métaboliques comme celles impliquées dans l’accumulation de graisses dans le foie, ou encore des atteintes chroniques touchant le fonctionnement global de cet organe. Un tel modèle est également utilisé pour étudier comment les médicaments sont transformés dans le corps humain, car le foie joue un rôle central dans l’élimination et la détoxification de nombreuses substances. Si ce projet donne les résultats espérés, il permettra d’améliorer la manière dont les souris sont élevées pour produire le modèle au foie humanisé. Aujourd’hui, suite schéma d’élevage hétérozygote × sans modification, une partie importante des souris nées sont des animaux non-modifiés, qui ne peuvent pas être utilisée et sont ensuite mises à mort. En rendant possible l’utilisation d’animaux homozygotes qui jusque là ne survivaient pas, le projet réduirait fortement ce nombre et rendrait l’élevage beaucoup plus efficace et respectueux des animaux. Le projet pourrait aussi remplacer certaines étapes plus lourdes du processus d’humanisation actuellement réalisées chez l’adulte par des procédures plus simples et moins invasives chez le nouveau né. Cela améliorerait considérablement les conditions de travail avec ces animaux et diminuerait l’inconfort lié aux traitements ou aux interventions nécessaires. Ainsi, ce projet présente à la fois un intérêt scientifique — en permettant de mieux étudier des maladies humaines du foie — et un intérêt éthique, puisqu’il contribue à réduire le nombre d’animaux utilisés et à rendre les procédures plus respectueuses de leur bien être.
Procédures
IDENTIFICATION ET GENOTYPAGE : Les souriceaux reçoivent un tatouage d’orteil pour leur identification individuelle. Une biopsie d’oreille est prélevée au même moment afin de permettre le génotypage. L’ensemble de la manipulation dure généralement entre 30 et 90 secondes. Dans de rares cas, un second prélèvement auriculaire peut être nécessaire si l’échantillon initial n’est pas exploitable. GREFFES DE CELLULES HEPATIQUES : Les greffes consistent en une unique injection intrahépatique transcutanée réalisée chez les nouveau nés. Cette intervention ne prend que quelques secondes et n’entraîne qu’une douleur minimale. Chez certaines souris hétérozygotes, des injections additionnelles d’un composé destiné à faciliter la reconstitution du foie peuvent être réalisées une fois les animaux sevrés. Chaque injection dure quelques secondes et provoque une gêne très limitée. Au maximum, une injection hebdomadaire est prévue, correspondant à un maximum de 14 injections si l’animal est suivi jusqu’à l’âge de 4 mois. PRELEVEMENTS SANGUINS : Chez les animaux greffés avec des cellules de foie humain, des prélèvements de sang peuvent être réalisés afin de suivre la progression de la reconstitution hépatique. Dans ce cas, 1 à 2 prélèvements par mois sont effectués, pour un maximum de 9 prélèvements par animal. Afin de réduire le stress et la douleur, tous les prélèvements sont réalisés sous anesthésie gazeuse. Les prélèvements durent quelques secondes, mais l’animal reste anesthésié pendant environ 5 à 10 minutes.
Impact sur les animaux
TRANSPORT : Les animaux sont transportés depuis un éleveur professionnel jusqu’à notre site. Bien que le trajet soit court, il peut provoquer un stress transitoire lié aux manipulations et au changement d’environnement. IMMUNODÉFICIENCE : Afin d’éviter le rejet des greffes de cellules de foie, les souris utilisées sont immunodéficientes, ce qui les rend particulièrement sensibles aux infections. Maintenues en conditions sanitaires strictes, elles restent cependant en bon état de santé. PHÉNOTYPE CHEZ DES HOMOZYGOTES : Avant que les cellules hépatiques saines ne recolonisent complètement le foie, les souriceaux homozygotes peuvent présenter des signes rappelant une insuffisance hépatique, tels qu’un retard de croissance, une baisse d’activité, une coloration cutanée altérée, une hypothermie ou un mauvais état général. Ces manifestations sont temporaires et diminuent à mesure que les cellules greffées prennent le relais. IDENTIFICATION ET GÉNOTYPAGE : À cet âge précoce, le tatouage des orteils et la biopsie auriculaire entraînent une douleur légère et brève. La principale nuisance est liée à la manipulation des animaux et à leur séparation momentanée de leur mère. INJECTION DE CELLULES HÉPATIQUES : Les cellules injectées ne provoquent aucune irritation ou toxicité. La seule nuisance associée à l’intervention est la douleur brève causée par l’insertion de l’aiguille lors de l’injection intra hépatique. INJECTION D’UN COMPOSÉ CHEZ LES HÉTÉROZYGOTES : Le composé administré à certaines souris hétérozygotes pour favoriser la recolonisation du foie peut entraîner une atteinte hépatique très légère et temporaire. Cela peut se traduire par une diminution transitoire de l’activité, un appétit réduit ou une hypothermie modérée. L’injection elle même provoque une douleur minime et de courte durée. PRÉLÈVEMENTS SANGUINS : Les prélèvements sanguins peuvent causer une douleur légère au site de ponction. Cette nuisance est fortement réduite puisqu’ils sont réalisés sous anesthésie, ce qui limite le stress et la gêne. STRESS : Toutes les interventions nécessitant une manipulation des animaux peuvent entraîner un stress temporaire, lié au contact, au changement d’environnement immédiat ou à la séparation brève d’avec leur groupe ou leur mère.
Devenir
Les animaux sont mis à mort lorsqu’ils atteignent un point limite, ou à la fin de la procédure, afin de permettre un prélévement de sang ou des organes pour effectuer des analyses plus approfondies. Selon la procédure concernée, cette étape se situe entre 4 et 6 mois d’âge. Les animaux destinés à l’élevage sont maintenus plus longtemps et mis à mort uniquement à la fin de leur période reproductive, soit vers 6 mois.
Remplacement
Le projet présenté s’inscrit dans un programme visant à développer une souris à foie humanisé, utilisée pour l’étude de nombreuses pathologies du foie humain, notamment les infections par des virus hépatotropes, les maladies métaboliques, la toxicité hépatique et le métabolisme des médicaments. Des modèles in vitro existent, comme les lignées cellulaires humaines, les hépatocytes primaires, les sphéroïdes 3D ou les systèmes « organ‑on‑a‑chip ». Bien que précieux pour les études mécanistiques, ces outils ne permettent pas de reproduire l’organisation d’un foie dans un organisme entier, ni ses interactions avec la circulation sanguine, le système immunitaire ou les autres organes. Pour les recherches nécessitant une physiologie systémique, un modèle murin partiellement humanisé reste donc indispensable. Le projet vise à corriger le phénotype létal observé chez les souris homozygotes afin qu’elles puissent être utilisées dans l’humanisation du foie et pour affiner le processus d’humanisation. Dans ce contexte, aucune alternative non animale ne peut être utilisée. Toutefois, ce projet contribue directement à la réduction du nombre d’animaux nécessaires au modèle final et à un raffinement du processus d’humanisation, comme décrit ci‑après.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été limité au strict minimum compatible avec une analyse fiable, tout en incluant des animaux des deux sexes afin de garantir la pertinence biologique des résultats. La stratégie expérimentale repose d’abord sur une étude pilote. Les études suivantes ne sont réalisées qu’en cas de succès de cette phase pilote, ce qui évite d’utiliser des animaux dans des approches qui ne seraient pas scientifiquement justifiées. De plus, la restauration de la fertilité des homozygotes constituerait un levier majeur de réduction. Le fait de pouvoir remplacer le schéma d’élevage actuel, basé sur l’accouplement de souris hétérozygotes et non-modifiées — lequel génère environ 50 % d’animaux sans modification et non utilisables et ensuite mis à mort — par un accouplement homozygote × homozygote, dont 100 % de la descendance serait utilisable, réduirait fortement le nombre d’animaux produits. Cette diminution concernerait non seulement ce projet, mais également l’ensemble du programme visant à développer le modèle murin à foie humanisé.
Raffinement
IMMUNODÉFICIENCE ET HÉBERGEMENT : En raison de leur sensibilité accrue aux infections, les souris sont hébergées et manipulées en permanence sous des conditions sanitaires strictes. Elles sont maintenues en groupes sociaux stables dans des cages transparentes et enrichies et disposent d’un accès ad libitum à l’eau et à une alimentation adaptée. Ces conditions visent à réduire le stress, minimiser les risques sanitaires et maintenir un bon état général. PHÉNOTYPE HÉPATIQUE : Un suivi clinique quotidien permet de détecter rapidement les animaux atteignant un point limite. En cas d’hypothermie, des tapis chauffants sont utilisés. Après sevrage, une alimentation enrichie, complétée par de l’hydrogel si nécessaire, favorise la récupération des animaux présentant une atteinte hépatique. MANIPULATION DES NOUVEAU NÉS : Les manipulations sont effectuées rapidement pour réduire la séparation de leur mère. Les gants des techniciens sont frottés avec de la litière de la cage afin de préserver l’odeur familière et limiter le stress. Les souriceaux sont toujours manipulés sur une couche de litière pour éviter l’hypothermie. Les injections sont réalisées avec des aiguilles la plus fines possible et des volumes minimaux. Le tatouage et la biopsie auriculaire sont pratiqués à un âge où les procédures sont peu douloureuse et le saignement est faible voire absent. PRÉLÈVEMENTS SANGUINS : Les prélèvements sanguins sont réalisés exclusivement sous anesthésie gazeuse afin de limiter la douleur et le stress. Ils sont limités au strict nécessaire et respectent les seuils éthiques internes, avec des périodes de récupération appropriées. Les sites de ponction sont alternés pour éviter les irritations ou lésions cutanées liées à des prélèvements répétés.
Choix des espèces
La souris est l’espèce de référence pour le développement de modèles humanisés, car sa petite taille, sa facilité de manipulation et la disponibilité de nombreuses lignées génétiquement modifiées permettent d’obtenir des modèles fiables et reproductibles. Les souris immunodéficientes sont aujourd’hui indispensables pour l’humanisation du foie, car elles permettent la greffe durable de cellules humaines et offrent un système pertinent pour l’étude de maladies du foie, des infections ciblant les cellules hépatiques, ainsi que du métabolisme et de la toxicité de nombreux médicaments. Dans ce projet, les interventions sont réalisées au stade nouveau né (3 à 8 jours). Ce choix est essentiel pour prévenir l’apparition du phénotype létal observé vers l’âge de quatre semaines chez les animaux homozygotes, et pour permettre une reconstitution précoce du foie avant que la dégradation hépatique ne soit trop avancée. Ce même stade d’âge est déjà utilisé avec succès pour d’autres modèles humanisés, car les nouveau nés tolèrent très bien les greffes de cellules et récupèrent rapidement. Une fois la greffe effectuée, les animaux sont suivis jusqu’à l’âge adulte afin de vérifier la stabilité de la reconstitution hépatique et d’évaluer leur capacité reproductive. Les animaux greffés et en bon état général peuvent être maintenus jusqu’à environ 180 jours, ce qui permet d’observer le fonctionnement du foie reconstruit sur le long terme et de déterminer s’ils peuvent être utilisés pour l’élevage et la production du modèle final.
Restauration des fonctions effectrices des lymphocytes T CD8 épuisés par modulation épigénétique dans les infections virales chroniques (LCMV) et le carcinome hépatocellulaire (CHC)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Réparties entre un modèle d'infection virale chronique et un modèle de cancer du foie, 4 660 souris vont être utilisées pour étudier l'épuisement des lymphocytes T, 2 950 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 1 710 sévère, toutes tuées à l'issue. Chaque animal ne subit qu'une procédure, entre transfert de cellules, infection virale, immunothérapie et croissance tumorale, avec des atteintes de l'état général et une gêne progressive selon la localisation de la tumeur. Les animaux atteignant les points limites, comme ceux qui guérissent, sont tués pour prélever organes et sang. Le porteur écarte cultures cellulaires et modèles informatiques, jugés incapables de reproduire un "organisme entier".
Objectifs
Ce projet vise à améliorer la compréhension fondamentale de l’immunité T CD8 en contexte de pathologie chronique et à identifier de nouvelles stratégies pour renforcer l’efficacité des immunothérapies, afin d’en faire bénéficier un plus large spectre de patients.Ce projet vise à mieux comprendre pourquoi certaines cellules du système immunitaire deviennent moins efficaces lors de maladies chroniques comme le cancer ou certaines infections virales persistantes. En temps normal, ces cellules permettent de combattre les cellules tumorales ou infectées. Cependant, lorsqu’elles sont stimulées trop longtemps, elles s’épuisent et perdent leur capacité à agir efficacement. L’objectif est d’identifier les mécanismes internes qui contrôlent cet épuisement, en particulier le rôle de certaines protéines qui régulent l’activité des cellules. Le projet vise également à tester si un médicament récent, seul ou en combinaison avec des traitements d’immunothérapie déjà utilisés chez les patients, permet de restaurer l’activité de ces cellules immunitaires. L’objectif général est de déterminer comment les facteurs de transcription et régulateurs épigénétiques de la famille IKZF contrôlent la différenciation, la fonction et la plasticité des lymphocytes T CD8 PD-1⁺ épuisés au cours d’une stimulation antigénique persistante , telle qu’observée dans les infections virales chroniques et le cancer. Nous chercherons également à évaluer l’efficacité antitumorale de la modulation pharmacologique de ces facteurs (iberdomide ), utilisée seule ou en association avec des immunothérapies actuellement employées en clinique (anti-PD-L1 et/ou anti-CTLA-4 ).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’améliorer les connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire dans les maladies chroniques. À court terme, il contribuera à mieux comprendre pourquoi certaines immunothérapies, pourtant très prometteuses, ne sont efficaces que chez une minorité de patients. À plus long terme, ces travaux pourraient aider à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à rendre les traitements anticancéreux plus efficaces, en réactivant les défenses naturelles de l’organisme. Les résultats pourraient bénéficier à des patients atteints de cancers, notamment du foie, mais aussi potentiellement à d’autres maladies où le système immunitaire est affaibli. Enfin, ce projet permettra d’évaluer un médicament actuellement en cours d’étude chez l’homme, ce qui pourrait faciliter le développement de nouvelles approches thérapeutiques combinées. Même en cas de résultats négatifs, les connaissances acquises seront utiles pour orienter les recherches futures.
Procédures
Chaque animal ne participe qu’à UNE seule procédure. Les animaux recevant un transfert adoptif ne reçoivent pas de modulateur pharmacologique, et inversement. Procédure 1 – Modèle d’infection virale Procédure Voie État de l’animal Fréquence Durée du geste Transfert adoptif de cellules intraveineuse Vigile, contention en tube 1 seule fois ~1 min Infection virale intraveineuse Vigile, contention en tube 1 seule fois ~1 min Prélèvement sanguin Sous-mandibulaire Vigile 100 µL/semaine ou 150 µL/2 semaines ~30 sec Immunothérapie intrapéritonéale Vigile 2×/semaine pendant 2 semaines ~30 sec Déplétion de cellules intrapéritonéale Vigile 1 injection avant infection ~30 sec Modulateur pharmacologique Per os Vigile 1× tous les 2 jours pendant 2 semaines ~1 min Procédure 2 – Modèle de carcinome hépatocellulaire autochtone Procédure Voie État de l’animal Fréquence Durée du geste Transfert adoptif de cellules intraveineuse Vigile, contention en tube 1 seule fois ~1 min Injection hydrodynamique intraveineuse Vigile, contention en tube 1 seule fois ~2 min Imagerie tumorale luciférine intrapéritonéale + anesthésie gazeuse Anesthésié 2× (immunophénotypage) ou 1×/semaine × 3 semaines (thérapie) ~5 min Immunothérapies intrapéritonéale Vigile 2×/semaine pendant 2 semaines ~30 sec Déplétion de cellules intrapéritonéale Vigile 1 injection avant injection hydrodynamique ~30 sec Modulateur pharmacologique Per os Vigile 1× tous les 2 jours pendant 2 semaines ~1 min
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales incluront principalement des injections (cellules, virus, plasmides, traitements), des prélèvements sanguins et le suivi de maladies expérimentales (infection chronique ou croissance tumorale). Les animaux infectés de manière chronique peuvent présenter une altération modérée et transitoire de l’état général durant la phase aiguë de l’infection (5-15 jours après le début de l’infection), incluant une perte de poids, une fatigue ou une légère diminution de l’activité. Dans les modèles tumoraux, la croissance de la tumeur peut entraîner une gêne progressive en fin d’expérience. Des points limites précoces et stricts seront appliqués afin d’éviter toute souffrance prolongée. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel formé, et tout animal présentant des signes de détresse, de perte de poids excessive ou d’altération marquée de l’état général sera euthanasié immédiatement.
Devenir
Dans ce projet, deux axes de travail sont prévus. Le premier axe vise la caractérisation fonctionnelle des cellules T CD8 ainsi que leur sensibilité à l’immunothérapie. Les animaux utilisés dans ce cadre seront tous euthanasiés au point d’analyse défini expérimentalement. Dans les approches évaluant l’efficacité thérapeutique, les animaux atteignant les points limites en lien avec la pathologie seront euthanasiés comme précédemment décrit. Les animaux présentant une guérison à long terme seront également euthanasiés, et des prélèvements d’organes et de sang seront réalisés afin d’évaluer la mémoire immunitaire antitumorale.
Remplacement
Les objectifs de ce projet nécessitent l’étude du système immunitaire dans un organisme entier, car ils reposent sur des interactions complexes entre différents types de cellules et les tissus. À ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives (comme des cultures de cellules en laboratoire ou des modèles informatiques) capables de reproduire fidèlement ces phénomènes observés dans les maladies chroniques. Cependant, des approches alternatives sont utilisées dès que possible afin de limiter le recours aux animaux. Par exemple, certaines manipulations sont réalisées sur des cellules en dehors de l’organisme, ce qui évite la création de modèles animaux supplémentaires. De plus, des analyses approfondies sont effectuées sur les cellules prélevées, permettant d’obtenir un maximum d’informations à partir de chaque animal. Enfin, des études préliminaires sont menées sur un nombre limité d’animaux afin d’optimiser les conditions expérimentales avant la réalisation des expériences principales.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est strictement déterminé afin d’obtenir des résultats fiables tout en évitant toute utilisation excessive. Plusieurs stratégies sont mises en place pour réduire ce nombre. Tout d’abord, certains modèles expérimentaux présentant moins de variabilité sont privilégiés, ce qui permet de travailler avec des groupes plus petits. Ces modèles sont utilisés pour identifier les approches les plus prometteuses, qui seules seront ensuite étudiées plus en détail. Ensuite, différentes conditions expérimentales peuvent être comparées au sein d’un même animal, ce qui limite le nombre total nécessaire. Enfin, plusieurs types d’analyses sont réalisés à partir des mêmes animaux (différents organes et paramètres biologiques), ce qui permet de maximiser les informations obtenues et d’éviter l’utilisation de cohortes supplémentaires.
Raffinement
Toutes les procédures sont conçues afin de limiter au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux. Les gestes expérimentaux sont réalisés par du personnel formé et expérimenté, en utilisant du matériel adapté et des volumes conformes aux recommandations en vigueur. Les prélèvements sanguins respectent les limites réglementaires en termes de volume et de fréquence, et privilégient des techniques les moins invasives possibles. Les conditions d’hébergement sont adaptées aux besoins physiologiques et comportementaux des animaux : hébergement en groupes sociaux compatibles avec le protocole, enrichissement du milieu, et accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. Les animaux sont progressivement habitués aux techniques de préhension afin de réduire le stress lié aux manipulations. Un suivi clinique rigoureux est mis en place. Les animaux sont observés quotidiennement par le personnel animalier. Ils sont examinés au minimum trois fois par semaine par les techniciens impliqués dans l’étude, et de manière quotidienne si une variable de la grille des points limites indique une possible dégradation de l’état de l’animal (perte de poids, modification du comportement, altération de l’état général). Une attention particulière est portée au poids, à l’aspect du pelage, à la posture, à l’activité et au comportement alimentaire. Des points limites précoces sont définis (perte de poids significative, altération de l’état général, signes cliniques sévères) et conduisent, si nécessaire, à une euthanasie immédiate afin d’éviter toute souffrance prolongée. L’ensemble de ces mesures garantit que toute contrainte ou souffrance est strictement limitée au minimum compatible avec les objectifs scientifiques du projet.
Choix des espèces
La souris constitue le modèle de référence pour l’étude du système immunitaire des mammifères. Les sous-populations de lymphocytes T CD8, y compris les cellules épuisées et les cellules progénitrices Tpex, y sont bien caractérisées et présentent de fortes similarités fonctionnelles et moléculaires avec celles observées chez l’humain. Des modèles murins d’infection virale chronique et de cancer sont disponibles et largement validés pour l’étude des mécanismes d’épuisement des lymphocytes T et de réponse aux immunothérapies. De plus, la disponibilité de lignées génétiquement modifiées et d’outils d’édition génétique permet d’analyser précisément le rôle de gènes d’intérêt dans des sous-populations cellulaires spécifiques. Aucune alternative in vitro ou in silico ne permet de reproduire la complexité des interactions entre cellules immunitaires, agents pathogènes ou tumeurs, et microenvironnement tissulaire. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (6 à 12 semaines)pour le démarrage des expériences. À ce stade, le système immunitaire est pleinement développé et fonctionnel, ce qui est indispensable pour l’étude des réponses immunitaires adaptatives. L’utilisation d’animaux adultes permet également de limiter la variabilité liée à la maturation immunitaire observée chez les animaux plus jeunes.
Impact d’une exposition alimentaire à un herbicide chez la souris
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Une partie d'entre elles finit remise à un service de formation aux gestes techniques : 351 souris exposées par leur alimentation à un herbicide très répandu vont être utilisées pour en étudier les effets indirects via le microbiote intestinal, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont suivies jusqu'à l'âge adulte avec pesées, mesures de glycémie et un modèle d'inflammation intestinale provoquant perte de poids et diarrhées. La plupart sont tuées pour prélever des échantillons ou fabriquer des organoïdes intestinaux, tandis que 45 reproductrices sont ensuite remises à un service de formation à la contention et aux gestes techniques. Le porteur présente cette réaffectation comme un moyen d'"optimiser leur utilisation".
Objectifs
Nous étudierons un des herbicides les plus utilisés dans le monde qui agit en bloquant un mécanisme essentiel chez les plantes, ce qui entraîne leur mort. Comme ce mécanisme n’existe pas chez les mammifères, cet herbicide a longtemps été considéré comme sans danger pour la santé humaine. Cependant, certaines bactéries présentes dans notre intestin possèdent ce mécanisme. Or, ces bactéries forment le microbiote intestinal, qui joue un rôle important dans la digestion, le système immunitaire et le bon fonctionnement de l’organisme. Des études chez la souris ont montré que l'herbicide peut modifier la composition de ce microbiote. Ces modifications pourraient avoir des conséquences sur la santé, notamment en favorisant des troubles digestifs ou métaboliques. Toutefois, on ne sait pas encore si l'herbicide peut réellement contribuer au développement de ces maladies via le microbiote. Ce projet vise donc à mieux comprendre ces effets en étudiant des souris exposées à l'herbicide par l’alimentation tout au long de leur vie, de manière à se rapprocher des conditions d’exposition humaine.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons approfondir les connaissances sur l’impact de l’exposition alimentaire à un herbicide et fournir des données indépendantes sur le pesticide le plus utilisé et le plus controversé au monde. Nous étudierons certains paramètres peu explorés dans les études toxicologiques réglementaires, à savoir les effets sur le microbiote intestinal, l'inflammation intestinale et le métabolisme. Ces données indépendantes pourront servir aux agences réglementaires et aux politiques pour formuler des recommandations sur l’utilisation de ce pesticide.
Procédures
Les animaux sont répartis en trois groupes (12 mâles et 12 femelles par groupe) et suivis jusqu’à l’âge adulte (J130). Les 3 groupes correspondent à des souris non exposées, exposées à une dose faible et exposées à une dose plus forte d'herbicide incorporé dans l'alimentation. Tous les animaux font l’objet d’un suivi régulier comprenant une pesée hebdomadaire et un suivi de la consommation alimentaire et hydrique (toute la durée de l’étude). Des prélèvements de fèces non invasifs sont réalisés toutes les deux semaines (environ 1–2 minutes par animal). Une mesure de la glycémie à jeun, similaire à celle réalisée chez l’Homme (prélèvement d’une goutte de sang), est effectuée une fois par mois (moins de 1 minute par animal). À partir de J84, trois interventions sont réalisées à deux semaines d’intervalle : • placement en cage individuelle spécifique pendant 23 heures pour la collecte des urines, • test de tolérance au glucose (durée totale d’environ 2 heures avec mesures répétées), • autre test de tolérance métabolique (durée totale d’environ 2 heures avec mesures répétées). En fin d’expérimentation, un prélèvement sanguin est réalisé (moins d’1 minute), suivi de la mise à mort des animaux. Dans un second groupe d’animaux, un suivi similaire est réalisé (pesée hebdomadaire, consommation, prélèvements de fèces toutes les deux semaines). Ces animaux reçoivent en plus un traitement de 7 jours visant à induire une inflammation intestinale, suivi d’une période de récupération de 5 jours, avec observation quotidienne de leur état général (quelques minutes par animal).
Impact sur les animaux
Aucun signe de toxicité notable n’a été observé dans des conditions d’exposition similaires lors d’études précédentes. Les interventions prévues peuvent néanmoins entraîner des effets indésirables modérés et transitoires, incluant un stress lié aux manipulations répétées et une gêne ponctuelle lors des prélèvements. L’hébergement temporaire en cage individuelle peut induire un stress léger à modéré. Le modèle d’inflammation intestinale induit entraîne des signes cliniques modérés à marqués sur une durée limitée, comprenant une perte de poids, des diarrhées et une altération de l’état général. Ces effets sont réversibles chez la majorité des animaux après la phase d’induction.
Devenir
Les souris F1 seront euthanasiées à la fin de l’expérimentation afin de prélever des échantillons qui seront analysés pour répondre à la question scientifique. Les souris F1 surnuméraires seront mises à mort au sevrage pour préparer des organoïdes intestinaux. Les souris F0 des deux sexes (10 femelles et 5 mâles par procédure, soit 45 souris au total) seront mises à disposition de la DAP de formation à la contention et aux gestes techniques de l’établissement déjà autorisée à cet effet, permettant d’optimiser leur utilisation.
Remplacement
Notre laboratoire utilise habituellement des modèles simplifiés (comme des cellules ou des tissus isolés) pour étudier les effets directs de certaines substances sur les organes. Cependant, dans ce projet, nous cherchons à comprendre des effets indirects d'un herbicide, qui pourraient passer par les bactéries présentes dans l’intestin, appelées microbiote intestinal. En effet, cet herbicide agit principalement sur une cible présente chez certaines bactéries, mais absente chez les cellules humaines, ce qui suggère que ses effets pourraient dépendre de ces micro-organismes. Pour étudier ces interactions complexes, il est nécessaire d’utiliser un organisme entier, car le microbiote, l’intestin, le système immunitaire et d’autres organes (comme le foie ou les tissus adipeux) communiquent entre eux et fonctionnent ensemble. À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode alternative permettant de reproduire fidèlement ces interactions dans leur globalité. Dans un second temps, les résultats obtenus permettront d’orienter des études complémentaires sur des modèles plus simples, afin de mieux comprendre les mécanismes en jeu et de limiter à l’avenir le recours aux animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé à l’aide d’un outil de biostatistique (R), sur la base de données issues d’études préliminaires. Cette approche permet de définir l’effectif minimal nécessaire pour mettre en évidence des effets biologiquement pertinents tout en garantissant une puissance statistique suffisante. Ainsi, un effectif de 12 animaux par groupe a été retenu afin d’assurer la robustesse des résultats tout en limitant le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes de 4 dans des cages enrichies comprenant des dispositifs permettant l’isolement si nécessaire. Ils seront manipulés régulièrement afin de les habituer à la contention et de limiter le stress lié aux interventions expérimentales. Une surveillance régulière des animaux sera mise en place tout au long de l’étude afin d’évaluer leur état général et de détecter précocement tout signe de souffrance ou de détresse. Cette surveillance repose sur une grille de scoring intégrant plusieurs paramètres (poids, apparence physique, comportement spontané et réponse aux stimuli), permettant une évaluation globale et standardisée de l’état de l’animal. Une surveillance renforcée sera appliquée lors des phases expérimentales les plus sensibles, notamment lors de l’induction de l’inflammation intestinale. La grille de score, associée à des points limites prédéfinis et adaptés à chaque procédure, permettra de guider les décisions de prise en charge et, si nécessaire, de déclencher l’arrêt de l’expérimentation afin de préserver le bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris est un modèle couramment utilisé en recherche biomédicale, car son organisme présente de nombreuses similitudes avec celui de l’être humain, notamment pour l’étude du métabolisme, du système immunitaire et du fonctionnement intestinal. De plus, de nombreux outils scientifiques permettent d’analyser précisément ces fonctions chez cet animal. Dans ce projet, des souris adultes seront utilisées pour permettre la reproduction, puis leurs descendants seront suivis jusqu’à l’âge adulte. Cette approche permet d’étudier les effets d’une exposition précoce, dès la vie avant la naissance, ainsi que ses conséquences à long terme sur la santé intestinale et métabolique.
Phénotypage fin de jeunes ovins pour une sélection sur la réduction de l’impact environnemental de l’élevage ovin allaitant
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Prélevés par ponction à la jugulaire et par sondage gastro-œsophagien pour recueillir leur fluide ruminal, sans anesthésie ni sédation, 1 000 agneaux vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. L'objectif est de repérer des prédicteurs de l'impact environnemental de l'élevage ovin, les animaux recevant par moments une alimentation entièrement à base de concentrés qui risque de provoquer une acidose du rumen. Le porteur écarte les alternatives au motif que la variabilité individuelle des émissions ne se mesure pas autrement. À la fin des prélèvements, les agneaux ne sont pas tués dans le projet mais poursuivent leur carrière de production, donc rejoignent la filière.
Objectifs
Notre projet a pour objectif d’identifier des prédicteurs de l’impact environnemental de l’élevage d’ovins allaitants. Les impacts seront étudiés sous l’angle de l’ingestion (aliments et eau) et des émissions de gaz à effet de serre. Nous utilisons des agneaux mâles et femelles de race Romane, descendants de béliers sélectionnés pour valoriser efficacement (ou peu efficacement) ce qu’ils ingèrent, une valorisation efficace signifiant que les individus ingèrent moins que les autres tout en ayant le même niveau de production. Le projet portera sur l’étude des 5ème et 6ème génération de sélection. Après 4 générations de sélection, la divergence est bien marquée : les agneaux issus de béliers efficaces ingèrent 10% de moins de concentré que les agneaux issus de béliers peu efficaces, tout en ayant des performances de croissance identiques. Ces différences sont très réduites bien que significatives, avec un régime plus riche en fourrages. La connaissance des émissions de gaz à effet de serre dans chacune des lignées et sous deux régimes différents nous renseignera sur les liens génétiques entre l’efficacité alimentaire et l’impact environnemental. Chaque année, une centaine d’agneaux de chacun des deux sexes (50% issus de béliers efficaces et 50% issus de béliers peu efficaces) seront mesurés pour leurs émissions de gaz et leurs ingestions d’aliments et d’eau. Les différents outils de mesures reposent sur l’identification électronique des animaux qui sont ainsi mesurés tout en étant maintenus dans leurs lots d’élevage. L’impact environnemental sera évalué sous deux régimes alimentaires différents : un régime 100% concentré basse énergie quand les agneaux auront entre 3 et 5 mois d’âge, puis un régime plus riche en fourrages quand les agneaux auront entre 6 et 9 mois d’âge. Enfin, l’enregistrement en routine des émissions de gaz et des quantités ingérées est peu envisageable à grande échelle, à des fins de sélection. Nous rechercherons donc des prédicteurs de ces caractères dans différents tissus/fluides : le plasma sanguin, le fluide ruminal et les fèces. Les prélèvements de chacun de ces fluides seront réalisés au maximum 2 fois dans la vie de chaque animal, à l’issue de chacune des phases d’alimentation, avec un délai de 3 à 4 mois entre les deux prélèvements. Les émissions de gaz à effet de serre sont principalement dues aux fermentations ruminales, donc l’étude du microbiote ruminal sera central dans ce projet en lien avec le microbiote fécal.
Bénéfices attendus
Notre projet propose d’étudier des animaux sélectionnés sur leur efficacité alimentaire et de répondre à la question suivante : des animaux plus efficaces émettent-ils plus de gaz à effet de serre que des animaux moins efficaces ? La sélection sur chacun des caractères pourra alors être différente en fonction des résultats obtenus, de façon à ce que l’impact environnemental de l’élevage ovin soit limité, tout en maintenant la rentabilité économique pour les éleveurs. De plus, l’ensemble des prélèvements sera utilisé pour rechercher des prédicteurs des émissions de méthane, car ces dernières restent encore peu accessibles en élevage conventionnel. Ces prédicteurs pourront être utilisés par les organismes de sélection, pour inclure l’efficacité alimentaire et/ou les émissions de gaz à effet de serre dans leurs programmes de sélection
Procédures
Pour ce protocole, les agneaux mâles auront chacun deux séries de prélèvements, espacées de 3 mois minimum. Les femelles ne seront prélevées qu’un seule fois, après la phase d’alimentation fourragère. Pour ces prélèvements, les animaux ne seront ni anesthésiés ni sédatés. Chaque année, les 200 animaux étudiés seront prélevés. Sur la totalité du projet, ce seront ainsi 1000 animaux qui seront échantillonnés. Ces prélèvements correspondent à une prise de sang à la jugulaire, un prélèvement de fèces au niveau rectal, et un prélèvement de fluide ruminal par sondage gastro-oesophagien. L’ensemble de ces 3 prélèvements est réalisé en moins de 10 minutes, sans isoler l’animal de ses congénères. Chaque mâle aura donc 2 prises de sang, 2 prélèvements de fèces et 2 prélèvements de fluide ruminal. Les prélèvements sont faits à 5 mois et 8 mois d’âge, pour les mâles. Les femelles n’auront qu’une prise de sang, un prélèvement de fèces et un prélèvement de fluide ruminal, lorsqu’elles auront environ 8 mois d’âge. Pour le prélèvement à la jugulaire et le prélèvement rectal, l’animal sera en attente dans un couloir. Un animalier lui soutiendra la tête pendant qu’un autre animalier fera le prélèvement de sang à la jugulaire. Suite à la prise de sang, un baume antiseptique et cicatrisant pourra être appliqué en massage sur les veines. Ensuite, environ 5g de fèces seront prélevés directement dans le rectum par un animalier dont le gant sera enduit de lubrifiant, un second animalier soutenant toujours la tête de l’animal. Enfin, l’animal passera du couloir au restrainer, matériel de contention adapté aux ovins. Celui-ci portera l’animal jusqu’au poste de prélèvement du fluide ruminal. La tête de l’animal sera maintenue par un animalier, pendant qu’un second animalier fera descendre la sonde gastro oesophagienne souple (12 mm de diamètre et 100 cm de longueur) par la bouche jusqu’au rumen. Une fois la sonde placée, la pompe à vide (reliée à l’autre extrémité de la sonde) sera activée et environ 40 mL de fluide ruminal sera prélevé. La pompe sera ensuite éteinte et la sonde retirée avec précaution. L’ensemble de ce prélèvement (de l’introduction de la sonde à son retrait) n’excède pas deux minutes. Un renforcement positif par distribution manuelle de concentré sera réalisé à la fin du prélèvement de fluide ruminal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pendant la première phase de contrôle pourraient être liés à l’alimentation 100% concentrés (à base de céréales) à volonté lors du premier contrôle, avec des risques d’acidification importante du milieu ruminal. L’aliment concentré a été formulé pour respecter des recommandations élevées en fibres et il a été enrichi en bicarbonate, pour prévenir cette acidose ruminale. Les soigneurs sont habitués à l’élevage de ruminants et connaissent ce trouble digestif et ses symptômes. En cas d’acidose aigüe, ils ont à leur disposition des traitements à administrer par voie orale. Ils sont formés à ce geste. Lors des phases d’adaptation prévues dans le projet, les animaux qui auraient du mal à se familiariser avec les automates d’ingestion sont entraînés par les animaliers, avec un renforcement positif par distribution manuelle de concentré. Tout animal qui ne parvient pas à s’adapter aux automates n’est pas conservé pour le protocole. Durant toute la phase d’élevage et d’expérimentation, en cas de signes de maladie (fièvre >40°C, problèmes respiratoires, décubitus prolongé, anorexie, perte de poids…), ou d’impact sur l’état général des animaux, une intervention vétérinaire aura lieu et un traitement adapté (antidouleurs, anti-inflammatoires, antibiotiques) sera mis en place (l’animal sortira du protocole si nécessaire). En cas de non réponse aux traitements et sur décision vétérinaire, l’animal sera euthanasié.
Devenir
Les agneaux poursuivront leur carrière de production suite à la procédure expérimentale.
Remplacement
Notre projet porte sur l’impact environnemental de la sélection sur l’efficacité alimentaire. Les principales émissions de gaz à effet de serre proviennent de la digestion des fibres dans le rumen, par les ruminants. Ces émissions de gaz poduits dans le rumen ont des origines génétiques et alimentaires complexes. Cette variabilité individuelle ne peut être étudiée en dehors des animaux eux-mêmes. De plus, nous cherchons des prédicteurs biologiques de ces émissions de gaz, donc il est indispensable de prélever des échantillons sur les animaux mesurés afin d’avoir le lien direct entre les mesures et les prédicteurs testés. Le recours à l’animal ne peut donc être évité.
Réduction
Notre projet repose sur le phénotypage de 200 agneaux par an, soit 1000 agneaux sur 5 ans. Ces effectifs ont été calculés pour nous permettre d’observer des différences faibles entre nos deux lignées d’animaux, sur des caractères autres que la consommation résiduelle. Nous avons choisi de travailler sur les deux sexes, afin d’appliquer le modèle de transmissibilité aux caractères que nous étudions. Ce modèles nécessite des trios (parents-descendants) phénotypés à un âge identique entre les générations. L’estimation des paramètres génétiques repose sur l’analyse de nombreux animaux (au moins 700). Les enregistrements issus de ce projet viendront compléter des bases de données issues de projets antérieurs de façon à avoir les effectifs suffisants nous permettant les analyses génétiques des nouveaux caractères.
Raffinement
Durant notre projet, les animaux sont élevés en lots pour exprimer leurs comportements sociaux. Les mesures réalisées reposent sur l’utilisation d’automates que les animaux fréquentent selon leurs besoins. Toutes les données sont gérées en temps réel et intégrées par un logiciel dédié. Le suivi des animaux est quotidien, par cet outil informatique, par des caméras, mais aussi par les nombreux passages des animaliers pour un suivi visuel. Les temps d’occupation des automates sont régulièrement contrôlés pour s’assurer que chaque animal se nourrisse à volonté. Tout animal qui ne parvient pas à s’adapter aux automates n’est pas conservé pour le protocole. Les animaux sont logés sur des aires de copeaux de bois, pour nous assurer qu’ils ne mangent pas leur litière, ce qui fausserait l’étude. Des disques à mordiller seront suspendus dans les parcs. Les animaux sont habitués dès leur plus jeune âge au contact humain, et en particulier à être manipulés. Afin de limiter le stress de contention, les prélèvements sont réalisés par du personnel qualifié à l’aide de matériel de contention adapté aux ovins et auquel les animaux sont habitués. Les prélèvements de fèces, sang et de contenu ruminal se font successivement lors de la même contention, afin de réduire au maximum le temps de contention. Les prélèvements de sang et de fèces sont similaires à ceux qui peuvent être réalisés en élevage classique pour du génotypage, de la prophylaxie ou du diagnostic de parasitisme gastro-intestinal. Pour les prises de sang, les agneaux pouront être tondus au niveau du coup pour faciliter la visualisation de la veine jugulaire. Un baume antiseptique et cicatrisant pourra être appliqué en massage sur les veines. Une attention particulière sera portée aux veines jugulaires pour repérer tout signe éventuel de phlébite. Les prélèvements de contenu ruminal ne sont pas des prélèvements habituels en élevage ovin. Néanmoins, le personnel de l’établissement utilisateur a été formé et pratique ce type de prélèvement depuis plusieurs années. A la fin des prélèvements, une poignée de granulés est donnée à l’animal pour un renforcement positif. Ils font l’objet d’une surveillance visuelle toute particulière au moment des prélèvements et après ceux-ci. Les ingestions et les poids sont encore enregistrés sur les deux jours suivants les prélèvements, pour avoir une indication de leur état de santé.
Choix des espèces
L’étude des émissions de gaz à effets de serre est primordiale pour l’espèce bovine qui en est la principale responsable. Néanmoins, l’espèce ovine présente 2 avantages au sein des ruminants pour l’étude de l’impact environnemental des ruminants : des troupeaux avec de grands effectifs (mêmes conditions d’élevage), une sélection génétique opérationnelle. Le rumen est l’élément central de notre projet, donc l’espèce ovine est toute indiquée pour être support de ce travail. Notre projet porte ainsi sur l’utilisation d’ovins allaitants de race Romane sélectionnés sur leur efficacité alimentaire. Cette efficacité alimentaire est évaluée lors de la phase de croissance dans un premier temps. Les agneaux entrent en halle de phénotypage entre 10 et 12 semaines d’âge, afin de débuter la phase de contrôle autour de 90 jours d’âge, et ont 8 à 9 mois d’âge en fin de projet.
Effet bénéfique de l’environnement enrichi sur les altérations de la mémoire et des mécanismes associés dans un modèle de maladie du cerveau.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
La moitié en cage enrichie, l'autre en cage standard : 192 souris vont être utilisées pour tester si un environnement enrichi limite les pertes de mémoire dans un modèle de maladie d'Alzheimer débutante, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal vit d'abord quatre mois dans son type de cage, puis passe une série de tests comportementaux en étant isolé 48 heures, 24 heures puis 4 heures. À la fin, 64 souris subissent un prélèvement de sang terminal et 64 une perfusion terminale sous anesthésie profonde. Le porteur justifie l'usage de souris par l'impossibilité de détecter ce stade précoce de la maladie chez l'humain.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie du cerveau encore incurable et irréversible. Elle est caractérisée par un déclin des fonctions cognitives telles que la mémoire. En novembre 2024, l’Agence européenne des médicaments a autorisé la commercialisation en Europe d’un traitement ciblant une des causes supposées de la maladie. Cependant, le rapport bénéfice/risque actuel de ce traitement destiné qu’aux patients en début de maladie, n’est pas suffisant pour le rendre accessible en France. Il est donc crucial de trouver d’autres approches thérapeutiques, en complément des approches existantes, pour mieux traiter la MA. Les approches non médicamenteuses comme une activité physique adaptée, la danse, la musicothérapie ou la médiation animale, sont de plus en plus utilisées pour accompagner les personnes atteintes de MA. Ces interventions non pharmacologiques exposent les malades à de nombreuses stimulations cognitives, sensorielles, motrices et sociales produisant un enrichissement de leur environnement capable de ralentir la progression de la MA, de maintenir plus longtemps l’autonomie de ces malades, et d’améliorer leur qualité de vie. Des études réalisées chez l’Homme comme chez l’animal (surtout rongeurs), indiquent qu’une exposition prolongée à un environnement enrichi améliore notamment les capacités mnésiques et stimule le système immunitaire. Cependant, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les effets d’un enrichissement de l’environnement restent encore à élucider. L’objectif de ce projet est donc d’étudier le bénéfice d’un hébergement en environnement enrichi sur un modèle de souris Alzheimer génétiquement modifié, notamment sur les déficits cognitifs, sur les biomarqueurs caractéristiques de la MA et sur les mécanismes moléculaires et cellulaires mis en jeu.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu de ce projet de recherche est la mise en évidence de modifications comportementales (capacités mnésiques), moléculaires et cellulaires (biomarqueurs MA, inflammation), qui sous-tendent les effets bénéfiques de l’enrichissement de l’environnement (EE) dans un modèle de maladie d’Alzheimer. Les analyses conjointes sur les deux sexes permettront d’étudier les différences entre mâles et femelles au niveau cognitif et permettront une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires/cellulaires, dépendants du sexe, qui sous-tendent les interventions non pharmacologiques telles que l’EE. Cela pourrait contribuer à développer des approches thérapeutiques personnalisées (Homme versus Femme) et à leur mise en place aux stades les plus précoces. En apportant des bases mécanistiques dans notre modèle animal de MA, ces études permettront d’étayer les connaissances plus fondamentales sur la MA (pathologie amyloïde et déficit cognitif), sur les effets bénéfiques de l’EE et leur implication en santé humaine. Enfin, l’identification et le traçage biologique sanguin et cérébraux de marqueurs de la MA permettra le développement de stratégies thérapeutiques nouvelles, ou combinatoires soutenant des stratégies non pharmacologiques.
Procédures
Pour 192 animaux : 96 animaux seront hébergés en cage standard et 96 animaux seront hébergés en environnement enrichi pendant 4 mois (de 1 à 5 mois d’âge). Les tests comportementaux seront réalisés sur l’ensemble des animaux sur une période de 13 jours durant laquelle les animaux seront hébergés transitoirement en cage individuelle pendant 48h pour le premier test, 24h pour le second test et 4h pour le dernier test. Pour 64 animaux : Environ une semaine après le dernier test comportemental, les animaux seront soumis à un prélèvement de sang terminal sous anesthésie profonde (durée totale de la procédure : environ 15 minutes) Pour 64 animaux : Environ une semaine après le dernier test comportemental, les animaux seront soumis à une perfusion terminale pour la fixation de tissus sous anesthésie profonde (durée totale de la procédure : environ 15 minutes).
Impact sur les animaux
Tous les animaux seront transférés en cage individuelle transitoirement avant de commencer chaque test, puis retourneront dans leur cage d’origine à la fin de chaque test (période d’isolement : 48h pour le premier test, 24h pour le deuxième test et 4h pour le dernier test). Cet hébergement en cage individuelle des congénères peut générer un stress. L’injection d’anesthésiques et/ou d’analgésiques aux souris, à l’aide d’une aiguille, entraîne une douleur légère de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvements et analyses post-mortem.
Remplacement
Dans la mesure où nos travaux portent sur les caractérisations comportementales et moléculaires suite à un changement des conditions environnementales (hébergement spécifique), il n’est pas possible de recourir à un autre type de modèle d’étude qu’à celui de l’animal entier. De plus, nous nous intéressons au stade prodromal de la MA difficilement détectable chez l’Homme. Nous ne pouvons, de ce fait, pas réaliser les analyses cellulaires et moléculaires sur l’Homme, ni utiliser d’alternative cellulaire ou de simulation par des techniques informatiques. Notons que les modèles murins (souris) récapitulent les symptômes majeurs de la maladie (déficit de mémoire) et restent ainsi des outils uniques pour l'étude des mécanismes physiopathologiques, la validation de cibles thérapeutiques et la réalisation de tests précliniques.
Réduction
Dans la mesure où nos travaux portent sur les caractérisations comportementales et moléculaires suite à un changement des conditions environnementales (hébergement spécifique), il n’est pas possible de recourir à un autre type de modèle d’étude qu’à celui de l’animal entier. De plus, nous nous intéressons au stade prodromal de la MA difficilement détectable chez l’Homme. Nous ne pouvons, de ce fait, pas réaliser les analyses cellulaires et moléculaires sur l’Homme, ni utiliser d’alternative cellulaire ou de simulation par des techniques informatiques. Notons que les modèles murins (souris) récapitulent les symptômes majeurs de la maladie (déficit de mémoire) et restent ainsi des outils uniques pour l'étude des mécanismes physiopathologiques, la validation de cibles thérapeutiques et la réalisation de tests précliniques.
Raffinement
Pour appliquer le principe de raffinement, un enrichissement environnemental est apporté dans les cages standards : dispositif de nidification (certifié contact alimentaire) chaque semaine. Dans le cas d’hébergement en cage individuelle (comportement), plusieurs cages (3 au minimum) seront maintenues côte à côte sur les rayonnages des racks de stabulation pour ne pas créer d’isolement visuel, ni olfactif. Des points limites prédictifs sont mis en place pour limiter la souffrance. Les souris sont habituées à la manipulation par l’expérimentateur pour réduire le stress lié à la manipulation lors des tests comportementaux. Les animaux sont testés dès le début de l’apparition des déficiences mnésiques afin de réduire le temps d’hébergement des animaux en animalerie. Une anesthésie générale et une analgésie adaptée sont utilisées pour les procédures qui le nécessitent.
Choix des espèces
Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des maladies du cerveau ayant une origine génétique. En effet, les maladies du cerveau que nous étudions dans ce projet apparaissent à l’âge adulte (40-50 ans) lorsque ce sont des formes génétiques. Elles apparaissent plus tardivement, quand leur origine n’est pas connue, le vieillissement étant un facteur de risque majeur de ces pathologies. Ainsi, les animaux étudiés seront testés à l’âge de 5 mois, âge ou au moins un des déficits mnésiques est bien marqué (nos études antérieures ayant montré que les premiers déficits apparaissent à l’âge de 4 mois) dans ce modèle de souris transgéniques. De plus, ce modèle permet de répondre à la question posée car les souris possèdent des structures neuroanatomiques comparables à celles du cerveau humain.
Rôle du microbiote humain dans le stockage lipidique hépatique.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Identifiées par un poinçon à l'oreille, traitées aux antibiotiques par quatorze gavages puis recevant des selles humaines par douze gavages supplémentaires, 60 souris vont être utilisées pour étudier l'effet du microbiote humain sur le foie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les gavages répétés, les pesées et le prélèvement sanguin à la queue provoquent stress et douleurs passagers. Toutes sont tuées à l'issue pour collecter leur sang et leurs tissus. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit les interactions entre microbiote transplanté et métabolisme du foie.
Objectifs
Des travaux précédents ont mis en évidence que : -chez l’Homme, plus l’accumulation de graisse dans le foie est sévère, plus le taux sanguin d’un métabolite, appelé ici X, est élevé ; -chez la souris, le métabolite X, lorsqu’il est administré par gavage, peut à lui seul provoquer l’accumulation de graisse dans le foie. Comme ce métabolite X est produit par le microbiote intestinal, nous souhaitons comprendre si le microbiote humain est directement responsable de sa production et donc de l’accumulation de graisse dans le foie. Pour répondre à cette question, nous allons réaliser des transplantations fécales chez la souris. Cela consiste à transférer le microbiote de donneurs humains (personnes en bonne santé ou patients atteints de foie gras, présentant soit de faibles soit de forts taux de métabolite X dans le sang) dans des souris dépourvues de leur propre microbiote. L’objectif est de vérifier si le microbiote humain suffit à reproduire chez la souris des taux sanguins similaires de métabolite X (faibles ou élevés) et s’il peut entraîner, selon l’origine des selles, une accumulation plus ou moins importante de graisse dans le foie. L’expérience comportera plusieurs étapes : 1. une phase d’acclimatation des animaux ; 2. une élimination du microbiote intestinal des souris grâce à un traitement antibiotique d’une semaine ; 3. la transplantation fécale, 4. un prélèvement de sang sous anesthésie pour mesurer les concentrations du métabolite X, suivi de la collecte des tissus nécessaires aux analyses.
Bénéfices attendus
À court terme, ce projet permettra de déterminer si le microbiote de patients avec la maladie du foie gras ayant des taux élevés de métabolite X peut, à lui seul, augmenter ce métabolite et provoquer une accumulation de graisse dans le foie chez la souris, comparé à des microbiotes de sujets sains ou de patients présentant de faibles taux. Cela établira un lien direct entre certaines bactéries, le métabolite X et les atteintes du foie. À plus long terme, ces résultats pourront guider le développement de stratégies visant à réduire les bactéries responsables de la surproduction du métabolite X, ouvrant la voie à de nouvelles approches pour prévenir ou traiter la maladie du foie gras.
Procédures
Identification : les 60 souris recevront un unique petit poinçon au niveau de l’oreille pour permettre leur identification (durée : < 30 s, contention comprise). Traitement antibiotique : les 60 souris seront traitées pendant 7 jours consécutifs par un cocktail d’antibiotiques administré deux fois par jour (à 8 h d’intervalle). Chaque animal recevra donc 14 gavages (durée : ~30 s par gavage, contention comprise). Transplantation fécale : les 60 souris recevront des suspensions de selles humaines par gavage 1 fois par jour pendant 3 jours consécutifs (lundi, mardi, mercredi), et ce durant 4 semaines, soit 12 gavages par animal (durée : ~30 s par gavage). Pesées : les 60 souris seront pesées 2 fois par semaine sur toute la durée de l’étude, soit 10 pesées par animal (durée : ~30 s par manipulation). Analgésie et anesthésie : les 60 souris recevront une injection d’antidouleur (durée : ~30 s, 1 seule fois avant euthanasie), suivie 30 minutes plus tard d’une injection d’anesthésiant (durée : ~30 s, 1 seule fois avant euthanasie). Jeûne : les 60 souris seront soumises à un jeûne nocturne avant la mise à mort afin de stabiliser les paramètres métaboliques et permettre au mécanisme identifié par lequel le métabolite induit un stockage de lipides de se mettre en place. Prélèvement sanguin : les 60 souris subiront une petite incision (< 1 mm) au bout de la queue permettant de recueillir quelques gouttes de sang (durée : ~1 min pour l’incision et le prélèvement).
Impact sur les animaux
L’identification par poinçonnement de l’oreille peut provoquer une douleur légère et transitoire. Le traitement antibiotique d’une semaine est susceptible d’entraîner une légère perte de poids. Les gavages induisent un stress et un inconfort temporaires. Les pesées génèrent un stress léger. Les injections nécessaires à l’anesthésie et à l’analgésie provoquent une légère douleur momentanée. La période de jeûne nocturne peut entraîner un inconfort supplémentaire, et le prélèvement sanguin à la pointe de la queue s’accompagne d’une douleur passagère. Aucun effet indésirable n’a été observé lors de protocoles similaires menés dans notre laboratoire.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure afin de collecter le sang et les tissus nécessaires aux analyses.
Remplacement
L’objectif du projet est d’évaluer la capacité d’un microbiote humain à induire la production du métabolite X et à déclencher l’accumulation de graisse dans le foie. Aucune méthode alternative ne permet aujourd’hui de reproduire l’ensemble des interactions complexes entre le microbiote transplanté, l’absorption intestinale, le métabolisme du foie et la régulation du métabolite X. Les cultures cellulaires ne permettent pas de modéliser le transfert des métabolites, la dynamique hôte–microbiote ni les conséquences. Le modèle souris reste donc le seul modèle pertinent pour établir un lien causal entre composition du microbiote, production du métabolite X et altérations du foie.
Réduction
Le nombre de souris par groupe a été déterminé à partir d’un calcul de puissance statistique, en utilisant des données issues de protocoles antérieurs menés chez des patients atteints de la maladie du foie gras pour lesquels le métabolite X a été mesuré en circulant. Ce calcul indique qu’un effectif de 20 animaux par groupe est nécessaire pour détecter une différence significative entre groupes. Par ailleurs, un maximum de tissus sera prélevé et conservé lors de la mise à mort, afin d’être utilisés pour des analyses complémentaires ou partagés dans le cadre de collaborations, permettant ainsi d’éviter la répétition inutile d’expérimentations animales.
Raffinement
Les animaux seront surveillés cinq fois par semaine, avec un suivi individuel du poids à J0 et deux fois par semaine et une mesure de la consommation alimentaire deux fois par semaine par cage. Ces suivis réguliers permettront d’identifier précocement tout signe de perte de poids excessive. Les gavages seront réalisés exclusivement par du personnel expérimenté, afin de garantir un geste précis et rapide minimisant stress et inconfort. Une sonde souple sera utilisée pour les gavages pour réduire le risque d’irritation ou de lésion de l’œsophage. Après chaque gavage, chaque animal sera observé durant au moins 5 minutes pour vérifier l’absence de douleur ou de détresse. Les volumes administrés par gavages seront strictement limités au minimum compatible avec la procédure pour réduire l’inconfort. Un enrichissement supplémentaire des cages sera mis en place durant la semaine de traitement antibiotique, ainsi que pendant la nuit de jeûne, afin d’atténuer le stress et maintenir un comportement normal. Les antibiotiques seront administrés par gavage plutôt que dans l’eau de boisson, afin de préserver une prise alimentaire et hydrique optimale et d’éviter une perte de poids excessive durant la phase d’antibiothérapie. Une seule incision de moins de 1 mm à l’extrémité de la queue sera réalisée pour recueillir les quelques gouttes nécessaires à l’évaluation du métabolisme du sucre. Les volumes injectés pour l’anesthésie et l’analgésie seront réduits au strict minimum efficace. Avant le prélèvement sanguin final, les animaux seront anesthésiés par injection avec analgésie complémentaire. La mise à mort sera ensuite réalisée par dislocation cervicale. Enfin, des points limites prédéfinis et adaptés au modèle seront appliqués afin d’interrompre la procédure dès l’apparition de signes précoces de souffrance ou de détérioration de l’état général.
Choix des espèces
La souris constitue l’espèce la plus appropriée pour répondre à la question scientifique posée. En effet, elle permet de réaliser des transplantations fécales dans des conditions contrôlées et reproductibles, tout en offrant une physiologie de l’intestin et du foie bien caractérisée et comparable à celle de l’Homme. Les modèles souris sont de référence pour étudier les interactions hôte–microbiote, la production de métabolites d’origine bactérienne et leurs conséquences. De plus, les procédures de traitements avec les antibiotiques et de transplantation de selles humaines sont validés dans cette espèce, rendant la souris le modèle le plus fiable pour établir un lien causal entre microbiote humain, métabolite X et altérations du foie. Des souris âgées de 10 semaines seront utilisées. À cet âge, les animaux ont terminé leur phase de croissance, présentent une physiologie stable et offrent une meilleure homogénéité des réponses. Par ailleurs, des souris de cet âge tolèrent bien les traitements antibiotiques nécessaires à l’élimination du microbiote, ce qui garantit la fiabilité et la reproductibilité du protocole.
Étude du rôle de la sénescence hépatique dans la cardiomyopathie diabétique via le métabolisme de la phénylalanine
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Nourries d'un régime destiné à imiter l'obésité humaine, 320 souris vont être utilisées pour étudier une atteinte cardiaque liée au diabète, dans des procédures classées en souffrance modérée, toutes tuées à l'issue. Elles subissent des échographies cardiaques sur animal vigile, des mesures de glycémie par prélèvement à la queue et des tests métaboliques après six heures de jeûne. Le porteur écrit qu'aucun effet douloureux n'est prévu, alors que le niveau de souffrance déclaré du projet est modéré. La mise à mort sert à prélever plusieurs organes jugés "indispensables" à l'évaluation de la maladie.
Objectifs
Ce projet étudie comment un régime riche en graisses et sucres, comme chez les personnes en surpoids et en obésité, peut endommager le foie (stéatose) et le cœur chez des souris adultes mâles et femelles. Nous comparons ces souris dans deux conditions : un avec ce régime riche en graisses et sucre, et un avec un régime pauvre en graisse . L'idée est de mieux comprendre ces maladies hepatiques courantes liées à l'obésité.
Bénéfices attendus
Ces observations pourraient aider à identifier des signaux précoces de lésions cardiaques dues à un foie malade, pour prévenir ou traiter mieux ces affections chez l'homme. Cela profiterait à des millions de personnes touchées par l'obésité, et leurs complications cardiaques, en guidant de futurs médicaments ou conseils alimentaires. Le projet valide aussi un modèle fiable pour d'autres recherches, en comparant les résultats de deux laboratoires.
Procédures
Echocardiographie : Geste non-invasif permettant d’évaluer les fonctions cardiaques, réalisé sur animaux vigiles préalablement épilés, sur tous les animaux. Il s’agit de maintenir les animaux sur le dos pour une durée de 3-4 minutes, le temps d’appliquer la sonde d’échographie et de procéder à l’enregistrement de l’échocardiogramme. Glycémie : Mesure du taux de glucose sanguin de tous les animaux. Sur animaux vigiles, on prélève une goutte de sang à la queue que l’on récupère sur un glucomètre afin de procéder à la lecture de la glycémie. Insuline-tolérance test (ITT) et glucose-tolérance test (GTT) : Tests métabolliques permettant d’évaluer la résistance à l’insuline et la tolérance au glucose. Sur animaux vigiles mis à jeun pendant 6h, injection (quelques secondes moins de 5 secondes) soit d’insuline (ITT), soit de glucose (GTT) et de suivre la glycémie à T=0, T=15min, 30 min, 60 min, 90 min et 120 min. La moitié des animaux seront soumis à un test GTT et l’autre moitié au test ITT en début et fin de régime (soit n=5 pour ITT et n=5 pour GTT).
Impact sur les animaux
Les animaux sont nourris avec un régime spécial pour imiter l'obésité humaine. Aucun effet douloureux prévu. On vérifie quotidiennement leur santé (poids, comportement). Lors des suivis métabolique et cardiaque, le moindre signe de malaise (ex. glycémie anormale, polyurie associé à diabète) entraîne un arrêt immédiat de l'analyse et exclut l'animal du protocole.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement de plusieurs organes nécessaires à l’analyse de différents paramètres cliniques indispensables à l’évaluation du stade d’avancement de la maladie.
Remplacement
Le développement des pathologies du foie comme la stéatose et la stéatohépatite dépendent étroitement de la communication entre les organes (foie, tissus adipeux, intestins et pancréas notamment) mais aussi de la communication entre les différents types cellulaires qui constituent le foie. Par conséquent, compte tenu de la nature multifactorielle, de la composition hétérogène du microenvironnement cellulaire et de la contribution du microbiote intrahépatique, seuls les modèles précliniques in vivo permettent jusqu’à présent de reproduire les diverses caractéristiques d’un organisme multicellulaire atteint par cette pathologie.
Réduction
La stratégie expérimentale a été définie de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en vue de l’obtention de résultats statistiquement significatifs tout en évitant des réplicats inutiles. En se basant sur les données de la littérature scientifique utilisant des modèles murins nourris par un régime alimentaire hypercalorique, un test statistique de calcul d’effectif minimal a été réalisé. Ainsi, un effectif de 10 animaux par groupe permettra de déceler de faibles variations quantitatives entre les groupes expérimentaux tout en prenant en compte la variabilité inter-individuelle. Afin d’optimiser au maximun le protocole en cours, nous regarderons simultanément différents tissus d’intérêt dans un même animal (réduction importante du nombre d’animaux prévus).
Raffinement
Des points limites ont été définis pour chacune des procédures. Tout signe témoignant d’une mauvaise tolérance au régime hypercalorique (par exemple perte de poids non désirée, souffrance, apathie, déshydratation des animaux) conduira à l’interruption de la procédure. Les animaux sont maintenus en groupes sociaux leur permettant d’exprimer leurs besoins avec leurs congénères et les cages sont enrichies avec une maison en carton et du papier kraft pour leur permettre de nicher. Un examen clinique des animaux sera effectué quotidiennement ou toutes les semaines selon le plan des procédures. De plus, les procédures que nous utilisons ont été optimisées et standardisées, ce qui permet de limiter la répétition des procédures.
Choix des espèces
Cette espèce (souris) permet de modéliser la pathologie humaine sur des temps raccourcis à l’échelle de vie de cet animal. Par ailleurs, ce modèle murin permet de tester in vivo le developpement de la pathologie stéatohépatite. D’ailleurs, la souris est un modèle classiquement utilisé dans les études concernant les désordres métaboliques causés par l’alimentation en raison des similitudes avec l’homme sur les paramètres liés au métabolisme du glucose et la surcharge pondérale. Les souris seront incluses aux protocoles expérimentaux au stade d’adultes (5 mois). En effet, la pathologie de la stéatohépatite se développe essentiellement chez les adultes.